Maturação e fecundação "in vitro" de ovócitos de caninos domésticos (Canis familiaris)

Este estudo foi realizado com o objetivo de 1) determinar a eficácia de duas temperaturas (370 C e 390 C) e três intervalos de tempo (48, 72 e 96h) comumente usados na maturação in vitro (MIV) de ovócitos caninos, 2) verificar o efeito de hormônios heterólogos: hormônio folículo estimulante (FSH) 0,5µg/ml, estradiol 20µg/ml e somatotropina humana (hST) 1µg/ml; e o efeito de proteínas: 0,4 % albumina sérica bovina (BSA), 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), e 10 % soro de cadela em estro inativado (SCE) na maturação nuclear de ovócitos caninos, 3) observar a influência da condição reprodutiva das doadoras de ovários (folicular, diestro, anestro, piometra, e prenhez) sobre os índices de maturação in vitro ovocitária, 4) verificar a habilidade para fecundação in vitro de ovócitos coletados de fêmeas em diferentes estágios do ciclo estral, previamente maturados in vitro e adicionalmente, examinar sua capacidade de desenvolvimento embrionário in vitro. O meio de maturação usado nos experimentos foi TCM-199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v) com 10 % de soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 1 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH e 0,03 UI/ml de hCG. O meio de maturação era modificado de acordo com a proposta experimental apresentada. Os resultados do primeiro experimento não mostraram diferença estatística no índice de meiose de ovócitos maturados à 37oC ou à 39oC em quaisquer dos intervalos testados (48, 72, 96 horas), embora a proporção de ovócitos que alcançaram metáfase II a 37oC após 72 horas da maturação in vitro, mostrasse uma tendência estatística à significância (p = 0,064), quando comparada àquela dos ovócitos maturados à 39oC. Foi concluído que temperaturas de 37oC e 39oC são similares para maturação in vitro de ovócitos de cadelas. No segundo experimento deste estudo, os índices mais elevados (p < 0,05) de retomada da meiose após 72 horas de maturação in vitro foram obtidos, quando TCM 199 era suplementado com 0,4 % de BSA. Uma influência positiva sobre a aquisição de metáfase II (MII) foi observada com a suplementação de 1µg/ml de hST no meio de maturação. Ao contrário, ovócitos maturados em TCM 199 com 10 % de soro de cadela em estro não se desenvolveram até o estádio de MII. Os resultados deste experimento mostraram que a suplementação de proteínas e de hormônios ao TCM-199 não facilitam as etapas finais da maturação in vitro de ovócitos de cadelas.No terceiro experimento, os resultados de maturação dos ovócitos não mostraram diferença estatística na progressão do material nuclear até o estádio de MII entre os ovócitos provenientes de cadelas em várias condições reprodutivas (fase folicular: 5,4 %; diestro: 4,2 %; anestro: 4,4 %; piometra: 8,1 % e prenhez: 4,7 %). A retomada da meiose mostrou índices de 24,6 % na fase folicular, 19,6 % no diestro, 16,4 % no anestro, 37,1 % na piometra e 29,2 % na prenhez. Índices positivos e mais elevados de resíduo acima do valor esperado foram observados para as condições de piometra e de prenhez nos estádios de metáfase/anáfase I (MI/AI). Nossos resultados indicam que a maturação nuclear in vitro de ovócitos caninos não é influenciada pela condição reprodutiva in vivo da fêmea no momento da coleta ovariana. No experimento de fecundação in vitro (FIV), 888 ovócitos selecionados através de sua qualidade morfológica superior foram distribuídos em 3 grupos de acordo com o estágio do ciclo estral da doadora em: a) folicular, b) anestro, c) luteal . Após período de 48 horas de maturação a 37oC em TCM 199 suplementado com 25 mM Hepes/l (v/v), com 10 % soro de vaca em estro inativado (SVE), 50 µg/ml de gentamicina, 2,2 mg/ml de bicarbonato de sódio, 22 µg/ml de ácido pirúvico, 20 µg/ml de estradiol, 0,5 µg/ml de FSH, 0,03 UI/ml hCG e 1 µg/ml de hST, os ovócitos eram fecundados in vitro (2x106 espermatozóides/ml) por um período de 24 horas. A percentagem de ovócitos nucleados desenvolvendo-se em embriões foi de 10,1 % (27/ 267). O índice de clivagem (2-8 células) após cinco dias da FIV foi similar nas fases reprodutivas (folicular, anestro, e luteal). Contudo, o índice geral de fecundação foi superior nos ovócitos oriundos de cadelas nos estágios folicular (42,4 %) e anestro do ciclo (34,3 %) comparativamente àqueles provenientes da fase luteal (18,6 %) (p < 0,001). Além disso, foi verificada influência da fase folicular sobre o desenvolvimento de pronúcleos, com os índices nesta fase (24,2 %) sendo estatisticamente diferentes daqueles observados no anestro e na fase luteal (9,6 % e 3,7 %, respectivamente) (p < 0,004). Não foi estabelecida correlação entre a proporção de espermatozóides capacitados ou com reação acrossômica e formação pronuclear e/ou percentagem de clivagem. Em resumo, conclui-se que: a) ovócitos caninos podem ser maturados in vitro de forma similar às temperaturas de 39oC e 37o. b) a adição de hormônios (FSH, estradiol, hST) e proteínas (BSA, SVE, SCE) ao meio TCM 199 não eleva os índices de maturação nuclear até o estádio de MII de ovócitos caninos maturados in vitro. c) em cães, a seleção de ovócitos com base na coleta dentro de um estágio específico do ciclo estral não deve ser usada para prever índices de meiose ou habilidade para desenvolvimento embrionário in vitro. d) ovócitos caninos maturados, fecundados e cultivados in vitro podem se desenvolver a zigotos com até 8 células.

Influência do número de espermatozóides na dose e do refluxo pós-inseminação sobre o desempenho reprodutivo de fêmeas suínas inseminadas intrauterinamente.

O presente trabalho objetivou avaliar o efeito do número de espermatozóides na dose inseminante sobre a taxa de prenhez (TPr) e no número de embriões de fêmeas suínas inseminadas pela técnica intra-uterina (IAU), em uma única inseminação (IA), efetuada no intervalo de até 24 horas antes da ovulação, considerando o refluxo de sêmen pós-inseminação. Foram utilizadas 211 fêmeas pluríparas híbridas (Landrace x Large White), com ordem de parto variando de dois a nove e intervalo desmame-estro de dois a seis dias. O diagnóstico de estro foi realizado duas vezes ao dia. Foram utilizadas doses com volume total de 20 ml contendo 0,25 x 109 (tratamento 1), 0,5 x 109 (tratamento 2) ou 1,0 x 109 (tratamento 3) espermatozóides diluídos em Beltsville Thawing Solution (BTS) produzidas em “split sample”. Quatro machos híbridos (Landrace x Large White x Pietrain) foram utilizados como doadores de sêmen. Foi acompanhada a motilidade (MOT) de uma dose de 100 ml contendo 2,5 x 109 espermatozóides proveniente de cada coleta de sêmen com a finalidade de avaliar a viabilidade espermática durante as 240 horas de armazenamento a 17°C. A coleta do refluxo vulvar, até 60 minutos após a IAU foi realizada com bolsas de colostomia descartáveis fixadas na região peri-vulvar. A determinação do número de espermatozóides contidos no refluxo foi realizada em câmara hemocitométrica. O diagnóstico de gestação foi realizado aos 20-23 dias com auxílio da ultra-sonografia transcutânea em tempo real. As fêmeas prenhes foram abatidas 34-41 dias após a IAU, onde foram coletados o útero e os ovários para contagem dos corpos lúteos e embriões. A passagem do cateter foi possível em todas as fêmeas. Não houve refluxo no momento da realização da IAU. Não houve diferença (P>0,05) no percentual de volume (pvol) e de espermatozóides (psptz) refluídos até 60 minutos após a IAU entre os três tratamentos. O baixo (inferior a 15%) ou alto (superior a 15%) psptz refluídos não influenciou a TPr, mas houve correlação negativa (P=0,0003; R=-0,34) do psptz refluídos com o número de embriões totais (NET). Não houve refluxo em apenas oito fêmeas e a amplitude do pvol variou de 0-136%. No presente trabalho, a MOT das doses inseminantes foi semelhante entre os quatro machos (P>0,05). A TPr não diferiu entre os tratamentos (P=0,36) porém foram verificadas diferenças (P<0,05) entre os machos dentro de cada tratamento. A redução na taxa de prenhez foi mais acentuada para o macho D, quando foram utilizadas doses com menor número de espermatozóides. Não houve efeito do macho ou da interação macho com tratamento sobre o número de embriões (P>0,05). O NET e viáveis diferiu entre o T1 e T2 (P<0,05). Utilizando-se apenas uma única inseminação intra-uterina no intervalo de até 24 horas antes da ovulação com 0,5 x 109 espermatozóides, é possível alcançar índices superiores a 85% de prenhez e 14 embriões, aos 34-41 dias de gestação.

Cultura de anteras e embriogênese de genótipos selecionados de cevada (Hordeum vulgare L.ssp.vulgare)

A eficiência da técnica de cultura de anteras, em escala comercial, ainda pode ser considerada baixa quando medida em número de plantas duplo-haplóides férteis obtidas para cada antera estabelecida in vitro. Dessa forma, o presente trabalho é pioneiro no estudo detalhado da embriogênese in vitro do micrósporo e do grão de pólen de cevada (Hordeum vulgare L. ssp. vulgare). Com o objetivo de contribuir para o aperfeiçoamento da técnica de cultura de anteras foi analisada a embriogênese, com especial ênfase na etapa da indução, através de análises citológicas e histológicas de anteras cultivadas in vitro. Foram analisadas uma cultivar brasileira de cevada, em comparação com linhagens de duas outras cultivares brasileiras, que foram selecionadas, por seleção divergente para maior ou para menor resposta na indução da rota embriogênica e, respectivamente, para menor ou para maior capacidade de regenerar plântulas verdes. Somente foram estabelecidas em cultivo in vitro as anteras que apresentaram micrósporos e pólens jovens, das linhagens selecionadas da cultivar A-05 (S3A22 e S3A23), e da cultivar BR-2(S3B63 e, apenas na cultura de anteras, S3B61), bem como da cultivar MN-599 (nãoselecionada). Para as análises histológicas, foram fixadas, a cada dois dias, duas anteras, correspondentes a cada fileira da mesma espiga, após o início do cultivo in vitro. As anteras em cultivo e respectivas estruturas multicelulares foram fixadas em FAA 50%, desidratadas em série etílica e incluídas em hidroxietilmetacrilato. Os blocos de resina polimerizada foram secionados longitudinalmente com 3 mm de espessura. Para as análises citológicas foram fixadas, de cada espiga recém-coletada, três espiguetas sendo uma da base, outra do meio e outra do ápice. Após o pré-tratamento à baixa temperatura (5 °C), porém antes do cultivo in vitro, foram fixadas três anteras (amostras utilizadas como controles). A cada três dias, durante o cultivo, três anteras foram fixadas (até 18 dias). As anteras em cultivo e estruturas multicelulares foram fixadas em Farmer e FAA 50%, transferidas após 24 horas para etanol 70%. Na cultura in vitro das anteras houve diferenças entre uma das linhagens da cultivar A-05 em relação a cultivar MN- 599, na produção inicial de estruturas embriogênicas, diferença que desapareceu na produção total. Entretanto, houve diferenças na formação dos xiii embriões: a cv.MN-599 formou embriões bem diferenciados ao passo que a linhagem S3A22 produziu um número aparentemente menor, sendo que os embriões não eram bem diferenciados. A linhagem S3B63 não apresentou embriões até o final da análise histológica. Considerando que a amostra dessa linhagem, mantida em cultura, formou plantas verdes, pode-se propor que a formação de embriões deve ocorrer posteriormente ao desenvolvimento da cv.MN-599. Cabe destacar que houve diferenças significativas entre as cultivares A-05 e BR-2 quanto à regeneração de plântulas verdes. Esses resultados indicam ter havido maior eficiência da seleção em relação à etapa da regeneração. Com relação às categorias classificatórias dos micrósporos e grãos de pólen, constatou-se que desde o início da análise histológica (2o dia de cultivo in vitro) até o final (34o dia), foram observados micrósporos, o mesmo tendo sido observado na análise citológica. Os grãos de pólen multinucleados ocorreram praticamente em todo o período de cultivo in vitro, em ambas análises; não ocorrendo nos controles da citologia (antes do cultivo); os multinucleados foram observados a partir do 3o dia, enquanto que os multicelulares a partir do 4o dia de cultivo. As estruturas multicelulares foram observadas a partir do 8o dia. A quantidade e o tamanho das estruturas multicelulares foram variáveis ao longo da análise histológica, sendo que do 14o ao 20o dia foram encontradas as de maiores dimensões, resultantes da proliferação celular por mitoses sucessivas. A partir do 22o dia (cultivar MN- 599), a ocorrência de estruturas multicelulares no interior dos lóculos da antera diminuiu, predominando o processo de proliferação externo às anteras. Para as linhagens, a partir do 18o dia foram observadas estruturas multicelulares liberadas das anteras. A análise das estruturas multicelulares permitiu classificá-las em quatro categorias: 1. SFD: Sem forma definida; 2. MAC: meristema apical caulinar; 3. MAR: meristema apical radical embrionário adventício; e 4. Embriões. As estruturas amorfas apareceram em maior número, quando comparadas com as outras categorias. Em síntese: as linhagens selecionadas e a cultivar diferiram não apenas no tempo necessário para a formação dos embriões, mas também no desenvolvimento dos mesmos, que foi mais diferenciado na cultivar MN-599, porém sendo observados mais cedo na linhagem S3A22 e S3A23, do que na cultivar MN-599.

Redução do número de espermatozóides por fêmea suína inseminada por ano.

Na inseminação artificial de suínos, são utilizados de 9 a 12 bilhões de espermatozóides por fêmea inseminada. A utilização de menor número de espermatozóides, sem interferir na performance reprodutiva das fêmeas, poderia otimizar o uso dos machos e reduzir os custos de inseminação. Esta tese foi dividida em três experimentos para avaliar o efeito da redução do número de espermatozóides por fêmea inseminada com a técnica tradicional ou intra-uterina. No experimento 1 foram utilizadas 218 leitoas Camborough 22 inseminadas em três intervalos antes da ovulação (0-12, 13-23 e 24-30 h), com doses inseminantes contendo 1,5 bilhão de espermatozóides e armazenadas por 0-48 h ou 96-120 h. As leitoas receberam uma única inseminação. As fêmeas foram abatidas aos 30,83,7 dias de gestação e o trato genital foi removido para contagem do número de corpos lúteos e embriões totais. A taxa de prenhez foi influenciada pelo intervalo inseminação-ovulação quando o sêmen foi armazenado por 96-120 h (P<0,05). Da mesma forma, a interação tempo de armazenamento do sêmen e o intervalo inseminação-ovulação afetou (P<0,05) o número de embriões totais e a sobrevivência embrionária. Quando o período de armazenamento do sêmen foi de 120 h e o intervalo inseminação-ovulação de 24-30 h, foi observada redução no número de embriões totais e na sobrevivência embrionária. No experimento 2 foi avaliado o efeito do intervalo inseminação-ovulação e do número de espermatozóides na dose inseminante em fêmeas submetidas à inseminação intra-uterina. Foram utilizadas 66 matrizes pluríparas da linhagem Camborough 22. As fêmeas foram distribuídas em quatro tratamentos (doses de 1 ou 2 bilhões de espermatozóides diluídos em 60 ml e intervalo inseminação-ovulação de 0-24 e 25-36 h). As fêmeas receberam uma única inseminação intra-uterina. No momento da inseminação, não foi observado refluxo de sêmen. A passagem do cateter pela cérvix foi possível em todas as fêmeas. Foi observada presença de sangue em 1,7% das fêmeas. Aos 314,3 dias de gestação, as fêmeas foram abatidas e o trato genital foi removido para a contagem dos corpos lúteos e número de embriões totais. A taxa de prenhez e a sobrevivência embrionária não foram afetadas pelo número de espermatozóides ou pelo intervalo inseminação-ovulação. O número de embriões totais não foi influenciado pelo número de espermatozóides, mas foi reduzido para o intervalo inseminação-ovulação de 25-36 h comparado a 0-24 h (P<0,05). No experimento 3 foram utilizadas 298 fêmeas Camborough 22 com o objetivo de comparar o desempenho reprodutivo de fêmeas submetidas à inseminação intra-uterina e a tradicional. As fêmeas foram distribuídas em dois tratamentos: T1 – inseminação intra-uterina com doses inseminantes contendo 0,5 bilhão de espermatozóides em um volume total de 20 ml; T2 - inseminação tradicional com doses inseminantes contendo 3,0 bilhões de espermatozóides em um volume total de 90 ml. As fêmeas receberam múltiplas inseminações. Foi possível a realização da inseminação intra-uterina em 98,1% das fêmeas. A presença de sangue, na extremidade do cateter ou espiral da pipeta de inseminação intra-uterina, foi observada em 8,4 % das fêmeas. As taxas de prenhez e de parto ajustada não diferiram entre os tratamentos. No entanto, o tamanho da leitegada foi menor (P<0,05) na IAU quando comparado à tradicional. Na inseminação artificial tradicional, em leitoas, é possível utilizar 1,5 bilhão de espermatozóides sem que as taxas de prenhez, número de embriões totais e sobrevivência embrionária sejam comprometidas. Para a inseminação intra-uterina, a utilização de 1 bilhão de espermatozóides não compromete o desempenho reprodutivo.

Influência da taxa de crescimento e estroda cobertura no desempenho reprodutivo da leitoa.

A inseminação artificial da leitoa é recomendada levando em consideração a idade, o peso, a espessura de toucinho e o ciclo estral no qual se encontra a fêmea. Entretanto, apesar dessas variáveis estarem correlacionadas, nem sempre todos esse índices são obtidos. A leitoa representa alto impacto nos dias-não-produtivos do plantel e é fundamental que seja inseminada no momento correto pois a longevidade e o desempenho reprodutivo da fêmea suína estão diretamente relacionados com o momento dessa inseminação. Esta tese foi dividida em três trabalhos, objetivando avaliar os efeito da idade, do peso, do estro da cobertura e da taxa de crescimento no desempenho reprodutivo da leitoa. O primeiro experimento foi realizado com o objetivo de determinar se leitoas que apresentam maiores taxas de crescimento e apresentam o peso mínimo recomendado para cobertura em uma idade mais precoce podem ser inseminadas sem apresentarem prejuízos reprodutivos ou uma maior taxa de descarte até o 3º parto. Foram formados 3 grupos, conforme o peso e a idade na inseminação. O grupo 1 foi composto pelas fêmeas que apresentaram alta taxa de crescimento (700 g/dia) inseminadas com idade inferior a 210 dias. O grupo 2 foi formado também por leitoas que apresentaram alta taxa de crescimento (700 g) porém que foram inseminadas com idade igual ou superior a 210 dias. O grupo 3 foi formado por fêmeas inseminadas com idade igual ou superior a 210 dias mas que apresentaram baixa taxa de crescimento (< 700 g/dia). Houve um maior número de nascidos totais no primeiro parto para as fêmeas do grupo 2. Entretanto, analisando os 3 primeiros partos, não houve diferença no número médio de leitões produzidos (11,6 x 12,3 x 11,7), na taxa de parto (87,1% x 88,7% x 89,8%) e na taxa de descarte (30,0% x 25,3% x 28,3%) entre as fêmeas dos grupos 1, 2 e 3, respectivamente (p>0.05). O segundo experimento foi desenvolvido com o objetivo de avaliar se existia diferença na idade à puberdade, na taxa de ovulação e na sobrevivência embrionária de leitoas que apresentaram diferenças nas taxas de crescimento. Foram selecionadas 120 leitoas, aos 144 dias de idade, sendo formados 2 grupos, de acordo com a taxa de crescimento na seleção. O grupo 1 foi formado por 60 leitoas que apresentaram taxa de crescimento média de 576 g/d e o grupo 2 por 60 fêmeas que apresentaram taxa de crescimento média de 722 g/d na seleção. As fêmeas foram agrupadas em baias e estimuladas ao desencadeamento da puberdade com o auxílio de machos adultos. As leitoas foram inseminadas a partir de 50 dias após o início do manejo e foram abatidas 30 dias após, para análise das ovulações e do número de embriões. As fêmeas com maiores taxas de crescimento apresentaram puberdade mais precoce (156 x 163 dias; p<0.01) e menor porcentagem de anestro aos 190 dias de idade (3,5% x 20,7%; p<0.01). O terceiro experimento teve por objetivo avaliar a influência do estro da inseminação sobre o desempenho reprodutivo no primeiro parto de leitoas que não apresentaram mesmo peso e idade na inseminação. Foram formados 4 grupos, conforme os estros da inseminação, sendo que as leitoas inseminadas no 1º estro apresentaram menor número de nascidos e menor taxa de parto que as leitoas inseminadas no 3º e 4º estros. Não houve diferença nas taxas de parto e no número de leitões nascidos entre as fêmeas inseminadas no 2º, 3º e 4º estro. Conforme os resultados obtidos nos 3 experimentos, é possível concluir que leitoas podem ser inseminadas a partir do 2º estro e aquelas que apresentam maiores taxas de crescimento têm puberdade mais precoce, menor porcentagem de anestro e podem ser inseminadas mais precocemente, sem prejuízos produtivos até o terceiro parto.

Efeito da sacarose e da forma de arraçoamento sobre alguns parâmetros reprodutivos da leitoa.

O trabalho foi realizado, no período de outubro a dezembro de 1996. Foram utilizadas 80 fêmeas híbridas F1, oriundas de cruzamentos de Landrace e Large White distribuídas aleatoriamente em quatro tratamentos: T1 – fornecimento de ração sem glicose e de forma restrita, 2 kg ao dia (duas vezes ao dia); T2 – fornecimento de ração sem glicose e à vontade; T3 – fornecimento de ração com 20% de glicose e de forma restrita, 2 kg ao dia (duas vezes ao dia), e, T4 – fornecimento de ração com 20% de sacarose, à vontade. Como fonte de glicose foi utilizado o açúcar cristal. A ração continha 3.150 kcal/Kg de E.D., 14%, de proteína bruta, 0,65 de lisina, 0,9% de cálcio e 0,45% de fósforo disponível. Todas as fêmeas foram pesadas individualmente ao alojamento e na apresentação do 10 e do 20 estro. Os tratamentos foram aplicados no momento em que as fêmeas manifestaram o 10 estro e terminaram quando estas apresentaram o 20 estro. As fêmeas foram inseminadas artificialmente (IA) no 20 estro e abatidas 28-34 dias após para a contagem do número de ovulações e número de embriões viáveis. Foram analisados, os dados referentes à taxa de prenhez, a taxa de sobrevivência embrionária e a taxa de retorno ao estro. A taxa de ovulação das fêmeas do T4 foi superior aquelas das fêmeas dos T1 e T3 (respectivamente 17,80; 15,26; 15,60) (p0,01). T4 foram diferentes quanto ao número de embriões viáveis daquelas do T1 (1,94 a mais; p0,03), do T2 (1,27 a mais; p0,05) e do T3 (3,6 a mais; p0,01). Na análise do contraste ração restrita (T1 e T3) vs. ração à vontade (T2 e T4), foi observada um aumento do número de ovulações (15,38 vs 17, 34, respectivamente; p<0,01) e também no número de embriões viáveis (11,52 vs 13,64, respectivamente; p<0,04). As fêmeas que receberam ração com açúcar (T3 e T4) não diferiram (p>0,05) dos que receberam ração sem açúcar (T1 e T2), nas variáveis estudadas. O arraçoamento à vontade, independente da adição de sacarose, foi efetivo no aumento do número médio de ovulações e número médio de embriões viáveis. Apesar do maior número de ovulações, a taxa de sobrevivência embrionária não foi diferente entre os tratamentos. As taxas de prenhez e retorno ao estro também não apresentaram diferenças as fêmeas dos diferentes tratamentos.

Algumas polêmicas envolvendo a utilização de células-tronco embrionárias no Brasil: um desafio à inovação jurisdicional

A finalidade da presente dissertação será o exame de algumas das muitas polêmicas éticas e jurídicas que envolvem a utilização das células-tronco embrionárias humanas para fins de pesquisa e terapia. A utilização de tais células-tronco foi aprovada pela Lei n.º 11.105 de 2005, conhecida como a nova Lei de Biossegurança, cujo artigo 5º permitiu, apenas para fins de pesquisa e terapia, a utilização das citadas células obtidas de embriões humanos provenientes do processo de fertilização in vitro, não utilizados no respectivo procedimento, atendidas certas condições. Assim que entrou em vigor, o citado dispositivo sofreu por parte do Procurador Geral da República a Ação Direta de Inconstitucionalidade (ADI) nº 3510, que gerou amplos debates de âmbito multidisciplinar. Apesar da declaração de constitucionalidade do referido artigo, ainda são muitas as polêmicas de ordem jurídica e ética. Questiona-se, principalmente, as divergências existentes acerca da natureza jurídica do embrião, produzido in vitro e excedente nos processos de fertilização, bem como a adequação do princípio constitucional da Dignidade Humana neste contexto. São demonstradas, ainda, questões pertinentes ao patenteamento de material genético e, consequentemente, das células-tronco embrionárias.

Avaliação da eficiência de co-transformação de soja (Glycine max (L.) Merrill) via bombardeamento de partículas utilizando um gene de seleção e um gene de interesse em plamídeos diferentes

Visando aumentar a resistência a moléstias fúngicas, o presente trabalho teve como objetivo introduzir um gene (chit1) que codifica uma quitinase do fungo Metarhizium anisopliae em cultivares de soja [Glycine max (L.) Merrill]. A co-transformação foi a estratégia escolhida, visando a obtenção de plantas livres de transgenes marcadores na progênie das plantas transformadas. A co-transformação foi realizada via biolística, tendo como tecido-alvo conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5. O plasmídeo pGusHyg, que contém o gene repórter gusA e o gene marcador hpt, foi bombardeado concomitantemente com o plasmídeo pMOG463chit1, que porta o gene chit1. Os conjuntos de embriões bombardeados foram transferidos para meio seletivo contendo higromicina, visando a obtenção de material estavelmente transformado. Os conjuntos embriogênicos higromicina-resistentes foram transferidos seqüencialmente para meios de proliferação D-20 (sem higromicina), maturação e regeneração. No total, foram obtidos 387 e 380 embriões histodiferenciados das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5, respectivamente. Plantas transgênicas adultas e férteis foram regeneradas. Para avaliar a eficiência da estratégia de cotransformação, foram realizadas análises moleculares de embriões histodiferenciados e de plantas regeneradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram o cálculo da taxa de co-transformação de 44% para os embriões histodiferenciados da cultivar MG/BR46 Conquista e de 50% para plantas de IAS-5. Não existem, até o momento, relatos de trabalhos em soja utilizando embriões somáticos globulares em proliferação como alvo para estudos de co-transformação.

Ecotoxicological assessment of sediments from the Port of Santos and the disposal sites of dredged material

A dragagem dos sedimentos do Canal de Santos é necessária para permitir o trânsito de navios que operam no Porto de Santos. As áreas de disposição do material dragado estão situadas na zona costeira, em frente à Baía de Santos. Este estudo visou avaliar a qualidade dos sedimentos do Canal de Santos e das áreas de disposição atuais e antigas, utilizando testes de toxicidade de sedimento integral com anfípodos e de toxicidade de elutriatos com embriões de ouriço do mar. As amostras do Canal de Santos foram consideradas as mais tóxicas: todas as amostras dessa área foram consideradas significativamente tóxicas. Além disso, algumas amostras das áreas de disposição exibiram toxicidade. Os resultados mostraram, portanto, que os sedimentos apresentam evidências de degradação em sua qualidade, porém novos estudos devem ser conduzidos visando determinar as relações entre contaminação e toxicidade. Os resultados sugerem ainda que a disposição dos sedimentos dragados deva ser reavaliada.

Acute and chronic toxicity of sediment samples from Guanabara Bay (RJ) during the rainy period

A Baía de Guanabara é um ambiente marinho-estuarino de grande relevância ecológica e sócio-econômica, e sujeita a uma ampla gama de impactos ambientais. O sedimento é o principal destino para a maioria das substâncias introduzidas nos corpos d'água, podendo fornecer uma medida integrada da qualidade ambiental, a qual pode ser avaliada por várias abordagens. Neste projeto, a qualidade de sedimentos da Baía de Guanabara foi por uma abordagem ecotoxicológica, por meio de testes de toxicidade aguda de sedimento integral, utilizando Tiburonella viscana, e testes de toxicidade crônica de água intersticial, elutriato e interface sedimento-água, utilizando embriões de Lytechinus variegatus. Os sedimentos foram coletados em 14 estações de amostragem. Nos testes crônicos houve efeitos significativos na maioria das amostras, enquanto os sedimentos coletados nas estações 1, 2, 3, 6, 8, 10, 11, 12 e 15 apresentaram também toxicidade aguda. Houve grande concordância entre os resultados dos diferentes testes, e sua integração mostrou que os sedimentos analisados encontram-se inadequados à vida aquática, indicando degradação ambiental na baía da Guanabara. Nesse contexto, o controle das fontes poluidoras e o gerenciamento dos múltiplos usos da baía devem ser implementados, no sentido da melhora da qualidade ambiental.

Calli induction in leaf explants of coffee elite genotypes

Visando a alcançar alta eficiência na indução de calos a partir de explantes foliares de plantas matrizes de C. arabica com alta heterozigose, por meio da embriogênese somática indireta, foram instalados três experimentos. O primeiro experimento foi conduzido em esquema fatorial 2x5, constituído de dois meios de cultura (BOXTEL & BERTHOULY, 1996 e TEIXEIRA et al., 2004) e cinco genótipos de C. arabica. No segundo experimento, foi avaliado o potencial de produção de calos embriogênicos em 10 genótipos, sendo cada genótipo considerado como um tratamento e, no terceiro experimento, foram avaliadas as variações nas concentrações de 2.4-D (2,5 e 20µM) e 2-iP (2,5 e 20µM) nos meios primário e secundário de TEIXEIRA et al. (2004). As culturas foram mantidas a 25oC, sob obscuridade. Para os genótipos 2.2 e 7.2, verificou-se a superioridade do meio de cultura Teixeira et al. (2004) em relação ao meio BOXTEL & BERTHOULY (1996). No genótipo 4.2, observou-se o comportamento inverso, ou seja, a superioridade do meio BOXTEL & BERTHOULY (1996). Os genótipos 3.0 e 5.0 apresentaram o mesmo comportamento em ambos os meios de cultura estudados, evidenciando que a produção de embriões somáticos é fortemente dependente do genótipo. A indução de calos depende da relação de 2-iP e 2.4-D. A combinação de 20.0µM of 2.4-D e 20.0µM of 2-iP promoveu a maior porcentagem de indução de calos embriogênicos.

Cytogenetic analysis of the neotropical spider Nephilengys cruentata (Araneomorphae, tetragnathidae): standard staining, NORs, C-bands and base-specific fluorochromes

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Viabilidade de sementes de acerola (Malpighia emarginata DC): avaliação da vitalidade dos tecidos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Indução de embriogênese somática em cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum.)

Folhas jovens de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum.) foram empregadas para indução de embriogênese somática, as quais foram cultivadas inicialmente em meio MS suplementado com 6,0 mg/L BAP e 0,5 mg/L AIA (meio de estabelecimento), seguindo-se o cultivo em meio MS suplementado com 2,20 mg/L TDZ (meio de indução). A região da nervura mostrou intumescimento três dias após inoculação no meio de estabelecimento, o qual foi seguido pela formação de cachos de calos. As massas calosas foram transferidas para o meio de indução, e as estruturas com características pró-embriogênicas puderam ser observadas após uma semana. Estudos de microscopia eletrônica de varredura revelaram estruturas com características de embriões somáticos no meio com TDZ.

Induction of somatic embryogenesis in soybean: physicochemical factors influencing the development of somatic embryos

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)