Analyse du mécanisme de la dégradation du récepteur CD4 par la protéine Vpu du virus de l'immunodéficience humaine-1 (VIH-1)

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4.

Charge virale intégrée du papillomavirus de type 16 dans la maladie anale préinvasive

L’histoire naturelle de l’infection anale par le virus du papillome de type 16 (VPH-16) est mal définie pour les hommes ayant des relations sexuelles avec d’autres hommes (HARSAHs) VIH-séropositifs. Le but de cette étude était d’évaluer l’association entre la charge épisomale et intégrée du VPH-16 et la progression de la néoplasie intraépithéliale anale (AIN). Les charges épisomales et intégrées du VPH-16 furent mesurées par PCR quantitatif en temps réel sur 665 spécimens anaux obtenus de 135 hommes VPH-16-positifs participant à l’étude prospective HIPVIRG (Human Immunodeficiency and Papilloma VIrus Research Group). Le grade de l’AIN fut déterminé sur des biopsies obtenues lors des anuscopies à haute résolution périodiques. L’intégration du VPH-16 fut confirmée par DIPS-PCR pour démontrer la présence de jonctions virales-cellulaires. La charge épisomale du VPH-16 [ratio de cote (OR) 1.5, intervalle de confiance (IC) à 95%=1.1–2.1], le nombre de types de VPH [OR 1.4 (IC 95%=1.1–1.8)] et le tabagisme actuel [OR 4.8 (IC 95%=1.3–18.6)], mais non la charge intégrée, furent associés aux lésions de haut-grade (AIN-2,3) après ajustement pour l’âge et le décompte des lymphocytes CD4. La charge épisomale du VPH-16 était le seul facteur prédictif de progression de l’AIN de bas-grade (AIN-1) vers l’AIN-2,3 [OR 8.0 (IC 95%=1.2–55.4)]. Les spécimens avec une charge épisomale du VPH-16 élevée étaient moins susceptibles de contenir de l’intégration [OR 0.5 (IC 95%=0.3–0.8)]. L’intégration du VPH-16 fut détectée en absence d’AIN, dans l’AIN-1 et dans l’AIN-2,3. L’analyse des jonctions virales-cellulaires ne permit pas d’identifier un site d’intégration spécifique.

Exploration fonctionnelle des réponses cellulaires T CD4+ et CD8+ dans l’infection par le VIH-1

L’infection par le VIH-1 est caractérisée par une déplétion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en l’absence de traitements anti-rétroviraux, conduit inéluctablement à la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mécanismes impliqués dans ce dysfonctionnement de la réponse cellulaire T ont été élucidés et ont révélé un rôle important de la molécule PD-1 dans l’exhaustion des cellules T en phase chronique de l’infection. En effet, des niveaux élevés de PD-1 ont été associés à une charge virale élevée ainsi qu’à une diminution de la production de cytokines et de la capacité de proliférer des cellules T spécifiques du virus. De plus, bloquer in vitro l’interaction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rétabli la fonction de ces cellules. De façon intéressante, notre groupe ainsi que d’autres équipes, ont montré que l’expression de PD-1 était non seulement augmentée sur les cellules spécifiques de l’antigène mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant à l’impact de l’expression de PD-1 sur le renouvellement et la différenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de l’infection. L’expression de PD-1 n’a notamment pas été étudiée en phase aigue de l’infection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue qu’en phase chronique de l’infection, l’expression de PD-1 est augmentée sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naïves. Nous avons également mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phénotype plus différencié, et ce à tous les stades de la maladie. Dans cette thèse, nous discutons le rôle possible de PD-1 dans l’homéostasie des cellules T chez les individus infectés par le VIH-1. En étudiant la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection, nous avons trouvé que les sous-populations T CD8+ des individus récemment infectés exprimaient moins de PD-1 que celles des individus à un stade plus avancé de la maladie. Ces niveaux plus élevés de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associés à des niveaux réduits de prolifération in vivo – comme mesuré par l’expression de Ki67 – suggérant que l’expression de PD-1 est partiellement impliquée dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naïves s’accumulent en fréquence lors de la transition de la phase aigue à la phase chronique de l’infection. Considérant que les cellules naïves expriment déjà des hauts niveaux de PD-1, nous avons émis l’hypothèse que l’activation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infectés est affectée. En résumé, nous proposons un modèle où des hauts niveaux d’expression de PD-1 sont associés à (1) un dysfonctionnement de la réponse cellulaire T CD8+ et (2) un défaut d’activation des cellules naïves ce qui contribue non seulement à la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter l’efficacité de potentiels vaccins dans l’infection par le VIH-1 en empêchant toute nouvelle réponse d’être initiée. Afin de mieux disséquer la réponse immunitaire mise en place lors d’une infection comme celle du VIH-1, nous avons développé un outil qui permet de détecter les cellules T CD4+ i.e. des tétramères de CMH de classe II. Ces réactifs ont pour but d’augmenter l’avidité du CMH de classe II pour son ligand et donc de détecter des TCR de faible affinité. Dans cette thèse, nous décrivons une méthode originale et efficace pour produire diverses molécules de HLA-DR liant de façon covalente le peptide antigénique. Mieux déterminer les mécanismes responsables de l’exhaustion des cellules T dans l’infection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que développer des outils de pointe pour suivre ces réponses T, est central à une meilleure compréhension de l’interaction entre le virus et le système immunitaire de l’hôte, et permettra ainsi le développement de stratégies pertinentes pour lutter contre l’infection par le VIH-1.

Modulation des réactions alloimmunitaires par les cytokines maîtresses IFN-γ et TGF-β

L’injection de cellules immunologiquement compétentes à un hôte histo-incompatible amène une réaction qui peut se traduire par la maladie du greffon-contre-l’hôte (GVHD). La GVHD demeure une barrière importante à une utilisation plus répandue de la greffe allogénique de cellules hématopoïétiques (AHCT), pourtant un traitement efficace pour traiter de nombreuses maladies. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent cette pathologie pourrait en faciliter le traitement et la prévention. L’Interféron-gamma (IFN-γ) et le Transforming Growth Factor-béta (TGF-β) sont deux cytokines maîtresses de l’immunité impliquées dans la fonction et l’homéostasie des cellules greffées. Nous démontrons chez la souris que l’IFN-γ limite la reconstitution lympho-hématopoïétique de façon dose-dépendante en mobilisant des mécanismes d’apoptose et en inhibant la prolifération cellulaire. Le TGF-β est quant à lui généralement connu comme un immunosuppresseur qui contrôle l’immunité en utilisant plusieurs voies de signalisation. Le rôle relatif de ces voies en AHCT est inconnu. Nous avons étudié une de ces voies en greffant des cellules provenant de donneurs déficients pour le gène SMAD3 (SMAD3-KO), un médiateur central de la voie canonique du TGF-β, à des souris histo-incompatibles. Bien que l’absence de SMAD3 ne cause aucune maladie chez nos souris donneuses, l’injection de cellules SMAD3-KO amène une GVHD du colon sévère chez le receveur. Cette atteinte est caractérisée par une différenciation Th1 et une infiltration massive de granulocytes témoignant d’un rôle central de SMAD3 dans la physiologie des lymphocytes T CD4 et des cellules myéloïdes. Nous avons focalisé ensuite nos efforts sur le rôle de SMAD3 chez les lymphocytes T CD4 en sachant que SMAD3 était actif chez les lymphocytes T CD4 tolérants. Nous avons découvert que SMAD3 était rapidement inactivé après une activation des cellules T, suggérant que l’inactivation de SMAD3 était fonctionnellement importante pour briser l’état de tolérance. Des études de micro-puces d’ADNc nous ont montré que SMAD3 contrôlait en effet l’expression de nombreux transcrits de gènes connus comme étant reliés à la tolérance et/ou à des processus biologiques dont les rôles dans le maintien de la tolérance sont plausibles.

Études sur la dérégulation des cytokines et des cellules Natural Killer chez les patients infectés par le VIH-1

La prolifération, la différenciation ainsi que les fonctions des cellules du système immunitaire sont contrôlées en partie par les cytokines. Lors de l’infection par le VIH-1, les défauts observés dans les fonctions, la maintenance, ainsi que la consistance des cellules du système immunitaire sont en large partie attribués à une production altérée des cytokines et à un manque d’efficacité au niveau de leurs effets biologiques. Durant ces études, nous nous sommes intéréssés à la régulation et aux fonctions de deux cytokines qui sont l’IL-18 et l’IL-21. Nous avons observé une corrélation inversée significative entre les concentrations sériques d’IL-18 et le nombre des cellules NK chez les patients infectés par le VIH-1. Nos expériences in vitro ont démontré que cette cytokine induit l’apoptose des cellules NK primaires et que cette mort peut être inhibée par des anticorps neutralisants spécifiques pour FasL et TNF-α. Cette mort cellulaire est due à l’expression de FasL sur les cellules NK et à la production de TNF-α par ces cellules. L’IL-18 augmente aussi la susceptibilité à la mort des cellules NK par un stimulus pro-apoptotique, en diminuant l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-XL. Nous démontrons aussi que, contrairement à l’IL-18, les niveaux d’IL-18BP sont plus faibles dans les sérum de patients infectés. Ceci résulte sur une production non coordonnée de ces deux facteurs, aboutissant à des niveaux élevés d’IL-18 libre et biologiquement active chez les patients infectés. L’infection de macrophages in vitro induit la production d’IL-18 et réduit celle d’IL-18BP. De plus, l’IL-10 et le TGF-β, dont les concentrations sont élevées chez les patients infectés, réduisent la production d’IL-18BP par les macrophages in vitro. Finalement, nous démontrons que l’IL-18 augmente la réplication du VIH-1 dans les lymphocytes T CD4+ infectés. Les niveaux élevés d’IL-18 libres et biologiquement actives chez les patients infectés contribuent donc à l’immuno-pathogénèse induite par le VIH-1 en perturbant l’homéostasie des cellules NK ainsi qu’en augmentant la réplication du virus chez les patients. Ces études suggèrent donc la neutralisation des effets néfastes de l’IL-18 en utilisant son inhibiteur naturel soit de l’IL-18BP exogène. Ceci permettrait de moduler l’activité de l’IL-18 in vivo à des niveaux souhaitables. L’IL-21 joue un rôle clef dans le contrôle des infections virales chroniques. Lors de ces études, nous avons déterminé la dynamique de la production d’IL-21 lors de l’infection par le VIH-1 et sa conséquence sur la survie des cellules T CD4+ et la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1. Nous avons démontré que sa production est compromise tôt au cours de l’infection et que les concentrations d’IL-21 corrèlent avec le compte de cellules T CD4+ chez les personnes infectées. Nos études ont démontré que le traitement antirétroviral restaure partiellement la production d’IL-21. De plus, l’infection par le VIH-1 de cellules T CD4+ humaines inhibe sa production en réduisant l’expression du facteur de transcription c-Maf. Nous avons aussi démontré que la fréquence des cellules T CD4+ spécifiques au VIH-1 qui produisent de l’IL-21 est réduite chez les patients virémiques. Selon nos résultats, l’IL-21 empêche l’apoptose spontanée des cellules T CD4+ de patients infectés et l’absence d’IL-21 réduit la fréquence des cellules T CD8+ spécifiques au VIH-1 chez ces patients. Nos résultats démontrent que l'IL-21R est exprimé de façon égale sur tous les sous-types de cellules NK chez les donneurs sains et chez les patients infectés. L’IL-21 active les protéines STAT-3, MAPK et Akt afin d'augmenter les fonctions effectrices des cellules NK. L'activation de STAT-3 joue un rôle clef dans ces fonctions avec ou sans un traitement avec de l'IL-21. L'IL-21 augmente l'expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Bcl-XL, augmente la viabilité des cellules NK, mais ne possède aucun effet sur leur prolifération. Nous démontrons de plus que l'IL-21 augmente l'ADCC, les fonctions sécrétrices et cytotoxiques ainsi que la viabilité des cellules NK provenant de patients chroniquement infectés par le VIH-1. De plus, cette cytokine semble présenter ces effets sans augmenter en contrepartie la réplication du VIH-1. Elle permet donc d'inhiber la réplication virale lors de co-cultures autologues de cellules NK avec des cellules T CD4+ infectées d'une manière dépendante à l'expression de perforine et à l'utilisation de la protéine LFA-1. Les niveaux d’IL-21 pourraient donc servir de marqueurs biologiques pour accompagner les informations sur le taux de cellules T CD4+ circulantes en nous donnant des informations sur l’état de fonctionnalité de ce compartiment cellulaire. De plus, ces résultats suggèrent l’utilisation de cette cytokine en tant qu’agent immunothérapeutique pour restaurer les niveaux normaux d’IL-21 et augmenter la réponse antivirale chez les patients infectés par le VIH-1.

Pathogenèse de l’hépatite autoimmune : influence des gènes, du sexe, de l’âge et de l’environnement

L’hépatite autoimmune (HAI) résulte d’une perte de tolérance du système immunitaire envers des antigènes de l’hépatocyte. Elle peut se présenter sous forme d’hépatite aiguë, parfois fulminante, ou comme une maladie chronique menant progressivement à une cirrhose hépatique. En absence de traitement, cette maladie est fatale. La pathogenèse de l’HAI et les mécanismes responsables de sa progression restent inconnus à ce jour. L’objectif global de ce projet est d’examiner les facteurs prédisposants et les mécanismes immunologiques responsables de l’apparition et de la progression de l’HAI. Pour permettre l’étude de la pathogenèse de l’HAI, nous avons développé un modèle murin expérimental d’hépatite autoimmune de type 2. Celui-ci est basé sur la xénoimmunisation de souris C57BL/6 avec les deux antigènes ciblés dans l’HAI de type 2 chez l’homme (CYP2D6 et FTCD). Par mimétisme moléculaire, le système immunitaire de ces souris réagit contre les protéines murines homologues et une HAI s’ensuit. Ce modèle expérimental présente la plupart des caractéristiques histologiques, biochimiques et sérologiques d’une HAI de type 2. Les souris développent une inflammation autoimmune chronique avec présence d’hépatite d’interface et d’infiltrations intralobulaires, un infiltrat composé majoritairement de lymphocytes T CD4+ mais aussi de lymphocytes T CD8+ et B, d’une élévation des ALT sériques, des niveaux d’immunoglobulines G circulantes augmentés ainsi que d’autoanticorps anti-LKM1 et anti-LC1. L’étude de l’influence du bagage génétique a permis de définir l’importance relative des gènes du CMH et des gènes non-CMH sur le développement d’une HAI. Les gènes du locus CMH sont essentiels mais insuffisants pour mener au développement d’une HAI et donc, la susceptibilité génétique à l’HAI est comme chez l’homme, multigénique. Les patients atteints d’HAI de type 2 sont généralement des jeunes filles. L’étude des influences de l’âge et du sexe dans ce modèle a permis de montrer que les souris femelles avant et au début de leur maturité sexuelle sont plus susceptibles au développement d’une HAI de type 2. De plus, les femelles ont un nombre réduit de lymphocytes T régulateurs, ce qui leur confère une susceptibilité accrue comparé aux mâles. L’ensemble de ces travaux nous a conduits à proposer un mécanisme où le développement d’une HAI chez les femelles d’un âge particulier résulterait de l’activation de cellules T CD4+ autoréactives ayant échappé aux mécanismes de tolérance centrale, via un mécanisme de mimétisme moléculaire avec un antigène exogène. En présence d’une tolérance périphérique réduite due à un faible nombre de cellules T régulatrices, les cellules T autoréactives proliféreraient et activeraient des cellules B autoréactives entraînant la sécrétion d’autoanticorps. L’activation subséquente de cellules T CD8+ cytotoxiques spécifiques amènerait la lyse des hépatocytes et la relâche d’autoantigènes permettant la perpétuation de l’autoimmunité.

Contrôle de la réponse immunitaire par l’indoleamine 2,3-dioxygénase : étude de la régulation d’une molécule immuno-suppressive dans les cellules cancéreuses et les lymphocytes B chez l’humain

Le système immunitaire se doit d’être étroitement régulé afin d’éviter que des réponses immunologiques inappropriées ou de trop forte intensité ne surviennent. Ainsi, différents mécanismes permettent de maintenir une tolérance périphérique, mais aussi d’atténuer la réponse lorsque celle-ci n’est plus nécessaire. De tels mécanismes sont cependant aussi exploités par les tumeurs, qui peuvent ainsi échapper à une attaque par le système immunitaire et donc poursuivre leur progression. Ces mécanismes immunosuppresseurs nuisent non seulement à la réponse naturelle contre les cellules tumorales, mais font aussi obstacle aux tentatives de manipulation clinique de l’immunité visant à générer une réponse anti-tumorale par l’immunothérapie. L’un des mécanismes par lesquels les tumeurs s’évadent du système immunitaire est l’expression d’enzymes responsables du métabolisme des acides aminés dont l’une des principales est l’indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO). Cette dernière dégrade le tryptophane et diminue ainsi sa disponibilité dans le microenvironnement tumoral, ce qui engendre des effets négatifs sur la prolifération, les fonctions et la survie des lymphocytes T qui y sont présents. Bien que la régulation de l’expression de cette enzyme ait été largement étudiée chez certaines cellules présentatrices d’antigènes, dont les macrophages et les cellules dendritiques, peu est encore connu sur sa régulation dans les cellules tumorales humaines. Nous avons posé l’hypothèse que différents facteurs produits par les cellules immunitaires infiltrant les tumeurs (TIIC) régulent l’expression de l’IDO dans les cellules tumorales. Nous avons effectivement démontré qu’une expression de l’IDO est induite chez les cellules tumorales humaines, suite à une interaction avec des TIIC. Cette induction indépendante du contact cellulaire résulte principalement de l’interféron-gamma (IFN-g) produit par les lymphocytes T activés, mais est régulée à la baisse par l’interleukine (IL)-13. De plus, la fludarabine utilisée comme agent chimiothérapeutique inhibe l’induction de l’IDO chez les cellules tumorales en réponse aux lymphocytes T activés. Cette observation pourrait avoir des conséquences importantes en clinique sachant qu’une forte proportion d’échantillons cliniques provenant de tumeurs humaines exprime l’IDO. Enfin, les lymphocytes B, qui sont retrouvés également dans certaines tumeurs et qui interagissent étroitement avec les lymphocytes T, sont aussi susceptibles à une induction transcriptionnelle et traductionnelle de l’IDO. Cette enzyme est cependant produite sous une forme inactive dans les lymphocytes B, ce qui rend peu probable l’utilisation de l’IDO par les lymphocytes B comme mécanisme pour freiner la réponse immunitaire. Nos travaux apportent des informations importantes quant à la régulation de l’expression de la molécule immunosuppressive IDO dans les cellules cancéreuses. Ils démontrent que l’expression de l’IDO est influencée par la nature des cytokines présentes dans le microenvironnement tumoral. De plus son expression est inhibée par la fludarabine, un agent utilisé pour le traitement de certains cancers. Ces données devraient être prises en considération dans la planification de futurs essais immunothérapeutiques, et pourraient avoir un impact sur les réponses cliniques anti-tumorales.

Association entre les dérégulations des cellules dendritiques et les altérations des lymphocytes B présentes chez les patients infectés par le VIH

La dérégulation du compartiment B est une conséquence importante de l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), qui peut mener à des manifestations autoimmunes et ultimement à des lymphomes B. Parmi les premières anomalies détectées, on dénote l’activation polyclonale, reflétée par la présence d’hyperglobulinémie (hyper-Ig) et des titres élevés d’autoanticorps chez les patients. On observe également une altération des dynamiques des populations, notamment une expansion de la population des cellules matures activées. De plus, les patients évoluent vers l’incapacité de générer une réponse humorale efficace, et sont sujets à une perte de la mémoire immunologique en phase chronique, caractérisée par une diminution de la population des cellules mémoires et par l’épuisement cellulaire. Toutefois, on connaît très peu les mécanismes impliqués dans de telles altérations. Les cellules dendritiques (DC) sont parmi les premières populations cellulaires à rencontrer et à propager le VIH lors d’une infection, et s’en trouvent affectées directement et indirectement, par le virus et ses composantes. On retrouve en effet une diminution des fréquences de DC dans le sang, les muqueuses et les organes lymphoïdes de patients infectés par le VIH, ainsi qu’un blocage au niveau de la maturation cellulaire. Toutefois, un débat perdure quant à l’apparition de ces altérations durant la phase aigüe de l’infection, et à la restauration des fréquences et des fonctions des DC chez les patients sous traitement. Cette controverse est due à la rareté des études longitudinales incluant des suivis qui s’échelonnent de la phase aigüe à la phase chronique de l’infection. Les DC jouent un rôle important dans le développement, la survie et l’activation des lymphocytes B, de façon T-dépendante et T-indépendante, notamment via des facteurs de croissance tel que BLyS (B lymphocyte stimulator). Par conséquent, nous formulons l’hypothèse que dans le cadre d’une infection VIH, les altérations observées au niveau des cellules B sont modulées par les DC. L’objectif majeur de cette étude est donc d’évaluer l’implication potentielle des DC dans les altérations des cellules B au cours de l’infection par le VIH. Pour ce faire, nous avons d’abord caractérisé de façon longitudinale le statut des populations de DC du sang périphérique de patients infectés au VIH et présentant différents types de progression de la maladie. Cela nous a permis d’évaluer la présence d’une corrélation entre les dynamiques de DC et le type de progression. Par la suite, nous avons évalué la capacité des DC à exprimer BLyS, puis mesuré sa concentration ainsi que celles d’autres facteurs de croissance des cellules B dans le plasma des patients. Enfin, nous avons caractérisé le statut des lymphocytes B, en fonction du stade de l’infection et du taux de progression clinique des patients. Cette étude démontre une diminution de la fréquence des populations de DC myéloïdes (mDC) dans le sang de patients infectés par le VIH sujets à une progression clinique. Cette diminution est observée dès le stade aigu de l’infection et au-delà du traitement antirétroviral (ART). Des concentrations élevées de MCP-1 (monocyte chemotactic protein), MIP (macrophage inflammatory protein) -3α et MIP-3β suggèrent la possibilité d’un drainage vers des sites périphériques. Nous observons également des niveaux supérieurs à la normale de précurseurs CD11c+CD14+CD16- en phase chronique, possiblement liés à une tendence de régénération des DC. Les patients en phase chronique présentent de hautes concentrations plasmatiques de BLyS, reflétée par un haut taux d’expression de cette cytokine par les mDC et leurs précurseurs. Parallèlement, nous observons une expansion des cellules B matures activées ainsi que des taux élevés d’IgG et IgA dans le sang de ces patients. De plus, nous constatons l’expansion d’une population de cellules B qui présente à la fois des caractéristiques de cellules B immatures transitionnelles (TI, transitional immature), et de cellules B recirculantes activées de la zone marginale (MZ, marginal zone), considérées ici comme des «précurseurs/activées de la MZ». Cette étude démontre aussi, chez les progresseurs lents, une meilleure préservation du compartiment des DC du sang périphérique, accompagnée d’une augmentation de précurseurs des DC de phénotype CD11c+CD14+CD16+, ainsi que des concentrations plasmatiques et niveaux d’expression normaux de BLyS. Conséquemment, nous n’avons pas observé d’augmentation des cellules B matures activées et des cellules B précurseurs/activées de la MZ. Toutefois, la fréquence des cellules B matures de la MZ est diminuée, reflétant possiblement leur recrutement vers des sites périphériques et leur contribution à un mécanisme actif de contrôle de la progression de la maladie. L’ensemble de ce travail suggère que dans le cadre d’une infection au VIH, les altérations observées au niveau des DC modulent les anomalies des cellules B. Par conséquent, le maintien de l’équilibre des fonctions DC, notamment les fonctions noninflammatoires, pourrait avoir un impact important dans la prévention de la progression de maladies associées aux altérations du compartiment des cellules B.

Caractérisation de DKK1 comme antigène tumoral et manipulation des lymphocytes T CD8 : utilisation de la voie de Wnt en immunothérapie du cancer

L’immunothérapie tumorale à médiation cellulaire est un traitement qui utilise le système immunitaire des patients afin d’induire une réponse des lymphocytes T CD8+ (T CD8+) contre la tumeur. Cette réponse est produite suite à la reconnaissance des antigènes par les T CD8+. Ces cibles sont appelées antigènes tumoraux (TAA) et définies comme des protéines exprimées par les cellules cancéreuses mais absentes des tissus normaux. Par une approche bio-informatique, notre laboratoire a identifié Dickkopf-1 (DKK1), une protéine inhibitrice de la voie de Wnt, comme un TAA potentiel. Une immunothérapie à médiation cellulaire efficace requiert l’identification de TAA candidats pertinents. Le traitement de patients par immunothérapie pourrait également être améliorées par l’augmentation de la puissance d’action anti-tumorale ainsi que la persistante des T CD8+ spécifiques aux TAA. Ce projet de doctorat se divise en deux parties : 1- La caractérisation de l’expression de DKK1 dans les cancers communs et la détermination de son immunogénicité afin de valider sa candidature comme TAA. 2- La reprogrammation des T CD8+, de patients atteints d’un cancer commun, vers un phénotype moins différentié afin d’augmenter leur potentiel anti-tumoral et leur persistance. Dans le premier objectif, nous avons caractérisé l’expression de DKK1 dans le cancer du sein et dans d’autres cancers communs. Le profil d’expression de DKK1 a été étudié par RT-PCR et par ELISA dans plusieurs lignées cellulaires de cancer et dans les tissus normaux. L’expression de DKK1 a aussi été étudiée dans des échantillons cliniques provenant de cancers du sein, du poumon et du rein. Trente pourcents (30%) des tumeurs provenant d’un cancer du sein exprimaient DKK1. La moitié des tumeurs DKK1(+) était triple négative, donc pas de récepteurs d’œstrogène et de progestérone et était Her-2/neu(-) (ces patientes ont des possibilités de traitements très restreintes). De plus, 50% des échantillons cliniques de tumeurs du poumon et 30% des tumeurs de rein exprimaient DKK1. Les observations effectuées dans le cancer du poumon ont été, par la suite, corroborées par d'autres groupes qui ont montré une corrélation entre l'expression de DKK1 et un mauvais pronostic. Après avoir confirmée l’expression de DKK1 dans les cancers communs, justifiant ainsi sa candidature comme TAA, nous avons évalué l’immunogénicité de DKK1. Pour ce faire, nous avons effectué des stimulations in vitro de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patient(e)s atteint(e)s d’un cancer du sein ou du poumon avec des peptides dérivés de DKK1 pouvant être présentés par les complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) HLA-A*0201. Des clones de T CD8+ reconnaissant un peptide de DKK1 ont été identifiés et isolés. Par essai multiplex et cytométrie de flux intracellulaire, la polyfonctionnalité d’un ces clones T CD8+ spécifiques à DKK1 a été étudiée et a révélée un profil effecteur, renforçant ainsi la candidature de DKK1 comme TAA. Dans l’ensemble, les résultats obtenus dans cette première partie de thèse suggèrent une possible utilisation de DKK1 en immunothérapie contre les cancers communs, attribuable à son expression dans ces cancers et la possibilité de faire proliférer des T CD8+ effecteurs spécifiques à DKK1 à partir de sang de patients. Dans la seconde partie de cette thèse, je décrirai la manipulation in vitro des T CD8+ de patients atteints d’un cancer commun, afin d’augmenter la force et la durée de leurs fonctions anti-tumorales. Il a été démontré que des lymphocytes moins différentiés sont capables d’une réponse immunologique plus efficace et durable. Nous avons basé ce projet sur l’utilisation d’un inhibiteur pharmacologique de la GSK-3, pour activer de la voie de Wnt chez les T CD8+ et ainsi leur conférer un phénotype moins différentié, partageant des caractéristiques de la cellule naïve et de la cellule mémoire. Des cultures de T CD8+, spécifiques à des antigènes viraux, en présence de l’inhibiteur ont permis d’augmenter la sécrétion d’interféron (IFN)- et leur activité cytotoxique. Ces résultats indiquent un effet de l’activation de la voie de Wnt sur la fonction des T CD8+. Ces observations sont rapportées pour la première fois chez les T CD8+ humains et suggèrent une nouvelle stratégie, applicables à l’immunothérapie du cancer, afin de prolonger la persistance des cellules ainsi que leur activité anti-tumorale. En conclusion, ces travaux de recherche ont mené à la réalisation d’une étape très importante dans la validation de la candidature de DKK1 comme TAA pour les cancers communs, soit la démonstration de son expression dans ces cancers et son absence dans les tissus normaux dérivés d’organes importants. Ces travaux ont également mené à la démonstration de l’immunogénicité de DKK1, par l’identification d’un peptide de DKK1 reconnu par les T CD8+. De plus, l’étude de la polyfonctionnalité des T CD8+ spécifiques à DKK1 a révélée un profil effecteur favorable pour l’obtention d’une réponse anti-tumorale efficace. Ces découvertes pourraient servir à l’élaboration d’une stratégie d’immunothérapie à médiation cellulaire pour les cancers communs. Pour sa part, l’étude phénotypique et fonctionnelle de la modulation de la voie de Wnt dans les T CD8+ a donné lieu à l’observation d’un phénotype encore jamais rapporté chez l’humain, conférant aux T CD8+ un aspect moins différentié avec des caractéristiques propre à un phénotype mémoire. Ces résultats sont pertinents dans l’amélioration de l’immunothérapie du cancer, passant par l’augmentation de la persistance des lymphocytes. En résumé, les résultats présentés dans cette thèse de doctorat fournissent des évidences indéniables quant à la validation de DKK1 comme TAA pour une immunothérapie à médiation cellulaire des cancers communs. Ces résultats fournissent également des preuves quant à la pertinence de la reprogrammation des T CD8+ par l’activation de la voie de la voie de Wnt, afin de générer des lymphocytes médiateurs plus efficaces pour ce type de thérapie.

Développement d’immunothérapies spécifiques pour le traitement de l’hépatite autoimmune de type 2 chez un modèle murin

L’hépatite autoimmune (HAI) est une maladie grave affectant le foie et présentant un haut taux de mortalité lorsque non traitée. Les traitements disponibles sont efficaces, mais de graves effets secondaires leur sont associés. Ces effets secondaires sont généralement le résultat d'une forte immunosuppression et d’autres sont spécifiques à chaque médicament. Aucune immunothérapie spécifique n’est présentement disponible pour le traitement de l’HAI. Récemment, un modèle murin d’HAI a été développé dans notre laboratoire par xénoimmunisation des souris C57BL/6 avec les antigènes humains de l'HAI de type 2. Ce modèle présente la plupart des caractéristiques biochimiques et cliniques retrouvées chez les patients atteints d'HAI de type 2. Dans cette étude, nous avons évaluée l’efficacité de deux types de traitement pour l’HAI de type 2 à l’aide de notre modèle murin. Dans un premier temps, l’anticorps anti-CD3ε a été étudié en prophylaxie et en traitement. Nous avons montré qu’une posologie de 5µg d’anti-CD3 i.v. par jour pendant 5 jours consécutifs induit une rémission chez les souris avec HAI de type 2 établie (traitement). Cette rémission est caractérisée par une normalisation des niveaux d’alanine aminotransférase et une diminution significative de l’inflammation hépatique. Cette rémission semble être associée à une déplétion partielle et transitoire des lymphocytes T CD3+ dans la périphérie et une augmentation des lymphocytes T régulateurs CD4+, CD25+ et Foxp3+ dans le foie. La même posologie lorsqu’elle est appliquée en prophylaxie n’a pas réussi à prévenir l’apparition de l’HAI de type 2. La deuxième voie de traitement consiste en l’administration par voie intranasale d’un forte dose de formiminotransférase cyclodésaminase murin (mFTCD), un autoantigène reconnu dans l’HAI de type 2. Une administration en prophylaxie par voie intranasale de 100µg de mFTCD par jour durant 3 jours consécutifs arrive à prévenir l’HAI de type 2 en diminuant l’inflammation hépatique au bout de deux semaines post-traitement.

Évaluation de la fréquence des micronoyaux et du potentiel clastogène et/ou aneugène du benzo-a-pyrène suite à une exposition in vitro des lymphocytes humains

Le benzo-a-pyrène (BaP) est un cancérogène reconnu pour l'homme, contaminant présent dans notre environnement. Il cause des dommages à l'ADN que nous avons mesurés dans les lymphocytes exposés à de faibles concentrations de BaP, provenant de 20 jeunes volontaires non fumeurs et en santé. Suite à l’exposition, la fréquence des micronoyaux (MN) augmente significativement et décrit une courbe dose-réponse non linéaire, suggérant le déclenchement du processus de détoxification et la réparation de l’ADN. Des différences entre les individus et entre les sexes sont présentes dans la réponse génotoxique produite par le BaP. Le test des aberrations chromosomiques montre que le pourcentage de chromosomes cassés augmente significativement dans les cellules exposées au BaP. Combinés avec l'augmentation de la fréquence des MN, nos résultats confirment l'effet clastogène du BaP déjà rapporté dans la littérature. L’hybridation in situ en fluorescence (FISH) des MN avec une sonde pancentromérique est aussi utilisée pour établir leur mécanisme de formation. La FISH révèle que la majorité des MN formés après une exposition au BaP contient un centromère et plus, ce qui est significativement différent de la condition non exposée. Plus précisément, dans nos conditions expérimentales, les MN induits par le BaP contiennent surtout trois centromères et plus, indiquant également la présence d'un effet aneugène. L'effet clastogène du BaP est relié à son rôle d'initiateur dans la cancérogenèse, alors que l'effet aneugène le relierait à l'étape de progression. Ces résultats sont importants puisque l'exposition aux composés de la classe du BaP est de longue durée (cigarette, air pollué).

Étude du rôle des lymphocytes T chez les receveurs pédiatriques de greffe de sang de cordon ombilical

La transplantation de sang de cordon ombilical (TSCO) est utilisée pour traiter les enfants atteints de maladies hématologiques en l’absence de donneurs apparentés compatibles. Elle est associée avec des risques plus élevés d’échec de greffe et d’infections opportunistes dans les premiers mois qui suivent la transplantation en comparaison avec une greffe de moelle osseuse. Par contre, la TSCO comporte un risque plus faible de maladie du greffon contre l’hôte et une incidence comparable de rechute de leucémie. Ces quatre complications impliquent directement les lymphocytes T. Dans le but de mieux comprendre le schéma particulier des évènements qui suivent la TSCO et d’améliorer le pronostic des patients, nous avons étudié le potentiel fonctionnel, la persistance et la reconstitution antivirale des lymphocytes T au sein d’un groupe d’enfants transplantés de sang de cordon ombilical (SCO). Étant donné que le SCO contient une majorité de lymphocytes T naïfs, nous avons étudié les lymphocytes T spécifiques au HLA-A2:Melan-A26-35 A27L; seul répertoire naïf et abondant caractérisé chez l’homme. Nous avons observé que les lymphocytes T du SCO se différencient en populations effectrices, s’oligoclonalisent, produisent de l’IFN-γ et lysent spécifiquement leur cible suite à la stimulation. Néanmoins, ces cellules produisent moins d’IFN-γ et sont moins bifonctionnelles que leurs homologues issus du sang périphérique d’adultes. Chez les patients, les lymphocytes T du SCO s’épuisent après la TSCO : ils s’oligoclonalisent dramatiquement, sont principalement en différenciation terminale, et une importante fréquence exprime PD-1 (« programmed death-1 ») dans les 3 à 6 premiers mois post-greffe. Très peu de patients sont capables de développer des réponses antivirales durant cette période et la fréquence de lymphocytes T qui expriment PD-1 semble aussi avoir un impact sur le risque subséquent de faire une rechute de leucémie. La deuxième vague de lymphocytes T émergeant à 6 mois post-TSCO mène à une population fonctionnelle et diversifiée. En conclusion, la fonctionnalité des lymphocytes T présents dans les 3 à 6 premiers mois post-TSCO doit être rétablie pour améliorer les risques d’infections opportunistes et de rechute de leucémie.

Impact de la maladie du greffon contre l’hôte sur la reconstitution immunitaire suite à une greffe de moelle osseuse allogénique

La transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques est une technique très efficace pour traiter différents cancers du sang. Malheureusement la réaction du greffon contre l’hôte (GVHD) demeure la cause principale de morbidité et de mortalité post-greffe. La GVHD entraîne une diminution de la reconstitution immunitaire ce qui accentue considérablement l’immunosuppression associée à ce traitement et de ce fait augmente les risques d’infection et de rechute. Notre laboratoire a démontré précédemment que les niveaux élevés d’IL-7 dans des hôtes lymphopéniques interféraient avec la capacité des cellules dendritiques (DC) à soutenir la prolifération homéostatique (PH) des lymphocytes T CD4+. Puisque les niveaux d’IL-7 sont aussi élevés dans un contexte de GVHD, nous avons émis l’hypothèse que la signalisation de l’IL-7 sur les DC pouvait contribuer à diminuer la reconstitution immunitaire des lymphocytes T CD4+. Pour répondre à cette question, nous avons utilisé le modèle murin de GVHD C57BL/6 (B6) dans B6D2F1. Afin de régénérer une niche hématopoïétique permissive à la PH des lymphocytes T CD4+, nous avons transplanté des souris B6D2F1 avec de la moelle osseuse de souris B6 IL-7Rα-/-. La GVHD a été induite en transférant des lymphocytes T B6 réactifs aux cellules B6D2F1. Dans les souris contrôles, la PH des lymphocytes T CD4+ est maintenue. Par contre, la PH est absente dans les souris en GVHD malgré la présence d’une niche périphérique qui ne répond pas à l’IL-7. L’absence de PH des lymphocytes T CD4+ durant la GVHD est associée à une diminution du nombre de DC. En utilisant un test de cytotoxicité in vivo nous démontrons que les DC B6 générées dans une hôte B6D2F1 sont éliminées par les lymphocytes T B6 alloréactifs. En conclusion, nos résultats démontrent que l’immunosuppression associée à la GVHD est en partie causée par une élimination des DC par les lymphocytes T allogéniques. Nous postulons donc que la perte des DC, et non la signalisation de l’IL-7 sur les DC, est le facteur limitant la PH des lymphocytes T CD4+ durant la GVHD.

Rôle différentiel des cellules épithéliales intestinales et pulmonaires dans le recrutement des cellules Th17 vers les sites de réplication du virus de l'immunodéficience humaine de type 1

L’infection à VIH-1 est associée à une forte déplétion des lymphocytes T CD4+ à polarisation Th17 au niveau des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses intestinales (GALT, gut-associated lymphoid tissues). Ceci conduit à la translocation microbienne, qui est une cause d’activation immunitaire chronique et de progression de la maladie. Les cellules épithéliales (CE) jouent un rôle critique dans le maintien de l’intégrité et de l’homéostasie au niveau des muqueuses intestinales via le recrutement des cellules de l’immunité innée (e.g., neutrophiles) et adaptative (e.g., cellules Th17). Les neutrophiles produisent des molécules antivirales (e.g., défensines-) et ont la capacité de limiter la réplication virale au niveau des muqueuses. Les cellules Th17 jouent un double rôle lors de l’infection à VIH. Elles contribuent d’une part à la défense contre différents pathogènes opportunistes en augmentant, via la production d’IL-17, la capacité des CE à attirer les cellules Th17 et les neutrophiles. D’autre part, les cellules Th17 jouent un rôle délétère en tant que cibles de réplication virale et sources de cytokines pro-inflammatoires. La fréquence des cellules Th17 est diminuée dans les GALT mais pas dans les poumons des patients infectés par le VIH, suggérant qu’il existe des mécanismes différents par lesquels les cellules Th17 sont recrutées vers ces sites anatomiques. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle le VIH interfère avec la capacité des CE intestinales et non pas pulmonaires à produire des chimiokines (CK) responsables de l’attraction des cellules Th17 et des neutrophiles. Nous avons démontré que les CE intestinales et pulmonaires produisent des CK spécifiques pour les cellules Th17 (CCL20) et les neutrophiles (CXCL8) en réponse à des stimuli pro-inflammatoires tels que l’IL-1 et le TNF-. Le TNF- agit en synergie avec l’IL-17, un « signal de danger » récemment identifié, et augmente la capacité des CE intestinales mais pas pulmonaires à produire la chimiokine CCL20. Cette synergie s’explique par l’augmentation préférentielle de l’expression du récepteur à l’IL-17 à la surface des CE intestinales suite à la stimulation par le TNF-. L’exposition au VIH n’affecte pas la production de CCL20 et de CXCL8 par les CE intestinales, mais altère la capacité des CE alvéolaires à produire ces chimiokines en accord avec la permissivité sélective de ces dernières à l’infection par le VIH. En conclusion, nos résultats démontrent que (i) le VIH n’interfère pas directement avec la capacité des CE intestinales à recruter des cellules Th17 et des neutrophils et que (ii) la production de CCL20 par ces cellules est dépendantes de la synergie entre le TNF- et l’IL-17. Ainsi, la déplétion des cellules Th17 et la pénurie en IL-17 dans les GALT des sujets infectés pourrait causer de façon préférentielle des altérations fonctionnelles au niveau des CE intestinales, se traduisant par l’altération du recrutement des cellules Th17 en réponse au CCL20.

Étude de la fonction et de la régulation homéostatique des lymphocytes T extrathymiques

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.