Physiology and endocrinology symposium: Influence of cattle genotype (Bos indicus vs. Bos taurus) on oocyte and preimplantation embryo resistance to increased temperature

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Timing of prostaglandin F2α treatment in an estrogen-based protocol for timed artificial insemination or timed embryo transfer in lactating dairy cows

Objectives were to investigate progesterone concentrations and fertility comparing 2 different intervals from PGF2α treatment and induced ovulation in an estrogen-based ovulation synchronization protocol for timed artificial insemination (TAI) or timed embryo transfer (TET) in lactating dairy cows. A total of 1,058 lactating Holstein cows [primiparous (n=371) and multiparous (n=687)], yielding 34.1±0.33 kg of milk/d at various days in milk were randomly assigned to receive treatment with PGF2α on either d 7 or 8 of the following protocol: d 0: 2mg of estradiol benzoate + controlled internal drug release device; d 8: controlled internal drug release device removal + 1.0mg of estradiol cypionate; d 10: TAI or d 17: TET. Only cows with a corpus luteum at d 17 received an embryo and all cows received GnRH at TET. Pregnancy diagnoses were performed by detection (transrectal ultrasonography) of an embryo on d 28 or a fetus on d 60. Fertility [pregnancy per artificial insemination (P/AI) or pregnancy per embryo transfer (P/ET)] was affected by breeding technique (AI vs. ET) and time of PGF2α treatment (d 7 vs. 8) at the 28-d pregnancy diagnosis for TAI [32.9% (238) vs. 20.6% (168)] and TET cows [47% (243) vs. 40.7% (244)] and at the 60-d pregnancy diagnosis for TAI [30% (238) vs. 19.2% (168)] and TET cows [37.9% (243) vs. 33.5% (244)]. The progesterone (P4) concentration at d 10 altered fertility in TAI cows, with higher P/AI in cows with P4 concentration <0.1 ng/mL compared with cows with P4 concentration ≥0.1 ng/mL, and in ET cows, with higher P/ET in cows with P4 concentration <0.22 ng/mL compared with cows with P4 concentration ≥0.22 ng/mL. Prostaglandin F2α treatment at d 7 increased the percentage of cows with P4 <0.1 ng/mL on d 10 [39.4 (85) vs. 23.2 (54)]. Reducing the period between PGF2α and TAI from 72 to 48h in dairy cows resulted in a clear reduction in fertility in cows bred by TAI and a subtle negative effect in cows that received TET. The earlier PGF2α treatment benefits are most likely mediated through gamete transport, fertilization, or early embryo development and a more subtle effect of earlier PGF2α treatment that may be mediated through changes in the uterine or hormonal environment that manifests itself after ET on d 7. © 2013 American Dairy Science Association.

Dynamics of DNA Methylation during Early Development of the Preimplantation Bovine Embryo

There is species divergence in control of DNA methylation during preimplantation development. The exact pattern of methylation in the bovine embryo has not been established nor has its regulation by gender or maternal signals that regulate development such as colony stimulating factor 2 (CSF2). Using immunofluorescent labeling with anti-5-methylcytosine and embryos produced with X-chromosome sorted sperm, it was demonstrated that methylation decreased from the 2-cell stage to the 6-8 cell stage and then increased thereafter up to the blastocyst stage. In a second experiment, embryos of specific genders were produced by fertilization with X- or Y-sorted sperm. The developmental pattern was similar to the first experiment, but there was stage × gender interaction. Methylation was greater for females at the 8-cell stage but greater for males at the blastocyst stage. Treatment with CSF2 had no effect on labeling for DNA methylation in blastocysts. Methylation was lower for inner cell mass cells (i.e., cells that did not label with anti-CDX2) than for trophectoderm (CDX2-positive). The possible role for DNMT3B in developmental changes in methylation was evaluated by determining gene expression and degree of methylation. Steady-state mRNA for DNMT3B decreased from the 2-cell stage to a nadir for D 5 embryos >16 cells and then increased at the blastocyst stage. High resolution melting analysis was used to assess methylation of a CpG rich region in an intronic region of DNMT3B. Methylation percent decreased between the 6-8 cell and the blastocyst stage but there was no difference in methylation between ICM and TE. Results indicate that DNA methylation undergoes dynamic changes during the preimplantation period in a manner that is dependent upon gender and cell lineage. Developmental changes in expression of DNMT3B are indicative of a possible role in changes in methylation. Moreover, DNMT3B itself appears to be under epigenetic control by methylation. © 2013 Dobbs et al.

Optimal single-embryo mass spectrometry fingerprinting

In pre-implantation embryos, lipids play key roles in determining viability, cryopreservation and implantation properties, but often their analysis is analytically challenging because of the few picograms of analytes present in each of them. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) allows obtaining individual phospholipid profiles of these microscopic organisms. This technique is sensitive enough to enable analysis of individual intact embryos and monitoring the changes in membrane lipid composition in the early stages of development serving as screening method for studies of biology and biotechnologies of reproduction. This article introduces an improved, more comprehensive MALDI-MS lipid fingerprinting approach that considerably increases the lipid information obtained from a single embryo. Using bovine embryos as a biological model, we have also tested optimal sample storage and handling conditions before the MALDI-MS analysis. Improved information at the molecular level is provided by the use of a binary matrix that enables phosphatidylcholines, sphingomyelins, phosphatidylserines, phosphatidylinositols and phosphoethanolamines to be detected via MALDI(±)-MS in both the positive and negative ion modes. An optimal MALDI-MS protocol for lipidomic monitoring of a single intact embryo is therefore reported with potential applications in human and animal reproduction, cell development and stem cell research. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd.

Inibição da maturação nuclear pela butirolactona I durante o transporte de oócitos bovinos destinados à produção in vitro de embrões (PIV)

Pós-graduação em Medicina Veterinária - FCAV

Transporte simulado de oócitos bovinos em meio de maturação por diferentes períodos de tempo sem controle da atmosfera gasosa

O transporte dos oócitos até ao laboratório é um fator determinante que tem limitado a difusão comercial da técnica de Produção in vitro de embriões (PIVE). Por este motivo, a utilização de um meio de transporte-maturação que forneça maior viabilidade aos oócitos durante o transporte é fundamental. O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade do transporte simulado de oócitos bovinos em meio quimicamente definido, por diferentes períodos de tempo sem o controle da atmosfera gasosa, e a necessidade da adição de hormônios neste meio. Oócitos bovinos imaturos (n=989) obtidos de ovários de vacas abatidas em frigorífico, foram selecionados e distribuídos aleatoriamente em 2 experimentos. No experimento I, 649 oócitos foram distribuídos em 5 grupos. No grupo controle (0h), os oócitos foram maturados por 24h em meio de maturação, em estufa de CO2 a 38,5°C. Os oócitos foram transportados em uma incubadora portátil sem controle da atmosfera gasosa a 38,5°C, por 3, 6, 9 e 12h. Os oócitos dos grupos experimentais completaram a maturação nas mesmas condições do grupo 0h. No experimento II, 340 oócitos foram distribuídos em 5 grupos. No grupo controle (0h), os oócitos foram maturados nas mesmas condições do grupo 0h do experimento I. Nos grupos experimentais, os oócitos foram transportados nas mesmas condições do experimento I, no entanto o meio de transporte-maturação foi suplementado ou não com hormônios, e o transporte ocorreu por 3h (com e sem hormônios) e 6h (com e sem hormônios). Os oócitos dos grupos experimentais completaram a maturação nas mesmas condições do grupo 0h. A fecundação foi efetuada em meio Talp-Stock por 18 a 22h e o cultivo por 7 dias em meio SOF. No experimento I, as taxas de clivagem foram estatisticamente similares (p>0,05) para os grupos 0h (64,9%) e 3h (56,2%), porém houve uma redução destas taxas nos grupos 6h (45,8%), 9h (47,1%) e 12h (44,0%), que foram semelhantes entre si. A produção de blastocistos no experimento I, não foi estatisticamente diferente (p>0,05) para os grupos 0h (38,0%) e 3h (32,3%), porém houve uma redução nestas taxas nos grupos 6h (27,3%), 9h (24,8%) e 12h (18,9%), no entanto, as taxas de blastocistos assemelham-se entre os grupos 3, 6 e 9h. No experimento II, as taxas de clivagem foram estatisticamente similares (p>0,05) para os grupos 0h (71,4%) e 3h com hormônios (70,3%), porém houve uma redução destas taxas nos grupos 3h sem hormônios (64,8%), 6h com (56,0%) e sem (54,1%) hormônios, que foram diferentes entre si. A produção de blastocistos no experimento II, foi estatisticamente similar (p>0,05) para os grupos 0h (46,1%) e 3h com hormônios (45,8%), porém houve uma redução destas taxas nos grupos 3h sem hormônios (41,1%), 6h com (35,5%) e sem (33,5%) hormônios, que foram diferentes entre si. Esses resultados indicam a possibilidade do transporte de oócitos bovinos, em meio quimicamente definido, utilizando incubadora portátil, sem controle da atmosfera gasosa, a 38,5ºC, pelo período de até 9h, e que a adição de hormônios neste meio pode aumentar os índices de blastocistos.

Reproductive characteristics and the weight-length relationship in Anableps anableps (Linnaeus, 1758) (Cyprinodontiformes: Anablepidae) from the Amazon Estuary

O presente estudo analisou a relação peso-comprimento e uma série de aspectos da biologia reprodutiva de Anableps anableps da foz do rio Maracanã, no estado brasileiro do Pará. Os espécimes foram coletados por meio de duas redes de emalhar de 30 m de comprimento, com malhas de 15 e 20 mm, e com um puçá com um metro de diâmetro, com malha de 10 mm. Foram capturados 865 espécimes, os quais foram analisados para estabelecer a razão sexual, que foi de 2,12 fêmeas por macho (χ² = 13,07; p<0,05). As fêmeas apresentaram crescimento alométrico positivo, enquanto que os machos foram alométricos negativos. Nas análises adicionais, as gônadas de 371 fêmeas foram observadas ao microscópio. O desenvolvimento gonadal foi classificado em três estádios: imaturo (5,0%), em maturação (12,0%) e maturo (83,0%). O desenvolvimento embrionário foi classificado em cinco fases, de acordo com o tamanho do embrião e do saco vitelino. A fecundidade média foi de 12 ovos / embriões por fêmea (variando de 1-37 ovos / embriões). Uma relação significativa foi verificada entre o comprimento padrão das fêmeas, o peso de seus ovários (R² = 0,257, p < 0,001), e o número de embriões (R² = 0,573, p < 0,001). O tamanho médio da primeira maturação sexual (L₅₀) para as fêmeas foi estimado em 11,7 cm. A espécie se reproduz durante todo o ano.

Feeding ecology of immature Lithodoras dorsalis (Valenciennes, 1840) (Siluriformes: Doradidae) in a tidal environment, estuary of the rio Amazonas

O estudo da ecologia alimentar de peixes é uma abordagem consistente na avaliação dos processos interativos dentro das comunidades. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo investigar a ecologia alimentar do bacu-pedra Lithodoras dorsalis em furos próximos no delta do estuário Amazônico (Brasil), uma área sobre influência de macro-marés, em diferentes períodos pluviométricos. Durante 12 meses de coletas (julho de 2010 a junho de 2011), foram coligidos 371 espécimes jovens, sendo que a dieta da espécie foi composta por 28 itens alimentares analisados pelos seguintes índices: Índice de Repleção Estomacal, Índice de Importância Alimentar e Amplitude de Nicho. Lithodoras dorsalis quando jovem foi classificada como herbívora com tendência à frugivoria, devido aos altos valores de importância de frutos e sementes em sua dieta. A intensidade de obtenção de alimento por L. dorsalis diferiu entre os meses de coleta, onde o final do período de transição chuva-estiagem e o início da estiagem foram os períodos de menor e maior atividade alimentar, respectivamente. Também houve diferença na importância alimentar dos itens entre os períodos pluviométricos. Estes resultados fornecem informações importantes sobre a ecologia alimentar de doradídeos na Amazônia. Além disso, percebeu-se o alto consumo de material alóctone pelo bacu-pedra, sendo estes itens alimentares provenientes da floresta ripária, o que reforça a importância deste ambiente para a conservação da ictiofauna neotropical.

Isolate((R)) and Optiprep((R)) minigradients as alternatives for sperm selection in bovine in vitro embryo production

The objective of this study was to evaluate alternatives in small volumes to conventional gradient of Percoll((R)) on semen quality, in vitro embryo production, sex ratio and embryo survival after vitrification. Thawed semen was randomly allocated to one of four density gradient selection methods: (1) conventional Percoll((R)) (P), (2) MiniPercoll (MP), (3) MiniIsolate (MI), and (4) MiniOptiprep (MO). Sperm kinetics and quality were evaluated. Use of P, MP and MI gradients did not affect sperm motility (P > 0.05). However, there was a decrease in total and progressive sperm motility in MO (70.8 and 51.3% vs. 87.3 and 69.5% for P; 87.3 and 73% for MP; 92.3 and 78.8% for MI; P < 0.05). The MO had lower membrane integrity compared with P, MP and MI (39.7 vs. 70.5, 72.3, 63.8%, respectively, P < 0.05). The percentage of blastocysts produced was higher in MI than in MP and MO (21.1 vs. 16.1 and 16.9%, P < 0.05) and similar to P (18.4%; P > 0.05). Sex ratio and embryo survival after vitrification were similar among groups (P > 0.05). Semen selected by Isolate and Optiprep gradient, at the concentrations and small volumes used, demonstrated similar characteristics and in vitro embryo production to conventional Percoll((R)) gradient.

In vivo embryo production in cows superovulated 1 or 2 days after ovum pick-up

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Improving postcryopreservation survival capacity: an embryo-focused approach

The major challenge for a greater dissemination of in vitro produced (IVP) bovine embryos is to improve embryonic survival after cryopreservation. The involvement of embryonic lipids on this issue is well documented. However, it has been recognized that not only the amount of lipids that affects embryo cryotolerance, but the embryo survival capacity after cryopreservation is a rather multifactorial event. In this review, some strategies to improve embryonic lipid composition and postcryopreservation survival by modifying the embryos themselves to make them more cryopreservable are overviewed. The use of semi-defined and defined serum-free culture media, the addition of some chemicals in the culture media to modify embryo lipid composition, and the modulation of embryo cell membrane fluidity by cholesterol or unsaturated fatty acids added to the culture media and oocyte/embryo donor nutritional management with a diet enriched in polyunsaturated fatty acids, were described as alternatives for the improvement of IVP embryo survival after cryopreservation.

Ultrastructural Morphology and Nuclear Maturation Rates of Immature Equine Oocytes Vitrified with Different Solutions and Exposure Times

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)