Purification, partial characterization and role in lipid transport to developing oocytes of a novel lipophorin from the cowpea weevil, Callosobruchus maculatus

Lipid transport in arthropods is achieved by highly specialized lipoproteins, which resemble those described in vertebrate blood. Here we describe purification and characterization of the lipid-apolipoprotein complex, lipophorin (Lp), from adults and larvae of the cowpea weevil Callosobruchus maculatus. We also describe the Lp-mediated lipid transfer to developing oocytes. Lps were isolated from homogenates of C. maculatus larvae and adults by potassio bromide gradient and characterized with respect to physicochemical properties and lipid content. The weevil Lp (465 kDa) and larval Lp (585 kDa), with hydrated densities of 1.22 and 1.14 g/mL, contained 34 and 56% lipids and 9 and 7% carbohydrates, respectively. In both Lps, mannose was the predominant monosaccharide detected by paper chromatography. SDS-PAGE revealed two apolipoproteins in each Lp with molecular masses of 225 kDa (apolipoprotein-I) and 79 kDa (apolipoprotein-II). The lipids were extracted and analyzed by thin-layer chromatography. The major phospholipids found were phosphatidylserine, phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in adult Lp, and phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and sphingomyelin in larval Lp. Hydrocarbons, fatty acids and triacylglycerol were the major neutral lipids found in both Lps. Lps labeled in the protein moiety with radioactive iodine (125I-iodine) or in the lipid moiety with fluorescent lipids revealed direct evidence of endocytic uptake of Lps in live oocytes of C. maculatus.

Effect of supplementation of green tea polyphenols on the developmental competence of bovine oocytes in vitro

The objective of the present study was to examine the effect of green tea polyphenols (GTPs) supplementation during in vitro maturation, in vitro fertilization, and in vitro culture on the developmental competence of bovine oocytes. Cumulus-oocyte complexes aspirated from the ovaries were matured in vitro (38.5ºC for 24 h) and fertilized (38.5ºC for 15-18 h) and embryos were cultured (38.5ºC for 192 h) in a defined conditioned medium with or without GTPs supplementation. The GTPs used in the present study contained 99% catechin derivatives, with the major components being 50% (-)-epigallocatechin gallate, 22% (-)-epicatechin gallate, 18% (-)-epigallocatechin, and 10% (-)-epicatechin. Four replicate trials were done for each type of experiment. GTPs supplementation (15 µM) of the maturation medium led to a significant increase in the rate of blastocyst formation (34.0 vs 21.4%, P < 0.05). However, the rate of blastocyst formation was not improved when higher GTPs concentrations (20 or 25 µM) were added to the in vitro maturation medium. During in vitro fertilization, supplementation with higher GTPs concentrations (20 or 25 µM) significantly reduced the rate of blastocyst formation (P < 0.05). Supplementation of the culture medium with 15 µM GTPs improved the rate of blastocyst formation, while higher GTPs concentrations (25 µM) significantly reduced embryo development (P < 0.05). In conclusion, these results demonstrate that supplementation with GTPs at low concentration (15 µM) during in vitro maturation and in vitro culture improved the developmental competence of bovine oocytes.

The expression of melanopsin and clock genes in Xenopus laevis melanophores and their modulation by melatonin

Vertebrates have a central clock and also several peripheral clocks. Light responses might result from the integration of light signals by these clocks. The dermal melanophores of Xenopus laevis have a photoreceptor molecule denominated melanopsin (OPN4x). The mechanisms of the circadian clock involve positive and negative feedback. We hypothesize that these dermal melanophores also present peripheral clock characteristics. Using quantitative PCR, we analyzed the pattern of temporal expression of Opn4x and the clock genes Per1, Per2, Bmal1, and Clock in these cells, subjected to a 14-h light:10-h dark (14L:10D) regime or constant darkness (DD). Also, in view of the physiological role of melatonin in the dermal melanophores of X. laevis, we determined whether melatonin modulates the expression of these clock genes. These genes show a time-dependent expression pattern when these cells are exposed to 14L:10D, which differs from the pattern observed under DD. Cells kept in DD for 5 days exhibited overall increased mRNA expression for Opn4x and Clock, and a lower expression for Per1, Per2, and Bmal1. When the cells were kept in DD for 5 days and treated with melatonin for 1 h, 24 h before extraction, the mRNA levels tended to decrease for Opn4x and Clock, did not change for Bmal1, and increased for Per1 and Per2 at different Zeitgeber times (ZT). Although these data are limited to one-day data collection, and therefore preliminary, we suggest that the dermal melanophores of X. laevis might have some characteristics of a peripheral clock, and that melatonin modulates, to a certain extent, melanopsin and clock gene expression.

Elucidation of the Retinoid Signalling Pathway Involved in Axon Guidance in Lymnaea stagnalis and Xenopus laevis

The vitamin A metabolite, retinoic acid (RA), is known to play a crucial role in several developmental processes including axial patterning and differentiation. More recently, RA has been implicated in the regenerative process acting through its classical signaling pathway, the nuclear receptors, retinoic acid receptor (RAR) and retinoid X receptor (RXR), to mediate gene transcription. Moreover, RA has been shown to act as a guidance molecule for growth cones of regenerating motorneurons of the pond snail, Lymnaea stagnalis. Our lab has recently shown that RA can induce this morphological response independent of nuclear transcription, however, the role of the retinoid receptors in RA-induced chemoattraction is still unknown. Here, I show that the retinoid receptors, RXR and RAR, may mediate the growth cones response to the metabolically active retinoic acid isomers, all-trans and 9-cis RA, in Lymnaea stagnalis. Data presented here show that both an RXR and RAR antagonist can block growth cone turning in response to application of both isomers. Because no prior investigations have shown growth cone turning of individual vertebrate neurons, I aimed to show that both retinoic acid isomers were capable of inducing growth cone turning of embryonic spinal cord neurons in the frog, Xenopus laevis. For the first time in Xenopus, I showed that both all-trans and 9-cis RA were able to induce significantly more neurite outgrowth from cultured embryonic spinal cord neurons and induce positive growth cone turning of individual growth cones. In addition, I showed that the presence of the RXR antagonist, HX531, blocked 9-cis RA-induced growth cone turning and the RARβ antagonist, LE135, blocked all-trans RA-induced growth cone turning in this species. Evidence provided here shows for the first time, conservation of retinoic acid-induced growth cone turning in a vertebrate model system. In addition, these data show that the receptors involved in this morphological response may be the same in vertebrates and invertebrates.

Propriétés anesthésiques et analgésiques de l’eugénol chez la grenouille (Xenopus laevis), le poisson (Oncorhynchus mykiss) et le rat (Rattus norvegicus)

L'eugénol (2-methoxy-4-(2-propenyl) phénol), produit dérivé du clou de girofle (Eugenia aromatica), fut tout d’abord utilisé en application topique à des fins d’analgésie dentaire. Il produit également une anesthésie chirurgicale lorsque administré en immersion chez les poissons. L’eugénol agit sur les récepteurs vanilloïdes, sensibles à la chaleur, aux protons et à certaines molécules lipidiques. Ces récepteurs jouent un rôle important dans le mécanisme de l’inflammation et de l’hyperalgésie. L’eugénol pourrait également produire ses effets par antagonisme des récepteurs glutamaergiques (NMDA) et par son activation des récepteurs GABAergiques. Considérant que l’eugénol produit des effets analgésiques et anesthésiques, des études de pharmacocinétique et de pharmacodynamie furent réalisées chez la grenouille (Xenopus laevis), le poisson (Oncorhynchus mykiss) et le rat (Rattus norvegicus). Les résultats démontrent que l’eugénol administré par immersion à une dose efficace permet d’atteindre une anesthésie chirurgicale chez les grenouilles (350 mg/L) et les poissons (75 mg/L). Suite à des analyses plasmatiques par LC/MS/MS, la pharmacocinétique des grenouilles, des poissons et des rats montre que la drogue est éliminée et qu’il pourrait y avoir une recirculation entérohépathique plus importante chez la grenouille et le rat. La longue demi-vie chez le rat suggère aussi une accumulation dans les tissus après des administrations répétées. Suite à l’administration intraveineuse d’une dose de 20 mg/kg chez le rat, l’eugénol induit une anesthésie chirurgicale pour une très courte période de temps variant autour de 167 s. Les résultats de sensibilité thermique confirment l’efficacité de l’eugénol pour réduire l’hyperalgésie induite chez des rats neuropathiques. L’effet pharmacologique de l’eugénol a démontré une augmentation progressive constante de l’analgésie sur une période de cinq jours de traitements journaliers. En conclusion, l’eugénol possède des propriétés analgésiques et anesthésiques chez la grenouille africaine à griffes (Xenopus laevis), le poisson (Oncorhynchus mykiss) et le rat (Rattus norvegicus).

Transport d’iode par le transporteur de sodium/acide monocarboxylique SMCT1

Le transporteur de Na+/ acide monocarboxylique sensible à l’ibuprofène (SMCT1) est exprimé dans la membrane apicale de plusieurs épithélia. Son rôle physiologique dans la glande thyroïde reste cependant obscur mais on présume qu’il pourrait agir comme un transporteur apical d’iode nécessaire pour la synthèse des hormones thyroïdiennes. Récemment, on a montré que SMCT1 possède un courant de fuite anionique sensible à [Na+]e qui permettrait de transporter l’iode de façon électrogénique. Cependant, un efflux d’iode sensible à l’ibuprofène, mais indépendant de la [Na+]e a été aussi observé sur des cultures primaires des thyrocytes porcins, suggérant un autre mécanisme de transport d’iode par SMCT1. Ce travail vise à comprendre les caractéristiques de ce genre de transport en utilisant comme modèle d’expression les ovocytes de Xenopus laevis. Les résultats obtenus des essais de captation d’iode radioactif montrent que SMCT1 présente un transport d’iode sensible à l’ibuprofène de l’ordre de 30nmol/ovocyte/h. Si ce transport est non saturable en iode (0-100 mM), il nécessite du Na+ dans la solution externe. En effet, le remplacement du Na+ extracellulaire par le NMDG inhibe complètement le transport. En outre, on s’est intéressé à exclure la possibilité de différents artefacts. En ayant trouvé que la grande majorité de l’iode radioactif se trouve dans la partie soluble de l’ovocyte, on exclut une liaison non spécifique de l’iode à la membrane cellulaire. Cependant, une bonne proportion de l’iode transporté pourrait être liée à des protéines à l’intérieur de l`ovocyte. En effet, on observe une réduction du transport d’iode dans les ovocytes exprimant SMCT1 de 81,6 ± 2 % en présence de 2 % BSA dans la solution extracellulaire. Également, on écarte la possibilité que le transport d’iode soit le résultat de la surexpression de protéines de transport endogènes dont les canaux chlore. Le transport d’iode semble spécifique à l’expression de SMCT1 et de manière intéressante à l’expression d’un autre transporteur de monocarboxylates, MCT1. L’analyse de l’ensemble des essais, y compris le fait que l’amplitude du transport observé est 20 fois plus grande que celle du courant de fuite nous mène à proposer que SMCT1 puisse transporter l’iode de façon électroneutre. Cependant, le mécanisme par lequel ceci est accompli n’est pas évident à identifier. L’utilisation d’un autre modèle cellulaire serait surement utile pour répondre à cette question.

Effets du myo-inositol sur la perméabilité à l'eau d'ovocytes de Xenopus laevis exprimant les formes native et mutée D150E de l'aquaporine-2

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Efficacité et toxicité de l'eugénol administré à des doses anesthésiantes chez des grenouilles Xenopus laevis.

L’eugénol permet d’induire une anesthésie chirurgicale chez la grenouille africaine à griffes (Xenopus laevis) sans causer de lésions chez des grosses grenouilles (90-140g). Le premier objectif de la présente étude était de déterminer la durée de l’anesthésie et d’évaluer la dépression du système nerveux central ainsi que les changements de saturation en oxygène et de fréquence cardiaque chez des petites (7.5 ± 2.1 g) et moyennes (29.2 ± 7.4 g) grenouilles Xenopus laevis en fonction du temps d’exposition à un bain d’eugénol de 350 µL/L. Suite à une immersion de 5 ou 10 minutes, la réponse au test à l’acide acétique, au réflexe de retrait et au réflexe de retournement était absente pendant 1 heure (petites grenouilles) et 0,5 heure (moyennes) et l’anesthésie chirurgicale durait au maximum 15 et 30 minutes chez les petites et moyennes grenouilles respectivement. La saturation en oxygène n’était pas affectée de façon significative, mais la fréquence cardiaque était diminuée jusqu’à 1 heure post-immersion dans les deux groupes. Le deuxième objectif était de déterminer la toxicité de l’eugénol chez des grenouilles de taille moyenne après une ou trois administrations à une dose anesthésique, avec ou sans période de récupération d’une semaine. Histologiquement, il y avait de l’apoptose tubulaire rénale et des membranes hyalines pulmonaires après une administration, et de la nécrose hépatique et des hémorragies dans les tissus adipeux après trois administrations. Ces résultats suggèrent que le poids corporel est un paramètre important à considérer lors de l’anesthésie de grenouilles Xenopus laevis par immersion dans l’eugénol.

Étude structure/fonction des cotransporteurs Na+/glucose

Cette thèse porte sur l’étude de la relation entre la structure et la fonction chez les cotransporteurs Na+/glucose (SGLTs). Les SGLTs sont des protéines membranaires qui se servent du gradient électrochimique transmembranaire du Na+ afin d’accumuler leurs substrats dans la cellule. Une mise en contexte présentera d’abord un bref résumé des connaissances actuelles dans le domaine, suivi par un survol des différentes techniques expérimentales utilisées dans le cadre de mes travaux. Ces travaux peuvent être divisés en trois projets. Un premier projet a porté sur les bases structurelles de la perméation de l’eau au travers des SGLTs. En utilisant à la fois des techniques de modélisation moléculaire, mais aussi la volumétrie en voltage imposé, nous avons identifié les bases structurelles de cette perméation. Ainsi, nous avons pu identifier in silico la présence d’une voie de perméation passive à l’eau traversant le cotransporteur, pour ensuite corroborer ces résultats à l’aide de mesures faites sur le cotransporteur Na/glucose humain (hSGLT1) exprimé dans les ovocytes. Un second projet a permis d’élucider certaines caractéristiques structurelles de hSGLT1 de par l’utilisation de la dipicrylamine (DPA), un accepteur de fluorescence dont la répartition dans la membrane lipidique dépend du potentiel membranaire. L’utilisation de la DPA, conjuguée aux techniques de fluorescence en voltage imposé et de FRET (fluorescence resonance energy transfer), a permis de démontrer la position extracellulaire d’une partie de la boucle 12-13 et le fait que hSGLT1 forme des dimères dont les sous-unités sont unies par un pont disulfure. Un dernier projet a eu pour but de caractériser les courants stationnaires et pré-stationaires d’un membre de la famille des SGLTs, soit le cotransporteur Na+/myo-inositol humain hSMIT2 afin de proposer un modèle cinétique qui décrit son fonctionnement. Nous avons démontré que la phlorizine inhibe mal les courants préstationnaires suite à une dépolarisation, et la présence de courants de fuite qui varient en fonction du temps, du potentiel membranaire et des substrats. Un algorithme de recuit simulé a été mis au point afin de permettre la détermination objective de la connectivité et des différents paramètres associés à la modélisation cinétique.

Évaluations physiologiques de la tricaïne méthanesulfonate pour l’anesthésie des grenouilles africaines à griffes (Xenopus laevis)

Il existe peu d’études sur les effets physiologiques et pharmacologiques du médicament anesthésiant le plus utilisé chez les anoures, la tricaïne méthanesulfonate, et son utilisation chez la grenouille Xenopus laevis. Notre premier objectif était d’évaluer l’effet de bains d’immersion de 20 minutes de 1 et 2 g/L de tricaïne méthanesulfonate sur la fonction cardiorespiratoire, l’analgésie et les réflexes ainsi que d’étudier la pharmacocinétique. Nos résultats démontrent que des bains de 1 et 2 g/L produisent une anesthésie chirurgicale de 30 et 60 minutes respectivement, sans effet significatif sur le système cardiorespiratoire. À la suite d’une immersion à 2 g/L, on note une demi-vie terminale de 3,9 heures. Cette dose ne produit aucun effet sur l’histologie des tissus 24 heures après l’immersion. Dans une deuxième expérience, nous avons évalué les effets d’une surdose de tricaïne méthanesulfonate en bain d’immersion sur les systèmes cardiorespiratoire et nerveux central grâce à l’électroencéphalographie ainsi que l’effet d’une injection de pentobarbital sodique après 2 heures d’immersion. L’EEG montre un effet dépresseur sur le SNC avec l’utilisation de la tricaïne méthanesulfonate sans voir un arrêt de signal d’EEG sur la période de 2 heures d’enregistrement. Les surdoses à 1 g/L et 3 g/L n’ont pas d’effet significatif sur le rythme cardiaque, et l’injection de pentobarbital suite au bain d’immersion de tricaïne méthanesulfonate est nécessaire pour induire l’euthanasie. Nous avons démontré que le bain de tricaïne méthanesulfonate peut produire une anesthésie de 30 à 60 minutes avec dépression du SNC sans effet cardiovasculaire chez les Xenopus laevis.

Caractérisation biochimique et fonctionnelle du mutant T179N de l’aquaporine-2 humaine

L’aquaporine-2 (AQP2) est le canal responsable de la réabsorption finale d’eau au niveau du tubule collecteur du rein. À la base, contenue dans des vésicules internes, l’AQP2 est acheminée à la membrane apicale des cellules principales du tubule collecteur suite à une stimulation par l’hormone antidiurétique (ADH). L’incapacité à accomplir cette fonction entraîne le diabète insipide néphrogénique (DIN), une maladie caractérisée par l’inhabileté du rein à concentrer l’urine, entraînant une production de volumes urinaires élevés. Alors que les mutations récessives génèrent des protéines mal structurées et incapables de former des tétramères, les mutations dominantes sont capables de s’associer à leurs homologues sauvages, engendrant ainsi un DIN même chez les patients hétérozygotes. Ce mémoire présente l’analyse biochimique et fonctionnelle d’une nouvelle mutation naturelle de l’AQP2, la mutation T179N, aussi responsable du DIN. Cette dernière est particulièrement intéressante de par son génotype qui implique un caractère dominant, et sa position extracellulaire habituellement réservée aux mutations récessives. Les études comparatives de T179N à deux modèles de mutation récessive et dominante démontrent, tant en ovocytes de Xenopus laevis qu’en lignée cellulaire mpkCCDc14, le caractère récessif de cette nouvelle mutation. Les tests d’immunobuvardage de lysats d’ovocytes en membranes totales et membranes plasmiques purifiées ont révélé que seule la forme sauvage atteint la membrane plasmique alors que le mutant T179N est séquestré dans la cellule. En accord avec ce résultat, les analyses de perméabilité fonctionnelle démontrent aussi une absence d’activité pour T179N. En cellule mpkCCDc14, le mutant T179N exprimé seul n’atteint pas la membrane plasmique suite à l’action de la forskoline, contrairement à la forme sauvage. Cependant, ce mutant peut s’associer à son homologue sauvage en coexpression tant dans les ovocytes qu’en lignée mpkCCDc14 sans toutefois engendrer l’effet typique de dominance négative. En fait, dans ce contexte de coexpression, on remarque une augmentation de la Pf de 83±7 % et une récupération d’adressage à la membrane plasmique en cellule (immunofluorescence). En conclusion, T179N serait un mutant récessif fonctionnellement récupérable lorsqu’en présence de l’AQP2 sauvage.

Seasonal variations in the developmental competence of bovine oocytes matured in vitro

Ovaries were collected over a period of two years from heifers slaughtered at under 30 months of age and used to harvest 1757 oocytes. After in vitro maturation, fertilisation and culture, the proportions of oocytes and cleaved embryos that developed to blastocysts were significantly higher (P < 0.01) in the autumn, from September to November, than in the spring, from March to May. In contrast, embryo development, as assessed by oocytes that developed to eight or more cells and blastocysts, was lowest (P < 0.01) in the spring. These results were consistent during the two-year study, indicating a seasonal fluctuation in oocyte competence.

Immunohistochemical localization of inhibin/activin alpha, beta(A) and beta(B) subunits and follistatin in bovine oocytes during in vitro maturation and fertilization

The aim of this study was to evaluate the distribution of inhibin/activin alpha, beta(A) and beta(B) subunits and follistatin in immature oocytes and in matured oocytes before and after IVF. Denuded oocytes were submitted to a whole-mount immunofluorescence procedure. Specimens were imaged and fluorescent intensities quantified by scanning laser confocal microscopy. Immunoreactivity for inhibin alpha subunit (both alpha(C) and pro-alpha. regions), abundant in the ooplasm of immature oocytes, decreased after maturation (a 68% and 88% decrease, respectively; P < 0.001), but increased after IVF by 2- and 5.7-fold, respectively (P < 0.01). Intense staining for PA was detected in immature oocytes (predominantly in the outer ooplasm and zona pellucida) but after maturation and fertilization it was localized mainly in the zona pellucida, perivitelline space and oolemma. Immunoreactivity for RA in the ooplasm decreased by 58% after maturation (P < 0.001) but increased again by 75% after fertilization (P < 0.01). Immunoreactivity for beta(B) was localized mainly in the zona pellucida and did not change after maturation. However, immurloreactivity for beta(B) was not detected in the zona pellucida after fertilization, but remained unchanged in unfertilized oocytes. Immunoreactivity for follistatin was detected in the ooplasm and zona pellucida of immature oocytes but decreased progressively in the ooplasm after maturation (a 63% decrease; P < 0.001) and did not change after IVF. Examination of partially denuded cumulus-oocyte complexes confirmed abundant expression of alpha(C), pro-alpha, beta(A) and follistatin immunoreactivity in cumulus cells, whereas beta(B) subunit staining was weak or absent in cumulus cells, but intense in the zona pellucida. In conclusion, the present study shows that qualitative and quantitative changes in the distribution of inhibin/activin subunits and follistatin accompany oocyte maturation and fertilization. The possibility, indicated by these observations, that activin A and activin B may play distinct roles in bovine oocyte maturation and fertilization warrants further study.

Messenger RNA expression of Pabpnl1 and Mbd3l2 genes in oocytes and cleavage embryos

Objective: To identify genes specifically expressed in mammalian oocytes using an in silico subtraction, and to characterize the mRNA patterns of selected genes in oocytes, embryos, and adult tissues. Design: Comparison between oocyte groups and between early embryo stages. Setting: Laboratories of embryo manipulation and molecular biology from Departamento de Genetica (FMRP) and Departamento de Ciencias Basicas (FZEA) - University of Sao Paulo. Sample(s): Oocytes were collected from slaughtered cows for measurements, in vitro fertilization, and in vitro embryo culture. Somatic tissue, excluding gonad and uterus tissue, was collected from male and female cattle. Main Outcome Measure(s): Messenger RNA levels of poly(A)-binding protein nuclear-like 1 (Pabpnl1) and methyl-CpG-binding domain protein 3-like 2 (Mbd3l2). Result(s): Pabpnl1 mRNA was found to be expressed in oocytes, and Mbd3l2 transcripts were present in embryos. Quantification of Pabpnl1 transcripts showed no difference in levels between good-and bad-quality oocytes before in vitro maturation (IVM) or between good-quality oocytes before and after IVM. However, Pabpnl1 transcripts were not detected in bad-quality oocytes after IVM. Transcripts of the Mbd3l2 gene were found in 4-cell, 8-cell, and morula-stage embryos, with the highest level observed in 8-cell embryos. Conclusion(s): Pabpnl1 gene expression is restricted to oocytes and Mbd3l2 to embryos. Different Pabpnl1 mRNA levels in oocytes of varying viability suggest an important role in fertility involving the oocyte potential for embryo development. (Fertil Steril (R) 2010; 93: 2507-12. (C) 2010 by American Society for Reproductive Medicine.)

Endothelial and inducible nitric oxide synthases in oocytes of cattle

Nitric oxide (NO) is a chemical messenger generated by the activity of the nitric oxide synthases (NOS). The NOS/NO system appears to be involved in oocyte maturation, but there are few studies on gene expression and protein activity in oocytes of cattle. The present study aimed to investigate gene expression and protein activity of NOS in immature and in vitro matured oocytes of cattle. The influence of pre-maturation culture with butyrolactone I in NOS gene expression was also assessed. The following experiments were performed: (1) detection of the endothelial (eNOS) and inducible (iNOS) isoforms in the ovary by immunohistochemistry; (2) detection of eNOS and iNOS in the oocytes before and after in vitro maturation (W) by immunofluorescence; (3) eNOS and iNOS mRNA and protein in immature and in vitro matured oocytes, with or without pre-maturation, by real time PCR and Western blotting, respectively; and (4) NOS activity in immature and in vitro matured oocytes by NADPH-diaphorase. eNOS and iNOS were detected in oocytes within all follicle categories (primary, secondary and tertiary), and other compartments of the ovary and in the cytoplasm of immature and in vitro matured oocytes. Amount of mRNA for both isoforms decreased after IVM but was maintained after pre-maturation culture. The NOS protein was detected in immature (pre-mature or not) and was still detected in similar amount after pre-maturation and maturation for both isoforms. NOS activity was detected only in part of the immature oocytes. In conclusion, isoforms of NOS (eNOS and iNOS) are present in oocytes of cattle from early folliculogenesis up to maturation; in vitro maturation influences amount of mRNA and NOS activity. (C) 2009 Elsevier B.V. All rights reserved.