Ação do Glucantime sobre macrófagos de camundongos

Os antimoniais pentavalentes, tais como o Glucantime, são geralmente usados como fármacos de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses, no entanto seu mecanismo de ação não é completamente esclarecido. Atua contra formas amastigotas intracelulares de Leishmania sp, comprometendo o potencial redox levando danos ao DNA do parasito. Alguns trabalhos sugerem que o Glucantime aumenta a capacidade fagocítica e a produção de TNF-alfa por fagócitos. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade do Glucantime modular a atividade do macrófago, a principal célula hospedeira da Leishmania. Inicialmente, a toxicidade do Glucantime foi testada sobre macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, tratando as monocamadas in vitro por 48 horas. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A capacidade do Glucantime (0,1, 1 e 10 mg/ml) modular os macrófagos foi avaliada tratando as monocamadas de macrófagos peritoneais por 24 horas antes da infecção com Leishmania braziliensis. Após 48 horas de incubação com meio de cultura foi avaliado o índice de infecção por contagem. Antes e após a infecção foram analisados a produção de óxido nítrico (NO) pelo método de Griess, espécies reativas de oxigênio (EROS) por fluorimetria usando a sonda H2DCFDA e a produção de citocinas por ELISA. Para avaliar se o Glucantime seria capaz de modular macrófagos in vivo, camundongos suíços foram tratados por 5 dias consecutivos com 8 mg de Glucantime pela via intraperitoneal. Macrófagos peritôneais foram avaliados quanto a sua capacidade de controlar a infecção in vitro com L. braziliensis. Os resultados mostraram que nas concentrações até 10 mg/ml, o Glucantime não alterou a viabilidade dos macrófagos in vitro. O pré-tratamento dos macrófagos com Glucantime nas concentrações de 0.1mg/mL, 1mg/mL e 10mg/mL, foi capaz de reduzir o índice de infecção em 49%, 74% e 85%, respectivamente. Em macrófagos não infectados a produção de NO foi aumentada na concentração de 10mg/ml de Glucantime. O tratamento com 1 e 10 mg/ml de Glucantime foi capaz de aumentar significativamente a produção de EROs (p<0,05 e p<0.01, respectivamente) e a produção IL-12 (p<0,05), mas a IL-10 não foi alterada. Não houve alterações significativas desses parâmetros em relação ao controle após a infecção com L. braziliensis. Os macrófagos oriundos dos animais tratados com Glucantime foram capazes de reduzir o índice de infecção por L. braziliensis (p<0,05). Esses resultados sugerem que o Glucantime é capaz de ativar os macrófagos e esse efeito pode contribuir para o mecanismo de ação desse fármaco.

Alterações na biodisponibilidade de óxido nítrico e no estresse oxidativo em plaquetas de mulheres na pós-menopausa

O risco de desenvolver doença cardiovascular aumenta com o avançar da idade, sendo exponencialmente maior em mulheres após a menopausa em relação a mulheres em idade reprodutiva. Esse aumento pode ser, em parte, explicado por uma hiperatividade plaquetária e disfunção endotelial nessas mulheres. Em plaquetas, o óxido nítrico é uma molécula essencial para a inibição da sua ativação e agregação; cuja biodisponibilidade depende de sua síntese e inativação por espécies reativas de oxigênio. Assim, o presente estudo visa determinar os efeitos da menopausa sobre a função plaquetária, biodisponibilidade de óxido nítrico e estresse oxidativo. Para tal, a amostra foi constituída por mulheres sendo elas 15 jovens entre 20 e 40 anos (grupo controle), 12 mulheres entre 45 e 60 anos pós-menopausadas há no mínimo 12 meses que não faziam uso de reposição hormonal e que não possuíam fatores de risco para doença cardiovascular. Os resultados demonstraram que mulheres pós-menopausadas apresentam uma hiperagregação plaquetária induzida por colágeno em relação a mulheres jovens. Essas mulheres também apresentaram o influxo de L-arginina aumentado em relação ao grupo controle. No entanto, a atividade da enzima óxido nítrico sintase estava diminuída nas mulheres após a menopausa, assim como os níveis plasmáticos de L-arginina. A expressão das enzimas iNOS e eNOS não diferiu significativamente entre os grupos. A expressão das subunidades 1 e 1 da enzima guanilato ciclase, e a fosfodiesterase 5 não se apresentaram diferentes entre os grupos. A expressão das enzimas glutationa peroxidase, subunidades gp91phox e p47phox da NADPH oxidase não estavam alteradas em plaquetas de mulheres pós-menopausadas, já a catalase estava mais expressa neste grupo. Em relação à atividade das enzimas antioxidantes, foi observado um aumento na superóxido dismutase em mulheres pós-menopausadas. Esse grupo apresentou ainda níveis mais elevados de grupamentos sulfidrila. Já em relação a danos proteicos não foi possível observar diferença entre os grupos. Dessa forma, esses resultados podem contribuir para uma melhor compreensão da hiperagregação plaquetária observada nas mulheres após a menopausa, o que, por sua vez, pode contribuir para a elucidação de mecanismos envolvidos na morbidade e mortalidade cardiovascular elevada nessa população.

Modulação redox da homeostase de células musculares lisas através de estimuladores do sistema NADPH oxidase

As doenças cardiovasculares representam a principal causa de morte nos países ocidentais. Dentre essas doenças, a aterosclerose é que mais se destaca, sendo caracterizada pelo acúmulo de células musculares lisas vasculares (CMLV). O efeito patológico das CMLV em resposta a diferentes estímulos pode acarretar em disfunções nestas células. É notável que a aterosclerose ocorra principalmente em vasos sinuosos onde ocorre um forte turbilhonamento do fluxo sanguíneo, que pode acarretar em hemólise e, consequentemente, acúmulo de heme livre. Além disso, no processo de aterogênese as moléculas de adesão, principalmente integrinas, são de crucial importância durante a resposta de CMLV. Nesse trabalho nosso objetivo inicial foi avaliar o efeito do heme livre nas funções de CMLV, bem como os mecanismos moleculares por trás desses efeitos. Em uma segunda parte, investigamos o envolvimento da integrina α1ß1 no efeito da Angiotensina II (Ang II) em CMLV. Nós observamos que o heme livre é capaz de induzir a proliferação e migração de CMLV via espécies reativas de oxigênio (ERO) provenientes da NADPHoxidase (NADPHox). Adicionalmente vimos que o heme ativa vias de sinalização redox-sensíveis relacionadas à proliferação celular, como MAPKinases e o fator de transcrição NFκB. Também observamos que há uma ligação entre a NADPHox e o sistema heme oxigenase (HO), uma vez que o heme induz a expressão de HO-1 e o pré-tratamento das CMLV com inibidores de HO levam ao aumento tanto o efeito proliferação quanto a indução de ERO promovidas pelo heme. Além disso, vimos que o efeito contra-regulatório promovido pela HO ocorre devido as metabolites do heme: biliverdina, bilirrubina e monóxido de carbono. Por último, quando bloqueamos tanto a NADPHox quanto o sistema HO o heme não teve efeito algum na proliferação de CMLV. Em um segundo estudo, observamos que o efeito da Ang II sobre a migração de CMLV foi inibido quando as células foram pré-tratadas com o ligante da integrina α1ß1, a desintegrina Obtustatina. A seguir observamos que o efeito da Ang II na ativação de FAK e na colocalização actina-ILK é dependente da integrina α1ß1, que possivelmente ativa PKCα, uma vez que vimos que a produção de ERO induzida por Ang II foi inibida pela Obtustatina. Vimos que a indução da expressão de ILK por Ang II em CMLV é dependente da integrina α1ß1 e também observamos que a Obtustatina inibibiu o desacoplamento de ILK da FAK, uma vez que a Obtustatina bloqueou a fosforilação de FAK induzida por Ang II (processo crucial para o desacoplamento da ILK). Nós também observamos que a Ang II induz, via integrina α1ß1, a fosforilação de AKT e a diminuição da expressão de p21, provavelmente via ILK. Corroborando estes dados, nós mostramos que o pré-tratamento com Obtustatina induziu um estacionamento na fase G0 e diminuição da proliferação de CMLV tratadas com Ang II. Portanto, mostramos nesse trabalho que o heme livre induz a ativação de CML via NADPHox, que é elegantemente contra-regulado pelo sistema HO. Além disso, sugerimos que a integrina α1ß1 pode ser um importante alvo molecular para o desenvolvimento de intervenções mais efetivas para a aterosclerose.

Efeitos genotóxicos e indução do SOS em mutantes derivados de Escherichia coli K-12 durante o processo de interação com superfícies bióticas e abióticas

A célula epitelial é o primeiro contato entre os micro-organismos e o hospedeiro. Essa interação pode levar a produção de diversas citocinas, quimiocinas, moléculas inflamatórias e também estimular a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste trabalho avaliamos se a interação com as células HEp-2 poderia ser genotóxica para os mutantes derivados de Escherichia coli K-12 deficientes em algumas enzimas que fazem parte do sistema de reparo por excisão de base (BER). Além disto, avaliamos a expressão do sistema SOS, que é induzido pela presença de danos no genoma bacteriano. Os resultados obtidos mostraram a presença de filamentos, na interação com células HEp-2, principalmente, no mutante xthA (BW9091) e no triplo mutante xthA nfo nth (BW535). Quando a interação foi quantificada na ausência da D-manose, observamos um aumento das bactérias aderidas. Além disto, a quantidade e o tamanho dos filamentos também aumentaram, mostrando que as adesinas manose-sensíveis estavam envolvidas na filamentação bacteriana. Para comprovar se o aumento da filamentação observada neste ensaio foram uma consequência da indução do sistema SOS, desencadeada pela interação com as células HEp-2, quantificamos a expressão do SOS, na presença e na ausência da D-manose. De fato, observamos que a indução do SOS na ausência da D-manose foi maior, quando comparada, com o ensaio realizado na presença de D-manose. Além disto, observamos que a ausência de xthA foi importante para o aumento da filamentação observada na ausência de D-manose. Diante destes resultados, verificamos se a resposta de filamentação ocorreria quando as bactérias interagiam com uma superfície abiótica como o vidro. Observamos também inúmeros filamentos nos mutantes BER, BW9091 e BW535, quando comparados a cepa selvagem AB1157. Essa filamentação foi associada à indução do SOS, em resposta a interação das bactérias com o vidro. Em parte a filamentação e a indução do SOS observadas na interação ao vidro, foram associadas à produção de ERO. Quantificamos também o número de bactérias aderidas e observamos que as nossas cepas formavam biofilmes moderados. Contudo, a formação de biofilme dependia da capacidade da bactéria induzir o sistema SOS, tanto em aerobiose como em anaerobiose. A tensão do oxigênio foi importante para interação dos mutantes BER, uma vez que os mutantes BW9091 e BW535 apresentaram uma quantidade de bactérias aderidas menor em anaerobiose. Contudo, a diminuição observada não estava vinculada a morte dos mutantes BER. Também realizamos microscopia de varredura na cepa selvagem e nos mutantes, BW9091 e BW535 e confirmamos que as três cepas formavam biofilmes tanto em aerobiose como em anaerobiose. Observamos uma estrutura sugestiva de matriz extracelular envolvendo os biofilmes da cepa selvagem AB1157 e do mutante BW9091. No entanto, a formação desta estrutura por ambas as cepas dependia da tensão de oxigênio, pois nos biofilmes formados em anaerobiose essa estrutura estava ausente. Em conclusão, mostramos que na interação das bactérias com a superfície biótica e abiótica, ocorreu lesão no genoma, com indução do SOS e a resposta de filamentação associada.

Papel do antioxidante (vitamina C) na modulação da pressão sanguínea em ratos espontaneamente hipertensos (SHR)

A hipertensão essencial humana, bem como a hipertensão desenvolvida em Ratos Espontaneamente Hipertensos (SHR), são caracterizadas pelo desenvolvimento de Pressão Arterial (PA) elevada na medida em que a idade avança, sem identificação da causa primária. Está bem estabelecido que este modelo animal apresenta estresse oxidativo (EOx) concomitante a hipertensão. O mecanismo pelo qual o antioxidante reduz a pressão não está claro, por essa razão, é necessário avaliar o comportamento destas enzimas envolvidas na homeostase da PA. Ratos Wistar-Kyoto (WKY) e SHR machos receberam ácido ascórbico, 200 mg / kg / dia por sonda orogástrica durante cinco semanas. A PA, a Hipertrofia Ventricular Esquerda (HVE), o Sistema Renina-Angiotensina (SRA), o Peptídeo Natriurético Atrial (ANP) e o EOx foram comparados entre os grupos por pletismografia, estereologia, microscopia confocal de varrimento a laser, microscopia eletrônica de transmissão, western blotting e análise do RT-qPCR. Os SHR tratados com ácido ascórbico reduziram a PA e a HVE. Além disso, as enzimas envolvidas na homeostase da PA, a renina e a Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) normalizaram-se, bem como os Receptores tipo 1 de Angiotensina II (AT1). A grande quantidade de grânulos de ANP no grupo SHR foi reduzida pelo tratamento com ácido ascórbico. O balanço oxidativo foi restabelecido nos SHR tratados com este antioxidante. O EOx nos SHR eleva os níveis de renina e de PA. Estas espécies reativas de oxigênio podem ser envolvidas no mecanismo de sinalização para aumentar a expressão de ANP nos miócitos atriais. Estes dados também mostram que o tratamento com o antioxidante (vitamin C) reduz o EOx e normaliza a PA ao menos parcialmente pela redução de taxas de renina.

Enzimas antioxidantes em sangue de peixes expostos à hipoxia e hiperoxia

O oxigênio é importante não só por sua participação no metabolismo energético, mas também por sua conversão em derivados parcialmente reduzidos, as espécies reativas de oxigênio (ERO). ERO participam de funções importantes em diversas vias do metabolismo, entretanto, em concentrações desequilibradamente elevadas deflagram a peroxidação lipídica, processo deletério que forma aldeídos tóxicos, como o 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE). A manutenção de concentrações não deletérias das ERO é realizada por moléculas componentes do sistema antioxidante. Peixes podem ser expostos a grandes variações das concentrações de oxigênio, o que provoca ciclos oxidantes. A maioria dos estudos usa fígado e rim para avaliar estresse oxidante por meio de ensaios das atividades antioxidantes, o que requer o sacrifício dos animais. Contudo, o sangue sofre efeitos das ERO e avaliações no sangue podem permitir o estudo de antioxidantes no mesmo animal, sem a necessidade de sacrifício. Em consequência, foram nossos objetivos estabelecer uma técnica de cateterismo branquial em peixes, a padronização dos ensaios e a avaliação em sangue de componentes do sistema antioxidante de duas espécies de teleósteos em diferentes tensões de oxigênio. Pacus e tilápias foram avaliados em 6,0 mg de O2.L-1 e em hipoxia a 0,5 mg de O2.L-1 por 42 horas . Para os ensaios de hiperoxia os animais foram avaliados em 6,0 mg de O2.L-1, depois de 6 horas em 9,5 mg de O2.L-1 e depois de 30 horas de recuperação a 6,0 mg de O2.L-1. A utilização de materiais para o cateterismo de humanos permitiu a implantação de um acesso branquial. Infelizmente, houve formação de trombo após 24 horas. Mesmo assim, a observação de fluxo sanguíneo no interior da cânula e a sobrevida dos animais testados, confirmam a viabilidade da técnica. Verificamos em sangue uma maior atividade da enzima glutationa S-transferase (GST) sobre o 4-HNE em relação ao 1-cloro-2-dinitrobenzeno (CDNB). Isto reflete a importância de avaliações de atividade de enzimas, como a GST, sobre substratos endógenos. As respostas enzimáticas de tilápias mostraram-se mais sensíveis que as dos pacus quando comparadas em diferentes tensões de oxigênio.

Modulação das vias de sinalização intracelulares pelo sistema NAD(P)H oxidase em melanoma humano

Evidências têm mostrado que as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas pela NAD(P)H oxidase são importantes moduladores de diversas funções celulares como migração, crescimento, proliferação e sobrevivência. Estudos recentes demonstraram o envolvimento da atividade da NAD(P)H oxidase no crescimento e sobrevivência de células de melanoma. Neste trabalho, investigamos o efeito da inibição da NAD(P)H oxidase por difenileneiodônio (DPI) sobre o crescimento das células de melanoma humano MV3 e observamos que este composto reduziu o crescimento destas células em aproximadamente 50%. A inibição da NAD(P)H oxidase induziu mudanças no formato celular, com arredondamento, diminuição do espraiamento e descolamento celular. Esta redução foi acompanhada por um rearranjo do citoesqueleto de actina, diminuição da fosforilação no resíduo Tyr397 da quinase de adesão focal (FAK) e redução na associação de FAK com actina e com a tirosina quinase c-Src. Isto indica que a inibição da geração de ROS está modulando negativamente vias de sinalização ativadas por integrinas, o que freqüentemente conduz a um tipo particular de morte celular conhecida por anoikis. Comprovando a ocorrência deste fenômeno, observamos que a inibição da atividade da NAD(P)H oxidase aumentou a apoptose das células de melanoma e induziu a ativação da caspase-3. Nossos resultados mostram ainda que a inibição da viabilidade celular por DPI foi revertida com o pré-tratamento das células MV3 com um inibidor de tirosina fosfatases (ortovanadato de sódio). Em resumo, este estudo mostra que a geração de ROS por NAD(P)H oxidase está envolvida nos mecanismos de sobrevivência em células de melanoma, uma vez que afetam as vias de sinalização dependentes de FAK-Src, através da inibição da atividade de proteína tirosina fosfatases.

Ação molecular da 1,25(OH)2D3 em células endoteliais humanas submetidas a diferentes concentrações de leptina

Altas concentrações plasmáticas de leptina têm sido relacionadas ao aumento da formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem desempenhar um papel regulador central em eventos inflamatórios e cardiovasculares. Estudos recentes têm demonstrado que a vitamina D é capaz de reduzir marcadores do estresse oxidativo, bem como modular a produção de citocinas inflamatórias. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do pré-tratamento com concentração fisiológica (10-10 M) e suprafisiológica(10-7 M) de 1,25(OH)2D3 na produção do ânion superóxido (O2) e nos fatores de transcrição NF-κB e Nrf2,em células endoteliais humanas estimuladas com diferentes concentrações de leptina (1 e 10 ng/mL). Quando as células foram pré-tratadas com 1,25(OH)2D3, e estimuladas com leptina (1 e 10 ng/mL), a 1,25(OH)2D3 reduziu (p<0,05) a produção de ânion superóxido (O ), principalmente na concentração de 10-7 M. O fator de transcrição NF-κB foi positivamente ativado em células incubadas com 10 ng/mL de leptina, entretanto, quando se realizou o pré-tratamento com 1,25(OH)2D3 houve redução da translocação do NF-κB, assim como a produção de citocinas reguladas por este fator de transcrição. Também foi observado que o pré-tratamento com 10-7 M de 1,25(OH)2D3 aumentou de forma significativa (p<0,05) a expressão do fator de transcrição Nrf2 na fração nuclear em comparação ao controle, principalmente quando associada à 10 ng/mL de leptina (p<0,05). Tomados em conjunto, nossos resultados indicam que o tratamento com ambas as concentrações, 10-10 e 10-7 M de 1,25(OH)2D3 em células endoteliais humanas, foram eficazes em inibir a produção do ânion superóxido (O2), citocinas pró-inflamatórias, bem como inibir a translocação nuclear do fator de transcrição NF-κB, e ativar a via antioxidante Nrf2. Estes achados sugerem que o pré-tratamento com ambas as concentrações (fisiológica e suprafisiológica) de 1,25(OH)2D3 na presença de alta concentração de leptina, pode ter um efeito positivo no endotélio através da regulação de marcadores de inflamação e atividade antioxidante

由农杆菌介导将葡萄糖氧化酶基因转入水稻

过氧化氢（Hydrogen peroxide,H2O2）是植物和病原微生物互作中快速合成的一种早期活性氧类（reactive oxygen species, ROS ），它在植物受到病原微生物侵染后引发的一系列防御反应中起着非常重要的作用，因此通过外源基因导入提高植物体内过氧化氢的含量，可以增强植物的广谱抗病性。葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GO）可以催化β-D-葡萄糖氧化生成过氧化氢和葡萄糖酸，此酶已在数种细菌和真菌中检测到，但在植物和动物中仍未发现。为了尝试将此酶应用于水稻广谱抗病基因工程，本研究将葡萄糖氧化酶基因插入具有潮霉素抗性选择标记的双元载体pCAMBIA1301，新构建为水稻高效表达载体pCAG1301。将此质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）菌株LBA4404后,转化粳稻(Oryza sativa )品种日本晴(Nipponbare)成熟胚来源的愈伤组织和幼胚，并由筛选出的潮霉素抗性愈伤组织分化再生植株。对所得到的潮霉素抗性植株的Southern杂交分析表明GO基因已整合到受体基因组,为单拷贝或双拷贝插入。利用过氧化氢与淀粉-碘化钾反应显蓝色的特性检测到了转基因植株产生的过氧化氢，证实GO基因表达产生的葡萄糖氧化酶已经在水稻中发挥功能，这是将GO基因转入单子叶植物的首例报道。 基于过氧化氢诱导的植物防御反应没有种属专一性的优点，可以预期所得转基因水稻植株很可能对水稻的多种病原菌具有良好的抗性。已完成的抗病性鉴定表明，所得转基因水稻植株对稻瘟病具有良好的抗性。

棉花抗黄萎病基因工程研究和防卫反应相关基因的克隆

系统获得性抗性(Systematic acquired resistance, SAR)是植物抵御病原菌侵染的最有效手段，利用基因工程技术导入SAR信号发生过程中的关键基因后，植物的SAR基因表达量提高并且对病原菌侵染的反应速度加快，因此植物的抗病性得以增强，与传统的抗病基因工程技术相比它对病原菌没有专一性，许多学者称之为广谱抗病基因工程，该领域已成为目前抗病基因工程研究的热点和前沿。 NDR1和NPR1基因在植物的SAR发生中起着重要的作用，前者功能定位在ROS(reactive oxygen species)的激活和随后的水杨酸(SA)诱导合成之间，突变株病原菌诱导后SA合成能力降低，SAR发生减弱，目前还没有对该基因进行过量表达分析的报道;后者功能定位在SAR信号转导级联反应之中的SA积累和随后的SAR基因表达之间。该突变株在病原菌侵染时不产生病程相关蛋白(PRs)，表现为感病，而对照抗病;过量表达该基因的转基因拟南芥对多种病原菌的侵染产生抗性，PR1等PRs蛋白的表达量也提高，异源表达该基因的水稻对白叶枯病的抗性也提高。本研究利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆了这两种基因，序列分析表明拟南芥Wassilewskija生态型的NDR1基因与Columbia生态型相比，共有7处碱基不同，引起编码氨基酸变化4处，而NPR1基因与报道的Wassilewskija生态型来源的NPR1基因完全相同。 我们构建了35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型高效表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草，PCR和Southern鉴定外源基因已经整合到植物基因组中。抗病性分析显示过量表达NDR1和NPR1基因的烟草对晚疫病和赤星病的抗性都有明显提高，说明这两个基因的在其它植物中异源表达后，都能提高植物对多种病原菌的抗性。 本论文提出了利用这两个基因来培育抗黄萎病棉花的设想，一方面为解决这个“世纪性”难题积累新的资料，另一方面也为其它作物的抗病基因工程提供新的经验。利用35S启动子驱动的NDR1和NPR1基因的植物组成型表达载体分别对陆地棉品种石远321进行花粉管通道法转化。同时，还探讨了这两个基因在棉花中的共转化实验，希望它们的“协同增效”能进一步提高棉花的抗病性。对其中2001年夏天在南京注射所获得的5,000粒种子在三亚进行100 g/ml卡那霉素筛选，初步鉴定分别获得转NDR1和NPR1基因株系26和24棵，PCR进一步鉴定其中分别有12和7棵为转基因阳性，转基因频率分别为0.50％和0.27％，目前利用营养钵蘸根法对其二代进行抗枯、黄萎病鉴定，结果显示有转基因植株对枯、黄萎病的抗性都明显增强，进一步的鉴定正在进行中。2002年初海南注射分别获得转NDR1和NPR1基因以及共转化种子22,000、10,500和12,500粒种子，2002年夏在中国农科院植保所黄萎菌病圃筛选抗黄萎病单株，并利用100 g/ml卡那霉素初步筛选出了一批抗性植株，每种转基因株系随机挑选5株进行PCR鉴定，结果显示为阳性。进一步的抗黄萎病鉴定和筛选以及分子分析正在进行中。 同时，本文还探讨了病原菌诱导型启动子在广谱抗病基因工程应用的可能性。根据烟草的Pr1-a启动子已知序列设计引物，PCR扩增启动子序列后,构建病原菌诱导型NPR1基因植物表达载体，并对棉花进行转化，获得种子11,500粒，利用同上的筛选方法，获得了一致的结果，目前抗黄萎病鉴定、分子检测以及生物学分析正在进行中。 最后，鉴于抗生素标记在转基因植物的应用引起了许多“安全性”争论的事实，还构建了无筛选标记的表达载体对抗虫棉进行转化，这样在生产上可以直接获得抗虫棉抗黄萎病棉花新材料，也为其它作物抗病基因工程积累经验。 本研究还提出了一种较为有效的提取高质量棉花总RNA的方法，与原来一些棉花RNA纯化方法相比，该方法所用都为常规试剂，易于重复，质量高。并且利用获得的总RNA构建了黄萎菌激发子诱导的cDNA文库，滴度测定为1╳107pfμ/μg，插入片段大小在5 00~2 000 bp范围内。 鉴于NPR1基因研究的重要性，本研究还利用简并引物PCR技术从海岛棉和陆地棉的基因组中都分离到了NPR1基因的同源片段，大小都为208 bp，与拟南芥NPR1基因的相应部分的同源性分别为66％和65％，它们之间的同源性为87％，目前该基因的全长正在分离鉴定中。 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIPs)在植物的防御反应中起着重要的作用，通过分析已知20余种pgip基因序列的保守区，设计简并引物，PCR扩增海岛棉（Gossypium barbadense）7124 cDNA文库，得到一条长561 bp的片段，序列测定后分析确认为pgip基因的一部分。根据此序列和棉花病原菌诱导的cDNA文库载体中已知部分设计RACE引物，扩增后，5’和3’RACE分别得到666bp和906 bp的片段。序列分析表明它具有完整的编码框，产物为330 aa的蛋白质。序列分析该蛋白具有10个串联的LRR(leucine-rich repeat)区，与柑桔(Citrus)和枳(Poncirus)的pgip基因的同源性分别为69.2%和68.7%。进一步PCR扩增得到该基因的全长阅读框，并且获得了相应的基因组片段，序列分析发现该基因没有内含子。这是从棉属植物中克隆的第一个pgip基因。

盐角草（Salicornia europaea L.）SePSY和SeLCY基因克隆及功能分析

盐角草（Salicornia europaea L.）是一种叶片退化而茎肉质化，不具有盐腺和盐囊泡的真盐生植物，可以在1020 mM NaCl下生存。其特殊的形态适应特点使其成为研究植物抗盐性的良好实验材料。但目前与盐角草抗盐机理相关的生理和分子方面的研究还非常有限。本文以盐角草为材料，首先探讨了盐分和渗透胁迫对其光合作用和渗透平衡的影响，在此基础上进一步克隆了盐角草类胡萝卜素合成途径中的两个关键酶，八氢番茄红素合成酶（SePSY）和番茄红素β-环化酶（SeLCY）基因，并进行了功能分析。该研究对于了解类胡萝卜素在植物抗盐性中所起的作用具有重要意义。 盐分和渗透胁迫对其光合作用和渗透平衡影响的实验结果表明：200 mM NaCl是盐生植物盐角草生长的最适盐浓度，在该盐度下盐角草中叶绿素a/b的比值和光饱和点升高，植株的光合作用表现出增强的效应，植株生长最佳。而27％ PEG-6000所模拟的渗透胁迫显著降低了盐角草中叶绿色a/b的比值，抑制其光合作用和生长。200 mM NaCl下，Na+的含量显著增加，但脯氨酸含量保持不变，说明Na+对盐角草渗透平衡的作用要强于脯氨酸。同时盐角草中液泡H+-ATPase（V-H+-ATPase）活性增强，而盐角草Na+/H+逆向转运蛋白基因（SeNHX1）在盐分和渗透胁迫下却表现为组成型表达;我们因此推断在盐分胁迫下，Na+的吸收是由于液泡H+-ATPase活性的增强，而不是诱导SeNHX1基因的表达。同时Na+的吸收可能进一步诱导了与光合作用相关基因的表达。 盐分对植物的影响涉及植物体内包括光合作用和活性氧代谢在内的多个代谢过程。在植物中，类胡萝卜素是植物捕光天线复合体（LHC）和光系统反应中心叶绿素结合蛋白的重要组成部分。植物体内类胡萝卜素能够清除植物叶绿体，线粒体和过氧化物体在电子传递过程中产生的活性氧。同时类胡萝卜素是植物激素ABA的前体。200 mM NaCl虽然增加了盐角草细胞的渗透势，但并没有对其造成氧化胁迫和离子毒害，相反提高了其光合能力。类胡萝卜素作为植物活性氧的淬灭剂和光系统的组成成分，可能在盐角草抗盐机理中发挥着比较重要的作用。在过去的十年中，类胡萝卜素研究大多集中在其生物合成和提高作物中类胡萝卜素含量方面，可是，在植物对非生物逆境（如氧化和盐分胁迫）的适应机制中，类胡萝卜素合成途径究竟发挥什么作用目前还不是很清楚。为了了解盐角草中类胡萝卜素合成途径在植物逆境的适应机制中所发挥的作用，本文采用RACE的方法克隆了盐角草类胡萝卜素合成途径中的两个关键酶基因 SePSY和SeLCY，将它们构建到植物表达载体SN1301中，转化拟南芥，并对它们进行了初步的功能分析。 研究发现盐角草SePSY基因全长1655 bp，编码419个氨基酸，推测分子量为47.2 kDa，等电点为8.92。其蛋白在1-65个氨基酸处有一个信号肽。在1-19和242-264氨基酸处有2个跨膜区。盐角草SeLCY基因全长1937 bp，编码498个氨基酸，推测分子量为56.1 kDa，等电点为8.41。其蛋白在1-37个氨基酸处有一个信号肽。在79-96，367-385和454-474氨基酸处有3个跨膜区。SePSY和SeLCY基因过量表达均促进转基因拟南芥的生长，转SePSY基因拟南芥次生根数目比野生型拟南芥明显增多。SePSY和SeLCY基因的过量表达还使转基因拟南芥对百草枯的抗性得到提高;SePSY基 因的过量表达增强了植株体内抗氧化保护酶过氧化物酶（POD），超氧化物歧化酶（SOD）活性，但过氧化氢酶 （CAT）的变化不显著;转SeLCY基因株系POD，SOD，CAT的活性都有所增强，但转SePSY基因株系中POD活性明显高于 转SeLCY基因株系。转SePSY和SeLCY基因拟南芥叶片中丙二醛（MDA）和H2O2含量均降低，但转SePSY基因株系中MDA和H2O2含量明显低于转SeLCY基因株系。说明转基因拟南芥对氧化胁迫的抗性得到了提高，同时使得光系统II（PSII）和细胞膜的结构和功能不被破坏。而转SePSY基因株系对盐分和氧化胁迫的抗性明显高于转SeLCY基因株系。SePSY和SeLCY基因的过量表达还提高了转基因拟南芥的光合效率，气孔导度和Fv/Fm比值。 SePSY和SeLCY基因转化拟南芥及其功能分析的初步结果表明，SePSY和SeLCY基因的过量表达提高了转基因拟南芥对体内活性氧（ROS）的清除能力，增强了拟南芥的光合能力，进而提高了拟南芥的抗盐性。

外源物质对酵母拮抗菌生活力的影响

　　近年来，酵母拮抗菌在水果采后病害防治中展示了良好的应用前景。然而，在实际应用中,酵母拮抗菌在逆境条件下会因为发生凋亡或细胞损伤而引起生活力的下降，最终导致拮抗菌抑病能力降低。研究酵母拮抗菌生活力下降的规律，提高酵母拮抗菌的生产效率，减少剂型加工过程中的细胞损伤，增强其对逆境条件的耐受力是增加或稳定生防制剂防治效果的有效途径。本文主要研究酵母拮抗菌正常培养过程中生活力下降的规律，筛选剂型加工过程中对酵母拮抗菌具有保护作用的化学物质，并对酵母拮抗菌的培养条件进行了优化。主要研究结果如下： 　　1. 在正常培养过程中，酵母拮抗菌Rhodotorula glutinis和Cryptococcus laurentii中细胞染色质凝集或细胞膜破损的发生一般在6天以后。外源加入的N-乙酰半胱氨酸及硅酸钠等物质在超过一定浓度时会加速酵母菌的死亡。 　　2. 在不同的液体悬浮制剂中，对R. glutinis而言，使用磷酸缓冲液（PBS）悬浮时保护效果最好；而C. laurentii悬浮在NYDB培养基中或海藻糖、乳糖溶液中时的生活力最高。 　　3. 以10 %葡萄糖 + 5 %脱脂牛奶作保护剂，可以有效地保持酵母拮抗菌C. laurentii冻干制剂的生活力，配合使用的保护效果高于它们单独使用时的保护效果。添加1 mM N-乙酰半胱氨酸能更好地保持拮抗菌制剂在常温保存过程中的生活力，这可能与这种还原性物质缓解了细胞内活性氧的积累有关。 　　4. 不同酵母拮抗菌对不同碳、氮源的利用能力有明显差异。在9种不同的碳源和10种不同的氮源中，Pichia membranefaciens能够最有效利用的碳、氮源是葡萄糖、果糖和多价胨，而Candida guilliermondii的最佳碳源和氮源分别是果糖和肉蛋白胨。

脂筏极化参与活性氧介导的白杄花粉管顶端生长

质膜上存在一种富含甾醇物质的液相有序膜脂微区，被称作脂筏 (lipid rafts或lipid microdomains)。这种小的膜微区可以通过在质膜上的侧向移动，聚集形成较大的片状结构，而与微区相关联的蛋白可以通过脂筏的这种聚合作用而凝聚分布于特定的亚细胞结构上。脂筏区域在真菌和动物质膜上具极性分布，并参与细胞的极性形态建成和运动。最近，通过生物化学研究证实，脂筏也存在于植物细胞，然而迄今为止，脂筏与植物细胞极性生长相关联的直接功能证据尚未见报道。 NADPH氧化酶 (NOX，在植物中又称为 Rboh) 产生的活性氧 (Reactive oxygen species, ROS) 可能是调控植物细胞（包括花粉管、根毛和墨角藻合子等）极性生长的通用信号机制。花粉管作为研究细胞极性控制的一种理想模式系统，已被许多信号转导调控研究所采用。在本研究中，我们使用一种能螯合甾醇类物质的多烯类抗生素filipin破坏脂筏结构，以探讨脂筏极化对ROS介导的白杄花粉管极性生长的作用。 我们首次在白杄 (Picea meyeri) 花粉管上应用一种全新的苯乙烯基染料di-4-ANEPPDHQ，成功地在活体细胞上观察到脂筏在花粉管生长顶端的极性分布模式。通过脂筏和甾醇在质膜上的相似定位清楚表明：在花粉管极性生长过程中，存在富含甾醇类物质的质膜微区在花粉管生长顶端的极化现象。 氮蓝四唑（NBT）的还原和二氯二氢荧光素（H2DCF）的氧化均显示，在活跃生长的花粉管顶端区域存在一个以顶端为基底的陡峭ROS梯度，从而进一步验证了ROS在细胞极性生长过程中的信号作用。此外，我们还发现在生长花粉管的亚顶端位置有另一类性质的活性氧组分存在，该ROS组分与线粒体的能量代谢相关。研究结果首次揭示，在快速生长的花粉管中同时存在两类性质不同的ROS组分。 ROS是一种寿命很短而且容易扩散的分子，NADPH氧化酶产生的ROS信号在细胞伸长位点的准确定位是调控极性生长的必要条件。免疫共定位实验显示，NOX成簇极化分布于花粉管的生长顶端。使用filipin进行甾醇的螯合会破坏膜的异质性，干扰NOX簇在生长顶端的定位，减少了顶端的ROS形成，消弱了胞质Ca2+ 浓度梯度，进而抑制了花粉管的顶端生长。 在纯化质膜的基础上，我们使用Triton去垢剂处理结合Optiprep密度梯度离心，分离纯化了抗去垢剂抽提的质膜微区 (Detergent-resistant microdomains, DRMs)。通过免疫印迹分析证实，NADPH氧化酶部分地存在于DRMs中。非变性胶活性实验证明，该酶需要脂筏定位来保持酶活性。因此我们认为，在正常的细胞极性生长中，脂筏招募并运载NADPH氧化酶到花粉管的生长顶端，并为NOX及其活性亚基的有效互作提供了适宜的微环境，由此保证了NOX蛋白产生ROS的较高酶活性，进而维持花粉管的极性顶端生长。 总之，甾醇螯合对白杄花粉管生长影响的研究，为脂筏极化在花粉管极性生长中的作用提供了证据。基于以上生物化学和细胞生物学的结果，我们针对花粉管中富含甾醇的脂筏微区和NOX功能之间的联系，提出了一种假说模式：(1) 植物细胞质膜上的脂筏为信号分子ROS在特定位点的聚集提供了物理载体；(2) 脂筏的完整性和甾醇依赖性对NOX的定位和活性是必要的，并为花粉管细胞极性产生和维持所必需。上述研究结果表明，脂筏在花粉管顶端的极化，以及作为关键生长因子的NOX在质膜脂筏中的定位，对花粉管的高度极性生长具有重要作用。

Antioxidant Peptidomics Reveals Novel Skin Antioxidant System

It is generally agreed that reactive oxygen species (ROS) contribute to skin aging, skin disorders, and skin diseases. Skin possesses an extremely efficient antioxidant system. This antioxidant activity is conferred by two systems: antioxidant enzymes and

Two Immunoregulatory Peptides with Antioxidant Activity from Tick Salivary Glands

Ticks are blood-feeding arthropods that may secrete immunosuppressant molecules, which inhibit host inflammatory and immune responses and provide survival advantages to pathogens at tick bleeding sites in hosts. In the current work, two families of immunoregulatory peptides, hyalomin-A and -B, were first identified from salivary glands of hard tick Hyalomma asiaticum asiaticum. Three copies of hyalomin-A are encoded by an identical gene and released from the same protein precursor. Both hyalomin-A and -B can exert significant anti-inflammatory functions, either by directly inhibiting host secretion of inflammatory factors such as tumor necrosis factor-alpha, monocyte chemotectic protein-1, and interferon-gamma or by indirectly increasing the secretion of immunosuppressant cytokine of interleukin-10. Hyalomin-A and -B were both found to potently scavenge free radical in vitro in a rapid manner and inhibited adjuvant-induced inflammation in mouse models in vivo. The JNK/SAPK subgroup of the MAPK signaling pathway was involved in such immunoregulatory functions of hyalomin-A and -B. These results showed that immunoregulatory peptides of tick salivary glands suppress host inflammatory response by modulating cytokine secretion and detoxifying reactive oxygen species.