Valutazione statistica della ripetibilità di esperimenti di sequenziamento del DNA in specie batteriche

I progressi della biologia molecolare assieme alle nuove tecnologie di sequenziamento applicate su scala genomica alla genetica molecolare, hanno notevolmente elevato la conoscenza sulle componenti di base della biologia e delle patologie umane. All’interno di questo contesto, prende piede lo studio delle sequenze genetiche dei batteri, consentendo dunque, una migliore comprensione di ciò che si nasconde dietro le malattie legate all’uomo. Il seguente lavoro di tesi si propone come obiettivo l’analisi del DNA del batterio Listeria monocytogenes, un microrganismo presente nel suolo e in grado di contaminare l’acqua e gli alimenti. Lo scopo principale è quello di confrontare la variabilità tecnica e biologica, al fine di capire quali siano gli SNPs reali (Single Nucleotide Polymorphism) e quali artefatti tecnici. La prima parte, quindi, comprende una descrizione del processo di individuazione degli SNPs presenti nel DNA dei campioni in esame, in particolare di tre isolati diversi e tre copie. Nella seconda parte, invece, sono effettuate delle indagini statistiche sui parametri relativi agli SNPs individuati, ad esempio il coverage o il punteggio di qualità assegnato alle basi. Il fine ultimo è quello di andare a verificare se sussistano particolari differenze tra gli SNPs dei vari isolati batterici.

Risk assessment to improve food safety along different food chains

The great challenges of today pose great pressure on the food chain to provide safe and nutritious food that meets regulations and consumer health standards. In this context, Risk Analysis is used to produce an estimate of the risks to human health and to identify and implement effective risk-control measures. The aims of this work were 1) describe how QRA is used to evaluate the risk for consumers health, 2) address the methodology to obtain models to apply in QMRA; 3) evaluate solutions to mitigate the risk. The application of a QCRA to the Italian milk industry enabled the assessment of Aflatoxin M1 exposure, impact on different population categories, and comparison of risk-mitigation strategies. The results highlighted the most sensitive population categories, and how more stringent sampling plans reduced risk. The application of a QMRA to Spanish fresh cheeses evidenced how the contamination of this product with Listeria monocytogenes may generate a risk for the consumers. Two risk-mitigation actions were evaluated, i.e. reducing shelf life and domestic refrigerator temperature, both resulting effective in reducing the risk of listeriosis. A description of the most applied protocols for data generation for predictive model development, was provided to increase transparency and reproducibility and to provide the means to better QMRA. The development of a linear regression model describing the fate of Salmonella spp. in Italian salami during the production process and HPP was described. Alkaline electrolyzed water was evaluated for its potential use to reduce microbial loads on working surfaces, with results showing its effectiveness. This work showed the relevance of QRA, of predictive microbiology, and of new technologies to ensure food safety on a more integrated way. Filling of data gaps, the development of better models and the inclusion of new risk-mitigation strategies may lead to improvements in the presented QRAs.

Bio-preservation and bio-active compounds as sustainable strategies to improve quality and safety of fresh and fermented products

The development of new “green” and sustainable approaches to reduce food wastes, guaranteeing food quality, microbiological safety and the environmental sustainability, is of great interest for food industry. This PhD thesis, as part of the European project BioProMedFood (PRIMA–Section2 Programme), was focused on two strategies: the use of natural antimicrobials and the application of microbial strains isolated from spontaneously fermented products. The first part concerned the valorisation of microbial biodiversity of 15 Mediterranean spontaneously fermented sausages, through the isolation of autochthonous lactic acid bacteria (LAB) strains, mainly Latilactobacillus sakei, that were characterised regarding their safety and technological aspects. The most promising strains were tested as bio-protective cultures in fresh sausages, showing promising anti-listerial activity, or as starter cultures in fermented sausages. The second part of the research was focused on the use of natural compounds (phenolic extracts and essential oils from Juniperus oxycedrus needles and Rubus fruticosus leaves) with antimicrobial potential. They were tested in vitro against List. monocytogenes and Enterococcus faecium, showing differences in relation to species and type of extracts, but they hint at important possibilities for applications in specific foods. Concluding, this PhD thesis highlighted the great potential of traditional meat products as an isolation source of new strains with industrial importance. Moreover, the antimicrobial potential of compounds obtained from plant matrices opened promising perspectives to exploit them as “green” strategies to increase fresh food safety. The last topic of research, carry out in collaboration with Department of Nutrition and Food Sciences (University of Granada), investigated the effect of LAB fermentation on avocado leaves by-products, focusing on the bio-availability of phenolic compounds in the plant extracts, caused by microbial metabolism.

Effetto di starter autoctoni sulla qualità e la sicurezza di salami tradizionali spagnoli

Il lavoro svolto in questa tesi aveva l’obiettivo di valutare il potenziale tecnologico e bioprotettivo di ceppi di batteri lattici (LAB) isolati da salami tradizionali spagnoli. In particolare due ceppi (Lactiplantibacillus paraplantarum BPF2 e Pediococcus acidilactici ST6) che avevano dimostrato buone performance in vitro sono stati utilizzati, da soli o in miscela, come colture starter per la produzione salami e i prodotti ottenuti sono stati confrontati con un controllo a fermentazione spontanea ed un prodotto addizionato di uno starter commerciale contenente LAB e stafilococchi. Per quanto riguarda gli aspetti tecnologici, il pH ha mostrato cinetiche di acidificazione simili in tutti i prodotti, mentre il calo peso era più lento nel controllo. A livello microbiologico, i campioni addizionati di colture starter hanno mostrato carichi di LAB molto più elevati già al tempo zero, senza differenze significative in relazione al ceppo utilizzato. Enterobatteri e lieviti hanno mostrato andamenti simili in tutti i campioni. L’utilizzo di colture starter ha invece avuto un impatto rilevante sul contenuto di ammine biogene, con valori totali doppi nel campione ottenuto con fermentazione spontanea, e sul profilo in metaboliti volatili (soprattutto a carico di composti derivanti dall’acido piruvico). L’aspetto più rilevante di questa tesi è stato ottenuto nel challenge test, utilizzando come microrganismo target Listeria monocytogenes (inoculo 3 log ufc/g): infatti, nel controllo e nei campioni contenenti starter commerciale, L. monocytogenes era in grado di crescere fino a valori superiori a 5.7 log ufc/g, mentre i ceppi BPF2 e ST6 hanno determinato una riduzione del suo carico cellulare (2.4 log ufc/g). Questo conferma quindi le grandi potenzialità anti-listeria dei due ceppi testati e la loro attitudine ad essere utilizzati, oltre che come starter per i salami, anche come colture bioprotettive con lo specifico compito di contrastare lo sviluppo di L. monocytogenes.

La sicurezza alimentare nel latte crudo: la problematica Bacillus cereus

La crescente richiesta di sicurezza negli alimenti di origine animale, inclusa la filiera lattiero casearia ha spinto gli operatori del settore a porre maggiore attenzione ad un sempre più elevato numero di batteri patogeni. Negli ultimi si è posta l’attenzione, in modo crescente, sul monitoraggio del Bacillus cereus, per il quale lo stesso Reg. 2073/2005 ha definito criteri igienici di processo nel latte in polvere. Il presente studio si è pertanto focalizzato sul monitoraggio delle caratteristiche igienico sanitarie di diverse tipologie di latte crudo (BIO, BIO Fieno, Tracciato, Alta Qualità e Alta Qualità NO OGM), includendo il controllo del Bacillus cereus. In particolare oltre alla detection ed identificazione del Bacillus cereus si sono valutati diversi parametri quali pH, cellule somatiche, Conta Batterica Totale (CBT), Enterobacteriaceae, E. coli, Staphylococchi coagulasi positivi, Salmonella e Listeria monocytogenes. I risultati ottenuti hanno confermato ottimali condizioni igieniche in tutte le tipologie di latte con una media geometrica della Carica batterica totale pari a 13553 ufc/ml valore nettamente inferiore rispetto al limite stabilito dal Reg. 853/2004). L’assenza di Salmonella in tutti i campioni testati ed una positività solo alla detection per Listeria moncytogenes in 2/46 campioni testati dimostrano ottimali garanzie di sicurezza alimentare. Relativamente alla positività per Bacillus cereus il 23.9% dei campioni analizzati sono risultati positivi (dopo conferma in PCR). In conclusione si può affermare che l’azienda fornitrice dei campioni di latte alimentare applichi buone pratiche di igiene e di processo nelle fasi antecedenti la trasformazione del latte, nel rispetto delle normative di riferimento sia in ambito igienico che di sicurezza alimentare.