Structure-function analysis of USP1: insights into the role of Ser313 phosphorylation site and the effect of cancer-associated mutations on autocleavage

Background: In complex with its cofactor UAF1, the USP1 deubiquitinase plays an important role in cellular processes related to cancer, including the response to DNA damage. The USP1/UAF1 complex is emerging as a novel target in cancer therapy, but several aspects of its function and regulation remain to be further clarified. These include the role of the serine 313 phosphorylation site, the relative contribution of different USP1 sequence motifs to UAF1 binding, and the potential effect of cancer-associated mutations on USP1 regulation by autocleavage. Methods: We have generated a large set of USP1 structural variants, including a catalytically inactive form (C90S), non-phosphorylatable (S313A) and phosphomimetic (S313D) mutants, deletion mutants lacking potential UAF1 binding sites, a mutant (GG/AA) unable to undergo autocleavage at the well-characterized G670/G671 diglycine motif, and four USP1 mutants identified in tumor samples that cluster around this cleavage site (G667A, L669P, K673T and A676T). Using cell-based assays, we have determined the ability of these mutants to bind UAF1, to reverse DNA damage-induced monoubiquitination of PCNA, and to undergo autocleavage. Results: A non-phosphorylatable S313A mutant of USP1 retained the ability to bind UAF1 and to reverse PCNA ubiquitination in cell-based assays. Regardless of the presence of a phosphomimetic S313D mutation, deletion of USP1 fragment 420-520 disrupted UAF1 binding, as determined using a nuclear relocation assay. The UAF1 binding site in a second UAF1-interacting DUB, USP46, was mapped to a region homologous to USP1(420-520). Regarding USP1 autocleavage, co-expression of the C90S and GG/AA mutants did not result in cleavage, while the cancer-associated mutation L669P was found to reduce cleavage efficiency. Conclusions: USP1 phosphorylation at S313 is not critical for PCNA deubiquitination, neither for binding to UAF1 in a cellular environment. In this context, USP1 amino acid motif 420-520 is necessary and sufficient for UAF1 binding. This motif, and a homologous amino acid segment that mediates USP46 binding to UAF1, map to the Fingers sub-domain of these DUBs. On the other hand, our results support the view that USP1 autocleavage may occur in cis, and can be altered by a cancer-associated mutation.

A tecnologia em prol da divulgação científica: criação de um site como meio de promoção da circulação de conhecimentos sociolinguísticos e do combate ao preconceito linguístico

Esta dissertação é a descrição de um trabalho cujo objetivo principal foi a criação de um site com materiais sobre o tema preconceito linguístico, visando a promover uma circulação do conhecimento científico entre diversas classes da sociedade não-acadêmica. Nossas primeiras motivações para a realização de um trabalho desse tipo se iniciaram após a polêmica ocorrida em 2011 sobre o livro didático que, segundo a mídia, ensinaria os alunos a falar errado. Essa situação demonstrou existir uma falta de diálogo entre academia e sociedade no que concerne a temas sociolinguísticos. Percebemos uma necessidade de se realizar uma divulgação científica que chegasse com sucesso à sociedade, de modo que as pessoas pudessem conhecer o assunto em questão e, ao menos, refletir sobre ele. Muito embora já existam trabalhos realizados por linguistas com essa intenção, como é o caso de Bagno (1997, 1999), Bortoni-Ricardo (2004, 2005) e Scherre (2005), estes ainda são limitados, por serem, em sua maioria, livros e artigos acadêmicos. Utilizando como base o princípio de indissociabilidade entre ensino, pesquisa e extensão (MEC/SESu, 2006), buscamos, segundo o próprio princípio exige, unir a pesquisa científica resultante dos estudos sociolinguísticos à extensão - através da divulgação do tema para as pessoas de fora do meio acadêmico - e ao ensino, criando e compartilhando materiais que possam ser também utilizados em sala de aula. Para conquistar tal objetivo, tendo como inspiração a proposta de Baronas (2010) e seguindo os exemplos de Ribeiro (2006), Chagas (2012) e Pauleto (2013), criamos um site com materiais diversos sobre o tema preconceito linguístico, como vídeos, imagens e textos informativos. Ainda, como complemento do trabalho, foi criada uma página no Facebook, de modo a obter uma eficácia maior na divulgação, sabendo que a internet é hoje um dos meios mais fáceis, rápidos e de longo alcance para o compartilhamento de informações. Tivemos por intenção promover uma circulação do conhecimento, aplicando o princípio da gratuidade linguística apresentado por Wolfram (1998) e assumindo um papel de agentes de mudança social, segundo aponta Charity (2008). De modo a verificar a eficácia de nosso trabalho, utilizamos uma avaliação em modelo de questionário de escala Likert, realizada por três grupos distintos de avaliadores. Nossos resultados mostraram aprovação ao site por parte dos três grupos de avaliação, demonstrando que esse tipo de trabalho é eficiente e promissor, sendo uma maneira eficaz e ampla de se promover a circulação de saberes sociolinguísticos e divulgar uma mensagem de combate ao preconceito linguístico