L’entérotoxine STb d’Escherichia coli affecte les jonctions serrées des cellules intestinales épithéliales

La toxine thermostable d’E.coli (STb) est une cause de diarrhée chez l’homme et l’animal. STb se lie au sulfatide, son récepteur, puis s’internalise. Dans le cytoplasme, par une cascade d’événements, STb déclenche l’ouverture des canaux ioniques permettant la sécrétion des ions et la perte d’eau menant à la diarrhée. Les jonctions serrées forment une barrière physique intercellulaire dans les cellules épithéliales intestinales, contrôlant ainsi le flux paracellulaire des ions et de l’eau. Les jonctions serrées sont affectées par divers pathogènes et par leurs toxines. À ce jour, l’effet de STb sur les jonctions serrées n’a pas été étudié. L’étude entreprise visait à explorer l’effet de STb sur les jonctions serrées et la barrière épithéliale des cellules intestinales. Des cellules épithéliales intestinales du colon humain (T84) ont été traitées pendant 24h soit avec la toxine STb purifiée soit avec une souche d’E.coli exprimant STb. La résistance transépithéliale (TER), le flux de marqueurs paracellulaires et la microscopie confocale ont été utilisés pour analyser les effets de STb sur les jonctions serrées. Les monocouches traitées par la souche E.coli exprimant STb et la toxine STb purifiée ont manifesté une forte réduction de TER (p<0.0001) parallèlement à une augmentation significative de la perméabilité paracellulaire à l’Albumine de Sérum Bovin marqué avec l’IsoThioCyanate Fluoroscéine, BSA-FITC (p<0.0001) comparativement aux cellules non traitées et aux cellules traitées par une souche d’E.coli commensale non-toxinogène. L’augmentation de la perméabilité paracellulaire induite par STb a été associée à une dissolution générale et une condensation des fibres de stress centrales des filaments d’actine. Le réarrangement des filaments d’actine a été accompagné par une redistribution et une fragmentation des protéines des jonctions serrées dont l’occludine, la claudine-1 et la Zonula Occludens-1. Les mêmes modifications on été observées après l’intoxication des cellules T84 avec un octapeptide synthétique retrouvé dans la séquence de STb correspondant à une séquence consensus de la toxine ZOT de Vibrio cholerae, impliquée dans la réorganisation des jonctions serrées. Cet effet n’a pas été observé lorsque les cellules ont été traitées avec un octapeptide synthétique comportant les mêmes acides aminés mais distribués de façon aléatoire ou avec la toxine mutée (D30V). Nos résultats montrent pour la première fois que STb induit le dysfonctionnement de la barrière épithéliale intestinale en modifiant la distribution des protéines des jonctions serrées. Ces résultats ouvrent une nouvelle voie pour la compréhension de la pathogenèse de diarrhée causée par la toxine STb.

Impact du statut de différenciation des cellules promyélocytaires HL-60 sur l’efficacité anticancéreuse et antiinflammatoire de l’EGCG

L’altération de la barrière hématoencéphalique (BHE) par les cellules tumorales et les cellules immunes circulantes peut mener à la neuroinflammation. Les cellules leucémiques promyélocytaires HL-60 sont un excellent modèle pour étudier et comprendre les mécanismes de signalisation moléculaires qui caractérisent le développement tumoral et métastatique. La cancérogenèse peut s’accompagner de modulations de l’expression de biomarqueurs tels que la cyclooxygénase-2 et la métalloprotéase-9. Les recherches décrites dans ce mémoire relatent l’analyse des biomarqueurs inflammatoires et invasifs régulés lors de la différenciation induite par le PMA des cellules HL-60 en macrophages. Le statut de différenciation cellulaire pourrait avoir un impact sur les gènes cibles de la voie NF-κB. Nous émettons l’hypothèse que le PMA active la voie NF-κB et que cette signalisation peut être renversée par l’(-)-épigallocatéchine-gallate (EGCG). En effet, une régulation à la hausse de l’expression de plusieurs gènes combinée à la diminution de l’expression d’IκB mettent en évidence l’implication de la voie NF-κB dans l’activation des mécanismes pro-inflammatoires et pro-invasifs. Les mêmes observations sont faites dans les cellules différenciées appelées «macrophages-like». L’EGCG, un polyphénol dérivé du thé vert, a un potentiel chimiopréventif. Il est capable d’inhiber la signalisation moléculaire passant par la voie NF-κB dans les cellules HL-60 traitées simultanément par l’EGCG et le PMA, mais pas dans les cellules «macrophages-like». Cette différence peut s’expliquer par une modulation de l’expression du récepteur de surface cellulaire de l’EGCG, le récepteur à la laminine de 67 kDa, et de son précurseur de 37 kDa. Collectivement, nos résultats montrent que le statut de différenciation des cellules promyélocytaires HL-60 concorde avec l’activation des mécanismes favorisant le développement d’un cancer et des métastases. Cet effet peut être prévenu par l’utilisation d’agents naturels tel l’EGCG. Le ciblage de biomarqueurs liés au statut de différenciation des cellules tumorales impliquées dans la perturbation de la barrière hématoencéphalique qui cause la neuroinflammation permettrait l’avancement des connaissances dans la prévention de la cancérogenèse.

Étude des effets du phénotype de sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse sur les fonctions hématopoïétiques

L’irradiation (IR) est utilisée dans le traitement de plusieurs cancers et désordres hématologiques, en particulier dans les protocoles de conditionnement précédents les transplantations de moelle osseuse. L’emploi de doses réduites d’IR semble favoriser le succès de la prise de greffe. Cette observation soulève un point de plus en plus discuté dans la littérature, soit l’importance de l’intégrité du microenvironnement pour la transplantation et le bon fonctionnement de l’hématopoïèse. L’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse in vitro. Ce mécanisme de défense cellulaire entraînant un arrêt de prolifération permanent est également observé in vivo dans différents systèmes, mais n’a pas encore été étudié dans le contexte de la niche hématopoïétique. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour objectif de déterminer si l’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse et si une telle induction altère les fonctions hématopoïétiques. Nos résultats ont permis de démontrer pour la première fois qu’une IR corporelle totale induit effectivement la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse. En outre, cette altération du microenvironnement affecte la lymphopoïèse B de façon Ink4a/Arf-dépendante (1er article). De plus, les modifications systémiques qui résultent de l’IR compromettent l’homéostasie osseuse en augmentant la résorption de l’os, sans toutefois diminuer la formation de celui-ci (2e article). Ces données nous permettent de mieux comprendre les effets de la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse sur les fonctions hématopoïétiques. Par ailleurs, elles suggèrent que l’emploi de drogues et/ou de procédés n’induisant pas la sénescence des cellules stromales de l’os offrirait un meilleur pronostic à long terme pour les patients.

La dynamique chromatinienne induite par le pic de LH dans les cellules de granulosa chez la souris

La régulation transcriptionnelle des gènes est un processus indispensable sans lequel la diversité phénotypique des cellules ainsi que l’adaptation à leur environnement serait inexistant. L’identification des éléments de régulation dans le génome est d’une importance capitale afin de comprendre les mécanismes gouvernant l’expression des gènes spécifiques à un type cellulaire donné. Ainsi, suite au pic de LH, le follicule ovarien entre dans un programme intensif de différentiation cellulaire, orchestré par des modifications majeures du profile transcriptionnel des cellules de granulosa, déclenchant ultimement l’ovulation et la lutéinisation, processus indispensables à la fertilité femelle. L’hypothèse supportée par cette étude stipule qu’une réorganisation de la structure chromatinienne survient aux régions régulatrices d’une panoplie de gènes dans les heures suivant le pic de LH et qu’en isolant et identifiant ces régions, il serait possible de retrouver des éléments essentiels aux processus d’ovulation et de lutéinisation. Ainsi, en utilisant un protocole standard de superovulation chez la souris, les éléments de régulation se modifiant 4h suivant l’administration de hCG ont été isolés et identifiés dans les cellules de granulosa en utilisant la méthode FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) combinée à un séquençage haut débit. Cette étude a démontré que suite au stimulus ovulatoire, les cellules de granulosa subissent une reprogrammation majeure des éléments de régulation, qui est corrélée avec une modification drastique de leurs fonctions biologiques. De plus, cette étude a mis en évidence une association majoritaire des éléments de régulation à des régions intergéniques distales et à des introns, indiquant que ces régions ont une importance capitale dans la régulation transcriptionnelle dans les cellules de granulosa. Cette étude a également permis d’identifier une panoplie de régulateurs transcriptionnels reconnus pour être essentiels à la fonction ovarienne, ainsi que leur sites de liaison dans le génome, démontrant que la méthode FAIRE est une méthode assez puissante pour permettre la prédiction d’événements moléculaires précis ayant un sens physiologique réel.

Mécanismes moléculaires de la réplication préférentielle du VIH-1 dans les cellules à polarisation Th1Th17 versus Th1 : rôle de PPARG dans la régulation négative de la réplication virale

Les cellules T CD4+ humaines sont hétérogènes du point de vue de la permissivité à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Notre laboratoire a préalablement démontré que les cellules Th1 à phénotype CXCR3+CCR6- sont relativement résistantes à l’infection par le VIH-1 alors que les cellules Th1Th17 à phénotype CXCR3+CCR6+ y sont hautement permissives. La réplication du VIH dépend de plusieurs facteurs cellulaires de restriction ou de permissivité agissant à différentes étapes du cycle viral. Toutefois, malgré plusieurs avancées, la compréhension des voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation de la réplication du VIH est encore limitée. L’objectif majeur de ce projet de maîtrise est de caractériser les mécanismes moléculaires de la permissivité et de la résistance au VIH respectivement dans les cellules Th1Th17 et Th1. Ce mémoire est divisé en quatre parties qui visent: (i) l’identification des voies canoniques et des fonctions biologiques différemment régulées dans les cellules Th1Th17 versus Th1 par l’analyse de leur transcriptome au niveau du génome entier; (ii) la validation de l’expression différentielle des gènes d’intérêt identifiés par biopuces au niveau des transcrits et des protéines; (iii) la caractérisation du rôle fonctionnel de certains de ces facteurs (i.e., PPARG, AhR) sur la réplication du VIH dans les cellules Th1Th17 versus Th1; et (iv) l’identification du niveau auquel ces facteurs interfèrent avec le cycle de réplication du VIH. Nos résultats d’analyse du transcriptome du génome entier par Gene Set Enrichment Analysis et Ingenuity Pathway Analysis indiquent que les cellules à profil Th1Th17 sont plus susceptibles à l’activation cellulaire et à l’apoptose, favorisent plus l’inflammation et expriment moins fortement les gènes liés à la dégradation protéosomale comparé aux cellules à profil Th1. Ces différences dans la régulation de diverses voies et fonctions biologiques permettent en partie d’expliquer la susceptibilité à l’infection par le VIH dans ces cellules. Nous avons ensuite confirmé l’expression différentielle de certains gènes d’intérêt dans les cellules Th1Th17 (CXCR6, PPARG, ARNTL, CTSH, PTPN13, MAP3K4) versus Th1 (SERPINB6, PTK2) au niveau de l’ARNm et des protéines. Finalement, nous avons démontré le rôle des facteurs de transcription PPARG et AhR dans la régulation de la réplication du VIH. L’activation de la voie PPARG par la rosiglitazone induit la diminution importante de la réplication du VIH dans les cellules T CD4+, alors que l’activation de la voie AhR par les ligands exogènes TCDD et FICZ augmente de façon significative la réplication virale. Nous proposons que la voie PPARG agit comme un régulateur négatif de la réplication du VIH dans ces cellules, en interférant avec la polarisation Th17 et probablement en inhibant l’activité transcriptionnelle du facteur NF-kB. Les rôles des formes nucléaires versus cytoplasmiques du récepteur Ahr semblent être diamétralement opposés, dans la mesure où l’interférence ARN contre AhR s’associe également à l’augmentation de la réplication virale. Il est ainsi possible que la forme cytoplasmique d’AhR, connue par son activité E3 ligase, participe à la dégradation protéosomale des particules virales. Le mécanisme par lequel le AhR nucléaire versus cytoplasmique interfère avec la réplication virale est en cours d’étude au laboratoire. Cette étude représente la première caractérisation de l’expression différentielle de gènes au niveau du génome entier de sous-populations T CD4+ permissives versus résistantes à l’infection par le VIH. Nos résultats identifient de nouvelles cibles moléculaires pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la réplication du VIH dans les lymphocytes T CD4+ primaires.

Les bactéries exprimant AIDA-I interagissent avec l'apolipoprotéine A-I cellulaire

AIDA-I (adhesin involved in diffuse adherence) est une importante adhésine autotransporteur exprimée par certaines souches de Escherichia. coli impliquée dans la colonisation des porcelets sevrés causant la diarrhée post-sevrage et la maladie de l’œdème. Une précédente étude de notre laboratoire a identifié l’apolipoprotéine AI (ApoAI) du sérum porcin, la protéine structurale des lipoprotéines à haute densité, comme récepteur cellulaire putatif de AIDA-I. L’interaction entre ces deux protéines doit être caractérisée. Ici, nous montrons par ELISA que AIDA-I purifiée est capable d’interagir avec l’ApoAI humaine, mais également avec les apolipoprotéines B et E2. L’ApoAI est rencontrée sous deux formes, soit libre ou associée aux lipides. Nous montrons que la forme libre n’interagit pas avec les bactéries AIDA-I+ mais s’associe spécifiquement à l’ApoAI membranaire de cellules épithéliales HEp-2. Afin d’étudier le rôle de l’ApoAI dans l’adhésion des bactéries, nous avons infecté des cellules HEp-2 en présence d’anticorps dirigés contre l’ApoAI, mais l’adhésion des bactéries AIDA I+ n’a jamais été réduite. De plus, l’induction de l’expression de l’ApoAI par fénofibrate et GW7647 chez les cellules Caco 2 polarisée et Hep G2, n’a pas permis l’augmentation de l’adhésion cellulaire des E. coli exprimant AIDA-I. Notre étude suggère davantage que l’interaction entre AIDA-I et ApoAI n’intervient pas dans les mécanismes d’adhésion cellulaire.

Le rôle de la MAPK non-conventionnelle ERK3 dans le développement thymique

Les premières cellules progénitrices lympho-myéloïdes (LMPP) entrent dans le thymus et commencent leur processus de différenciation au stade double négatif (DN, CD4-CD8-). Après un réarrangement fonctionnel de la chaine bêta de leur récepteur des cellules T (RCT), les cellules reçoivent des signaux de différenciation, de prolifération, de survie et de sélection et passent au stade double positif (DP, CD4+CD8+). Ensuite, la chaine alpha du RCT est réarrangée et testée via les sélections positive et négative. Si le RCT reçoit un signal ni trop fort, ni trop faible, les cellules passent au stade simple positif où elles exprimeront soit la molécule CD4 ou CD8. ERK3, une MAPK non-conventionnelle, joue un rôle important dans le développement thymique. Des études précédentes ont démontré qu’une déficience en ERK3 diminue de 50 % la cellularité thymique et de 75% le nombre de cellules simples positives CD4 (CD4SP). Nous avons posé comme hypothèses qu’il y a une augmentation de l’apoptose chez les thymocytes DP de souris Erk3-/- et que cette déficience chez les thymocytes DP affecterait la sélection positive des cellules DP, réduisant ainsi le nombre de thymocytes CD4SP. Afin de vérifier la première hypothèse, nous avons regardé les niveaux d’apoptose grâce à la cytométrie en flux et par immunohistochimie. Dans les deux cas, nous étions incapables de détecter une différence du niveau d’apoptose chez les thymocytes DP entre les souris Erk3+/+ et Erk3-/-. Ensuite, nous nous sommes posés la question suivante : La demi-vie des thymocytes DP Erk3-/- était-elle plus courte que le type sauvage? La demi-vie des thymocytes DP a été mesurée à l’aide de l’étude des réarrangements secondaires de la chaine alpha du RCT par PCR semi-quantitatif et à l’aide de cultures de thymus fœtaux. En effet, ERK3 semble important pour prolonger la demi-vie des thymocytes DP. Ensuite, nous avons utilisé des marqueurs cellulaires différentiels (CD69, CD5 et RCT) pour regarder si les thymocytes DP sont capables de passer la sélection positive. En effet, il y a moins de thymocytes DP Erk3-/- qui sont CD69fort, CD5fort et RCTfort. Finalement, nous voulons savoir si les fonctions de ERK3 passent par MK5, son seul partenaire d’interaction connu à ce jour. Après la caractérisation du thymus de la souris Mk5-/-, nous observons que seulement la réduction du nombre de thymocytes CD4SP est identique à celle des thymocytes CD4SP de la souris Erk3-/-. En conclusion, ces résultats révèlent des fonctions importantes pour la molécule ERK3 lors du processus de sélection positive, le maintient de la demi-vie des thymocytes DP et lors de la régulation de développement thymique de manière MK5-dépendante et -indépendante.

ARF1 contrôle la migration des cellules hautement invasives du cancer du sein via Rac1

Dans un contexte où la forte prévalence du cancer du sein chez les femmes demeure depuis plusieurs années un enjeu de société majeur, les nouvelles stratégies visant à réduire la mortalité associée à cette maladie sont le sujet de nombreuses recherches scientifiques. Les facteurs d’ADP-ribosylation sont des petites protéines G monomériques importantes pour la réorganisation du cytosquelette d’actine, le remodelage des lipides membranaires et la formation de vésicules. Notre laboratoire a précédemment montré qu’ARF1 est surexprimée dans les cellules hautement invasives du cancer du sein et contribue à leur phénotype migratoire accru. Dans le cadre de ce mémoire, nous avons défini le rôle de cette GTPase dans la migration de telles lignées cellulaires. Pour ce faire, nous avons étudié le rôle d’ARF1 dans l’activation de Rac1, un membre de la famille des GTPases Rho connu pour son implication dans la formation de lamellipodes ainsi que dans la migration cellulaire. Globalement, nous avons déterminé que l’activation d’ARF1 permet l’activation subséquente de Rac1 ainsi que de la voie de signalisation nécessaire au processus de migration. Par une approche d’interférence à l’ARN dans les cellules MDA-MB-231, nous avons d’abord montré la contribution essentielle de Rac1 la migration dépendante d’ARF1. Puis, de façon à établir le mécanisme derrière cette régulation, nous avons montré que l’inhibition de l’expression endogène d’ARF1 altère l’activation de Rac1 dépendante de l’EGF. Nous avons ensuite examiné les conséquences d’une telle inhibition sur les partenaires d’interaction de Rac1. Nous avons découvert qu’ARF1 et Rac1 forment un complexe constitutif, puis qu’ARF1est nécessaire à l’association de Rac1 à IRSp53, une protéine importante dans la formation de lamellipodes. La translocation dépendante de l’EGF du complexe Rac1/IRSp53 à la membrane plasmique est également sous le contrôle d’ARF1. En conclusion, cette étude fournit un nouveau mécanisme par lequel ARF1 régule la migration cellulaire et identifie cette GTPase en tant que cible pharmacologique prometteuse pour freiner le développement des métastases chez les patients atteints du cancer du sein.

La résolution du problème de formation de cellules dans un contexte multicritère

Les techniques de groupement technologique sont aujourd’hui utilisées dans de nombreux ateliers de fabrication; elles consistent à décomposer les systèmes industriels en sous-systèmes ou cellules constitués de pièces et de machines. Trouver le groupement technologique le plus efficace est formulé en recherche opérationnelle comme un problème de formation de cellules. La résolution de ce problème permet de tirer plusieurs avantages tels que la réduction des stocks et la simplification de la programmation. Plusieurs critères peuvent être définis au niveau des contraintes du problème tel que le flot intercellulaire,l’équilibrage de charges intracellulaires, les coûts de sous-traitance, les coûts de duplication des machines, etc. Le problème de formation de cellules est un problème d'optimisation NP-difficile. Par conséquent les méthodes exactes ne peuvent être utilisées pour résoudre des problèmes de grande dimension dans un délai raisonnable. Par contre des méthodes heuristiques peuvent générer des solutions de qualité inférieure, mais dans un temps d’exécution raisonnable. Dans ce mémoire, nous considérons ce problème dans un contexte bi-objectif spécifié en termes d’un facteur d’autonomie et de l’équilibre de charge entre les cellules. Nous présentons trois types de méthodes métaheuristiques pour sa résolution et nous comparons numériquement ces métaheuristiques. De plus, pour des problèmes de petite dimension qui peuvent être résolus de façon exacte avec CPLEX, nous vérifions que ces métaheuristiques génèrent des solutions optimales.

Modulation par le récepteur neurokinine-1du mécanisme d’action des immunosuppresseurs chez les cellules T.

Le récepteur neurokinine 1 (NK1R) est impliqué dans la régulation des réponses immunitaires innées et adaptatives. Cependant, les mécanismes par lesquels le NK1R modulerait ces réponses ne sont pas connus. Chez les cellules T, les voies de la calcineurine et de la mTOR constituent les cibles d’immunosuppresseurs, comme la cyclosporine A (CsA), le tacrolimus et la rapamycine. Ainsi, nous avons voulu déterminer si le NK1R pourrait agir sur ces voies et si le blocage pharmacologique du NK1R avec des antagonistes sélectifs, pourrait augmenter l’action de ces immunosuppresseurs sur l’activation des cellules T. Tout d’abord, nos résultats ont montré que les cellules Jurkat (celules T humaines) exprimaient à la fois le gène du NK1R et de son ligand (les endokinines). Ceci suggère l'existence d'une régulation autocrine tachykinergique de la fonction des cellules T. Cette hypothèse est appuyée par nos données, où nous avons observé que le blocage du NK1R avec des antagonistes spécifiques (L-733,060 et L-703,606) chez les cellules Jurkat, inhibe la production d'IL-2 et diminue l'activation du NFAT (substrat de la calcineurine). De façon intéressante, nous avons montré un effet de combinaison entre les antagonistes du NK1R et les inhibiteurs de la calcineurine (CsA et tacrolimus) sur la production d’IL-2 et l’activation du NFAT. En revanche, le blocage du NK1R n'a pas d'effet inhibiteur sur l’activation de la mTOR et la p70S6K, mais réduit la phosphorylation de S6R (Ser235/236) et Akt (Ser473). Enfin, nous n’avons observé aucun effet de combinaison avec la rapamycine et l’antagoniste NK1R sur l’activation de mTOR et de sa voie de signalisation. L’ensemble de nos résultats, démontrent la présence d'un nouveau mécanisme de régulation de NFAT impliquant le système tachykinergique NK1R/endokinines chez les cellules T. Par conséquent, nous suggérons que la combinaison des antagonistes NK1R avec les inhibiteurs de la calcineurine pourrait être une alternative thérapeutique intéressante afin de réduire les doses de CsA et le FK506 dans les protocoles de prévention de rejet de greffes.

Sensibilité des cellules leucémiques aux immunoconjugués anti-CD33

La leucémie myéloïde aigue (LMA), cancer du sang causé par une prolifération excessive des précurseurs myéloïdes à un stade précoce de maturation, est associée à une survie variant entre 20 et 30% à cinq ans en dépit des traitements de chimiothérapie les plus intensifs. L’antigène CD33 est exprimé chez les cellules malignes dans 90% des LMA ce qui en fait une cible de choix pour le développement d’immunoconjugué (IC). Trois IC composés d’un anticorps monoclonal anti-CD33 couplé à la maytansine, une toxine s’attaquant aux fuseaux mitotiques, ont été créés. Nous avons étudié l’effet de ces IC sur des cellules primaires et des lignées cellulaires LMA et étudier les mécanismes pouvant expliquer différents niveaux de sensibilité. Les études effectuées ont permis de déterminer que le niveau d’expression du CD33 n’explique pas la variation de sensibilité face aux IC. Il a été démontré que les IC anti-CD33 sont internalisés rapidement par la cellule et que le conjugué est retrouvé au niveau de l’endosome en premier lieu. Il a été confirmé que le lysosome est essentiel à l’effet anti-mitotique induit par le conjugué. Aussi, il est proposé que la protéine SOCS3 pourrait jouer un rôle dans la résistance aux IC anti-CD33 en dirigeant le complexe IC-CD33-SOCS3 vers le protéasome et ainsi empêcher la libération du composé toxique par le lysosome. Nous avons aussi conclu que les variations d’agent de liaison et l’augmentation du nombre de molécules toxiques entre les 3 IC n’ont pas été suffisantes pour augmenter leur efficacité à éliminer les cellules LMA. L’évaluation de ces IC ainsi que l’identification des mécanismes de résistance permettra de cibler les patients les plus susceptibles de bénéficier de ce type de traitement et potentiellement d’identifier de nouvelles voies pour améliorer l’efficacité des traitements.

Caractérisation phénotypique et génotypique de Campylobacter jejuni et évaluation d’une stratégie de contrôle de la colonisation du poulet de chair par ce pathogène alimentaire

Campylobacter jejuni est l’agent causal de la campylobactériose, infection bactérienne importante en santé publique. Un des vecteurs de transmission de C. jejuni pour l’humain est le poulet via la chaîne alimentaire. Les mécanismes impliqués dans colonisation caecale commensale des oiseaux par C. jejuni sont toujours peu caractérisés, bien qu’une meilleure compréhension de ces mécanismes puisse apporter des solutions pour le contrôle du pathogène à la ferme. Cette étude avait pour buts de caractériser les propriétés phénotypiques et les facteurs génétiques impliqués dans la colonisation du poulet par C. jejuni et d’identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans cette association. Des souches, issues d’élevages conventionnels échantillonnés en 2003 et en 2008 ainsi que d’élevages biologiques, ont été caractérisées afin d’obtenir leur profil de résistance aux antibiotiques, leur autoagglutination et leur chimiotactisme. Les souches des élevages conventionnels ont de plus été caractérisées pour leur capacité à adhérer et envahir une culture primaire de cellules caecales de poulet. Une puce à ADN a été développée pour détecter la présence de 254 gènes et variants associés à la colonisation des poulets ainsi qu’à la résistance aux antibiotiques chez les souches issues d’élevages conventionnels. Les propriétés phénotypiques et la présence de certains gènes chez les souches ont par la suite été comparées. Finalement, des souches ayant des caractéristiques différentes ont été utilisées dans un modèle de colonisation du poulet pour évaluer l’efficacité d’un nouvel additif alimentaire à base d’acides organiques et d’huiles essentielles sur le contrôle de C. jejuni. Les propriétés phénotypiques des souches étaient très variées et n’étaient pas corrélées entre elles, à l’exception de l’adhésion et de l’invasion. L’analyse génétique a révélé que le contenu en gènes des souches était variable, notamment au niveau des gènes de l’enveloppe bactérienne, au flagelle, aux récepteurs du chimiotactisme et à la résistance à l’arsenic. Les souches de 2003 et de 2008 étaient semblables lorsque leur contenu en gènes ainsi que leurs propriétés phénotypiques étaient comparés. Des gènes possiblement associés à un fort ou un faible potentiel de colonisation ont été identifiés. L’additif alimentaire a diminué la contamination des carcasses bien qu’une augmentation de la colonisation intestinale ait été observée pour certaines souches. La moitié des lots de poulets d’origine biologique étaient positifs pour C. jejuni. Les souches issues de ce type d’élevage étaient peu résistantes aux antibiotiques et possédaient des phénotypes variés. Cette étude a permis de mieux définir les caractéristiques importantes de C. jejuni qui sont associées à la colonisation intestinale du poulet. Elle a établi pour la première fois au Canada la présence du pathogène dans les élevages de poulets biologiques. Cette étude fait partie des quelques études qui décrivent la présence des gènes de colonisation et de résistance aux antibiotiques dans une collection de souches issues uniquement du poulet. Elle a également remis en doute l’importance de certains gènes dans la colonisation. La caractérisation exhaustive des souches a également permis d’identifier de nouveaux gènes possiblement associés à la colonisation de poulet par C. jejuni. Finalement, elle a indiqué que l’utilisation d’un mélange d’huiles essentielles et d’acide organique encapsulés pouvait être efficace pour réduire la contamination des carcasses de poulet par C. jejuni et que son effet était souche-dépendant.

Étude de la variation de phase des fimbriae F1651, Pap et CS31A et de l'impact des régulateurs homologues de PapI

Les Escherichia coli pathogènes extra-intestinaux (ExPEC) sont responsables d’une grande variété de maladies. Plus particulièrement, certaines souches ExPEC, du sous-groupe d’E. coli uropathogènes, sont porteuses de fimbriae de type P. Cette famille d’adhésines est soumise à une régulation transcriptionnelle appelée variation de phase; un mécanisme du tout ou rien. Il s’agit d’une compétition entre deux protéines régulatrices : la Dam méthylase et la nucléoprotéine Lrp. Ce mécanisme est aussi soumis à l’influence des régulateurs locaux PapB et PapI, deux régulateurs essentiels. Afin d’étudier PapI et ses homologues ainsi que leur impact sur la variation de phase des fimbriae F1651, Pap et CS31A. Grâce à une fusion chromosomique entre la région régulatrice de clp et les gènes lacZYA, nous avons étudié l’effet, en trans, de PapI et FooI qui ont pu restaurer la variation de phase avec une forte tendance pour la phase OFF. Pour étudier l’action de ces protéines sur foo et pap, nous avons utilisé un système utilisant gfp comme gène rapporteur de l’activité des promoteurs des opérons pap et foo. Cela a permis d’observer la variation de phase au niveau cellulaire par cytométrie en flux et en temps réel par microscopie à fluorescence. Ces expériences ont confirmé que la population de cellules F1651 positives a un phénotype d’expression de F1651 partielle alors que les cellules Pap sont en majorité en phase OFF. PapI et FooI n’ont pas la même influence sur la variation de phase, puisque FooI favorise une plus grande fréquence de variation de phase.

Identification et caractérisation de gènes chez Salmonella enterica sérovar Typhi impliqués dans l’interaction avec les macrophages humains.

Le genre bactérien Salmonella regroupe plus de 2500 sérovars, mais peu sont responsables de pathologies humaines. Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est reconnu pour son importance médicale à travers le globe. S. Typhi cause la fièvre typhoïde chez l’Homme, une maladie infectieuse létale caractérisée par la dissémination systémique de la bactérie vers des organes du système réticulo-endothélial. La fièvre typhoïde représente un fardeau pour la santé mondiale, notamment auprès des pays en développement où les conditions sanitaires sont désuètes. La situation se complique davantage par l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques. De plus, les deux vaccins licenciés sont d’efficacité modérée, présentent certaines contraintes techniques et ne sont pas appropriés pour les jeunes enfants et nourrissons. La phase systémique de l’infection par Salmonella repose sur sa survie dans les macrophages du système immunitaire. Dans ce compartiment intracellulaire, la bactérie module les défenses antimicrobiennes grâce à de multiples facteurs de virulence encodés dans son génome. Les mécanismes moléculaires sollicités sont complexes et finement régulés. Malgré les progrès scientifiques réalisés précédemment, plusieurs incompréhensions persistent au sujet de l’adaptation de ce pathogène dans les macrophages de l’hôte. Pour mieux concevoir les déterminants génétiques de S. Typhi impliqués dans l’interaction avec ces cellules, une stratégie de sélection négative a été appliquée afin de vérifier systématiquement l’effet direct des gènes pendant l’infection. En premier temps, une librairie de mutants par transposon chez S. Typhi a été créée pour l’infection de macrophages humains en culture. Après 24 heures d’infection, la présence des mutants fut évaluée simultanément par analyse sur des biopuces de Salmonella. Au total, 130 gènes ont été sélectionnés pour leur contribution potentielle auprès des macrophages infectés. Ces gènes comptaient des composantes d’enveloppe bactérienne, des éléments fimbriaires, des portions du flagelle, des régulateurs, des facteurs de pathogenèse et plusieurs protéines sans fonction connue. En deuxième temps, cette collection de gènes a dirigé la création de 28 mutants de délétion définie chez S. Typhi. Les capacités d’entrée et de réplication intracellulaire de ces mutants au sein des macrophages humains ont été caractérisées. D’abord, les macrophages ont été co-infectés avec les mutants en présence de la souche sauvage, pour vérifier la compétitivité de chacun d’eux envers cette dernière. Ensuite, les mutants ont été inoculés individuellement chez les macrophages et leur infectivité fut mesurée comparativement à celle de la souche sauvage. Sommairement, 26 mutants ont présenté des défauts lorsqu’en compétition, tandis que 14 mutants se sont montrés défectueux lorsque testés seuls. Par ailleurs, 12 mutants ont exposé une déficience lors de l’infection mixte et individuelle, incluant les mutants acrA, exbDB, flhCD, fliC, gppA, mlc, pgtE, typA, waaQGP, STY1867-68, STY2346 et SPI-4. Notamment, 35 nouveaux phénotypes défectueux d’entrée ou de survie intracellulaire chez Salmonella ont été révélés par cette étude. Les données générées ici offrent plusieurs nouvelles pistes pour élucider comment S. Typhi manipule sa niche intracellulaire, menant à l’infection systémique. Les gènes décrits représentent des cibles potentielles pour atténuer la bactérie chez l’humain et pourraient contribuer au développement de meilleures souches vaccinales pour immuniser contre la fièvre typhoïde.

Développement de nouveaux sels Binol-imidazoliums : de la catalyse asymétrique aux applications biologiques

Le 1,1'-bi-2-naphtol ou Binol, présentant une chiralité axiale, est un ligand très utilisé en catalyse asymétrique. Au cours des vingt dernières années, le Binol a servi de synthon à l’élaboration de très nombreux ligands permettant la catalyse asymétrique de tous types de réactions, allant de l’hydrogénation, à l’alkylation, en passant par diverses réactions péricycliques. Le grand intérêt pour ce ligand vient de sa versatilité et des nombreuses possibilités de fonctionnalisation qu’il offre, permettant d’altérer ses propriétés catalytiques à volonté, aussi bien en modifiant son caractère électronique, qu’en introduisant des facteurs stériques autour du site catalytique. Parallèlement aux développements de la catalyse par des dérivés de Binol, le domaine des liquides ioniques a connu un intérêt croissant ces dernières années. Les liquides ioniques, sels dont le point de fusion est inférieur à 100°C, cumulent de nombreuses qualités convoitées : faible pression de vapeur, stabilité thermique et chimique et fort pouvoir de solvatation. Dû à ces propriétés, les liquides ioniques ont principalement été étudiés dans l’optique de développer une gamme de solvants recyclables. Alors que les propriétés des liquides ioniques sont facilement modulables en fonction de l’anion et du cation choisi, le concept de liquide ionique à tâche spécifique va plus loin et propose d’introduire directement, sur le cation ou l’anion, un groupement conférant une propriété particulière. En suivant cette approche, plusieurs ligands ioniques ont été rapportés, par simple couplage d’un cation organique à un ligand déjà connu. Étonnamment, le Binol a fait l’objet de très peu de travaux pour l’élaboration de ligands ioniques. Dans cette thèse, nous proposons l’étude d’une famille de composés de type Binol-imidazolium dont les unités Binol et imidazolium sont séparées par un espaceur méthylène. Différents homologues ont été synthétisés en variant le nombre d’unités imidazolium et leur position sur le noyau Binol, la longueur de la chaîne alkyle portée par les unités imidazolium et la nature du contre-anion. Après une étude des propriétés thermiques de ces composés, l’utilisation des Binol-imidazoliums en tant que ligands dans une réaction asymétrique d’éthylation d’aldéhydes aromatique a été étudiée en milieu liquide ionique. La réaction a été conduite en solvant liquide ionique dans le but de recycler aussi bien le ligand Binol-imidazolium que le solvant, en fin de réaction. Cette étude nous a permis de démontrer que la sélectivité de ces ligands ioniques dépend grandement de leur structure. En effet, seuls les Binols fonctionnalisés en positions 6 et 6’ permettent une sélectivité de la réaction d’éthylation. Alors que les dérivés de Binol fonctionnalisés en positions 3 et 3’ ne permettent pas une catalyse énantiosélective, il a déjà été rapporté que ces composés avaient la capacité de complexer des anions. D’autre part, il a déjà été rapporté par notre groupe, que les composés comportant des unités imidazolium pouvaient permettre le transport d’anions à travers des bicouches lipidiques en fonction de leur amphiphilie. Ceci nous a amenés à la deuxième partie de cette thèse qui porte sur les propriétés ionophores des Binols fonctionnalisés en positions 3 et 3’ par des unités imidazoliums. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à l’étude de la relation structure-activité et au mécanisme de transport de ces composés. Le transport d’anions étant un processus clé dans la biologie cellulaire, l’activité biologique des composés présentant une activité ionophore dans des systèmes modèles (liposomes) a été étudiée par la suite. L’activité antibactérienne des nos composés a été testée sur quatre souches de bactéries. Il s’est avéré que les composés Binol-imidazolium sont actifs uniquement sur les bactéries Gram positives. Finalement, la cytotoxicité des composés présentant une activité antibactérienne a été étudiée sur des cellules humaines.