In vitro generation and characterization of acute myeloid leukemia-reactive CD8 + cytotoxic T-lymphocyte clones from healthy donors

Donor-derived CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) eliminating host leukemic cells mediate curative graft-versus-leukemia (GVL) reactions after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The leukemia-reactive CTLs recognize hematopoiesis-restricted or broadly expressed minor histocompatibility and leukemia-associated peptide antigens that are presented by human leukocyte antigen (HLA) class I molecules on recipient cells. The development of allogeneic CTL therapy in acute myeloid leukemia (AML) is hampered by the poor efficiency of current techniques for generating leukemia-reactive CTLs from unprimed healthy donors in vitro. In this work, a novel allogeneic mini-mixed lymphocyte/leukemia culture (mini-MLLC) approach was established by stimulating CD8+ T cells isolated from peripheral blood of healthy donors at comparably low numbers (i.e. 10e4/well) with HLA class I-matched primary AML blasts in 96-well microtiter plates. Before culture, CD8+ T cells were immunomagnetically separated into CD62L(high)+ and CD62L(low)+/neg subsets enriched for naive/central memory and effector memory cells, respectively. The application of 96-well microtiter plates aimed at creating multiple different responder-stimulator cell compositions in order to provide for the growth of leukemia-reactive CTLs optimized culture conditions by chance. The culture medium was supplemented with interleukin (IL)-7, IL-12, and IL-15. On day 14, IL-12 was replaced by IL-2. In eight different related and unrelated donor/AML pairs with complete HLA class I match, numerous CTL populations were isolated that specifically lysed myeloid leukemias in association with various HLA-A, -B, or -C alleles. These CTLs recognized neither lymphoblastoid B cell lines of donor and patient origin nor primary B cell leukemias expressing the corresponding HLA restriction element. CTLs expressed T cell receptors of single V-beta chain families, indicating their clonality. The vast majority of CTL clones were obtained from mini-MLLCs initiated with CD8+ CD62L(high)+ cells. Using antigen-specific stimulation, multiple CTL populations were amplified to 10e8-10e10 cells within six to eight weeks. The capability of mini-MLLC derived AML-reactive CTL clones to inhibit the engraftment of human primary AML blasts was investigated in the immunodeficient nonobese diabetic/severe combined immune deficient IL-2 receptor common ��-chain deficient (NOD/SCID IL2R��null) mouse model. The leukemic engraftment in NOD/SCID IL2R��null was specifically prevented if inoculated AML blasts had been pre-incubated in vitro with AML-reactive CTLs, but not with anti-melanoma control CTLs. These results demonstrate that myeloid leukemia-specific CTL clones capable of preventing AML engraftment in mice can be rapidly isolated from CD8+ CD62L(high)+ T cells of healthy donors in vitro. The efficient generation and expansion of these CTLs by the newly established mini-MLLC approach opens the door for several potential applications. First, CTLs can be used within T cell-driven antigen identification strategies to extend the panel of molecularly defined AML antigens that are recognizable by T cells of healthy donors. Second, because these CTLs can be isolated from the stem cell donor by mini-MLLC prior to transplantation, they could be infused into AML patients as a part of the stem cell allograft, or early after transplantation when the leukemia burden is low. The capability of these T cells to expand and function in vivo might require the simultaneous administration of AML-reactive CD4+ T cells generated by a similar in vitro strategy or, less complex, the co-transfer of CD8-depleted donor lymphocytes. To prepare clinical testing, the mini-MLLC approach should now be translated into a protocol that is compatible with good manufacturing practice guidelines.

Host immune response in immunodeficient mice against infection with Cryptosporidium parvum

Immunantwort von immundefizienten M��usen gegen��ber Infektionen mit Cryptosporidium parvum. Cryptosporidium parvum ist ein intrazellul��rer, protozoischer Krankheitserreger, der im immunkompromittierten Wirt zu lebensbedrohender Enteritis f��hren kann. CD4+ T-Zellen und Interferon (IFN)-�� spielen wesentliche Rollen bei der Wirtsimmunantwort gegen die Infektion. Dennoch sind die Effektormechanismen, die zur Resistenz f��hren nur wenig verstanden. In dieser Studie wurde die Immunantwort von IFN-��- und Interleukin (IL)-12-Defektm��usen parallel zu Wildtypm��usen analysiert. Die Ergebnisse identifizierten IFN-�� als Schl��sselzytokin bei der nat��rlichen und erworbenen Immunit��t w��hrend der Erst- und Folgeinfektion mit C. parvum. Tumornekrosefaktor (TNF)-�� ist m��glicherweise ein Induktor der fr��hen IFN-��-Antwort in IL-12 Knockout-M��usen. Weiterhin tragen offenbar sowohl Th1- als auch Th2-Zytokine zur ��berwindung der Prim��rinfektion bei, die ersten mehr als die letztgenannten. Zytokingene waren am Ort der Infektion (Ileum) dramatisch ver��ndert, nicht aber in den lokalen Lymphknoten und der Milz. Nach Folgeinfektion ergab sich in Abwesenheit von IFN-�� eine signifikante Erh��hung der Th2-Zytokine IL-5 and IL-13. Die Ergebnisse zeigten weiterhin, dass das Th1-Zytokin IL-18 zur Resistenz gegen��ber C. parvum beitr��gt, m��glicherweise durch verschiedene Immunfunktionen, wie der Regulation von Serum-IFN-�� w��hrend der Infektion und/oder der Erhaltung der Homeostase der Th1/Th2-Zytokine durch Regulation der Th2-Zytokine. Weiterhin zeigten diese Untersuchungen den Transfer von Resistenz gegen��ber C. parvum von infizierten auf na��ve M��use mittels stimulierter intraepithelialer Lymphozyten und CD4+ T-Zellen. Diese Ergebnisse weisen auf die Gegenwart von C. parvum-spezifischen CD4+ T-Zellen in anderen lymphatischen Geweben neben der Darmmukosa hin. Eine Stimulation der Spendertiere durch Infektion war notwendig f��r eine ��bertragbare sch��tzende Immunit��t. Dennoch konnte die ��bertragene Immunit��t nicht die Infektion der Empf��ngertiere vollst��ndig verhindern; eine Verdopplung der Spenderzellen f��hrte zu keinem besseren Ergebnis. Weiterhin ergab der Transfer von CD4+ und CD8+ T-Zellen (Pan-T-Zellen) keinen erh��hten Schutz der naiven Empf��ngertiere als der alleinige Transfer von CD4+ T-Zellen. Dies weist auf die fehlende Bedeutung der CD8+ T-Zellen beim Schutz vor C. parvum-Infektion hin.

Die Rolle von IL-17 in Patienten und im Mausmodell f��r Lungen-Adenokarzinom

Die Funktion der Th 17-Zelllinie im Lungenkarzinom wurde noch nicht vollst��ndig verstanden. In dieser Studie wurde dar��ber berichtet, dass die Expression der Th17-Zellmarker (RORA, RORC2, IL-17A) in den Lungen der Patienten mit Adenokarzinom erh��ht ist, und diese mit dem Transkriptionsfaktor der regulatorischen T-Zellen FOXP 3 positiv korrelieren, was auf eine Beziehung dieser Zelltypen deutet. Au��erdem hat man auch herausgefunden, dass IL-17A mit T-bet Trankriptionsfaktor in den Patienten entgegengesetzt korreliert. Die Blockade in einem Mausmodell f��r Lungen-Adenokarzinom resultierte die Reduktion von Tumorbefall in der Lunge, lokale Expansion der IFNg produzierenden CD4+ T-Effektorzellen und Reduktion der CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T-Zellen. Untersuchungen in T-bet(-/-) M��usen zeigten, dass die antikarzinogenen Wirkungen der antiIL-17A-Behandlung T-bet Transkriptionsfaktor ben��tigen, um sowohl die FOXP3 regulatorischen T-Zellen als auch die Th17-Zellen in vivo zu supprimieren. Dementsprechend hat man herausgefunden, dass der Th17-Pfad beim Fehlen des T-bet Transkriptionsfaktors durch Hochregulierung des IL-23 Rezeptors in CD4+ T-Zellen stimuliert wurde. Bemerkenswert, dass der IL-17 Rezeptor haupts��chlich auf den CD4+CD62Lhigh naiven T-Zellen exprimiert wird und sowohl auf den CD4+T-bet+ Th1- als auch auf den CD4+CD25+FOXP3+ Treg -Zellen im Tumor fehlt. Dieses resultiert den Verlust der Kontrolle der IL-17 auf Th1 und Treg-Zellentwicklung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Blockade des IL-17A eine m��gliche klinische Behandlung darstellt, weil sie die IFNg produzierenden Th1 Zellen unterst��tzt und die CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T Zellen in Lungen Karzinom reduziert.

Die Rolle der Ubiquitin-Ligase Smurf2 in T-Lymphozyten bei der Entwicklung von chronisch entz��ndlichen Darmerkrankungen

TGF-beta ist ein Schl��sselmolek��l zellvermittelter Immuntoleranz. So spielt es neben seiner pleiotropen Rolle in Immunzellen auch bei der Tumorentwicklung eine gro��e Rolle. Das TGF-beta hat bei der Tumorentwicklung eine duale Rolle. So dient es in fr��hen Phasen als Tumorsuppressor, w��hrenddessen es in sp��ten Phasen der Entwicklung als Tumorpromotor wirkt. Eine strikte Regulation des TGF-beta Signalweges ist daher f��r ein funktionierendes Immunsystem von essentieller Bedeutung. Die Ubiquitin Ligase Smurf2 ist dabei ein wichtiger negativ Regulator des TGF-beta Signalweges.In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Splei��form des Smurf2 (dE2Smurf2) aus murinen CD4+ T-Zellen isoliert werden, deren Funktion in vitro und in vivo in T-Lymphozyten untersucht worden ist. F��r diese Splei��form konnte zudem eine humane Relevanz nachgewiesen werden. Mit Hilfe von ��berexpressionen in Cos7 Zellen konnte eine ver��nderte Lokalisation der Smurf2 Splei��formen (WT und dE2) festgestellt werden. Dabei konnten lysosomale und endosomale Kompartimente bei der Kolokalisation mit dem dE2Smurf2 Konstrukt beobachtet werden. Das Splei��en des Exons2 f��hrte dabei zu ��nderungen der Topologie der N-terminalen C2-Dom��ne, wodurch sich eine ver��nderte Lokalisation in der Zelle beschreiben lie��. Mit der ver��nderten intrazellul��ren Verteilung erfuhr auch die Funktion der dE2Smurf2 Ubiquitin Ligase eine ��nderung. So konnte ��berraschenderweise eine positive Signalinduktion des TGF-beta Signalweges beobachtet werden, was im Gegensatz zum beschriebenen WTSmurf2 stand. Durch eine ��berexpression des dE2Smurf2 Proteins in T-Lymphozyten wurde der TGF-beta Signalweg in CD4+ und CD8+ Zellen positiv reguliert, dabei wurde der TGFbetaRII vermehrt exprimiert und gleichzeitig fand eine verst��rkte Phosphorylierung der Transkriptionsfaktoren Smad2 und Smad3 nach TGF-beta Stimulation statt. Die transgenen T-Lymphozyten waren somit sensitiver gegen��ber TGF-beta. Dies f��hrte zur Hypothese, die durch Western Blot Analyse best��tigt werden konnte, da�� das dE2Smurf2 nach ��berexpression seine WT-Form bindet und dadurch degradiert. Die Degradation der Ubiquitin Ligase war dabei Smad7 abh��ngig. Zur Analyse des Einflusses der Ubiquitin Ligase dE2Smurf2 auf die Differenzierung von CD4+ T-Zellen, sowie ihre Rolle bei der T-Zell Proliferation, konnte gezeigt werden, da�� durch die h��here Sensitivit��t gegen��ber TGF-beta naive T-Zellen unter Einflu�� von TGF-beta und IL6 vermehrt in TH17 Zellen differenzierten. Zudem konnte gezeigt werden, da�� die Proliferationsrate transgener naiver CD4+ T-Zellen bei geringen Mengen von TGF-beta starkt vermindert war. Weiterhin konnte gezeigt werden, da�� bei einer Differenzierung der naiven CD4+ T-Zellen in TH1 Zellen, diese signifkant weniger das proinflammatorische Zytokin INF�� produzierten.So zeigten in vivo Versuche, da�� die transgenen Tiere in der Entwicklung von Kolorektalen Karzinomen protektiert waren. Sowohl im kolitisassiziierten Tumor Modell als auch bei der spontanen Entwicklung von Tumoren im APCmin Modell. Dies konnte zum einen auf eine deutlich verminderte Entz��ndung (geringere Produktion an Zytokinen durch verminderte Proliferation) des Darms und zum anderen durch eine st��rkere Produktion an zytotoxischen Genen, wie Perforin, INF�� und Granzym B erkl��rt werden. Interessanterweise konnte jedoch im Transfer Kolitis Modell eher eine proinflammatorische Wirkung des dE2Smurf2 Proteins nachgewiesen werden. So wiesen die immundefizienten M��use, in denen die transgenen T-Zellen injiziert wurden, eine signifikant st��rkere Kolitis auf als die Kontrollen. Dies konnte mit einer ��berproduktion an IL17 sezernierenden T-Zellen erkl��rt werden. Klonierungsexperimente f��hrten zudem zur Identifikation einer bisher nicht beschriebenen nicht kodierenden RNA. Diese zeigte in Kombination mit dem dE2Smurf2 Protein in einer Reportergen Analyse eine Hyperaktivierung des Smad3 Promotors. Diese Daten liefern zum einen ein genaueres Modell ��ber die Regulation des TGF-beta Signalweges sowie wichtige Erkenntnisse zur Pathophysiologie chronisch entz��ndlicher Darmerkrankung und daraus resultierende Tumorerkrankungen. So entwickelt sich das dE2Smurf2, Teil des TGF-beta Signalweges, als attraktives Zielprotein f��r die Modulation von chronisch entz��ndlichen Darmerkrankungen und (kolitisassoziierte) Kolonkarzinomen.

Studio dell'interazione di HIV-1 sulle cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ (HPCs)

Oltre alla progressiva perdita dei linfociti T CD4, i pazienti HIV-infetti presentano diverse citopenie periferiche. In particolare l���anemia si riscontra nel 10% dei pazienti asintomatici e nel 92% di quelli con AIDS e la terapia cART non �� in grado di risolvere tale problematica. I meccanismi patogenetici alla base di questa citopenia si ritiene che possano riguardare la deregolazione citochinica, il danno alle HPCs, alle cellule in differenziamento e alle cellule stromali. Le cellule progenitrici ematopoietiche CD34+, dopo essere state separate da sangue cordonale e differenziate verso la linea eritroide, sono state trattate con HIV-1 attivo, inattivato al calore e gp120. In prima istanza �� stata messa in luce la mancata suscettibilit�� all���infezione e l���aumento dell��� apoptosi dovuto al legame gp120-CD4/CXCR4 e mediato dal TGF-��1 nelle cellule progenitrici indifferenziate. L���aspetto innovativo di questo studio per�� si evidenzia esaminando l���effetto di gp120 durante il differenziamento verso la filiera eritrocitaria. Sono stati utilizzati due protocolli sperimentali: nel primo le cellule sono inizialmente trattate per 24 ore con gp120 (o con HIV-1 inattivato al calore) e poi indotte in differenziamento, nel secondo vengono prima differenziate e poi trattate con gp120. Il ���priming��� negativo determina una apoptosi gp120-indotta molto marcata gi�� dopo 48 ore dal trattamento ed una riduzione del differenziamento. Se tali cellule vengono invece prima differenziate per 24 ore e poi trattate con gp120, nei primi 5 giorni dal trattamento, �� presente un aumento di proliferazione e differenziamento, a cui segue un brusco arresto che culmina con una apoptosi molto marcata (anch���essa dipendente dal legame gp120-CD4 e CXCR4 e TGF-��1 dipendente) e con una drastica riduzione del differenziamento. L���insieme dei risultati ha permesso di definire in modo consistente la complessit�� della genesi dell���anemia in questi pazienti e di poter suggerire nuovi target terapeutici in questi soggetti, gi�� sottoposti a cART.

Assessing the role of sCYLD and Bcl-3 in immune regulation

CYLD is a deubiquitinating enzyme, which negatively regulates NF-��B signaling by removing Lys63-linked polyubiquitin chains from its substrates. In mice, there are two variants of CYLD: full-length CYLD (FL-CYLD) and its short splice variant sCYLD. sCYLD lacks the NEMO and TRAF2 binding sites and CYLDex7/8 mice, which have been generated in our laboratory, overexpress sCYLD in the absence of the full length transcript. In this thesis, we show that bone marrow-derived macrophages (BMDCs) overexpressing sCYLD display a hyperactive phenotype. They have increased levels of the inflammatory cytokines IL-6 and TNF��, have exaggerated stimulatory capacity and fail to induce tolerance in in vivo experiments. CYLDex7/8 BMDCs have increased levels of nuclear Bcl-3, which we could show to be directly induced by sCYLD expression. NF-��B signaling was markedly upregulated in CYLDex7/8 BMDCs.rnBcl-3 overexpressing BMDCs with normal CYLD expression, however, were not hyperactive, suggesting that Bcl-3 overexpression is not sufficient for causing the observed phenotype. Taken together we propose a model in which the exclusive overexpression of sCYLD with high nuclear levels of Bcl-3 in BMDCs is accompanied by an increased NF-��B activation, resulting in a hyperactive phenotype.rnWe further analyzed macrophages overexpressing sCYLD using the LysMcre CyldFL/FL strain, but could not detect differences in activation marker expression, cytokine secretion or iNOS production. LysMcre CyldFL/FL mice immunized with MOG35-55 peptide showed a more severe course of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), which could not be explained by enhanced levels of MHC class II on CNS-resident macrophages and microglia or increased T cell infiltration.rnMice overexpressing Bcl-3 in T cells develop spontaneous colitis. They have less peripheral memory/effector T cells and less Th1 cells, whereas Th17 numbers are normal. Nai��ve T cells overexpressing Bcl-3 show defects in in vitro differentiation to the Th1 or Th17 fate. CD4+ T cells overexpressing Bcl-3 show enhanced survival capacity in in vitro culture, but have a defect in proliferative capacity when stimulated in vitro or when adoptively transferred into lymphopenic hosts.

Flagellin:allergen fusion proteins as novel vaccines for the treatment of severe type I allergies

Over the last decades the prevalence of food allergies has continually increased on a world wide scale. While there are effective treatments available for bee and wasp venom allergic patients, there is currently no established therapy for the treatment of severe food allergies. Aim of the project was to genetically fuse different food allergens with the immune modulating Toll-like receptor 5 (TLR5)-ligand flagellin and to test these constructs for their immune modulatory capacities both in vitro and in vivo. Chicken ovalbumin (Ova) as model antigen, Pru p 3, and Ara h 2 the respective major allergens from peach and peanut were used as allergens. The potential vaccine candidates were characterized by protein biochemical methods (purity, folding, endotoxin contaminations). Moreover, their immune modulating effects on cell culture lines (TLR5-receptor activation) and primary mouse immune cells (myeloid and plasmacytoid dendritic cells) were investigated. Additionally, the prophylactic and therapeutic use of the flagellin Ova fusion protein (rflaA:Ova) were investigated in a mouse model of intestinal allergy. In myeloid dendritic cells (mDC) stimulation with the fusion proteins led to a strong cell activation and cytokine secretion. Here, the fusion proteins proved to be a much stronger stimulus than the equimolar amount of both proteins provided alone or as a mixture. Noteworthy, stimulation with rflaA:Ova induced the secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10 from mDC. In co-culture experiments this IL-10 secretion suppressed the Ova-induced secretion of Th1 and Th2 cytokines from Ova-specific CD4 T cells. Using MyD88-deficient mDC this repression of cytokine secretion was shown to be TLR-dependent. Finally, the potency of the rflaA:Ova construct was investigated in a mouse model of Ova-induced intestinal allergy. In a prophylactic vaccination approach rflaA:Ova was shown to prevent the establishment of the intestinal allergy and all associated symptoms (weight loss, temperature drop, soft faeces). This fusion protein-mediated protection was accompanied by a reduced T cell activation, and reduced Th2 cytokines in intestinal homogenates. These effects were paralleled by a strong induction of Ova-specific IgG2a antibodies in rflaA:Ova-vaccinated sera, while Ova-specific IgE antibody production was significantly reduced. Therapeutic vaccination with rflaA:Ova reduced allergic symptoms and T cell activation but did not influence weight loss and antibody production. In all in vivo experiments vaccination with both proteins either provided alone or as a mixture did not have comparable effects. Future experiments aim at elucidating the mechanism and further optimization of the therapeutic vaccination approach. The results presented in this thesis demonstrate, that fusion proteins containing flagellin have strong immune modulatory capacities both in vitro and in vivo. Therefore, such constructs are promising vaccine candidates for the therapy of type I allergies.

Das Interleukin-1Beta-Rezeptor-Homolog im Modifizierten Vakziniavirus Ankara (MVA) - Charakterisierung und m��glicher Einfluss auf MVA-basierte Impfvektoren

MVA ist ein attenuiertes Vakziniavirus, das durch wiederholte Passagierung von Chorioallantoisvirus Ankara auf H��hnerembryofibroblasten gewonnen wurde. Es ist bis auf wenige Ausnahmen nicht mehr in der Lage, in S��ugerzellen zu replizieren, zeigt aber dennoch eine vollst��ndige virale Proteinexpression und induziert nach Immunisierung eine zu VACV vergleichbare Immunantwort. Aus diesem Grund wurde es bereits als Impfstoff gegen die menschliche Pockenerkrankung eingesetzt, ohne hierbei die bei den klassischen Impfviren beobachtbaren Nebenwirkungen hervorzurufen. Das Genom von MVA enth��lt jedoch noch Immunmodulatoren, deren Deletion Ansatzpunkt f��r die weitere Verbesserung des Impfstoffes sein kann. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Deletionsmutante untersucht, bei der das Gen f��r den Interleukin-1�� Rezeptor (IL-1��R) deletiert ist (MVA ��IL-1��R). Es konnte nachgewiesen werden, dass der IL-1��R in murinen als auch in humanen Zellen exprimiertes IL-1�� bindet und somit inaktiviert. Des Weiteren wurde gefunden, dass MVA in der Lage ist, IL-1�� in antigenpr��sentierenden Zellen zu induzieren, welches aber durch die Neutralisierung aufgrund des IL-1��R nur transient nachzuweisen war. Im Gegensatz dazu induzierte MVA ��IL-1��R eine anhaltende und um ein Vielfaches erh��hte Sekretion an IL-1��. Untersuchungen in antigenpr��sentierenden Zellen aus knock-out M��usen, die verschiedene Defizienzen in den Signalwegen zur IL-1��-Induktion trugen, zeigten, dass die Sekretion von IL-1�� von Caspase-1 abh��ngig war, welches wahrscheinlich aus der vorgeschalteten Aktivierung der NLRP3- und/oder AIM2-Inflammasomen resultierte. Interessanterweise wurden auch Caspase-1 unabh��ngige Mechanismen beobachtet, die auf eine Inflammasom-unabh��ngige IL-1��-Induktion hinweisen k��nnten. In Bezug auf die Immunaktivierung f��hrte die vermehrte Sekretion von IL-1�� durch MVA ��IL-1��R vermutlich zu einer verbesserten Antigenpr��sentation, die die nachfolgende T-Zellantwort beeinflusste. In ��bereinstimmung mit bereits ver��ffentlichten Daten wurde nach Immunisierung mit MVA ��IL-1��R eine effektivere Ged��chtnis-T-Zellantwort festgestellt, deren Charakteristika und zu Grunde liegenden Mechanismen hier untersucht wurden. Jedoch konnten weder Unterschiede in weiteren pro-inflammatorischen Zytokinmustern noch im Verlauf insbesondere der CD8+ T-Zell-Aktivierung und -erhaltung zwischen MVA und MVA ��IL-1��R beobachtet werden. Als m��gliche weitere Ursache f��r die ver��nderte Ged��chtnis-T-Zellantwort k��nnte daher eine vermehrte Stimulation durch antigenpr��sentierende Zellen und eine IL-21-vermittelte bessere Unterst��tzungsfunktion der CD8+ Ged��chtnis-T-Zellen durch CD4+ T-Zellen in Frage kommen. Zusammenfassend konnten hier neue molekulare Mechanismen, die zur Induktion von IL-1�� nach einer MVA-Infektion f��hren, aufgedeckt werden. Dar��ber hinaus existieren bereits erste Hinweise auf einen Vorteil der Deletion des IL-1��R f��r MVA-basierte Vektorimpfstoffe. Die vorliegende Arbeit hat weitere Daten erhoben, die das Erzielen verbesserter Immunantworten nach Immunisierung mit MVA ��IL-1��R unterst��tzen, woraus sich neue Ans��tze f��r die Entwicklung MVA-basierter Impfstoffe ergeben k��nnten.

Immunologische Effekte von nativen Allergenen im Vergleich zu modifizierten Allergenen

Die Pr��valenz allergischer Erkrankungen ist in den letzten Jahrzehnten, insbesondere in den Industriestaaten, stetig angestiegen und schreitet weiterhin fort. Die einzige kausale Therapie, die eine Langzeitwirkung verspricht und der Entwicklung neuer Allergien bzw. dem Fortschreiten der Allergie vorbeugen kann, ist die spezifische Immuntherapie (SIT). Da bei der SIT mit nat��rlichen Allergenextrakten Nebenwirkungen auftreten k��nnen, ist es wichtig Alternativen f��r diese zu finden. In der vorliegenden Arbeit wurden native Allergene mit modifizierten Allergenen hinsichtlich ihrer Allergenit��t und Immunogenit��t verglichen. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Glutaraldehyd-modifizierte Allergoide im Vergleich zu nativen Allergenextrakten und Formaldehyd-Allergoiden eine verminderte Allergenit��t besitzen, was sich z.B. durch den verminderten Release der Allergiemediatoren, den Leukotrienen, durch Basophile allergischer Spender zeigte. Gleichzeitig war allerdings die F��higkeit Glutaraldehyd-Allergoid-behandelter dendritischer Zellen (DC) autologe CD4+ T-Zellen zu stimulieren stark reduziert. Verglichen mit den nativen Allergenextrakten und den Formaldehyd-Allergoiden waren die Zytokinproduktion und die T-Zellproliferation, f��r letztere signifikant, vermindert. Damit ��bereinstimmend war die Aufnahme von Fluoreszenz-markierten Glutaraldehyd-Allergoiden in unreife DC reduziert. Daraus l��sst sich schie��en, dass die Modifizierung mit Glutaraldehyd, jedoch nicht mit Formaldehyd, zumindest bei den hier verwendeten Allergenpr��paraten, B-Zell-Epitope zerst��rt und somit die Allergenit��t herabgesetzt wurde. Allerdings war dabei gleichzeitig die Immunogenit��t vermindert. Das verminderte Vorkommen der B-Zell-Epitope w��re beim Einsatz der Allergoide von Vorteil, da damit eine verminderte IgE-Bindekapazit��t einhergeht und unerw��nschte Nebenwirkungen reduziert werden k��nnen. Jedoch sollte im g��nstigsten Fall bei der Allergoidisierung die T-Zell-Stimulationsf��higkeit intakt bleiben, was bei den hier verwendeten Glutaraldehyd-modifizierten Allergoiden nicht der Fall war. rnMit Einzelallergenen aus Birken- und Gr��serpollen konnten keine vergleichbaren T-Zellantworten erzielt werden wie mit den Gesamtallergenextrakten. Auch hier waren Proliferation und Zytokinproduktion durch CD4+ T-Zellen nach Stimulation mit Einzelallergen-gepulsten DC bei Verwendung von Glutaraldehyd-modifizierten Allergoiden vermindert. rnEine adjuvante Wirkung von Aluminiumhydroxid (Alum) in vitro konnte in dieser Arbeit nicht eindeutig gezeigt werden. Zun��chst konnte beobachtet werden, dass die eingesetzten Alum-adsorbierten Allergene und Allergoide eine toxische Wirkung auf DC hatten. Die Proliferation CD4+ T-Zellen konnte durch DC, die mit Alum-adsorbierten Allergenen behandelt wurden, nicht verst��rkt werden, verglichen mit DC, die mit unadsorbiertem Allergen gepulst wurden. Es konnte lediglich eine erh��hte Produktion des Th2 Zytokins IL-4 durch Alum induziert werden. Einen Adjuvanteffekt, der in Zusammenhang mit der Induktion des pro-inflammatorischen Zytokins IL-1�� stehen soll, konnte mittels ELISA in den ��berst��nden unreifer DC nicht nachgewiesen werden. Lediglich in Monozyten, die zus��tzlich mit dem TLR-Ligand LPS stimuliert wurden, war IL-1�� in den ��berst��nden detektierbar. Auf mRNA-Ebene konnte man einen leichten Effekt durch Alum hinsichtlich der IL-1�� Expression erkennen. Nach zus��tzlicher Gabe verschiedener Alum-Pr��parationen zu unreifen DC, die mit Allergen oder LPS stimuliert wurden, exprimierten diese leicht verst��rkt IL-1�� verglichen mit DC, die kein Alum erhielten.

Funktionelle Charakterisierung der Casein Kinase 2 in der Etablierung und Aufrechterhaltung peripherer Toleranz durch dendritische Zellen

Dendritische Zellen (DCs) nehmen eine Schl��sselrolle in unserem Immunsystem ein, indem DCs sowohl Immunit��t, als auch Toleranz induzieren k��nnen. Im Falle der Immunit��t sind DCs in der Lage die Differenzierung der verschiedenen T-Helferzellen, wie Th1-, Th2- und Th17-Zellen zu steuern und tragen so zu der Qualit��t einer Immunantwort bei. Auf der anderen Seite k��nnen DCs in Gegenwart von TGF-��, IDO und Retins��ure die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen induzieren und tragen somit zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz bei. Insbesondere in den Darm-assoziierten lymphatischen Geweben (GALT) m��ssen DCs unverh��ltnism����ige Immunantworten gegen harmlose Antigene aus der Nahrung und kommensale Bakterien verhindern, w��hrend gegen Pathogene sch��tzende Immunantworten induziert werden m��ssen. Auf Grund dieser entgegengesetzten Funktionen der DCs wollten wir die molekularen Mechanismen der DCs untersuchen, die der Regulation von Immunit��t und Toleranz zu Grunde liegen. Insbesondere der Wnt-Signalweg ist f��r die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz im GALT von Bedeutung. Da die Casein Kinase 2 in diesem Signalweg entscheidend beteiligt ist, haben wir die CK2-Funktion konditionell, unter der Kontrolle des CD11c-Promotors, deletiert. Hierf��r haben wir CD11c-cre M��use mit M��usen verpaart, welche ein von loxP-Signalsequenzen flankiertes Ck2�� Gen (CK2��-fl/fl) tragen. Die konditionelle Deletion der CK2-Funktion in DCs, f��hrte zu einer verst��rkten Expression der kostimulatorischen Molek��le (wie CD40, CD80, CD86) und der Zytokine IL-6 und IL-12 unter ���steady-state��� Bedingungen. Detaillierte Untersuchungen der T-Zellen in CD11c-cre x CK2��-fl/fl M��usen zeigte eine deutlich reduzierte naive T-Zellpopulation, einhergehend mit einer erh��hten Th1- und Th17-Differenzierung. Speziell in den mesenterialen Lymphknoten konnte eine h��here Frequenz von T-bet+ und Ror��t+ CD4+ T-Zellen gefunden werden, welche gro��e Mengen der Zytokine IFN-�� und IL-17 nach ex vivo Stimulation produzierten. Weiterf��hrende in vivo Versuche, hier wurde das Modell der oralen Toleranz gew��hlt, zeigten das eine CK2-Deletion in DCs die Induktion einer oralen Toleranz verhindert. Unsere Daten zeigen eindeutig, dass die CK2 entscheidend in der Regulation der DC Hom��ostase und der Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz beteiligt ist.

Regulation der Funktion dendritischer Zellen im immunologischen steady state

Dendritische Zellen sind professionelle Antigenpr��sentierende Zellen und ��bernehmen sowohl in der Aktivierung naiver T-Zellen als auch in der Aufrechterhaltung peripherer Toleranz eine zentrale Funktion. Ruhende Dendritische Zellen im immunologischen Steady State induzieren antigenspezifisch Toleranz in autoreaktiven T-Zellen, welche bei der negativen Selektion im Thymus nicht eliminiert wurden und verhindern somit die Entstehung von Autoimmunit��t. Mit Hilfe eines transgenen Maus Modells, welches die induzierbare Expression transgen kodierter CD8+ T-Zell-Epitope auf ruhenden Dendritischen Zellen erlaubt, konnten wir zeigen, dass die periphere Toleranz Induktion durch Dendritische Zellen in Abwesenheit von regulatorischen T-Zellen beeintr��chtigt ist. Wir konnten verdeutlichen, dass f��r die Suppression von steady-state Dendritischen Zellen die Erkennung von MHC Klasse II Molek��len auf Dendritischen Zellen durch den T-Zell-Rezeptor regulatorischer T-Zellen zwingend erforderlich ist. In Abwesenheit dieser suppressiven Interaktion hatten Dendritische Zellen einen aktivierten Ph��notyp und l��sten eine funktionale T-Zell-Antwort aus, anstatt periphere Toleranz zu induzieren. Als Folge dessen entwickelten M��use, in denen Dendritische Zellen nicht antigenspezifisch mit suppressiven CD4+ T-Zellen interagieren konnten, spontane Autoimmunit��t, welche durch CD8+ T-Zellen mediiert wurde. Wir konnten weiterhin zeigen, dass der Verlust peripherer T-Zell Toleranz durch basale Level an Typ I Interferonen mediiert wird sowie durch CD40 Signale, welche von adaptiven Immunzellen geliefert werden.

Gewebeprotektive und antiinflammatorische Wirkung von humanem Choriogonadotropin in Mausmodellen mit autoimmunem Leberschaden

W��hrend der Schwangerschaft kommt es h��ufig zu einer spontanen Verbesserung von klinischen Symptomen der autoimmunen Hepatitis und anderen Th1-vermittelten Autoimmunerkrankungen. Die Gr��nde hierf��r sind bis heute noch nicht vollst��ndig aufgekl��rt. Eines der wichtigsten Hormone in der Schwangerschaft ist das humane Choriogonadotropin (hCG), welches schon in der fr��hen Schwangerschaft eine entscheidende Rolle spielt. Es sorgt f��r die Stimulation des Corpus luteums, wodurch es zur Aussch��ttung von Progesteron kommt und somit die Einnistung der Blastozyte gew��hrleistet und die Absto��ung des Embryos verhindert wird. In dieser Arbeit wurden Effekt und Signalweg von hCG in prim��ren murinen und humanen Hepatozyten sowie in Mausmodellen mit T-Zell-abh��ngigem Leberschaden untersucht. hCG f��hrte sowohl bei akuten als auch bei chronischen Lebersch��den zu einer drastischen Senkung der Aspartat-Aminotransferase, einem Indikator f��r Lebererkrankungen. Die Histologie der Leber hCG-behandelter Tiere wies au��erdem signifikant weniger apoptotische Zellen und eine deutliche Reduktion infiltrierender CD4+ T-Zellen auf. Die Analyse des hCG-Signalweges zeigte, dass hCG die Langlebigkeitsproteine Foxo3a und Sirt1 reguliert. Die Aktivierung des PI3-Kinase/Akt-Signalweges durch hCG f��hrte zu einem Transport des Transkriptionsfaktors Foxo3a aus dem Zellkern, wodurch die proapoptotischen Zielgene Bim und Puma nicht mehr transkribiert werden k��nnen. Eine zus��tzliche Hemmung von Foxo3a erfolgte durch die Aktivierung der Deacetylase Sirt1, indem diese phosphoryliert wird und in den Zellkern transloziert. In weiteren Untersuchungen wurde der immunsuppressive Effekt von hCG n��her betrachtet. Dabei stellte sich heraus, dass hCG effektiv die proteolytische Aktivit��t der Caspase-3 in Hepatozyten hemmt, wodurch die Aussch��ttung der biologisch aktiven Form von Interleukin-16, einem chemotaktischen Faktor f��r CD4+ Zellen, herabgesetzt wird. Dadurch wird die Leber erfolgreich vor der Infiltration durch autoaggressive CD4+ Zellen gesch��tzt. IL-16 spielt bei vielen inflammatorischen Krankheiten eine Rolle, was auch in dieser Arbeit durch den Nachweis hoher IL-16-Konzentrationen in Seren von Patienten mit autoimmuner Hepatitis best��tigt werden konnte. Die in dieser Studie beschriebene Wirkung von hCG und die Tatsache, dass hCG ein bereits bew��hrtes und auf Nebenwirkungen getestetes Medikament bei Infertilit��t ist, macht es zu einem idealen Kandidaten f��r immunsuppressive Therapieans��tze bei akuten und chronisch entz��ndlichen Lebererkrankungen.

Analyse humaner regulatorischer T-Zellen im humanisierten Mausmodell

Regulatorische T-Zellen sind essentiell f��r die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz. Hierbei sorgen diese hocheffektiven Suppressorzellen f��r ein immunologisches Gleichgewicht, indem sie Immunantworten gegen Autoantigene sowie harmlose Nahrungs- und Umweltantigene verhindern. Andererseits k��nnen diese bei chronischen Infekten Immunantworten reduzieren sowie effektive Antitumor-Immunantworten hemmen. Aufgrund ethischer Erw��gungen ist die Erforschung regulatorischer T-Zellen und deren Rolle bei der Tumorentwicklung weitestgehend auf Mausmodelle oder humane in vitro oder ex vivo Analysen beschr��nkt. Um diese Limitationen zu ��berwinden und translationale immunologische Experimente zu erm��glichen, wurde hier ein humanisiertes Mausmodell verwendet. T- und B-Zell-defiziente NOD-scid IL2Rgammanull (NSG) M��use wurden mit humanen CD34+ h��matopoetischen Stammzellen aus Nabelschnurblut rekonstituiert. Aus diesen Stammzellen entstanden in den Tieren vielf��ltige humane Immunzellen. Im murinen Thymus der NSG Tiere entwickelten sich CD4+ und CD8+ einzelpositive T-Zellen, welche als funktionelle Effektorpopulationen in die Peripherie auswanderten. Humane regulatorische T-Zellen (CD4+ CD25+ Foxp3+ CD127-) entwickelten sich ebenfalls im murinen Thymus der Tiere und machten ca. 10% der humanen peripheren CD4+ T-Zellen in den M��usen aus. Diese humanen regulatorischen T-Zellen zeigten vorwiegend einen HLA-DR+ Ph��notyp, welcher mit h��chster Suppressivit��t assoziiert ist. Weiter verhielten sich die regualtorischen T-Zellen anergisch und bewiesen ihre Funktionalit��t unter anderem durch die Inhibition der Proliferation von Effektor-T-Zellen in vitro. rnSubkutan injizierte Tumorzellen eines humanen undifferenzierten pleomorphen Sarkoms wurden in den humanisierten M��usen nicht abgesto��en und der Tumor konnte, trotz Infiltration humaner Immunzellen, ungehindert wachsen. Als m��gliche Ursache hierf��r zeigte sich die selektive Akkumulation regulatorischer T-Zellen im Tumor. Zusammen mit dem erh��hten Anteil humaner regulatorischer T-Zellen in der Peripherie, weisen diese Beobachtungen deutliche Parallelen mit Befunden aus humanen Patienten auf. Dies bietet somit erstmalig die Option in vivo die Rolle humaner regulatorischer T-Zellen im undifferenzierten pleomorphen Sarkom zu analysieren. Die hier gezeigten Daten machen deutlich, dass es das humanisierte Mausmodell erm��glicht, die Entstehung und Funktion humaner regulatorischer T-Zellen in vivo zu analysieren, deren Bedeutung in klinisch relevanten Modellen zu charakterisieren und somit innovative Therapien zu etablieren.

Untersuchungen zur antitumoralen Wirkungsweise eines bispezifischen MCSP-CD3 Antik��rpers in vitro und im humanisierten Tumormausmodell

Humanes MCSP ist ein gut charakterisiertes Tumorantigen, das auf der Mehrzahl aller malignen Melanome hoch exprimiert wird, und stellt somit eine gute Zielstruktur f��r immuntherapeutische Ans��tze dar. rnInnerhalb der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkmechanismen eines neuen bispezifischen Antik��rpers, der gegen humanes MCSP und CD3 auf T-Zellen gerichtet ist, in vitro und im humanisierten Tumormausmodell in vivo untersucht. In humanen T Zellkokulturen induzierte der bispezifische MCSP-CD3 Antik��rper in Gegenwart MCSP-positiver Melanomzellen konzentrationsabh��ngige T-Zellaktivierung, Sekretion von Zytokinen und effiziente Tumorzelllyse durch CD4- und CD8-positive T-Zellen. Die induzierte Lyse war hierbei unabh��ngig von der T-Zellrezeptorspezifit��t sowie kostimulatorischen Molek��len und allein abh��ngig von der Expression des Tumorantigens sowie CD3 auf den T-Zellen. Wie hier diskutiert, liegt es nahe, dass die Freisetzung lytischer Molek��le (Perforin und Granzym-B) durch CD8- und auch CD4 positiver T-Zellen den Hauptmechanismus in der Lyse der Melanomzellen darstellt. rnUm die Wirksamkeit in vivo testen zu k��nnen, wurde ein humanisiertes Tumormausmodell etabliert. Die Injektion humaner h��matopoetischer Stammzellen in neugeborene Rag2-/-gc-/- M��use f��hrte zur Entwicklung funktioneller T-Zellen im murinen Thymus, welche lymphatische Organe besiedelten. In vitro induzierten die T-Zellen humanisierter M��use in Anwesenheit des bispezifischen MCSP-CD3 Antik��rpers ebenfalls konzentrationsabh��ngige Lyse der Melanomzellen. Wie hier gezeigt, induzierte die Injektion humaner Melanomzellen in humanisierte M��use keine messbare Absto��ungsreaktion. Unter Behandlung mit MCSP-CD3 wurde zwar eine erh��hte Anzahl humaner T-Zellen im Tumorgewebe nachgewiesen, jedoch verf��gte die verwendete Melanomzelllinie ��ber eine geringe basale T Zellinfiltration, geringe Vaskularisierung und ein nodul��res Wachstumsverhalten. Wie innerhalb dieser Arbeit diskutiert, kann durch die Kombination mit Therapien, die eine erh��hte T-Zellinfiltration in das Tumorgewebe erm��glichen, die Wirksamkeit von bispezifischen Antik��rpern m��glicherweise gesteigert werden. rn

Molekulare Charakterisierung der Il-9-Genexpression in T-Helfer-Typ-9-Zellen

CD4+ T-Zellen k��nnen in verschiedene T-Helferzellsubpopulationen differenzieren. Dabei h��ngt es von verschiedensten Milieubedingungen ab, welche Subpopulation sich auspr��gt, damit die CD4+ T-Zelle durch die Sekretion verschiedenster Zytokine ihre Funktion im Immunsystem wahrnehmen kann.rnBei der Th9-Subpopulation handelt es sich um einen IL-9-produzierenden Ph��notyp, welcher sich in der Anwesenheit von TGF-�� und IL-4 entwickelt39. Als treibender Transkriptionsfaktor f��r diese Subpopulation wurde das Protein IRF4 beschrieben45. Da dieser Transkriptionsfaktor auch f��r die Differenzierung weiterer Subpopulationen, wie Th2- und Th17-Zellen von Bedeutung ist30,121, stellte sich die Frage, welcher Interaktionspartner von IRF4 dar��ber entscheidet, welcher Subtyp sich entwickelt. Deshalb wurde in dieser Arbeit der Transkriptionsfaktor NFATc2 als m��glicher Interaktionspartner f��r IRF4 am murinen Il9 Promotor untersucht. Allerdings zeigten Reportergen��analysen, dass NFATc2 die IL-9-Produktion in Th9-Zellen inhibiert anstatt sie zu f��rdern. Th9-Zellen aus NFATc2-defizienten Tieren zeigen folglich im Vergleich zu wildtypischen Th9-Zellen sowohl nach Prim��r- als auch nach Restimulation eine verst��rkte IL-9-Produktion. Der Faktor NFATc2 kann somit als transkriptioneller Aktivator f��r die IL-9-Expression in Th9-Zellen ausgeschlossen werden. In vivo wurden diese Beobachtungen dadurch untermauert, dass NFATc2-defiziente Tiere im Rahmen des Asthma bronchiale zu einer verst��rkten pulmonalen Inflammation neigen und auch einen erh��hten Atemwegswiderstand nach Methacholin-Provokation aufweisen. Diese asthmatischen Symptome konnten durch Applikation eines neutralisierenden Antik��rpers f��r IL-9 wesentlich gemildert werden. In einem B16F10-Melanommodell konnten NFATc2-defiziente Tiere gegen��ber dem Wildtyp eine verbesserte anti-Tumorantwort auspr��gen. Nach Gabe eines IL-9-neutralisierenden Antik��rpers, wurde dieser Effekt wiederum gemildert.rnZusammenfassend l��sst sich sagen, dass IRF4 nicht mit NFATc2 am murinen Il9 Promotor interagiert, um die IL-9-Expression in Th9-Zellen zu f��rdern. Eine NFATc2-Defizienz resultiert sogar in einer gesteigerten IL-9-Produktion, womit ein inhibitorischer Einfluss von NFATc2 in Bezug auf die IL-9-Expression in Th9-Zellen nachgewiesen werden konnte.rn