Regulación transcripcional y relación entre estructura y función de proteínas relacionadas con el metabolismo de colina en Pseudomonas aeruginosa. Transcriptional regulation and relationship between structure and function of proteins related with the choline metabolism in Pseudomonas aeruginosa.

El objetivo general de este proyecto es dilucidar los mecanismos de acción a nivel molecular de enzimas y proteínas involucradas en el metabolismo de colina en Pseudomonas aeruginosa, con énfasis en la identificación de residuos aminoacídicos críticos y regulación de la expresión de los genes en estudio. Los objetivos específicos que se palntean involucran abordajes bioquímicos y moleculares y serán llevados a cabo mediante técnicas de biología molecular y bioquímica (mutación sitio-dirigida, deleción génica, expresión y purificación de proteínas, fusión transcripcional a genes reporteros, etc). Planteo de hipótesis: las proteínas que se inducen por colina (fosforilcolina fosfatasa (PchP), fosfolipasa C (PlcH), acetilcolinestera (AchE), proteínas periplásmicas unidoras de colina (PUch) podrían compartir: a) una organización génica y responder a la regulación por proteínas regulatorias o a factores ambientales de manera similar; b) residuos aminoacídicos conservados que intervengan en la unión o interacción con diferentes ligandos, principalmente, colina. Para ello, se plantean los siguientes Objetivos Específicos: 1) identificar las zonas promotoras de los genes que codifican para PchP, PlcH, AchE y PUch, a fin de localizar posibles sitios de unión a proteínas reguladoras y los factores ambientales que afectan la actividad promotora. 2) determinar en las proteínas mencionadas los residuos aminoacídicos de importancia involucrados en la catálisis y en la interacción con ligandos, principalmente en la unión a compuestos de alquilamonio; 3) Se iniciarán estudios que demuestren la relación entre la inducción por colina de varios factores de patogenicidad la virulencia del microorganismo, empleando mutantes simples o múltiples en estos factores y como modelo de patogenicidad el nematodo C. elegans. A partir de los resultados obtenidos se pretende tener un conocimiento profundo sobre la regulación molecular y bioquímica de varias enzimas comprometidas en la patología que produce P. aeruginosa. Esto más el conocimiento de la fisiología de este microorganismo abre el camino para la búsqueda de posibles blancos de acción de drogas. Por otro lado, se espera tener un conocimiento integral sobre la regulación de la expresión de las actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo de colina y la respuesta de P. aeruginosa ante la presencia de compuestos de alquilamonio utilizados como nutrientes. Se espera conocer el papel que desempeña cada uno de los sitios de unión a los diferentes ligandos para el funcionamiento y control de las enzimas mencionadas y explicar el comportamiento diferencial de las enzimas frente a distintos sustratos y otros ligandos. El conocimiento de los sitios de unión a compuestos de alquilamonio permitirá encontrar esos dominios en diferentes proteínas del género Pseudomonas y otras bacterias Gram negativas. Desde el punto de vista evolutivo, se podrá comparar la similitud de los sitios de unión a colina entre proteínas de organismos eucariotas con procariotas (ej. PUch de bacterias Gram positivas, transportadores de colina, proteína C reactiva, AchE de eucariotas contra las encontradas en bacterias del género Pseudomonas, fosfolipasas A, C o D, etc.). Este proyecto permitirá concretar al menos dos tesis doctorales (Sanchez, Otero) más varios trabajos finales de grado (tesinas) que son y serán realizados por alumnos de la carrera de Microbiología en la UNRC. Les permitirá a los doctorandos y a los alumnos de grado adquirir una formación bastante integral ya que utilizarán herramientas de la fisiología general bacteriana, de la bioquímica clásica, de la biología molecular y de la bioinformática.

Interacciones Transitorias de Proteínas Solubles con Membranas Lipídicas. Transient interactions of soluble proteins with lipid membranes.

La transferencia de proteínas solubles a la interfase de la membrana lipídica es un paso clave en varios procesos celulares. Esta traslocación resulta en un importante cambio en el ambiente de la proteína con consecuencias sobre su conformación, estabilidad y actividad biológica. En este proyecto estudiamos las condiciones que determinan la unión a la membrana, particularmente el balance entre interacciones electrostáticas e hidrofóbicas, y los factores que determinan la conformación, estabilidad y dinámica de la proteína en interfaces. Particularmente, estudiaremos la interacción con membranas de la proteína transportadora de ácido cólico de hígado de ave L-BABP, la proteína beta-2 glicoproteína humana y la proteína asociada a microtúbulos SL21. Hemos encontrado que el estado de fase del lípido determina la conformación y estabilidad de L-BABP unida periféricamente. En este proyecto estudiaremos la naturaleza de las interacciones que determinan esta dependencia. beta-2 glicoproteína humana se une a membranas aniónicas e induce cambios estructurales en el lípido cuando ocurre la transición al estado desplegado de la proteína. El proyecto contempla estudiar comparativamente las interacciones del estado nativo y parcialmente desplegado de beta-2 glicoproteína con membranas. Estudiaremos los cambios conformacionales de proteínas y lípidos utilizando espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR), espectroscopia de emisión de fluorescencia y espectroscopia de dicroísmo circular (CD). Utilizaremos calorimetría diferencial de barrido (DSC) para estudios de estabilidad y espectroscopia de fosforescencia para estudiar dinámica rotacional de proteínas en la membrana.

Métodos estadístico-computacionales para la caracterización de patrones de expresión de proteínas en 2D-DIGE.

El volumen de datos provenientes de experimentos basados en genómica y poteómica es grande y de estructura compleja. Solo a través de un análisis bioinformático/bioestadístico eficiente es posible identificar y caracterizar perfiles de expresión de genes y proteínas que se expresan en forma diferencial bajo distintas condiciones experimentales (CE). El objetivo principal es extender las capacidades computacionales y analíticos de los softwares disponibles de análisis de este tipo de datos, en especial para aquellos aplicables a datos de electroforésis bidimensional diferencial (2D-DIGE). En DIGE el método estadístico más usado es la prueba t de Student cuya aplicación presupone una única fuente de variación y el cumplimiento de ciertos supuestos distribucionales de los datos (como independencia y homogeneidad de varianzas), los cuales no siempre se cumplen en la práctica, pudiendo conllevar a errores en las estimaciones e inferencias de los efectos de interés. Los modelos Generalizados lineales mixtos (GLMM) permiten no solo incorporar los efectos que, se asume, afectan la variación de la respuesta sino que también modelan estructuras de covarianzas y de correlaciones más afines a las que se presentan en la realidad, liberando del supuesto de independencia y de normalidad. Estos modelos, más complejos en esencia, simplificarán el análisis debido a la modelización directa de los datos crudos sin la aplicación de transformaciones para lograr distribuciones más simétricas,produciendo también a una estimación estadísticamente más eficiente de los efectos presentes y por tanto a una detección más certera de los genes/proteínas involucrados en procesos biológicos de interés. La característica relevante de esta tecnología es que no se conoce a priori cuáles son las proteínas presentes. Estas son identificadas mediante otras técnicas más costosas una vez que se detectó un conjunto de manchas diferenciales sobre los geles 2DE. Por ende disminuir los falsos positivos es fundamental en la identificación de tales manchas ya que inducen a resultados erróneas y asociaciones biológica ficticias. Esto no solo se logrará mediante el desarrollo de técnicas de normalización que incorporen explícitamente las CE, sino también con el desarrollo de métodos que permitan salirse del supuesto de gaussianidad y evaluar otros supuestos distribucionales más adecuados para este tipo de datos. También, se desarrollarán técnicas de aprendizaje automática que mediante optimización de funciones de costo específicas nos permitan identificar el subconjunto de proteínas con mayor potencialidad diagnóstica. Este proyecto tiene un alto componente estadístico/bioinformática, pero creemos que es el campo de aplicación, es decir la genómica y la proteómica, los que más se beneficiarán con los resultados esperados. Para tal fin se utilizarán diversas bases de datos de distintos experimentos provistos por distintos centros de investigación nacionales e internacionales.

Participación del tráfico y la distribución de proteínas en la polaridad y el desarrollo de procesos neuronales. Protein sorting and trafficking participation in neuronal processes polarity and development.

El estudio del tráfico intracelular en neuronas ha despertado gran interés en los últimos años, debido a que un gran número de enfermedades neurodegenerativas y neuropsiquiátricas parecen tener origen en en el transporte defectuoso de proteínas en estos tipos celulares. Mediante el uso de técnicas de biología celular y molecular, fuimos capaces de describir una de las vías que regula la fisión de las vesículas que llevan su cargo desde la última cisterna del Aparato de Golgi hacia la superficie celular en células epiteliales no polarizadas. Uno de los componentes clave de esa vía resultó ser la Proteina Kinasa D1 (PKD1), cuya actividad en el Aparato de Golgi es esencial para un normal transporte intracelular. Sorprendentemente, observamos que la PKD1 en neuronas con polaridad establecida no regula la fisión en el Golgi, pero si estaría involucrada en la selectividad y distribución (sorting) de vesículas cuyo cargo debe ser específicamente dirigido a las membranas dendríticas. El bloqueo de la actividad de la PKD1 no solamente cambia el destino final de estos cargos, que son enviados de esta forma a la membrana terminal del axón, sino que también es capaz de inducir defectos en el desarrollo y crecimiento de los procesos dendríticos a largo plazo. En este proyecto estudiaremos de que manera influye la perturbación del sorting, en ausencia de PKD1 activa y de otros componentes que la regulan, en la distribución de receptores de factores neurotróficos y de neurotransmisores glutamatérgicos, y cómo estos cambios en su distribución afectan el número, tamaño, y funcionalidad de los procesos neuronales (axones y dendritas). Estos resultados contribuirán a adquirir mayores conocimientos de los mecanismos dependientes del transporte y sorting de proteínas de membrana que participan en la regulación del crecimiento neuronal, los cuales a su vez aportarán información valiosa en la comprensión de un gran número de enfermedades neurológicas. The study of intracellular trafficking in neurons has arisen a great deal of interest in the last years, since a great number of neurodegenerative and neuropsychiatric disorders seem to be originated in abnormal protein transport in these type of cells. Using cell and molecular biology methodologies, we have been capable of describe one of the pathways that regulate the fission of vesicles that carry their cargo from the last Golgi Apparatus cisternae to the cell surface in non-polarized epithelial cells. One of the key components in this pathway is the Protein Kinase D1 (PKD1), whose activity in the Golgi Apparatus is essential for a normal intracelular transport. Surprisingly, we have observed that PKD1 does not regulate fission in neurons with established polarity, but it would be involved in vesicles' sorting at Golgi, particularly of those that carry specific dendritic cargo. Blocking PKD1 activity changes the final destination of these cargoes, which is now sent to the axons' terminal membranes, and also produces late dendritic development and growing defects. In this project we will study how sorting perturbation in absence of PKD1 and its regulators activities influences selectivity and distribution of neurotrophic and neurotransmitter receptors, and how these sorting changes affect number, size and functionality of neuronal processes (axons and dendrites). These results will help to acquire greater knowledge about transport and sorting mechanisms of neuronal growth regulatory membrane proteins. In addition, these studies will contribute with new valuable information necessary to understand numerous neurological diseases.

Expresión de las proteínas relacionadas con la proliferación celular y la apoptosis en lesiones blancas de la mucosa oral, como precursoras de la cancerización en el epitelio escamoso oral.

El cáncer de la mucosa oral es una patología muy frecuente que llega en muchos casos a conformar entre el 8 y el 10% de los tumores malignos del hombre. La baja concientización de la población general sobre el tema es un factor importante que hace que estas lesiones sean detectadas en forma tardía y cuando ya se trata de lesiones avanzadas de muy mal pronóstico. Si bien ha habido grandes avances en el diagnóstico y tratamiento de lesiones blancas de la mucosa oral como el liquen plano oral, estas lesiones siguen siendo entidades con muchos interrogantes para todos los expertos en medicina oral, sobre todo en lo referente a su proceso de aparición y a su tratamiento. Es importante la diferenciación correcta de estas lesiones, ya que el carcinoma epidermoide bucal puede aparecer también como una lesión blanca. No hay suficiente conocimiento de lo que ocurre en otras lesiones blancas de la mucosa oral no liquen plano. Para evaluar el verdadero potencial de transformación maligna de leucoplasias, liquen plano oral, reacciones liquenoides y lesiones escamosas intraepiteliales (incluídas las inducidas por acción viral) se evaluará la expresión de las proteínas relacionadas con la proliferación celular y la apoptosis en estas lesiones. Se evaluará con técnicas inmunohistoquímicas la relación de bcl-2 como marcador apoptótico en leucoplasias, liquen plano oral, lesiones escamosas intraepiteliales y carcinomas epidermoides orales, así como también en estas mismas lesiones la expresión proteica de MIB-1 (ki67), ciclina D1, p16 y p53 para valorar si las alteraciones en la expresión proteica de estos marcadores, suceden de forma secuencial a través de las distintas etapas en la cancerización del campo de cavidad oral, ya que no existe consenso en los resultados y las conclusiones obtenidas en los diferentes estudios efectuados sobre la influencia exclusiva de los marcadores apoptóticos en el desarrollo de las lesiones de algunas de las lesiones como el LPO.

Desarrollo de vacunas orales basado en las propiedades protectivas y adyuvantes de las proteínas variables de superficie (VSPS) de giardia lamblia.

El protozoario parásito intestinal Giardia lamblia es el único microorganismo que coloniza el intestino superior de vertebrados, incluyendo al hombre. Esto es posible porque el mismo está recubierto de una densa capa protectora de proteínas ricas en cisteína que evitan la “digestión” del parásito por el pH ácido del estómago y la acción de las proteasas intestinales, llamadas VSPs por su sigla en Inglés. Nuestra hipótesis de trabajo es que estas VSPs pueden ser utilizadas para transportar antígenos vacunales para su administración por vía oral. Como se sabe, la mayoría de los agentes patógenos entran al cuerpo a través de las mucosas. Por ello, ya que las VSPs son capaces de inducir una fuerte respuesta inmune mucosal se desarrollarán diferentes estrategias para verificar su potencial utilización en formulaciones vacunales orales. Se comenzará con el modelo de Influenza y luego con otras enfermedades infecciosas de relevancia social.

Efeito anti-inflamatório do treinamento físico na insuficiência cardíaca: papel do TNF-α e da IL-10

Nos últimos 50 anos, a compreensão sobre as alterações deteriorativas envolvidas na progressão da insuficiência cardíaca (IC), descritas inicialmente como decorrentes de alterações na retenção de sais e fluidos, ou alterações nos parâmetros hemodinâmicos, mudou significatiamente. Recentemente, diversos estudos em pacientes com IC demonstraram níveis plasmáticos (ou no soro) alterados de citocinas pro-inflamatórias, tais como o fator α de necrose tumoral (TNF-α), as interleucinas 1, 6 e 18, e a cardiotropina-1, dentre outros marcadores inflamatórios. Essas alterações monstraram-se independentes da etiologia da IC, sugerindo uma via patogênica comum. Em reposta a esses novos achados, intervenções no sentido de evitar e/ou reduzir essas alterações inflamatória tem sido propostas. Os benefícios cardiovasculares, induzidos treinamento aeróbio realizados em intensidades variando de leve a moderada, têm sido previamente relatados. Além disso, tem-se demonstrado que o treinamento físico (aeróbio moderado) parece capaz de modular, na vigência de um quadro inflamatório crônico anormal, a expressão elevada de citocinas pró-inflamatórias, moléculas de adesão solúveis, fatores quimioatratantes e estresse oxidativo. Tomados em conjunto, esses dados indicam um possível efeito anti-inflamatório induzido pelo treinamento físico. Dessa forma, esta revisão tem por objetivo abordar o treinamento físico como uma alternativa não farmacológica adjuvante a ser administrada em alguns quadros patológicos em que predominam as alterações crônicas do TNF-α, como na IC. Por sua vez, o "efeito anti-inflamatório" induzido pelo treinamento físico parece ser mediado principalmente pela IL-10.

Associação de bronquite plástica com enteropatia perdedora de proteínas após operação de Fontan

Relatamos um caso incomum de associação de bronquite plástica (BP) com enteropatia perdedora de proteínas (EPP) em menina de 4 anos e 9 meses de idade. com dupla via de entrada de ventrículo único tipo esquerdo e concordância ventrículo-arterial submetida à cirurgia cavopulmonar total. com túnel lateral intracardíaco aos três anos. Tornaram-se chamativas a eliminação de molde brônquico de fibrina de 10 cm (BP) e a elevação de alfa-1-antitripsina de 52 mg/g de fezes. Em uso de sildenafila. programou-se. em caso de continuidade do processo. a ligadura do ducto torácico e transplante cardíaco.

Papel da titina na modulação da função cardíaca e suas implicações fisiopatológicas

A titina é uma proteína sarcomérica gigante que se estende desde a linha Z até a linha M. Em razão de sua localização, representa um importante sensor biomecânico com um papel fundamental na manutenção da integridade estrutural do sarcômero. A titina funciona como uma "mola bidirecional" que regula o comprimento sarcomérico e realiza ajustes adequados da tensão passiva sempre que o comprimento varia. Dessa forma, não só determina a rigidez ventricular e a função diastólica, como também influencia a função cardíaca sistólica, modulando o mecanismo de Frank-Starling. O miocárdio expressa duas isoformas dessa macromolécula: a N2B, mais rígida, e a isoforma N2BA, mais complacente. As alterações na expressão relativa das duas isoformas da titina ou alterações do seu estado de fosforilação têm sido implicadas na fisiopatologia de várias doenças como a insuficiência cardíaca diastólica, a cardiomiopatia dilatada, a cardiomiopatia isquêmica e a estenose aórtica. Neste artigo pretende-se descrever sumariamente a estrutura e localização da titina, a sua relação com diferentes cardiomiopatias, e compreender de que forma as alterações dessa macromolécula influenciam a fisiopatologia da insuficiência cardíaca diastólica, salientando o potencial terapêutico da manipulação dessa macromolécula.

Exercício e restrição alimentar aumentam o RNAm de proteínas do trânsito de Ca2+ miocárdico em ratos

FUNDAMENTO: Treinamento físico (TF) aumenta a sensibilidade dos hormônios tireoidianos (HT) e a expressão gênica de estruturas moleculares envolvidas no movimento intracelular de cálcio do miocárdio, enquanto a restrição alimentar (RIA) promove efeitos contrários ao TF. OBJETIVO: Avaliar os efeitos da associação TF e RIA sobre os níveis plasmáticos dos HT e a produção de mRNA dos receptores HT e estruturas moleculares do movimento de cálcio do miocárdio de ratos. MÉTODOS: Utilizaram-se ratos Wistar Kyoto divididos em: controle (C, n = 7), RIA (R50, n = 7), exercício físico (EX, n = 7) e exercício físico + RIA (EX50, n = 7). A RIA foi de 50% e o TF foi natação (1 hora/dia, cinco sessões/semana, 12 semanas consecutivas). Avaliaram-se as concentrações séricas de triiodotironina (T3), tiroxina (T4) e hormônio tireotrófico (TSH). O mRNA da bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA2a), fosfolamban (PLB), trocador Na+/Ca+2 (NCX), canal lento de cálcio (canal-L), rianodina (RYR), calsequestrina (CQS) e receptor de HT (TRα1 e TRβ1) do miocárdio foram avaliados por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. RESULTADOS: RIA reduziu o T4, TSH e mRNA do TRα1 e aumentou a expressão da PLB, NCX e canal-L. TF aumentou a expressão do TRβ1, canal-L e NCX. A associação TF e RIA reduziu T4 e TSH e aumentou o mRNA do TRβ1, SERCA2a, NCX, PLB e correlação do TRβ1 com a CQS e NCX. CONCLUSÃO: Associação TF e RIA aumentou o mRNA das estruturas moleculares cálcio transiente, porém o eixo HT-receptor não parece participar da transcrição gênica dessas estruturas.

Comparação de Proteínas: alimentação das aves I

Beginning an experiment on protein comparisons, at the Poultry and Rabbitry Departament of the Esc. Sup. de Agricultura "Luiz de Queiroz", University of S. Paulo, four groups of growing chicks were submitted during 40 days to the following rations: basal part - 50 corn meal and 30 wheat bran, variable part - R1 - 10 tankage and 10 peanut meal, R2 - 10 tankage and 10 cottonseed meal, R3 - 7 peanut meal, 7 cocoanut meal and 7 cottonseed meal, R4 - 5 tankage, 5 peanut, 5 cocoanut and 5 cottenseed meal, R2 and R3 gave results which may be considered as equal and inferior than those obtained with the others, R4 being the best one. The statistical analises showed no significant differences.

Alimentação dos marrecos: III sôro de leite (Líquido)

The author studied in this paper the influence of liquid whey in feeding Pekin ducklings. Wet mash, either by liquid whey or water, was given to the ducklings during the whole day. Green feed was added to the ration just once a day. The statistical analysis did not show significant differences between the use of water and liquid whey but the results obtained with wet mash proved to be statistically better than the results obtained with dry mash.

Cálcio e fósforo no leite da região de Piracicaba

Twelve samples of fluid milk delivered by "Laticínios Piracicaba Ltda." for public consumption, from March 25 do August 7, 1959, were analysed to determine its calcium and phosphorus content per 100 ml. A slight variation was observed. Calcium varied from 119 to 136 mg and phosphorus from 83 to 91 mg. These results are comparable to the ones obtained in other countries, showing that calcium and phosphorus content in cow milk is almost invariable.

Microbiología de alimentos II : análise bacteriológica de leite

Foi analisado o produto dos três laticínios que fornecem leite a população piracicabana, sob a designação de pasteurizado tipo C. Procedeu-se a analise bacteriológica de coliformes, de anaeróbios esporulados, bem como a prova da redutase microbiana. As amostras de leite examinadas revelaram estado sanitário precário: as amostras 1 e 3 continham 1600 coliformes por 100 ml da amostra (N.M.P.) e a amostra 2, 350 por 100 ml. Quanto a presença da redutase microbiana a amostra 1 se classificou como ruim porque continha 20 milhões de células por ml, enquanto as amostras 2 e 3 como procedentes de leite bom, com 500 mil por ml, mas com a agravante de se apresentar peptonizada em 24 horas.

Cristalogênese do cloreto de cobre: emprego da cristalização sensitiva na distinção de tipos de leite

O método da cristalização sensitiva é utilizado na distinção de tipos de leite. Foram estudadas três concentrações de cloreto de cobre (0,1; 0,25 e 0,5 g/placa) combinadas a três de leite (0,01, 0,025 e 0,05 g/placa) de três tipos (cru, B e C), com três repetições. Para as 27 combinações possíveis, observou-se nítida influência do leite como modificador do modelo de cristalização do cloreto de cobre. O método mostrou sensibilidade suficiente para distinção de tipos de leite, principalmente nas concentrações 0,05 : 0,5e 0,025 : 0,5.