Accessing advanced computational resources in Africa through Cloud Computing

Low resources in many African locations do not allow many African scientists and physicians to access the latest advances in technology. This deficiency hinders the daily life of African professionals that often cannot afford, for instance, the cost of internet fees or software licenses. The AFRICA BUILD project, funded by the European Commission and formed by four European and four African institutions, intends to provide advanced computational tools to African institutions in order to solve current technological limitations. In the context of AFRICA BUILD we have carried out, a series of experiments to test the feasibility of using Cloud Computing technologies in two different locations in Africa: Egypt and Burundi. The project aims to create a virtual platform to provide access to a wide range of biomedical informatics and learning resources to professionals and researchers in Africa.

On a meaningful integration of web services in data-intensive biomedical environments: The DICODE approach

This paper reports on an innovative approach that aims to reduce information management costs in data-intensive and cognitively-complex biomedical environments. Recognizing the importance of prominent high-performance computing paradigms and large data processing technologies as well as collaboration support systems to remedy data-intensive issues, it adopts a hybrid approach by building on the synergy of these technologies. The proposed approach provides innovative Web-based workbenches that integrate and orchestrate a set of interoperable services that reduce the data-intensiveness and complexity overload at critical decision points to a manageable level, thus permitting stakeholders to be more productive and concentrate on creative activities.

Protein isolate and inulin: chemical, rheological and structural basis

Soy protein isolate is typical vegetable protein with health-enhancing activities. Inulin, a prebiotic no digestible carbohydrate, has functional properties. A mashed potato serving of 200 g with added soy protein isolate and inulin concentrations of 15?60 g kg provides from 3 to 12 g of soy protein isolate and/or inulin, respectively. Currently, no information is available about the possible texture-modifying effect of this non-ionizable polar carbohydrate in different soy-based food systems. In this study, the effect of the addition of soy protein isolate and inulin blends at different soy protein isolate: inulin ratios on the degree of inulin polymerization and the rheological and structural properties of fresh mashed and frozen/thawed mashed potatoes were evaluated. The inulin chemical structure remained intact throughout the various treatments, and soy protein isolate did not affect inulin composition being a protein compatible with this fructan. Small-strain rheology showed that both ingredients behaved like soft fillers. In the frozen/thawed mashed potatoes samples,0 addition of 30 : 30 and 15 : 60 blend ratios significantly increased elasticity (G value) compared with 0 : 0 control, consequently reducing the freeze/thaw stability conferred by the cryoprotectants. Inulin crystallites caused a significant strengthening effect on soy protein isolate gel. Micrographs revealed that soy protein isolate supports the inulin structure by building up a second fine-stranded network. Thereby, possibility of using soy protein isolate and inulin in combination with mashed potatoes to provide a highly nutritious and healthy product is promising.

Circuito de disparo de lámparas flash para la iluminación de sistemas fotovoltaicos

La medición y testeo de células fotovoltaicas en el laboratorio o en la industria exige reproducir unas condiciones de iluminación semejantes a las reales. Por eso se utilizan sistemas de iluminación basados en lámparas flash de Xenon que reproducen las condiciones reales en cuanto a nivel de irradiancia y espectro de la luz incidente. El objetivo de este proyecto es realizar los circuitos electrónicos necesarios para el disparo de dichas lámparas. El circuito de alimentación y disparo de una lámpara flash consta de una fuente de alimentación variable, un circuito de disparo para la ionización del gas Xenon y la electrónica de control. Nuestro circuito de disparo pretende producir pulsos adecuados para los dispositivos fotovoltaicos tanto en irradiancia, espectro y en duración, de forma que con un solo disparo consigamos el tiempo, la irradiancia y el espectro suficiente para el testeo de la célula fotovoltaica. La mayoría de estos circuitos exceptuando los específicos que necesita la lámpara, serán diseñados, simulados, montados en PCB y comprobados posteriormente en el laboratorio. ABSTRACT. Measurement and testing of photovoltaic cells in the laboratory or in industry requires reproduce lighting conditions similar to the real ones. So are used based lighting systems xenon flash lamps that reproduce the actual conditions in the level of irradiance and spectrum of the incident light. The objective of this project is to make electronic circuits required for such lamps shot. The power supply circuit and flash lamp shot consists of a variable power supply, a trigger circuit for Xenon gas ionization and the control electronics. Our shot circuit aims to produce pulses suitable for photovoltaic devices both irradiance, spectrum and duration, so that with a single shot get the time, the irradiance and spectrum enough for testing the photovoltaic cell. Most of these circuits except lamp specific requirements will be designed, simulated, and PCB mounted subsequently tested in the laboratory.

Factores transcripcionales de la clase DOF en Brachypodium distachyon: caracterización molecular de BdDOF24 durante la germinación de las semillas

La semilla es el órgano que garantiza la propagación y continuidad evolutiva de las plantas espermatofitas y constituye un elemento indispensable en la alimentación humana y animal. La semilla de cereales acumula en el endospermo durante la maduración, mayoritariamente, almidón y proteínas de reserva. Estas reservas son hidrolizadas en la germinación por hidrolasas sintetizadas en la aleurona en respuesta a giberelinas (GA), siendo la principal fuente de energía hasta que la plántula emergente es fotosintéticamente activa. Ambas fases del desarrollo de la semilla, están reguladas por una red de factores de transcripción (TF) que unen motivos conservados en cis- en los promotores de sus genes diana. Los TFs son proteínas que han desempeñado un papel central en la evolución y en el proceso de domesticación, siendo uno de los principales mecanismos de regulación génica; en torno al 7% de los genes de plantas codifican TFs. Atendiendo al motivo de unión a DNA, éstos, se han clasificado en familias. La familia DOF (DNA binding with One Finger) participa en procesos vitales exclusivos de plantas superiores y sus ancestros cercanos (algas, musgos y helechos). En las semillas de las Triticeae (subfamilia Pooideae), se han identificado varias proteínas DOF que desempeñan un papel fundamental en la regulación de la expresión génica. Brachypodium distachyon es la primera especie de la subfamilia Pooideae cuyo genoma (272 Mbp) ha sido secuenciado. Su pequeño tamaño, ciclo de vida corto, y la posibilidad de ser transformado por Agrobacterium tumefaciens (plásmido Ti), hacen que sea el sistema modelo para el estudio de cereales de la tribu Triticeae con gran importancia agronómica mundial, como son el trigo y la cebada. En este trabajo, se han identificado 27 genes Dof en el genoma de B. distachyon y se han establecido las relaciones evolutivas entre estos genes Dof y los de cebada (subfamilia Pooideae) y de arroz (subfamilia Oryzoideae), construyendo un árbol filogenético en base al alineamiento múltiple del dominio DOF. La cebada contiene 26 genes Dof y en arroz se han anotado 30. El análisis filogenético establece cuatro grupos de genes ortólogos (MCOGs: Major Clusters of Orthologous Genes), que están validados por motivos conservados adicionales, además del dominio DOF, entre las secuencias de las proteínas de un mismo MCOG. El estudio global de expresión en diferentes órganos establece un grupo de nueve genes BdDof expresados abundantemente y/o preferencialmente en semillas. El estudio detallado de expresión de estos genes durante la maduración y germinación muestra que BdDof24, ortólogo putativo a BPBF-HvDOF24 de cebada, es el gen más abundante en las semillas en germinación de B. distachyon. La regulación transcripcional de los genes que codifican hidrolasas en la aleurona de las semillas de cereales durante la post‐germinación ha puesto de manifiesto la existencia en sus promotores de un motivo tripartito en cis- conservado GARC (GA-Responsive Complex), que unen TFs de la clase MYB-R2R3, DOF y MYBR1-SHAQKYF. En esta tesis, se ha caracterizado el gen BdCathB de Brachypodium que codifica una proteasa tipo catepsina B y es ortólogo a los genes Al21 de trigo y HvCathB de cebada, así como los TFs responsables de su regulación transcripcional BdDOF24 y BdGAMYB (ortólogo a HvGAMYB). El análisis in silico del promotor BdCathB ha identificado un motivo GARC conservado, en posición y secuencia, con sus ortólogos en trigo y cebada. La expresión de BdCathB se induce durante la germinación, así como la de los genes BdDof24 y BdGamyb. Además, los TFs BdDOF24 y BdGAMYB interaccionan en el sistema de dos híbridos de levadura e in planta en experimentos de complementación bimolecular fluorescente. En capas de aleurona de cebada, BdGAMYB activa el promotor BdCathB, mientras que BdDOF24 lo reprime; este resultado es similar al obtenido con los TFs ortólogos de cebada BPBF-HvDOF24 y HvGAMYB. Sin embargo, cuando las células de aleurona se transforman simultáneamente con los dos TFs, BdDOF24 tiene un efecto aditivo sobre la trans-activación mediada por BdGAMYB, mientras que su ortólogo BPBF-HvDOF24 produce el efecto contrario, revirtiendo el efecto de HvGAMYB sobre el promotor BdCathB. Las diferencias entre las secuencias deducidas de las proteínas BdDOF24 y BPBF-HvDOF24 podrían explicar las funciones opuestas que desempeñan en su interacción con GAMYB. Resultados preliminares con líneas de inserción de T-DNA y de sobre-expresión estable de BdGamyb, apoyan los resultados obtenidos en expresión transitoria. Además las líneas homocigotas knock-out para el gen BdGamyb presentan alteraciones en anteras y polen y no producen semillas viables. ABSTRACT The seed is the plant organ of the spermatophytes responsible for the dispersion and survival in the course of evolution. In addition, it constitutes one of the most importan elements of human food and animal feed. The main reserves accumulated in the endosperm of cereal seeds through the maturation phase of development are starch and proteins. Its degradation by hydrolases synthetized in aleurone cells in response to GA upon germination provides energy, carbon and nitrogen to the emerging seedling before it acquires complete photosynthetic capacity. Both phases of seed development are controlled by a network of transcription factors (TFs) that interact with specific cis- elements in the promoters of their target genes. TFs are proteins that have played a central role during evolution and domestication, being one of the most important regulatory mechanisms of gene expression. Around 7% of genes in plant genomes encode TFs. Based on the DNA binding motif, TFs are classified into families. The DOF (DNA binding with One Finger) family is involved in specific processes of plants and its ancestors (algae, mosses and ferns). Several DOF proteins have been described to play important roles in the regulation of genes in seeds of the Triticeae tribe (Pooideae subfamily). Brachypodium distachyon is the first member of the Pooideae subfamily to be sequenced. Its small size and compact structured genome (272 Mbp), the short life cycle, small plant size and the possibility of being transformed with Agrobacterium tumefaciens (Ti-plasmid) make Brachypodium the model system for comparative studies within cereals of the Triticeae tribe that have big economic value such as wheat and barley. In this study, 27 Dof genes have been identified in the genome of B. distachyon and the evolutionary relationships among these Dof genes and those frome barley (Pooideae subfamily) and those from rice (Oryzoideae subfamily) have been established by building a phylogenetic tree based on the multiple alignment of the DOF DNA binding domains. The barley genome (Hordeum vulgare) contains 26 Dof genes and in rice (Oryza sativa) 30 genes have been annotated. The phylogenetic analysis establishes four Major Clusters of Orthologous Genes (MCOGs) that are supported by additional conserved motives out of the DOF domain, between proteins of the same MCOG. The global expression study of BdDof genes in different organs and tissues classifies BdDof genes into two groups; nine of the 27 BdDof genes are abundantly or preferentially expressed in seeds. A more detailed expression analysis of these genes during seed maturation and germination shows that BdDof24, orholog to barley BPBF-HvDof24, is the most abundantly expressed gene in germinating seeds. Transcriptional regulation studies of genes that encode hydrolases in aleurone cells during post-germination of cereal seeds, have identified in their promoters a tripartite conserved cis- motif GARC (GA-Responsive Complex) that binds TFs of the MYB-R2R3, DOF and MYBR1-SHAQKYF families. In this thesis, the characterization of the BdCathB gene, encoding a Cathepsin B-like protease and that is ortholog to the wheat Al21 and the barley HvCathB genes, has been done and its transcriptional regulation by the TFs BdDOF24 and BdGAMYB (ortholog to HvGAMYB) studied. The in silico analysis of the BdCathB promoter sequence has identified a GARC motif. BdCathB expression is induced upon germination, as well as, those of BdDof24 and BdGamyb genes. Moreover, BdDOF24 and BdGAMYB interact in yeast (Yeast 2 Hybrid System, Y2HS) and in planta (Bimolecular Fluorecence Complementation, BiFC). In transient assays in aleurone cells, BdGAMYB activates the BdCathB promoter, whereas BdDOF24 is a transcriptional repressor, this result is similar to that obtained with the barley orthologous genes BPBF-HvDOF24 and HvGAMYB. However, when aleurone cells are simultaneously transformed with both TFs, BdDOF24 has an additive effect to the trans-activation mediated by BdGAMYB, while its ortholog BPBF-HvDOF24 produces an opposite effect by reducing the HvGAMYB activation of the BdCathB promoter. The differences among the deduced protein sequences between BdDOF24 and BPBF-HvDOF24 could explain their opposite functions in the interaction with GAMYB protein. Preliminary results of T-DNA insertion (K.O.) and stable over-expression lines of BdGamyb support the data obtained in transient expression assays. In addition, the BdGamyb homozygous T-DNA insertion (K.O.) lines have anther and pollen alterations and they do not produce viable seeds.

User Experience in Human-Technology Interaction. Communication, context and evaluation methodology

En esta Tesis se presentan dos líneas de investigación relacionadas y que contribuyen a las áreas de Interacción Hombre-Tecnología (o Máquina; siglas en inglés: HTI o HMI), lingüística computacional y evaluación de la experiencia del usuario. Las dos líneas en cuestión son el diseño y la evaluación centrada en el usuario de sistemas de Interacción Hombre-Máquina avanzados. En la primera parte de la Tesis (Capítulos 2 a 4) se abordan cuestiones fundamentales del diseño de sistemas HMI avanzados. El Capítulo 2 presenta una panorámica del estado del arte de la investigación en el ámbito de los sistemas conversacionales multimodales, con la que se enmarca el trabajo de investigación presentado en el resto de la Tesis. Los Capítulos 3 y 4 se centran en dos grandes aspectos del diseño de sistemas HMI: un gestor del diálogo generalizado para tratar la Interacción Hombre-Máquina multimodal y sensible al contexto, y el uso de agentes animados personificados (ECAs) para mejorar la robustez del diálogo, respectivamente. El Capítulo 3, sobre gestión del diálogo, aborda el tratamiento de la heterogeneidad de la información proveniente de las modalidades comunicativas y de los sensores externos. En este capítulo se propone, en un nivel de abstracción alto, una arquitectura para la gestión del diálogo con influjos heterogéneos de información, apoyándose en el uso de State Chart XML. En el Capítulo 4 se presenta una contribución a la representación interna de intenciones comunicativas, y su traducción a secuencias de gestos a ejecutar por parte de un ECA, diseñados específicamente para mejorar la robustez en situaciones de diálogo críticas que pueden surgir, por ejemplo, cuando se producen errores de entendimiento en la comunicación entre el usuario humano y la máquina. Se propone, en estas páginas, una extensión del Functional Mark-up Language definido en el marco conceptual SAIBA. Esta extensión permite representar actos comunicativos que realizan intenciones del emisor (la máquina) que no se pretende sean captadas conscientemente por el receptor (el usuario humano), pero con las que se pretende influirle a éste e influir el curso del diálogo. Esto se consigue mediante un objeto llamado Base de Intenciones Comunicativas (en inglés, Communication Intention Base, o CIB). La representación en el CIB de intenciones “no claradas” además de las explícitas permite la construcción de actos comunicativos que realizan simultáneamente varias intenciones comunicativas. En el Capítulo 4 también se describe un sistema experimental para el control remoto (simulado) de un asistente domótico, con autenticación de locutor para dar acceso, y con un ECA en el interfaz de cada una de estas tareas. Se incluye una descripción de las secuencias de comportamiento verbal y no verbal de los ECAs, que fueron diseñados específicamente para determinadas situaciones con objeto de mejorar la robustez del diálogo. Los Capítulos 5 a 7 conforman la parte de la Tesis dedicada a la evaluación. El Capítulo 5 repasa antecedentes relevantes en la literatura de tecnologías de la información en general, y de sistemas de interacción hablada en particular. Los principales antecedentes en el ámbito de la evaluación de la interacción sobre los cuales se ha desarrollado el trabajo presentado en esta Tesis son el Technology Acceptance Model (TAM), la herramienta Subjective Assessment of Speech System Interfaces (SASSI), y la Recomendación P.851 de la ITU-T. En el Capítulo 6 se describen un marco y una metodología de evaluación aplicados a la experiencia del usuario con sistemas HMI multimodales. Se desarrolló con este propósito un novedoso marco de evaluación subjetiva de la calidad de la experiencia del usuario y su relación con la aceptación por parte del mismo de la tecnología HMI (el nombre dado en inglés a este marco es Subjective Quality Evaluation Framework). En este marco se articula una estructura de clases de factores subjetivos relacionados con la satisfacción y aceptación por parte del usuario de la tecnología HMI propuesta. Esta estructura, tal y como se propone en la presente tesis, tiene dos dimensiones ortogonales. Primero se identifican tres grandes clases de parámetros relacionados con la aceptación por parte del usuario: “agradabilidad ” (likeability: aquellos que tienen que ver con la experiencia de uso, sin entrar en valoraciones de utilidad), rechazo (los cuales sólo pueden tener una valencia negativa) y percepción de utilidad. En segundo lugar, este conjunto clases se reproduce para distintos “niveles, o focos, percepción del usuario”. Éstos incluyen, como mínimo, un nivel de valoración global del sistema, niveles correspondientes a las tareas a realizar y objetivos a alcanzar, y un nivel de interfaz (en los casos propuestos en esta tesis, el interfaz es un sistema de diálogo con o sin un ECA). En el Capítulo 7 se presenta una evaluación empírica del sistema descrito en el Capítulo 4. El estudio se apoya en los mencionados antecedentes en la literatura, ampliados con parámetros para el estudio específico de los agentes animados (los ECAs), la auto-evaluación de las emociones de los usuarios, así como determinados factores de rechazo (concretamente, la preocupación por la privacidad y la seguridad). También se evalúa el marco de evaluación subjetiva de la calidad propuesto en el capítulo anterior. Los análisis de factores efectuados revelan una estructura de parámetros muy cercana conceptualmente a la división de clases en utilidad-agradabilidad-rechazo propuesta en dicho marco, resultado que da cierta validez empírica al marco. Análisis basados en regresiones lineales revelan estructuras de dependencias e interrelación entre los parámetros subjetivos y objetivos considerados. El efecto central de mediación, descrito en el Technology Acceptance Model, de la utilidad percibida sobre la relación de dependencia entre la intención de uso y la facilidad de uso percibida, se confirma en el estudio presentado en la presente Tesis. Además, se ha encontrado que esta estructura de relaciones se fortalece, en el estudio concreto presentado en estas páginas, si las variables consideradas se generalizan para cubrir más ampliamente las categorías de agradabilidad y utilidad contempladas en el marco de evaluación subjetiva de calidad. Se ha observado, asimismo, que los factores de rechazo aparecen como un componente propio en los análisis de factores, y además se distinguen por su comportamiento: moderan la relación entre la intención de uso (que es el principal indicador de la aceptación del usuario) y su predictor más fuerte, la utilidad percibida. Se presentan también resultados de menor importancia referentes a los efectos de los ECAs sobre los interfaces de los sistemas de diálogo y sobre los parámetros de percepción y las valoraciones de los usuarios que juegan un papel en conformar su aceptación de la tecnología. A pesar de que se observa un rendimiento de la interacción dialogada ligeramente mejor con ECAs, las opiniones subjetivas son muy similares entre los dos grupos experimentales (uno interactuando con un sistema de diálogo con ECA, y el otro sin ECA). Entre las pequeñas diferencias encontradas entre los dos grupos destacan las siguientes: en el grupo experimental sin ECA (es decir, con interfaz sólo de voz) se observó un efecto más directo de los problemas de diálogo (por ejemplo, errores de reconocimiento) sobre la percepción de robustez, mientras que el grupo con ECA tuvo una respuesta emocional más positiva cuando se producían problemas. Los ECAs parecen generar inicialmente expectativas más elevadas en cuanto a las capacidades del sistema, y los usuarios de este grupo se declaran más seguros de sí mismos en su interacción. Por último, se observan algunos indicios de efectos sociales de los ECAs: la “amigabilidad ” percibida los ECAs estaba correlada con un incremento la preocupación por la seguridad. Asimismo, los usuarios del sistema con ECAs tendían más a culparse a sí mismos, en lugar de culpar al sistema, de los problemas de diálogo que pudieran surgir, mientras que se observó una ligera tendencia opuesta en el caso de los usuarios del sistema con interacción sólo de voz. ABSTRACT This Thesis presents two related lines of research work contributing to the general fields of Human-Technology (or Machine) Interaction (HTI, or HMI), computational linguistics, and user experience evaluation. These two lines are the design and user-focused evaluation of advanced Human-Machine (or Technology) Interaction systems. The first part of the Thesis (Chapters 2 to 4) is centred on advanced HMI system design. Chapter 2 provides a background overview of the state of research in multimodal conversational systems. This sets the stage for the research work presented in the rest of the Thesis. Chapers 3 and 4 focus on two major aspects of HMI design in detail: a generalised dialogue manager for context-aware multimodal HMI, and embodied conversational agents (ECAs, or animated agents) to improve dialogue robustness, respectively. Chapter 3, on dialogue management, deals with how to handle information heterogeneity, both from the communication modalities or from external sensors. A highly abstracted architectural contribution based on State Chart XML is proposed. Chapter 4 presents a contribution for the internal representation of communication intentions and their translation into gestural sequences for an ECA, especially designed to improve robustness in critical dialogue situations such as when miscommunication occurs. We propose an extension of the functionality of Functional Mark-up Language, as envisaged in much of the work in the SAIBA framework. Our extension allows the representation of communication acts that carry intentions that are not for the interlocutor to know of, but which are made to influence him or her as well as the flow of the dialogue itself. This is achieved through a design element we have called the Communication Intention Base. Such r pr s ntation of “non- clar ” int ntions allows th construction of communication acts that carry several communication intentions simultaneously. Also in Chapter 4, an experimental system is described which allows (simulated) remote control to a home automation assistant, with biometric (speaker) authentication to grant access, featuring embodied conversation agents for each of the tasks. The discussion includes a description of the behavioural sequences for the ECAs, which were designed for specific dialogue situations with particular attention given to the objective of improving dialogue robustness. Chapters 5 to 7 form the evaluation part of the Thesis. Chapter 5 reviews evaluation approaches in the literature for information technologies, as well as in particular for speech-based interaction systems, that are useful precedents to the contributions of the present Thesis. The main evaluation precedents on which the work in this Thesis has built are the Technology Acceptance Model (TAM), the Subjective Assessment of Speech System Interfaces (SASSI) tool, and ITU-T Recommendation P.851. Chapter 6 presents the author’s work in establishing an valuation framework and methodology applied to the users’ experience with multimodal HMI systems. A novel user-acceptance Subjective Quality Evaluation Framework was developed by the author specifically for this purpose. A class structure arises from two orthogonal sets of dimensions. First we identify three broad classes of parameters related with user acceptance: likeability factors (those that have to do with the experience of using the system), rejection factors (which can only have a negative valence) and perception of usefulness. Secondly, the class structure is further broken down into several “user perception levels”; at the very least: an overall system-assessment level, task and goal-related levels, and an interface level (e.g., a dialogue system with or without an ECA). An empirical evaluation of the system described in Chapter 4 is presented in Chapter 7. The study was based on the abovementioned precedents in the literature, expanded with categories covering the inclusion of an ECA, the users’ s lf-assessed emotions, and particular rejection factors (privacy and security concerns). The Subjective Quality Evaluation Framework proposed in the previous chapter was also scrutinised. Factor analyses revealed an item structure very much related conceptually to the usefulness-likeability-rejection class division introduced above, thus giving it some empirical weight. Regression-based analysis revealed structures of dependencies, paths of interrelations, between the subjective and objective parameters considered. The central mediation effect, in the Technology Acceptance Model, of perceived usefulness on the dependency relationship of intention-to-use with perceived ease of use was confirmed in this study. Furthermore, the pattern of relationships was stronger for variables covering more broadly the likeability and usefulness categories in the Subjective Quality Evaluation Framework. Rejection factors were found to have a distinct presence as components in factor analyses, as well as distinct behaviour: they were found to moderate the relationship between intention-to-use (the main measure of user acceptance) and its strongest predictor, perceived usefulness. Insights of secondary importance are also given regarding the effect of ECAs on the interface of spoken dialogue systems and the dimensions of user perception and judgement attitude that may have a role in determining user acceptance of the technology. Despite observing slightly better performance values in the case of the system with the ECA, subjective opinions regarding both systems were, overall, very similar. Minor differences between two experimental groups (one interacting with an ECA, the other only through speech) include a more direct effect of dialogue problems (e.g., non-understandings) on perceived dialogue robustness for the voice-only interface test group, and a more positive emotional response for the ECA test group. Our findings further suggest that the ECA generates higher initial expectations, and users seem slightly more confident in their interaction with the ECA than do those without it. Finally, mild evidence of social effects of ECAs was also found: the perceived friendliness of the ECA increased security concerns, and ECA users may tend to blame themselves rather than the system when dialogue problems are encountered, while the opposite may be true for voice-only users.

Monitorización de sistemas en alta disponibilidad

El objetivo del proyecto es implantar un sistema de monitorización, con la peculiaridad de encontrarse en alta disponibilidad, esto es, que el servicio (la monitorización de una infraestructura) se preste forma continua y no se vea interrumpido. Dado que el propósito del sistema es monitorizar activamente una infraestructura, ha sido necesario desplegar una infraestructura, además del sistema de monitorización. La infraestructura en cuestión está compuesta por un servidor de documentación, un servidor de base de datos, un servidor de aplicaciones y un servidor web. El sistema de monitorización se ha desplegado en la misma red de área local de esta infraestructura y monitoriza que los servicios prestados por los componentes de esta infraestructura se encuentren operativos y funcionando adecuadamente. Así pues, se tendría un sistema de monitorización local funcional. No obstante, el proyecto plantea un sistema escalable, que esté preparado para el crecimiento de la infraestructura y continúe siendo eficiente. Para ello, sistema de monitorización se encuentre dividido por dos componentes:  Sonda delegada: monitoriza localmente los activos de la infraestructura a monitorizar, es el escenario anteriormente descrito.  Sonda maestra: recibe los resultados de la monitorización realizada, este sistema puede estar desplegado en otra red distinta a la sonda delegada. Este enfoque no solo es escalable, sino también es fiel a la realidad, pues puede darse el caso de que las sondas pertenezcan a distintas infraestructuras e inclusive, distintas organizaciones, y se comuniquen a través de internet, mediante un mecanismo confiable a ser posible. El proyecto plantea que ambas sondas se encuentren en alta disponibilidad (en adelante HA, referente a high availability), y que cada sonda está compuesta por dos equipos (nodos, en adelante). Como se analizará en posteriores capítulos, existen diversas configuraciones que permiten implantar un sistema en HA, la configuración escogida para el proyecto es Activo – Pasivo(los detalles de esta configuración también se explican en posteriores capítulos). Para finalizar, se estudiara la posibilidad de ofrecer respuestas activas en ciertas situaciones y configuraciones adicionales sobre el sistema de monitorización base. Por otro lado, para la implantación del proyecto se ha usado software de código abierto para la virtualización de la infraestructura (Virtual Box y GNS3), los sistemas operativos base (Linux), el sistema de monitorización(Nagios Core) así como el software que implementa la HA (corosync y pacemaker).---ABSTRACT---The aim of the Project is to implement a monitoring system, with the peculiarity of being deployed in high availability, what it is that the service (monitoring infrastructure) is provided continuously and not interrupted. As the purpose of the system is monitoring infrastructure actively, an infrastructure has been deployed, and also the monitoring system. The infrastructure monitored is composed of a documentation server, a server database, an application server and a Web server. The monitoring system has been also deployed on the same LAN of this infrastructure and monitors the services provided by the components of this infrastructure are operational and working as expected. This is a local monitoring system functional. However, the project also proposes a scalable system that is ready for growth of infrastructure and efficient. This is the reason of divide the system in two components:  Slave Component: monitors locally the infrastructure assets to be monitored, this is the scenario described above.  Master Component: get the results from the monitoring, provided by the Slave Component. This system can be deployed in a different network than the slave component. This approach is not only scalable but also a real scenario, as may be the case that the Components belongs to different infrastructures and even, different organizations, also this components can communicate over the Internet, through a reliable mechanism if possible. The project proposes that both Components are deployed in high availability (HA onwards concerning high availability), each Component is composed of two servers (nodes, hereafter). As will be discussed in later chapters, there are several settings available to deploy a system in HA, the configuration chosen for the project is Active - Passive (details of this configuration are also explained in later chapters). Finally the possibility of offering active responses in certain situations and additional settings on the monitoring system will be discussed. On the other hand, for the implementation of the project, open source software has been used, for virtualization infrastructure (Virtual Box and GNS3), code-based operating systems (Linux), the monitoring system (Nagios core), as well as the software that implements the HA (corosync and pacemaker).

Análisis de algoritmos para posicionamiento de aeronaves mediante respuestas SSR utilizando recepción omnidireccional

El transporte aéreo constituye un sector estratégico para el crecimiento económico de cualquier país. El sistema de gestión de tráfico aéreo ATM tiene como objetivo el movimiento seguro y eficiente de las aeronaves dentro del espacio aéreo y de los aeropuertos, siendo la seguridad, en la fase táctica, gestionada por el servicio de control de la circulación aérea. Mediante los procesos de control el tráfico aéreo es vigilado a través de sensores, regulado y guiado de forma organizada y segura. Es precisamente sobre la vigilancia donde se enfoca el contenido de la tesis, en el desarrollo de nuevos conceptos que proporcionen información de vigilancia de ‘bajo coste’ basados en las señales existentes proporcionadas por la infraestructura actual de radar secundario y por los sistemas de posicionamiento basados en satélite que utiliza la ADS-B. El conocimiento y acceso en tiempo real a las trayectorias de las aeronaves es un elemento de valor añadido no sólo para la provisión de los servicios de control de tránsito aéreo, sino para todos los actores del transporte aéreo o de la investigación, siendo uno de los elementos clave en el concepto operacional de los dos grandes proyectos tecnológicos, SESAR en Europa y NextGen en EE.UU.. En las últimas décadas el control de la circulación aérea en espacios aéreos de media y alta densidad de tráfico se ha basado en tecnologías complejas que requieren importantes infraestructuras como son el radar primario de vigilancia (PSR) y el radar secundario de vigilancia (SSR). La filosofía de los programas SESAR y NextGen siguiendo las directrices de la OACI es la de alejarse de las tecnologías basadas en tierra para evolucionar hacia nuevas tecnologías más dinámicas basadas en satélite como la ADS-B. Pero hasta que la implementación y operación de la ADS-B sea completa, existirá un período de transición que implica la coexistencia de aeronaves equipadas o no con ADS-B. El objetivo de la presente Tesis es determinar las metodologías y algoritmos más adecuados para poder hibridar las dos tecnologías descritas anteriormente, utilizando para ello un receptor de bajo coste con antena estática omnidireccional, que analice todas las señales presentes en el canal que comparten el SSR y ADS-B. Mediante esta hibridación se podrá obtener la posición de cualquier aeronave que transmita respuestas a interrogaciones SSR, en cualquiera de sus modos de trabajo, o directamente mensajes de posición ADS-B. Para desarrollar los algoritmos propuestos, además del hardware correspondiente, se han utilizado las aplicaciones LabVIEW para funciones de adquisición de datos reales, y el software MATLAB® para el desarrollo de algoritmos y análisis de datos. La validación de resultados se ha realizado mediante los propios mensajes de posición ADS-B y a través de las trazas radar proporcionadas por la entidad pública empresarial ENAIRE. La técnica desarrollada es autónoma, y no ha requerido de ninguna otra entrada que no sea la recepción omnidireccional de las señales. Sin embargo para la validación de resultados se ha utilizado información pública de las ubicaciones de la red de estaciones SSR desplegadas sobre territorio español y portugués y trazas radar. Los resultados obtenidos demuestran, que con técnicas basadas en superficies de situación definidas por los tiempos de llegada de las respuestas, es posible determinar con una precisión aceptable la posición de las estaciones SSR y la posición de cualquier aeronave que responda mediante el Modo A a éstas. ABSTRACT Air transport is a strategic sector for the economic growth of any country. The air traffic management system (ATM) aims at the safe and efficient movement of aircraft while operating within the airspace and airports, where safety, in the tactical phase, is managed by the air traffic control services. Through the air traffic control processes, aircraft are monitored by sensors, regulated and guided in an organized and safe manner. It is precisely on surveillance where this thesis is focused, developing new concepts that provide a 'low cost' surveillance information based on existing signals provided by currently secondary radar infrastructure and satellite-based positioning systems used by ADS-B. Having a deeper knowledge and a real-time access to the trajectories of the aircraft, is an element of added value not only for the provision of air traffic control services, but also for all air transport or research actors. This is one of the key elements in the operational concept proposed by the two large scale existing technological projects, SESAR in Europe and NextGen in the US. In recent decades, air traffic control in medium and high traffic density areas has been based on complex technologies requiring major infrastructures, such as the primary surveillance radar (PSR) and secondary surveillance radar (SSR). The philosophy of SESAR and NextGen programs, both following the guidelines of ICAO, is to move away from land-based technologies and evolving into some new and more dynamic satellite-based technologies such as ADS-B. Nevertheless, until the ADS-B implementation and operation is fully achieved, there will be a transitional period where aircraft with and without ADS-B equipment will have to coexist. The main objective of this thesis is to determine those methodologies and algorithms which are considered more appropriate to hybridize those two technologies, by using a low cost omnidirectional receiver, which analyzes all signals on the SSR and ADS-B shared channel. Through this hybridization, it is possible to obtain the position of any aircraft answering the SSR interrogations, in any of its modes of operation, or through the emission of ADS-B messages. To develop the proposed algorithms, LabVIEW application has been used for real-time data acquisition, as well as MATLAB software for algorithm development and data analysis, together with the corresponding hardware. The validation of results was performed using the ADS-B position messages and radar tracks provided by the Public Corporate Entity ENAIRE The developed technique is autonomous, and it does not require any other input other than the omnidirectional signal reception. However, for the validation of results, not only radar records have been used, but also public information regarding the position of SSR stations spread throughout the Spanish and Portuguese territory. The results show that using techniques based in the definition of positioning surfaces defined by the responses’ times of arrival, it is possible to determine with an acceptable level of accuracy both the position of the SSR stations as well as the position of any aircraft which transmits Mode A responses.

Slow cycling of unphosphorylated myosin is inhibited by calponin, thus keeping smooth muscle relaxed

A key unanswered question in smooth muscle biology is whether phosphorylation of the myosin regulatory light chain (RLC) is sufficient for regulation of contraction, or if thin-filament-based regulatory systems also contribute to this process. To address this issue, the endogenous RLC was extracted from single smooth muscle cells and replaced with either a thiophosphorylated RLC or a mutant RLC (T18A/S19A) that cannot be phosphorylated by myosin light chain kinase. The actin-binding protein calponin was also extracted. Following photolysis of caged ATP, cells without calponin that contained a nonphosphorylatable RLC shortened at 30% of the velocity and produced 65% of the isometric force of cells reconstituted with the thiophosphorylated RLC. The contraction of cells reconstituted with nonphosphorylatable RLC was, however, specifically suppressed in cells that contained calponin. These results indicate that calponin is required to maintain cells in a relaxed state, and that in the absence of this inhibition, dephosphorylated cross-bridges can slowly cycle and generate force. These findings thus provide a possible framework for understanding the development of latch contraction, a widely studied but poorly understood feature of smooth muscle.

Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis

Plague, one of the most devastating diseases of human history, is caused by Yersinia pestis. In this study, we analyzed the population genetic structure of Y. pestis and the two other pathogenic Yersinia species, Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica. Fragments of five housekeeping genes and a gene involved in the synthesis of lipopolysaccharide were sequenced from 36 strains representing the global diversity of Y. pestis and from 12–13 strains from each of the other species. No sequence diversity was found in any Y. pestis gene, and these alleles were identical or nearly identical to alleles from Y. pseudotuberculosis. Thus, Y. pestis is a clone that evolved from Y. pseudotuberculosis 1,500–20,000 years ago, shortly before the first known pandemics of human plague. Three biovars (Antiqua, Medievalis, and Orientalis) have been distinguished by microbiologists within the Y. pestis clone. These biovars form distinct branches of a phylogenetic tree based on restriction fragment length polymorphisms of the locations of the IS100 insertion element. These data are consistent with previous inferences that Antiqua caused a plague pandemic in the sixth century, Medievalis caused the Black Death and subsequent epidemics during the second pandemic wave, and Orientalis caused the current plague pandemic.

Hybridization of single-stranded DNA targets to immobilized complementary DNA probes: comparison of hairpin versus linear capture probes

A microtiter-based assay system is described in which DNA hairpin probes with dangling ends and single-stranded, linear DNA probes were immobilized and compared based on their ability to capture single-strand target DNA. Hairpin probes consisted of a 16 bp duplex stem, linked by a T2-biotin·dT-T2 loop. The third base was a biotinylated uracil (UB) necessary for coupling to avidin coated microtiter wells. The capture region of the hairpin was a 3′ dangling end composed of either 16 or 32 bases. Fundamental parameters of the system, such as probe density and avidin adsorption capacity of the plates were characterized. The target DNA consisted of 65 bases whose 3′ end was complementary to the dangling end of the hairpin or to the linear probe sequence. The assay system was employed to measure the time dependence and thermodynamic stability of target hybridization with hairpin and linear probes. Target molecules were labeled with either a 5′-FITC, or radiolabeled with [γ-33P]ATP and captured by either linear or hairpin probes affixed to the solid support. Over the range of target concentrations from 10 to 640 pmol hybridization rates increased with increasing target concentration, but varied for the different probes examined. Hairpin probes displayed higher rates of hybridization and larger equilibrium amounts of captured targets than linear probes. At 25 and 45°C, rates of hybridization were better than twice as great for the hairpin compared with the linear capture probes. Hairpin–target complexes were also more thermodynamically stable. Binding free energies were evaluated from the observed equilibrium constants for complex formation. Results showed the order of stability of the probes to be: hairpins with 32 base dangling ends > hairpin probes with l6 base dangling ends > 16 base linear probes > 32 base linear probes. The physical characteristics of hairpins could offer substantial advantages as nucleic acid capture moieties in solid support based hybridization systems.

Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice.

During metamorphosis of Drosophila melanogaster, a cascade of morphological changes is triggered by the steroid hormone 20-OH ecdysone via the ecdysone receptor, a member of the nuclear receptor superfamily. In this report, we have transferred insect hormone responsiveness to mammalian cells by the stable expression of a modified ecdysone receptor that regulates an optimized ecdysone responsive promoter. Inductions reaching 4 orders of magnitude have been achieved upon treatment with hormone. Transgenic mice expressing the modified ecdysone receptor can activate an integrated ecdysone responsive promoter upon administration of hormone. A comparison of tetracycline-based and ecdysone-based inducible systems reveals the ecdysone regulatory system exhibits lower basal activity and higher inducibility. Since ecdysone administration has no apparent effect on mammals, its use for regulating genes should be excellent for transient inducible expression of any gene in transgenic mice and for gene therapy.

Iontophoresis for modulation of cardiac drug delivery in dogs.

Cardiac arrhythmias are a frequent cause of death and morbidity. Conventional antiarrhythmia therapy involving oral or intravenous medication is often ineffective and complicated by drug-associated side effects. Previous studies from our laboratory have demonstrated the advantages of cardiac drug-polymer implants for enhanced efficacy for cardiac arrhythmia therapy compared with conventional administration. However, these studies were based on systems that deliver drugs at a fixed release rate. Modulation of the drug delivery rate has the advantage of regulating the amount of the drug delivered depending upon the disease state of the patient. We hypothesized that iontophoresis could be used to modulate cardiac drug delivery. In this study, we report our investigations of a cardiac drug implant in dogs that is capable of iontophoretic modulation of the administration of the antiarrhythmic agent sotalol. We used a heterogeneous cation-exchange membrane (HCM) as an electrically sensitive and highly efficient rate-limiting barrier on the cardiac-contacting surface of the implant. Thus, electric current is passed only through the HCM and not the myocardium. The iontophoretic cardiac implant demonstrated in vitro drug release rates that were responsive to current modulation. In vivo results in dogs have confirmed that iontophoresis resulted in regional coronary enhancement of sotalol levels with current-responsive increases in drug concentrations. We also observed acute current-dependent changes in ventricular effective refractory periods reflecting sotalol-induced refractoriness due to regional drug administration. In 30-day dog experiments, iontophoretic cardiac implants demonstrated robust sustained function and reproducible modulation of drug delivery kinetics.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Sistemas radar aplicados a la investigación de subsidencia y movimientos de ladera

En este trabajo se presentan los sistemas radar satélite y terrestres, así como los métodos de análisis de imágenes radar clásicos y avanzados para la investigación de los movimientos del terreno, haciendo énfasis en la subsidencia y los movimientos de ladera. Para ello en primer lugar se describen los distintos sensores radar disponibles así como las principales características de las imágenes radar generadas. A continuación se detallan los aspectos fundamentales de la interferometría diferencial, de los distintos métodos de interferometría diferencial avanzada y del radar terrestre. Finalmente se presentan los resultados obtenidos en distintas zonas de estudio: la subsidencia por explotación del acuífero en el área metropolitana de Murcia, la subsidencia minera y los movimientos de ladera de la Sierra de Cartagena, los movimientos de ladera de la cuenca del río Gállego y el deslizamiento del Portalet.