水稻花药绒毡层特异基因及减数分裂相关基因的分离与功能分析

　利用RNA减法杂交、差异筛选和5’-RACE等方法从水稻分离到了一花药绒毡层特异表达的基因RA39。Southern 杂交表明，RA39在水稻基因组中是以单拷贝的形式存在的。RT-PCR 结果初步表明，RA39是一水稻花药特异表达的基因。RNA原位杂交进一步表明，RA39主要在水稻花药的绒毡层中表达，而且在小孢子母细胞减数分裂期和四分体时期表达量最高。RA39 cDNA全长1013bp，编码298个氨基酸残基。 RA39 cDNA与数据库中的已知序列没有明显的相似性，由其推测的多肽与核糖体失活蛋白（ribosome-inactivating protein, RIP）的序列相似在19-34%之间。多重序列排列分析结果表明构成RIPs活性位点的5个关键氨基酸残基在RA39中是保守的，在蓖麻毒蛋白中分别为Tyr80、 Tyr123、 Glu177、 Arg180 and Trp211 。利用原核表达系统，通过蛋白质分离和纯化获得了在SDS电泳图谱上为单一条带的纯的RA39蛋白，用兔rRNA作底物进行的酶活性分析证明该蛋白有N-糖基化作用，是一种类型I的核糖体失活蛋白。反义转基因植株的花粉用TTC进行活性染色结果显示其活性明显减弱，成熟的T0代反义转基因植株的结实率明显降低，只有对照的20-60%。这说明，RA39蛋白可能和小孢子母细胞的发育相关。 　　酵母DMC1是减数分裂过程中同源染色体配对和重组修复所必需的减数分裂特异基因。根据酵母Dmc1和拟南芥AtDmc1的保守区设计简并性引物，通过RT-PCR和RACE等方法，从水稻中分离出了酵母DMC1的同源基因OsDMC1。RT-PCR分析表明，OsDMC1在花中表达量最高，在根中表达量较低，在叶片和幼芽几乎不表达。水稻基因组中有两个拷贝的OsDMC1。OsDmc1蛋白与酵母Dmc1和拟南芥AtDmc1氨基酸一致性分别为53%和81%。 　　酵母Spo11在减数分裂过程中具有催化DNA双链断裂从而起始同源重组的功能。以酵母Spo11氨基酸序列为探针和现有的数据库通过数据分析，结合RACE技术，克隆了水稻SPO11同源基因OsSPO11-1， OsSPO11-1是一个单拷贝基因，有3个外显子和2个内含子，在转录过程中通过内含子的可变剪切产生4个不同的转录本（OsSPO11-1A、OsSPO11-1B、OsSPO11-1C和OsSPO11-1），其中，OsSPO11-1A是一个未剪切的转录本，OsSPO11-1B包含内含子2，OsSPO11-1C包含内含子1，OsSPO11-1D是一个完全剪切的转录本。这些转录本编码的蛋白有一致的246氨基酸残基的C-端，包含了Spo11/TopVIA家族蛋白共有的5个功能基元，是该家族的新成员。OsSPO11-1A和 OsSPO11-1C在花中优势积累，OsSPO11-1B是花特异的，而OsSPO11-1D在营养器官中优势积累。在花中该基因主要在减数分裂的花粉母细胞和胚曩中表达，在减数分裂期的绒毡层细胞和不同花器官的微管束细胞中也表达。这些结果说明内含子涉及到了OsSPO11-1表达的器官特异性调节，该基因除了参与减数分裂的调节外，在体细胞的发育中可能起重要作用。