Combined clonotyping and gene signatures of individual tumor-reactive CD8 T-cells define their functional relevance following peptide vaccination in melanoma patients

Novel cancer vaccines are capableto efficiently induce and boost humantumor antigen specific T-cells. However,the properties of these CD8T-cells are only partially characterized.For in depth investigation ofT-cells following Melan-A/MART-1peptide vaccination in melanoma patients,we conducted a detailed prospectivestudy at the single cell level.We first sorted individual human naiveand effector CD8 T-cells from peripheralblood by flow cytometry, andtested a modified RT-PCR protocolincluding a global amplification ofexpressed mRNAs to obtain sufficientcDNAfromsingle cells.We successfullydetected the expression ofseveral specific genes of interest evendown to 106-fold dilution (equivalentto 10-5 cell). We then analyzed tumor-specific effector memory (EM)CD8T-cell subpopulations ex vivo, assingle cells from vaccinated melanomapatients. To elucidate the hallmarksof effective immunity the genesignatures were defined by a panel ofgenes related to effector functions(e.g. IFN-, granzyme B, perforin),and individual clonotypes were identifiedaccording to the expression ofdistinct T-cell receptors (TCR). Usingthis novel single cell analysis approach,we observed that T-cell differentiationis clonotype dependent,with a progressive restriction in TCRBV clonotype diversity from EMCD28pos to EMCD28neg subsets. However,the effector function gene imprintingis clonotype-independent,but dependent on differentiation,since it correlates with the subset oforigin (EMCD28pos or EMCD28neg). We also conducted a detailedcomparative analysis after vaccinationwith natural vs. analog Melan-Apeptide. We found that the peptideused for vaccination determines thefunctional outcome of individualT-cell clonotypes, with native peptideinducing more potent effector functions.Yet, selective clonotypic expansionwith differentiation was preservedregardless of the peptide usedfor vaccination. In summary, the exvivo single cell RT-PCR approach ishighly sensitive and efficient, andrepresents a reliable and powerfultool to refine our current view of molecularprocesses taking place duringT-cell differentiation.

Intercellular calcium waves in primary cultured rat mesenteric smooth muscle cells are mediated by connexin43.

Intercellular Ca(2+) wave propagation between vascular smooth muscle cells (SMCs) is associated with the propagation of contraction along the vessel. Here, we characterize the involvement of gap junctions (GJs) in Ca(2+) wave propagation between SMCs at the cellular level. Gap junctional communication was assessed by the propagation of intercellular Ca(2+) waves and the transfer of Lucifer Yellow in A7r5 cells, primary rat mesenteric SMCs (pSMCs), and 6B5N cells, a clone of A7r5 cells expressing higher connexin43 (Cx43) to Cx40 ratio. Mechanical stimulation induced an intracellular Ca(2+) wave in pSMC and 6B5N cells that propagated to neighboring cells, whereas Ca(2+) waves in A7r5 cells failed to progress to neighboring cells. We demonstrate that Cx43 forms the functional GJs that are involved in mediating intercellular Ca(2+) waves and that co-expression of Cx40 with Cx43, depending on their expression ratio, may interfere with Cx43 GJ formation, thus altering junctional communication.

clc is co-expressed with clf or cntfr in developing mouse muscles

Affiliation: Jean-François Gauchat : Département de Pharmacologie, Faculté de médecine, Université de Montréal

Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la régulation du développement des circuits d’interneurones GABAergiques dans le néocortex : rôle de la molécule d’adhésion cellulaire neurale (NCAM)

Les interneurones GABAergiques constituent une population mineure de cellules par rapport aux neurones glutamatergiques dans le néocortex. Cependant ils contrôlent fortement l'excitabilité neuronale, la dynamique des réseaux neuronaux et la plasticité synaptique. L'importance des circuits GABAergiques dans le processus fonctionnel et la plasticité des réseaux corticaux est soulignée par des résultats récents qui montrent que des modifications très précises et fiables des circuits GABAergiques sont associées à divers troubles du développement neurologique et à des défauts dans les fonctions cérébrales. De ce fait, la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires impliquant le développement des circuits GABAergiques est la première étape vers une meilleure compréhension de la façon dont les anomalies de ces processus peuvent se produire. La molécule d’adhésion cellulaire neurale (NCAM) appartient à la super-famille des immunoglobulines de reconnaissance cellulaire et est impliquée dans des interactions homophiliques et hétérophiliques avec d’autres molécules. Même si plusieurs rôles de NCAM ont été démontrés dans la croissance neuronale, la fasciculation axonale, la formation et la maturation de synapses, de même que dans la plasticité cellulaire de plusieurs systèmes, le rôle de NCAM dans la formation des synapses GABAergiques reste inconnu. Ce projet visait donc à déterminer le rôle précis de NCAM dans le processus de maturation des synapses GABAergiques dans le néocortex, en modulant son expression à différentes étapes du développement. L’approche choisie a été de supprimer NCAM dans des cellules GABAergiques à paniers avant la maturation des synapses (EP12-18), pendant la maturation (EP16-24), ou durant le maintien de celles-ci (EP24-32). Les méthodes utilisées ont été le clonage moléculaire, l’imagerie confocale, la culture de coupes organotypiques et des techniques morphométriques de quantification de l’innervation GABAergique. Nos résultats montrent que l’inactivation de NCAM durant la phase de maturation des synapses périsomatiques (EP16-24) cause une réduction du nombre de synapses GABAergiques périsomatiques et du branchement de ces axones. En revanche, durant la phase de maintien (EP26-32), l’inactivation de NCAM n’a pas affecté ces paramètres des synapses GABAergiques. Or, il existe trois isoformes de NCAM (NCAM120, 140 et 180) qui pourraient jouer des rôles différents dans les divers types cellulaires ou à des stades développementaux différents. Nos données montrent que NCAM120 et 140 sont nécessaires à la maturation des synapses périsomatiques GABAergiques. Cependant, NCAM180, qui est l’isoforme la plus étudiée et caractérisée, ne semble pas être impliquée dans ce processus. De plus, l’inactivation de NCAM n’a pas affecté la densité des épines dendritiques ou leur longueur. Elle est donc spécifique aux synapses périsomatiques GABAeriques. Finalement, nos résultats suggèrent que le domaine conservé C-terminal KENESKA est essentiel à la maturation des synapses périsomatiques GABAergiques. Des expériences futures nous aiderons à mieux comprendre la mécanistique et les différentes voies de signalisation impliquées.

Automaticité dans le coeur ischémique : analyse de bifurcation d’un modèle mathématique de cellule ventriculaire humaine

L’ischémie aigüe (restriction de la perfusion suite à l’infarctus du myocarde) induit des changements majeurs des propriétés électrophysiologique du tissu ventriculaire. Dans la zone ischémique, on observe une augmentation du potassium extracellulaire qui provoque l’élévation du potentiel membranaire et induit un "courant de lésion" circulant entre la zone affectée et saine. Le manque d’oxygène modifie le métabolisme des cellules et diminue la production d’ATP, ce qui entraîne l’ouverture de canaux potassique ATP-dépendant. La tachycardie, la fibrillation ventriculaire et la mort subite sont des conséquences possibles de l’ischémie. Cependant les mécanismes responsables de ces complications ne sont pas clairement établis. La création de foyer ectopique (automaticité), constitue une hypothèse intéressante expliquant la création de ses arythmies. Nous étudions l’effet de l’ischémie sur l’automaticité à l’aide d’un modèle mathématique de la cellule ventriculaire humaine (Ten Tusscher, 2006) et d’une analyse exhaustive des bifurcations en fonction de trois paramètres : la concentration de potassium extracellulaire, le "courant de lésion" et l’ouverture de canaux potassiques ATP-dépendant. Dans ce modèle, nous trouvons que seule la présence du courant de lésion peut entrainer une activité automatique. Les changements de potassium extracellulaire et du courant potassique ATP-dépendant altèrent toutefois la structure de bifurcation.

Pro-inflammatory and angiogenic activities of VEGF and angiopoietins in murine sponge/Matrigel model

La dérégulation de la formation et l'intégrité des vaisseaux sanguins peut conduire à un état pathologique tel qu’observé dans de nombreuses maladies ischémiques telles que: la croissance de tumeur solide, l’arthrite rhumatoïde, le psoriasis, les rétinopathies et l'athérosclérose. Par conséquent, la possibilité de moduler l'angiogenèse régionale chez les patients souffrant d'ischémie est cliniquement pertinente. Un élément clé dans l'induction de l'angiogenèse pathologique est une inflammation qui précède et accompagne la formation des nouveaux vaisseaux. Ce phénomène est démontré par l'augmentation de la perméabilité vasculaire et le recrutement de monocytes/ macrophages et cellules polynucléaires (neutrophiles). En collaboration avec d'autres groupes, nous avons montré que différents facteurs de croissance tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire et les angiopoïétines peuvent non seulement promouvoir l'angiogenèse mais aussi induire diverses étapes connexes au processus de la réaction inflammatoire, y compris la synthèse et la libération des médiateurs inflammatoires et la migration des neutrophiles. Les objectifs de notre étude étaient d'adresser si le vascular endothelial growth factor (VEGF) et les angiopoïétines (Ang1 et Ang2) sont capables de promouvoir la formation des nouveaux vaisseaux sanguins au fil du temps et d'identifier la présence de différentes cellules inflammatoires dans ce processus. Des éponges d'alcool polyvinylique stérilisées et imbibées de Matrigel appauvri en facteur de croissance (contenant PBS, VEGF, Ang1 ou Ang2 (200 ng/200 μl)) ont été insérées sous la peau de souris C57/Bl6 anesthésiées. Les éponges ont ensuite été retirées aux jours 4, 7, 14 ou 21 après la procédure pour des analyses histologiques, immunohistologiques et cytométriques. La formation des nouveaux vaisseaux a été validée par la coloration au Trichrome de Masson et des analyses histologiques et immunohistologiques contre les cellules endothéliales (anti-CD31). De plus, la maturation des vaisseaux a été démontrée par la coloration séquentielle contre les cellules endothéliales (anti-CD31) et musculaires lisses (anti-alpha-actine). Nous avons effectué la même procédure pour caractériser le recrutement de neutrophiles (anti-MPO), et de macrophages (anti-F4/80). Afin de mieux délimiter la présence de différents sous-ensembles de leucocytes recrutés dans les éponges, nous avons utilisé une technique de cytométrie en flux sur des préparations de cellules isolées à partir de ces éponges. Nous avons observé que le VEGF et les angiopoïétines favorisent le recrutement de cellules endothéliales et la formation de nouveaux vaisseaux plus rapidement qu’en présence de PBS. Une fois formé au jour 7, ces nouveaux vaisseaux restent stables en nombre, et ne subissent pas une réorganisation importante de leur surface. Ces vaisseaux maturent grâce au recrutement et au recouvrement par les cellules musculaires lisses des néovaisseaux. En outre, le microenvironnement angiogénique est composé de cellules inflammatoires, principalement de neutrophiles, macrophages et quelques cellules de type B et T. Donc, le VEGF, l’Ang1 et l’Ang2 induisent séparément la formation et la stabilisation de nouveaux vaisseaux sanguins, ainsi que le recrutement de cellules inflammatoires avec des puissances différentes et une action temps-dépendante dans un modèle d’éponge/Matrigel.

Mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement des synapses GABAergiques périsomatiques et dans la plasticité corticale : rôle de l’activité neuronale et de proBDNF/p75NTR

Dans le cortex visuel des mammifères, une cellule à panier (BC) qui représente un sous-type majoritaire d’interneurones GABAergiques, innerve une centaine de neurones par une multitude de synapses localisées sur le soma et sur les dendrites proximales de chacune de ses cibles. De plus, ces cellules sont importantes pour la génération des rythmes gammas, qui régulent de nombreuses fonctions cognitives, et pour la régulation de la plasticité corticale. Bien que la fonction des BC au sein des réseaux corticaux est à l'étude, les mécanismes qui contrôlent le développement de leur arborisation complexe ainsi que de leurs nombreux contacts synaptiques n’ont pas été entièrement déterminés. En utilisant les récepteurs allatostatines couplés aux protéines G de la drosophile (AlstR), nous démontrons in vitro que la réduction de l'excitation ainsi que la réduction de la libération des neurotransmetteurs par les BCs corticales individuelles des souris, diminuent le nombre de cellules innervées sans modifier le patron d'innervation périsomatique, durant et après la phase de prolifération des synapses périsomatiques. Inversement, lors de la suppression complète de la libération des neurotransmetteurs par les BCs individuelles avec l’utilisation de la chaîne légère de la toxine tétanus, nous observons des effets contraires selon le stade de développement. Les BCs exprimant TeNT-Lc pendant la phase de prolifération sont caractérisées par des arborisations axonales plus denses et un nombre accru de petits boutons homogènes autour des somas innervés. Toutefois, les cellules transfectées avec TeNT-Lc après la phase de la prolifération forment une innervation périsomatique avec moins de branchements terminaux d’axones et un nombre réduit de boutons avec une taille irrégulière autour des somas innervés. Nos résultats révèlent le rôle spécifique des niveaux de l’activité neuronale et de la neurotransmission dans l'établissement du territoire synaptique des cellules GABAergiques corticaux. Le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) est un modulateur puissant de la maturation activité-dépendante des synapses GABAergiques. Grâce à l'activation et à la signalisation de son récepteur tyrosine kinase B (TrkB), la liaison de mBDNF module fortement la prolifération des synapses périsomatiques GABAergiques formés par les BCs. Par contre, le rôle du récepteur neurotrophique de faible affinité, p75NTR, dans le développement du territoire synaptique des cellules reste encore inconnu. Dans ce projet, nous démontrons que la suppression de p75NTR au niveau des BCs individuelles in vitro provenant de souris p75NTRlox induit la formation d'une innervation périsomatique exubérante. BDNF est synthétisé sous une forme précurseur, proBDNF, qui est par la suite clivée par des enzymes, y compris la plasmine activée par tPA, pour produire une forme mature de BDNF (m)BDNF. mBDNF et proBDNF se lient avec une forte affinité à TrkB et p75NTR, respectivement. Nos résultats démontrent qu’un traitement des cultures organotypiques avec la forme résistante au clivage de proBDNF (mut-proBDNF) réduit fortement le territoire synaptique des BCs. Les cultures traitées avec le peptide PPACK, qui inactive tPA, ou avec tPA altèrent et favorisent respectivement la maturation de l’innervation synaptique des BCs. Nous démontrons aussi que l’innervation exubérante formée par les BCs p75NTR-/- n’est pas affectée par un traitement avec mut-proBDNF. L’ensemble de ces résultats suggère que l'activation de p75NTR via proBDNF régule négativement le territoire synaptique des BCs corticaux. Nous avons ensuite examiné si mut-proBDNF affecte l’innervation périsomatique formée par les BCs in vivo, chez la souris adulte. Nous avons constaté que les boutons GABAergiques périsomatiques sont significativement diminués dans le cortex infusé avec mut-proBDNF par rapport à l’hémisphère non-infusé ou traité avec de la saline. En outre, la plasticité de la dominance oculaire (OD) est rétablie par ce traitement chez la souris adulte. Enfin, en utilisant des souris qui ne possèdent pas le récepteur p75NTR dans leurs BCs spécifiquement, nous avons démontré que l'activation de p75NTR via proBDNF est nécessaire pour induire la plasticité de la OD chez les souris adultes. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle critique de l'activation de p75NTR dans la régulation et le maintien de la connectivité des circuits GABAergiques, qui commencent lors du développement postnatal précoce jusqu’à l'âge adulte. De plus, nous suggérons que l'activation contrôlée de p75NTR pourrait être un outil utile pour restaurer la plasticité dans le cortex adulte.

Process Optimization for Mass Production of Marine Yeast Candida sp. S 27 and its Nutritional Characterization

The main source of protein for human and animal consumption is from the agricultural sector, where the production is vulnerable to diseases, fluctuations in climatic conditions and deteriorating hydrological conditions due to water pollution. Therefore Single Cell Protein (SCP) production has evolved as an excellent alternative. Among all sources of microbial protein, yeast has attained global acceptability and has been preferred for SCP production. The screening and evaluation of nutritional and other culture variables of microorganisms are very important in the development of a bioprocess for SCP production. The application of statistical experimental design in bioprocess development can result in improved product yields, reduced process variability, closer confirmation of the output response to target requirements and reduced development time and overall cost.The present work was undertaken to develop a bioprocess technology for the mass production of a marine yeast, Candida sp.S27. Yeasts isolated from the offshore waters of the South west coast of India and maintained in the Microbiology Laboratory were subjected to various tests for the selection of a potent strain for biomass production. The selected marine yeast was identified based on ITS sequencing. Biochemical/nutritional characterization of Candida sp.S27 was carried out. Using Response Surface Methodology (RSM) the process parameters (pH, temperature and salinity) were optimized. For mass production of yeast biomass, a chemically defined medium (Barnett and Ingram, 1955) and a crude medium (Molasses-Yeast extract) were optimized using RSM. Scale up of biomass production was done in a Bench top Fermenter using these two optimized media. Comparative efficacy of the defined and crude media were estimated besides nutritional evaluation of the biomass developed using these two optimized media.

Cellular and humoral factors involved in defense mechanisms of Fenneropenaeus indicus (H. Milne Edwards, 1837)

The present investigation revealed three types of circulating haemocytes in the haemolymph of F. indicus: hyalinocytes, small-granule haemocytes, and large-granule haemocytes. Intermediate stages indicate the maturing process of a single cell. The presence of enzymes such as peroxidase, phenoloxidase and acid phosphatase in the haemocytes, and the substantial production of oxygen radicals during phagocytosis show that the haemocytes are capable of mounting a fme cellular defense mechanism. The enzyme activities of the serum and the presence of agglutinins in the serum, which may act as opsonins, agglutinate foreign particles and augment phagocytosis, confirm the presence of a superior humoral immune system in F. indicus.Bacterial infection caused considerable variations in the cellular and humoral factors, such as the number of circulating cells and haemagglutinating activity, especially in the initial hours of infection. The total haemocyte count, haemagglutination titer and phenoloxidase enzyme showed significant reductions on bacterial presence and could be used as indicators of bacterial infection.The number of circulating cells showed drastic fluctuation on exposure to pollutants. Nuvan at low concentrations was able to produce changes in the haemolymph factors and in the tissue organization, which implies that the animal is under stress and is easily prone to infections. Exposure to nuvan resulted in significant variation in all of the cellular and humoral factors, especially, the total haemocyte count, percentage of small granule haemocytes, phagocytic activity and the haemagglutinating activity, which might be good indicators of pesticide pollution. Heavy metal exposure caused significant increase in total haemocyte count and reduction in phenoloxidase enzyme activity Even changes in the physio-chemical parameters, such as salinity caused fluctuations in the defense factors, indicating stress in this euryhaline species. The dietary incorporation of a commercial immunostimulant containing P-l,3 glucan resulted in stimulation of some of the humoral defense factors of F indicus, but was time dependent. The modulations, on exposure to various external factors, in the cellular and humoral factors, especially, total haemocyte count, phagocytic activity, haemagglutinating activity and the phenoloxidase and acid phosphatase enzymes suggest that these parameters could be used as indicators of the health status of F indicus, which assist in better monitoring and effective health management of this important cultured species.

Microbial enzyme production utilizing banana wastes

A critical survey of the fruits and vegetable markets of the towns and cities in South India reveals that banana fruit stalk wastes share a dominant proportion among the solid wastes generated. In the light of the review of literature presented in the foregoing section, few reports are available on the utilisation of banana waste for the production of alcoholic beverages, biogas, and single cell protein. However, it is not yet tried for the production of industrial enzymes. Moreover, preliminary fermentation studies conducted under uncontrolled conditions revealed that banana fruit stalk could be aptly utilised as solid substrate? for the industrial production of microbial amylases and cellulases at a cheaper cost. Therefore, it was proposed to conduct a detailed study towards the development of a suitable fermentation process for the production of industrial enzymes using banana fruit stalk wastes, which is rich in carbohydrate, as solid substrate, employing bacteria, under SSF.

Marine yeast Candida MCCF 101 as feed supplement in aquaculture: nutritional quality, optimization of large scale production and evaluation of its protective effect on Koi carp from Aeromonas infection

Marine yeast have been regarded as safe and showing a beneficial impact on biotechnological process. It provides better nutritional and dietary values indicating their potential application as feed supplements in aquaculture. Brown et al. (1996) evaluated all the marine yeasts characterised with high protein content, carbohydrate, good amino acid composition and high levels of saturated fats. However, there is paucity of information on marine yeasts as feed supplements and no feed formulation has been found either in literature or in market supplemented with them. This statement supported by Zhenming et al. (2006) reported still a lack of feed composed of single cell protein (SCP) from marine yeasts with high content of protein and other nutrients. Recent research has shown that marine yeasts also have highly potential uses in food, feed, medical and biofuel industries as well as marine biotechnology (Chi et al., 2009; 2010). Sajeevan et al. (2006; 2009a) and Sarlin and Philip (2011) demonstrates that the marine yeasts Candida sake served as a high quality, inexpensive nutrient source and it had proven immunostimulatory properties for cultured shrimps. This strain has been made part of the culture collection of National Centre for Aquatic Animal Health, Cochin University of Science and Technology as Candida MCCF 101. Over the years marine yeasts have been gaining increased attention in animal feed industry due to their nutritional value and immune boosting property.Therefore, the present study was undertaken, and focused on the nutritional quality, optimization of large scale production and evaluation of its protective effect on Koi carp from Aeromonas infection

Molecular studies on a Dictyostelium homolog of the tafazzin gene, the cause of Barth syndrome in humans

Der eukaryotische Mikroorganismus Dictyostelium discoideum lebt als einzellige Amöbe solange ausreichende Nahrungsressourcen zur Verfügung stehen. Sobald Nahrungsmangel eintritt, entwickeln sich die Zellen von einem einzelligen zu einem mehrzelligen Zustand, der mit einem multizellulären Fruchtkörper abschließt. Dieser Prozess wird durch eine Reihe aufeinanderfolgender Signale organisiert, die eine differentielle Genexpression regulieren. Die Gene der Discoidin I Familie gehören zu den Ersten, die im Laufe des Wachstums-Differenzierungs-Übergangs (engl. GDT) aktiviert werden. Sie eignen sich daher vorzüglich als Marker für den Beginn der Entwicklung. Mit Hilfe einer REMI-Mutagenese und Discoidin I als molekularem Marker sind verschiedene Komponenten des Wachstums-Differenzierungs-Übergangs in unserer Arbeitsgruppe identifiziert worden (Zeng et al., 2000 A und B; Riemann und Nellen, persönliche Mitteilung). Mit demselben Ansatz wurde in der vorliegenden Arbeit eine REMI-Mutante identifiziert, die eine Fehl-Expression von Discoidin zeigte und einen axenischen Wachstumsdefekt bei 15 °C aufwies. Das Gen wurde als Homolog zum humanen Tafazzin-Gen identifiziert. Dieses Gen wurde zur Rekonstruktion des Phänotyps über homologe Rekombination erneut disruptiert, was wie erwartet zu dem zuerst beschriebenen Phänotyp führte. Folgerichtig ergab eine Überexpression des Gens in den Mutanten eine Komplementation des Phänotyps. Immunfluoreszenz-Experimente zeigten eine mitochondriale Lokalisation des Dictyostelium discoideum Taffazzin Proteins. Dass ein mitochondriales Protein in Zusammenhang mit dem Wachstums-Differenzierungs-Übergang steht, ist ein unerwarteter Befund, der aber als Hinweis darauf gewertet werden kann, dass Mitochondrien einen direkten Einfluss auf die entwicklungsspezifische Signaltransduktion ausüben. Die Taffazzin Disruptions-Mutante in Dictyostelium führte zu einem abnormalen Cardiolipin Metabolismus. Dieses Phospholipid ist ein charakteristischer Bestandteil der inneren Mitochondrienmembran und für die Funktion verschiedener Enzyme erforderlich. Unsere vorläufigen Analysen des Phospholipid-Gehalts zeigten Übereinstimmung mit Daten von Patienten mit Barth-Syndrom, einer humanen Erkrankung, bei der das Taffazzin-Gen Mutationen aufweist, und mit Hefe-Mutanten dieses Gens. Dies zeigt den Wert von Dictyostelium discoideum als einen weiteren Modelorganismus zur Untersuchung des Barth-Syndroms und zur Erprobung möglicher Therapieansätze.

Molekulare Systematik der Gattung Suaeda (Chenopodiaceae) und Evolution des C4-Photosynthesesyndroms

Mit der vorliegenden Arbeit wird eine Synthese aus molekularer Phylogenie und Merkmalsentwicklung für die Unterfamilie Suaedoideae der Chenopodiaceae präsentiert. Anhand von rekonstruierten Stammbäumen aus den Sequenzunterschieden von DNA-Abschnitten zweier unabhängiger Genome (Kern, Chloroplast) werden monophyletische Gruppen herausgearbeitet und die Variabilität der molekularen Merkmale in Bezug auf die bekannten Arten diskutiert. Insgesamt wurden für alle molekularen Analysen 294 Sequenzen ausgewertet. Mit 254 Sequenzen von Arten der Unterfamilie Suaedoideae und 18 Sequenzen von Arten der Unterfamilie Salicornioideae wurde eine vergleichende molekulare Analyse mit den DNA-Regionen ITS, atpB-rbcL und psbB-psbH durchgeführt. Mit der Einbeziehung von ca. 65 bekannten Suaeda-Arten sind damit je nach Artauffassung bis zu 80% aller Arten der Gattung berücksichtigt. Mittels Fossildaten werden die wichtigsten Divergenzereignisse zeitlich fixiert. Die molekularen Stammbäume dienen weiterhin als Grundlage für die Bewertung der Arten sowie ihrer morphologischen und anatomischen Merkmale. Ein wichtiger Aspekt bildet dabei die Entwicklung der C4-Photosynthese mit den zugehörigen Blatttypen. Die folgenden vier Themenkomplexe bzw. Fragestellungen sollten bearbeitet werden (für ausführliche Darstellung vgl. Kap. 1.3): 1. Monophyletische Gruppen und ihre Beziehungen 2. Prinzipien der Evolution und Artbildung in der untersuchten Gruppe, Abgrenzung der Arten. 3. Entwicklung des C4-Photosynthesesyndroms 4. Entwicklung und Variabilität systematisch relevanter Merkmale Die Ergebnisse der auf vergleichender DNA-Sequenzierung beruhenden molekularen Analyse und die Synthese mit weiteren Daten führen als Resultat der vorliegenden Arbeit zusammenfassend zu folgenden Ergebnissen: 1.) Die drei sequenzierten DNA-Regionen ITS, atpB-rbcL und psbB-psbH zeigen im Vergleich eine sehr unterschiedliche Variabilität, ITS ist die variabelste aller Regionen. Die in den Alignments gefundenen Merkmale in Form von Punkt- und Längenmutationen zwischen den Einzelsequenzen waren zahlenmäßig ausreichend und qualitativ geeignet, um mit den drei Verfahren Maximum Parsimony, Maximum Likelihood und Bayes’scher Analyse aussagekräftige und in wesentlichen Aussagen kongruente molekulare Phylogenien zu rekonstruieren. Die Chloroplasten-Daten wurden für die Berechnungen kombiniert. 2.) Die beiden DNA-Regionen ITS und atpB-rbcL evolvieren mit sehr unterschiedlichen Geschwindigkeiten. Die mit der Glättungsmethode PL berechneten durchschnittlichen Substitutionsraten weisen für ITS eine 5,5fach höhere Substitutionsrate gegenüber atpB-rbcL nach. Die ITS-Sequenzen sind daher wesentlich diverser und für einige Sippen, bei identischen atpB-rbcL-Sequenzen, unterschiedlich. Eine direkte Homologisierung von molekularer und morphologischer Variabilität oder die molekulare Limitierung von Arten ist daher nur in einigen Fällen möglich. 3.) Die Gattungen Suaeda, Alexandra und Borszczowia bilden eine monophyletische Gruppe, die den Salicornioideae als Schwestergruppe gegenübersteht. Dies bestätigt die Ergebnisse der Phylogenie der Chenopodiaceae (Kadereit et al. 2003). Im traditionellen Verständnis ist damit die Gattung Suaeda paraphyletisch. Durch taxonomische Umkombination (Schütze et al. 2003. Kapralov et al. 2006) werden die Gattungen Alexandra und Borszczowia in Suaeda eingegliedert, womit das Monophylie-Kriterium für die Gattung wieder erfüllt ist. Die molekularen Daten unterstützen diese nomenklatorische Neubewertung. Der nachfolgend verwendete Gattungsname Suaeda bezieht sich auf die neue Fassung. 4.) Bienertia gehört nicht in die unter 2.) beschriebene monophyletische Gruppe. Die Stellung dieser Gattung ist intermediär. Im ITS-Baum bildet sie die Schwestergruppe zu den Salicornioideae, im Chloroplasten-Baum diejenige zu Suaeda. Da Bienertia aufgrund morphologischer Merkmale Suaeda ähnlicher ist als den Salicornioideae wird sie in die intern neu gegliederte Unterfamilie der Suaedoideae einbezogen, die weitgehend der in Ulbrich (1934) vertretenen Auffassung entspricht. 5.) Suaeda teilt sich in zwei sehr deutlich getrennte Gruppen, die in einer neuen Gliederung als Untergattungen Brezia und Suaeda definiert werden. Die Trennung datiert mit etwa 30 Mio. Jahren in das Oligozän. Zur Untergattung Brezia gehören alle Arten der Sektion Brezia nach bisheriger taxonomischer Auffassung, die Untergattung Suaeda vereint alle übrigen Arten und wird in weitere Sektionen untergliedert. 6.) Die Untergattung bzw. Sektion Brezia zeigt im ITS-Baum eine deutliche Dreigliederung in 3 Subclades, die allerdings von den Chloroplasten-Bäumen nicht verifiziert wird und auch durch morphologische Merkmale nicht zu rechtfertigen ist. Die Subclades der Untergattung Suaeda entsprechen in Grundzügen den bisherigen Sektionen und sind durch synapomorphe Merkmale gekennzeichnet. Für die Gattung Suaeda leiten sich nach monophyletischen Gruppen oder singulären Linien folgende Sektionen ab: Brezia, Alexandra, Borszczowia, Schanginia, Schoberia Salsina (inkl. der früheren Sektionen Limbogermen, Immersa und Macrosuaeda), Suaeda, Physophora und Glauca (neu). 7.) Hybridisierung und Polyploidisierung sind wichtige Prozesse der sympatrischen Artbildung innerhalb der Suaedoideae und waren wahrscheinlich immer mit Arealerweiterungen gekoppelt. Mehrere Linien sind durch Vervielfachung des Chromosomensatzes charakterisiert, wobei auch die recht seltene Form der Dekaploidie erreicht wird. Vieles spricht dafür, dass sowohl Auto- als auch Allopolyploidie eine Rolle spielt. Auf Autopolyplodie beruhen höchstwahrscheinlich die unterschiedlichen Chromosomenrassen von S. corniculata. Durch Inkongruenzen zwischen Chloroplasten- und ITS (Kern)-Stammbäumen konnten einige Arten mit hoher Wahrscheinlichkeit als etablierte, allopolyploide Hybridsippen identifiziert werden (Suaeda kulundensis, S. sibirica). Es ist damit erwiesen, dass die Diversifizierung durch retikulate Evolution beeinflusst wird. 8.) Die Ergebnisse der molekularen Phylogenien belegen sehr deutlich, dass sich die C4-Photosynthese innerhalb der Suaedoideae viermal unabhängig mit vier vollkommen unterschiedlichen Blatttypen entwickelt hat. Dazu gehören zwei Blatttypen mit single cell C4-photosynthesis, ein bis vor kurzem bei Landpflanzen unbekanntes Phänomen. Innerhalb der Sektionen Schoberia, Salsina und Borszczowia datiert die Entstehung in das späte Miozän, bei Bienertia entstand die C4-Photosynthese möglicherweise noch früher. 9.) Als systematisch äußerst bedeutsame Merkmale haben sich die schon von Iljin (1936a) benutzten Pistill-Formen sowie spezifische Blattmerkmale herausgestellt. Mit diesen Merkmalen können Sektionen, die auf monophyletischen Gruppen beruhen, gut definiert werden. Synapomorphe Merkmale des Pistills sind die Zahl und Ausbildung der Narben sowie die Form ihrer Insertion im Ovar. Bei den Blatttypen sind es vor allem die vier histologisch hoch differenzierten C4-Blatttypen, die als gemeinsam abgeleitetes Merkmal rezenter, teilweise aufgespaltener Linien gewertet werden. 10.) Die früher z.T. überbewerteten Merkmale des Perianths (Verwachsungen, Flügel, Anhänge und Umbildungen) können nur zur Beschreibung einzelner Sippen oder lokaler Gruppen herangezogen werden. Ebenso ist das Merkmal der Lebensformen (Therophyten, Chamaephyten) kaum zur Charakterisierung von Gruppen geeignet. Wie das Beispiel Brezia sehr deutlich zeigt, kam es allein in dieser Gruppe mehrfach zur Entwicklung ausdauernder, verholzender Sippen. Der umgekehrte Prozess fand bei der Entstehung der annuellen S. aegyptiaca und S. arcuata statt. Mit Hilfe von DNA-basierten Stammbäumen ist es in der vorliegenden Arbeit möglich geworden, die evolutionäre Geschichte der Gattung nachzuzeichnen und eine auf monophyletischen Gruppen basierende Gliederung abzuleiten. Damit wird eine Grundlage für ein verbessertes Artkonzept der Gattung Suaeda geschaffen. Für die praktische Taxonomie ist dies aber nur teilweise bedeutend. Die morphologisch nachvollziehbare Abgrenzung von Arten bleibt, gerade in den diversen Sektionen Brezia und Salsina, umstritten und kaum nachvollziehbar. Ein Großteil der Arten hat offenbar keine interspezifischen Kompatibilitätsschranken, es handelt sich daher um Morpho- oder Semispecies, möglicherweise sogar nur geographische Rassen, die allerdings mit schnell evolvierenden DNA-Regionen wie ITS differenzierbar sind. Ausgehend von den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit verbleibt genügend Raum für weiterführende, vertiefende systematische und populationsbiologische Studien.

Physiological analysis of central and peripheral insect circadian pacemaker neurons

Alle bisher untersuchten Lebewesen besitzen (circadiane) innere Uhren, die eine endogene Perioden-länge von ungefähr 24 Stunden generieren. Eine innere Uhr kann über Zeitgeber mit der Umwelt synchronisiert werden und ermöglicht dem Organismus, rhythmische Umweltveränderungen vorweg zu nehmen. Neben einem zentralen Schrittmacher, der Physiologie und Verhalten des Organismus steuert, gibt es in unterschiedlichen Organen auch periphere Uhren, die die zeitlichen Abläufe in der spezifischen Funktion dieser Organe steuern. In dieser Arbeit sollten zentrale und periphere Schrittmacherneurone von Insekten physiologisch untersucht und verglichen werden. Die Neurone der akzessorischen Medulla (AME) von Rhyparobia maderae dienten als Modellsystem für zentrale Schrittmacher, während olfaktorische Rezeptorneurone (ORNs) von Manduca sexta als Modellsystem für periphere Schrittmacher dienten. Die zentralen Schrittmacherneurone wurden in extrazellulären Ableitungen an der isolierten AME (Netzwerkebene) und in Patch-Clamp Experimenten an primären AME Zellkulturen (Einzelzellebene) untersucht. Auf Netzwerkebene zeigten sich zwei charakteristische Aktivitätsmuster: regelmäßige Aktivität und Wechsel zwischen hoher und niedriger Aktivität (Oszillationen). Es wurde gezeigt, dass Glutamat ein Neurotransmitter der weitverbreiteten inhibitorischen Synapsen der AME ist, und dass in geringem Maße auch exzitatorische Synapsen vorkommen. Das Neuropeptid pigment-dispersing factor (PDF), das von nur wenigen AME Neuronen exprimiert wird und ein wichtiger Kopplungsfaktor im circadianen System ist, führte zu Hemmungen, Aktivierungen oder Oszillationen. Die Effekte waren transient oder langanhaltend und wurden wahrscheinlich durch den sekundären Botenstoff cAMP vermittelt. Ein Zielmolekül von cAMP war vermutlich exchange protein directly activated by cAMP (EPAC). Auf Einzelzellebene wurde gezeigt, dass die meisten AME Neurone depolarisiert waren und deshalb nicht feuerten. Die Analyse von Strom-Spannungs-Kennlinien und pharmakologische Experimente ergaben, dass unterschiedliche Ionenkanäle vorhanden waren (Ca2+, Cl-, K+, Na+ Kanäle sowie nicht-spezifische Kationenkanäle). Starke, bei hohen Spannungen aktivierende Ca2+ Ströme (ICa) könnten eine wichtige Rolle bei Ca2+-abhängiger Neurotransmitter-Ausschüttung, Oszillationen, und Aktionspotentialen spielen. PDF hemmte unterschiedliche Ströme (ICa, IK und INa) und aktivierte nicht-spezifische Kationenströme (Ih). Es wurde angenommen, dass simultane PDF-abhängige Hyper- und Depolarisationen rhythmische Membranpotential-Oszillationen verursachen. Dieser Mechanismus könnte eine Rolle bei PDF-abhängigen Synchronisationen spielen. Die Analyse peripherer Schrittmacherneurone konzentrierte sich auf die Charakterisierung des olfaktorischen Corezeptors von M. sexta (MsexORCO). In anderen Insekten ist ORCO für die Membran-Insertion von olfaktorischen Rezeptoren (ORs) erforderlich. ORCO bildet Komplexe mit den ORs, die in heterologen Expressionssystemen als Ionenkanäle fungieren und Duft-Antworten vermitteln. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass MsexORCO in pheromonsensitiven ORNs in vivo nicht als Teil eines ionotropen Rezeptors sondern als Schrittmacherkanal fungiert, der unterschwellige Membranpotential-Oszillationen generiert. MsexORCO wurde mit vermeintlichen Pheromonrezeptoren in human embryonic kidney (HEK 293) Zellen coexprimiert. Immuncytochemie und Ca2+ Imaging Experimente zeigten sehr schwache Expressionsraten. Trotzdem war es möglich zu zeigen, dass MsexORCO wahrscheinlich ein spontan-aktiver, Ca2+-permeabler Ionenkanal ist, der durch den ORCO-Agonisten VUAA1 und cyclische Nucleotide aktiviert wird. Außerdem wiesen die Experimente darauf hin, dass MsexOR-1 offensichtlich der Bombykal-Rezeptor ist. Eine weitere Charakterisierung von MsexORCO in primären M. sexta ORN Zellkulturen konnte nicht vollendet werden, weil die ORNs nicht signifikant auf ORCO-Agonisten oder -Antagonisten reagierten.

Programmable Self-Assembly: Constructing Global Shape using Biologically-inspire

In this thesis I present a language for instructing a sheet of identically-programmed, flexible, autonomous agents (``cells'') to assemble themselves into a predetermined global shape, using local interactions. The global shape is described as a folding construction on a continuous sheet, using a set of axioms from paper-folding (origami). I provide a means of automatically deriving the cell program, executed by all cells, from the global shape description. With this language, a wide variety of global shapes and patterns can be synthesized, using only local interactions between identically-programmed cells. Examples include flat layered shapes, all plane Euclidean constructions, and a variety of tessellation patterns. In contrast to approaches based on cellular automata or evolution, the cell program is directly derived from the global shape description and is composed from a small number of biologically-inspired primitives: gradients, neighborhood query, polarity inversion, cell-to-cell contact and flexible folding. The cell programs are robust, without relying on regular cell placement, global coordinates, or synchronous operation and can tolerate a small amount of random cell death. I show that an average cell neighborhood of 15 is sufficient to reliably self-assemble complex shapes and geometric patterns on randomly distributed cells. The language provides many insights into the relationship between local and global descriptions of behavior, such as the advantage of constructive languages, mechanisms for achieving global robustness, and mechanisms for achieving scale-independent shapes from a single cell program. The language suggests a mechanism by which many related shapes can be created by the same cell program, in the manner of D'Arcy Thompson's famous coordinate transformations. The thesis illuminates how complex morphology and pattern can emerge from local interactions, and how one can engineer robust self-assembly.