Pharmacogenetic Study on Antidementia Drugs

Differences in efficacy and safety of drugs among patients are a recognized problem in pharmacotherapy. The reasons are multifactorial and, therefore, the choice of a drug and its dosage for a particular patient based on different clinical and genetic factors is suggested to improve the clinical outcome. Four drugs are currently used for the treatment of Alzheimer's disease: three acetylcholinesterase inhibitors (donepezil, galantamine, rivastigmine) and the N-methyl-D-aspartate-antagonist memantine. For these drugs, a high interindividual variability in plasma levels was observed, which might influence the response to treatment. The main objective of this thesis was to provide a better understanding of clinical and genetic factors affecting the plasma levels of antidementia drugs. Furthermore, the relationship between plasma levels, genetic variations and side effects was assessed. For this purpose, a pharmacogenetic study was conducted including 300 patients from a naturalistic clinical setting. Analytical methods for the simultaneous measurement of antidementia drugs in plasma have been developed and validated using liquid chromatography methods coupled with mass spectrometry detection. Presently, these methods are used in the therapeutic drug monitoring service of our laboratory. The routine use of therapeutic drug monitoring for antidementia drugs cannot yet be recommended with the available data, but it may be beneficial for some patients in special clinical cases such as insufficient treatment response, side effects or drug interactions. Donepezil and galantamine are extensively metabolized by the liver enzymes cytochromes P450 (CYP) 2D6 and 3A and are substrates of the drug transporter P-glycoprotein. The relationship of variations in genes affecting the activity of these metabolic enzymes and drug transporter (CYP2D6, CYP3A, POR, NR1I2, ABCB1) with donepezil and galantamine plasma levels was investigated. The CYP2D6 genotype appeared to be the major genetic factor involved in the pharmacokinetics of these two drugs. Thus, CYP2D6 poor metabolizers demonstrated significantly higher drug plasma levels than extensive metabolizers. Additionally, in the donepezil study population, the frequency of side effects was significantly increased in poor metabolizers. Lower donepezil plasma levels were observed in ultra rapid metabolizers, which might expose those patients to the risk of non-response. Memantine is mainly eliminated unchanged by the kidney, with implication of tubular secretion by renal transporters. A population pharmacokinetic model was developed to quantify the effects of clinical factors and genetic variations in renal cation transporters (SLC22A1/2/5, SLC47A1, ABCB1), and nuclear receptors (NR1I2, NR1I3, PPARG) involved in transporter expression, on memantine plasma levels. In addition to the renal function and gender, a genetic variation in the nuclear receptor Pregnane-X-Receptor (NR1I2) significantly affected memantine elimination. These findings suggest that an individualized therapy approach for antidementia drugs, taking into account clinical characteristics and genetic background of a patient, might increase efficacy and safety of the treatment. - Les différences interindividuelles dans l'efficacité et la tolérance des médicaments sont un problème connu en pharmacothérapie. Les raisons sont multiples, et le choix du médicament et de la dose, basé sur des facteurs cliniques et génétiques spécifiques au patient, peut contribuer à améliorer la réponse clinique. Quatre médicaments sont couramment utilisés dans le traitement de la maladie d'Alzheimer : trois inhibiteurs de l'acétylcholinestérase (donépézil, galantamine, rivastigmine) et un antagoniste du récepteur N-méthyl-D-aspartate, la mémantine. Une forte variabilité interindividuelle dans les taux plasmatiques de ces quatre composés a été observée, ce qui pourrait influencer la réponse au traitement. L'objectif principal de ce travail de thèse est de mieux comprendre les facteurs cliniques et génétiques influençant les taux des médicaments pro-cognitifs. En outre, des associations entre les taux, la variabilité génétique et les effets secondaires ont été recherchées. Dans ce but, 300 patients sous traitement avec un médicament pro-cognitif ont été recrutés pour une étude pharmacogénétique. Des méthodes de dosage simultané de médicaments pro-cognitifs par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ont été développées et validées. Ces méthodes sont actuellement utilisées dans le service de suivi thérapeutique de notre unité. Malgré le fait qu'un suivi des taux sanguins des pro-cognitifs ne puisse pas encore être recommandé en routine, un dosage peut être utile dans des cas cliniques spécifiques, comme une réponse insuffisante, une intolérance ou une interaction médicamenteuse. Le donépézil et la galantamine sont fortement métabolisés par les cytochromes P450 (CYP) 2D6 et 3A, et sont également substrats du transporteur P-glycoprotéine. Les associations entre les polymorphismes génétiques de ces enzymes, cofacteur, récepteur nucléaire et transporteur (CYP2D6, CYP3A, POR, NR1I2, ABCB1) et les taux de donépézil et de galantamine ont été étudiées. Le génotype du CYP2D6 a été montré comme le facteur génétique majeur impliqué dans la pharmacocinétique de ces deux médicaments. Ainsi, les métaboliseurs déficients du CYP2D6 ont démontré des taux plasmatiques significativement plus élevés comparé aux bons métaboliseurs. De plus, dans la population traitée avec le donépézil, la fréquence des effets secondaires était plus élevée chez les métaboliseurs déficients. Des taux plasmatiques bas ont été mesurés chez les métaboliseurs ultra-rapides traités avec le donépézil, ce qui pourrait être un facteur de risque à une non-réponse au traitement. La mémantine est principalement éliminée sous forme inchangée par les reins, et partiellement par sécrétion tubulaire grâce à des transporteurs rénaux. Un modèle de cinétique de population a été développé pour quantifier les effets des différents facteurs cliniques et de la variabilité génétique des transporteurs rénaux (SLC22A1/2/5, SLC47A1, ABCB1) et des récepteurs nucléaires (NR1I2, NR1I3, PPARG, impliqués dans l'expression des transporteurs) sur les taux plasmatiques de mémantine. En plus de la fonction rénale et du genre, une variation génétique dans le récepteur nucléaire Pregnane-X-Receptor (NR1I2) a montré une influence significative sur l'élimination de la mémantine. Ces résultats suggèrent qu'une approche thérapeutique individualisée, prenant en compte des facteurs cliniques et génétiques du patient, pourrait améliorer l'efficacité et la sécurité du traitement pro-cognitif.

Neurophysiological effects of vasopressin and oxytocin in the central amygdala of the rat : a potential mechanism for the opposite modulation of anxiety and fear behavior

Abstract The amygdala is a group of nuclei in the temporal lobe of the brain that plays a crucial role in anxiety and fear behavior. Sensory information converges in the basolateral and lateral nuclei of the amygdala, which have been the first regions in the brain where the acquisition of new (fear) memories has been associated with long term changes in synaptic transmission. These nuclei, in turn, project to the central nucleus of the amygdala. The central amygdala, through its extensive projections to numerous nuclei in the midbrain and brainstem, plays a pivotal role in the orchestration of the rapid autonomic and endocrine fear responses. In the central amygdala a large number of neuropeptides and receptors is expressed, among which high levels of vasopressin and oxytocin receptors. Local injections of these peptides into the amygdala modulate several aspects of the autonomic fear reaction. Interestingly, their effects are opposing: vasopressin tends to enhance the fear reactions, whereas oxytocin has anxiolytic effects. In order to investigate the neurophysiological mechanisms that could underlie this opposing modulation of the fear behavior, we studied the effects of vasopressin and oxytocin on the neuronal activity in an acute brain slice preparation of the rat central amygdala. We first assessed the effects of vasopressin and oxytocin on the spontaneous activity of central amygdala neurons. Extracellular single unit recordings revealed two major populations of neurons: a majority of neurons was excited by vasopressin and inhibited by oxytocin, whereas other neurons were only excited by oxytocin receptor activation. The inhibitory effect of oxytocin could be reduced by the block of GABAergic transmission, whereas the excitatory effects of vasopressin and oxytocin were not affected. In a second step we identified the cellular mechanisms for the excitatory effects of both peptides as well as the morphological and biochemical mechanisms underlying the opposing effects, by using sharp electrode recordings together with intracellular labelings. We revealed that oxytocin-excited neurons are localized in the lateral part (CeL) whereas vasopressin excited cells are found in the medial part of the central amygdala (CeM). The tracing of the neuronal morphology showed that the axon collaterals of the oxytocin-excited neurons project from the CeL, far into the CeM. Combined immunohistochemical stainings indicated that these projections are GABAergic. In the third set of experiments we investigated the synaptic interactions between the two identified cell populations. Whole-cell patch-clamp recordings in the CeM revealed that the inhibitory effect of oxytocin was caused by the massive increase of inhibitory GABAergic currents, which was induced by the activation of CeL neurons. Finally, the effects of vasopressin and oxytocin on evoked activity were investigated. We found on the one hand, that the probability of evoking action potentials in the CeM by stimulating the basolateral amygdala afferents was enhanced under vasopressin, whereas it decreased under oxytocin. On the other hand, the impact of cortical afferents stimulation on the CeL neurons was enhanced by oxytocin application. Taken together, these findings have allowed us to develop a model, in which the opposing behavioral effects of vasopressin and oxytocin are caused by a selective activation of two distinct populations of neurons in the GABAergic network of the central amygdala. Our model could help to develop new anxiolytic treatments, which modulate simultaneously both receptor systems. By acting on a GABAergic network, such treatments can further be tuned by combinations with classical benzodiazepines. Résumé: L'amygdale est un groupe de noyaux cérébraux localisés dans le lobe temporal. Elle joue un rôle essentiel dans les comportements liés à la peur et l'anxiété. L'information issue des aires sensorielles converge vers les noyaux amygdaliens latéraux et basolatéraux, qui sont les projections vers différents noyaux du tronc cérébral et de l'hypothalamus, joue un rôle clef premières régions dans lesquelles il a été démontré que l'acquisition d'une nouvelle mémoire (de peur) était associée à des changements à long terme de la transmission synaptique. Ces noyaux envoient leurs projections sur l'amygdale centrale, qui à travers ses propres dans l'orchestration des réponses autonomes et endocrines de peur. Le contrôle de l'activité neuronale dans l'amygdale centrale module fortement la réaction de peur. Ainsi, un grand nombre de neuropeptides sont spécifiquement exprimés dans l'amygdale centrale et un bon nombre d'entre eux interfère dans la réaction de peur et d'anxiété. Chez les rats, une forte concentration de récepteurs à l'ocytocine et à la vasopressine est exprimée dans le noyau central, et l'injection de ces peptides dans l'amygdale influence différents aspects de la réaction viscérale associée à la peur. Il est intéressant de constater que ces peptides exercent des effets opposés. Ainsi, la vasopressine augmente la réaction de peur alors que l'ocytocine a un effet anxiolytique. Afin d'investiguer les mécanismes neurophysiologiques responsables de ces effets opposés, nous avons étudié l'effet de la vasopressine et de l'ocytocine sur l'activité neuronale de préparations de tranches de cerveau de rats contenant entre autres de l'amygdale centrale. Tout d'abord, notre intérêt s'est porté sur les effets de ces deux neuropeptides sur l'activité spontanée dans l'amygdale centrale. Des enregistrements extracellulaires ont révélé différentes populations de neurones ; une majorité était excitée par la vasopressine et inhibée par l'ocytocine ; d'autres étaient seulement excités par l'activation du récepteur à l'ocytocine. L'effet inhibiteur de l'ocytocine a pu être réduit par l'inhibition de la transmission GABAergique, alors que ses effets excitateurs n'étaient pas affectés. Dans un deuxième temps, nous avons identifié les mécanismes cellulaires responsables de l'effet excitateur de ces deux peptides et analysé les caractéristiques morphologiques et biochimiques des neurones affectés. Des enregistrements intracellulaires ont permis de localiser les neurones excités par l'ocytocine dans la partie latérale de l'amygdale centrale (CeL), et ceux excités par la vasopressine dans sa partie médiale (CeM). Le traçage morphologique des neurones a révélé que les collatérales axonales des cellules excitées par l'ocytocine projetaient du CeL loin dans le CeM. De plus, des colorations immuno-histochimiques ont révélé que ces projections étaient GABAergiques. Dans un troisième temps, nous avons étudié les interactions synaptiques entre ces deux populations de cellules. Les enregistrements en whole-cell patch-clamp dans le CeM ont démontré que les effets inhibiteurs de l'ocytocine résultaient de l'augmentation massive des courants GABAergique résultant de l'activation des neurones dans le CeL. Finalement, les effets de l'ocytocine et de la vasopressine sur l'activité évoquée ont été étudiés. Nous avons pu montrer que la probabilité d'évoquer un potentiel d'action dans le CeM, par stimulation de l'amygdale basolatérale, était augmentée sous l'effet de la vasopressine et diminuée sous l'action de l'ocytocine. Par contre, l'impact de la stimulation des afférences corticales sur les neurones du CeL était augmenté par l'application de l'ocytocine. L'ensemble de ces résultats nous a permis de développer un modèle dans lequel les effets comportementaux opposés de la vasopressine et de l'ocytocine sont causés par une activation sélective des deux différentes populations de neurones dans un réseau GABAergique. Un tel modèle pourrait mener au développement de nouveaux traitements anxiolytiques en modulant l'activité des deux récepteurs simultanément. En agissant sur un réseau GABAergique, les effets d'un tel traitement pourraient être rendus encore plus sélectifs en association avec des benzodiazépines classiques.

Characterization of GLUT8 and GLUT9, two novel glucose transporter isoforms

Summary Prevalence of type 2 diabetes is increasing worldwide at alarming rates, probably secondarily to that of obesity. As type 2 diabetes is characterized by blood hyperglycemia, controlling glucose entry into tissues from the bloodstream is key to maintain glycemia within acceptable ranges. In this context, several glucose transporter isoforms have been cloned recently and some of them have appeared to play important regulatory roles. Better characterizing two of them (GLUT8 and GLUT9) was the purpose of my work. The first part of my work was focused on GLUT8, which is mainly expressed in the brain and is able to transport glucose with high affinity. GLUT8 is retained intracellularly at basal state depending on an N-terminal dileucine motif, thus implying that cell surface expression may be induced by extracellular triggers. In this regard, I was interested in better defining GLUT8 subcellular localization at basal state and in finding signals promoting its translocation, using an adenoviral vector expressing a myc epitope-tagged version of the transporter, thus allowing expression and detection of cell-surface GLUT8 in primary hippocampal neurons and PC 12 cells. This tool enabled me to found out that GLUT8 resides in a unique compartment different from lysosomes, endoplasmic reticulum, endosomes and the Golgi. In addition, absence of GLUT8 translocation following pharmacological activation of several signalling pathways suggests that GLUT8 does not ever translocate to the cell surface, but would rather fulfill its role in its unique intracellular compartment. The second part of my work was focused on GLUT9, which -contrarily to GLUT8 - is unable to transport glucose, but retains the ability to bind glucose-derived cross-linker molecules, thereby suggesting that it may be a glucose sensor rather than a true glucose transporter. The aim of the project was thus to define if GLUT9 triggers intracellular signals when activated. Therefore, adenoviral vectors expressing GLUTS were used to infect both ßpancreatic and liver-derived cell lines, as GLUTS is endogenously expressed in the liver. Comparison of gene expression between cells infected with the GLUTS-expressing adenovirus and cells infected with a GFP-expressing control adenovirus ended up in the identification of the transcription factor HNF4α as being upregulated in aGLUT9-dependent manner. Résumé La prévalence du diabète de type 2 augmente de façon alarmante dans le monde entier, probablement secondairement à celle de l'obésité. Le diabète de type 2 étant caractérisé par une glycémie sanguine élevée, l'entrée du glucose dans les tissus depuis la circulation sanguine constitue un point de contrôle important pour maintenir la glycémie à des valeurs acceptables. Dans ce contexte, plusieurs isoformes de transporteurs au glucose ont été clonées récemment et certaines d'entre elles sont apparues comme jouant d'importants rôles régulateurs. Mieux caractériser deux d'entre elles (GLUT8 et GLUT9) était le but de mon travail. La première partie de mon travail a été centrée sur GLUT8, qui est exprimé principalement dans le cerveau et qui peut transporter le glucose avec une haute affinité. GLUT8 est retenu intracellulairement à l'état basal de façon dépendante d'un motif dileucine N-terminal, ce qui implique que son expression à la surface cellulaire pourrait être induite par des stimuli extracellulaires. Dans cette optique, je me suis intéressé à mieux définir la localisation subcellulaire de GLUT8 à l'état basal et à trouver des signaux activant sa translocation, en utilisant comme outil un vecteur adénoviral exprimant une version marquée (tag myc) du transporteur, me permettant ainsi d'exprimer et de détecter GLUT8 à la surface cellulaire dans des neurones hippocampiques primaires et des cellules PC12. Cet outil m'a permis de montrer que GLUT8 réside dans un compartiment unique différent des lysosomes, du réticulum endoplasmique, des endosomes, ainsi que du Golgi. De plus, l'absence de translocation de GLUT8 à la suite de l'activation pharmacologique de plusieurs voies de signalisation suggère que GLUT8 ne transloque jamais à la membrane plasmique, mais jouerait plutôt un rôle au sein même de son compartiment intracellulaire unique. La seconde partie de mon travail a été centrée sur GLUT9, lequel -contrairement à GLUT8 -est incapable de transporter le glucose, mais conserve la capacité de se lier à des molécules dérivées du glucose, suggérant que ce pourrait être un senseur de glucose plutôt qu'un vrai transporteur. Le but du projet a donc été de définir si GLUT9 active des signaux intracellulaires quand il est lui-même activé. Pour ce faire, des vecteurs adénoviraux exprimant GLUT9 ont été utilisés pour infecter des lignées cellulaires dérivées de cellules ßpancréatiques et d'hépatocytes, GLUT9 étant exprimé de façon endogène dans le foie. La comparaison de l'expression des gènes entre des cellules infectées avec l'adénovirus exprimant GLUT9 et un adénovirus contrôle exprimant la GFP a permis d'identifier le facteur de transcription HNF4α comme étant régulé de façon GLUT9-dépendante. Résumé tout public Il existe deux types bien distincts de diabète. Le diabète de type 1 constitue environ 10 des cas de diabète et se déclare généralement à l'enfance. Il est caractérisé par une incapacité du pancréas à sécréter une hormone, l'insuline, qui régule la concentration sanguine du glucose (glycémie). Il en résulte une hyperglycémie sévère qui, si le patient n'est pas traité à l'insuline, conduit à de graves dommages à divers organes, ce qui peut mener à la cécité, à la perte des membres inférieurs, ainsi qu'à l'insuffisance rénale. Le diabète de type 2 se déclare plus tard dans la vie. Il n'est pas causé par une déficience en insuline, mais plutôt par une incapacité de l'insuline à agir sur ses tissus cibles. Le nombre de cas de diabète de type 2 augmente de façon dramatique, probablement à la suite de l'augmentation des cas d'obésité, le surpoids chronique étant le principal facteur de risque de diabète. Chez l'individu sain, le glucose sanguin est transporté dans différents organes (foie, muscles, tissu adipeux,...) où il est utilisé comme source d'énergie. Chez le patient diabétique, le captage de glucose est altéré, expliquant ainsi l'hyperglycémie. Il est ainsi crucial d'étudier les mécanismes permettant ce captage. Ainsi, des protéines permettant l'entrée de glucose dans la cellule depuis le milieu extracellulaire ont été découvertes depuis une vingtaine d'années. La plupart d'entre elles appartiennent à une sous-famille de protéines nommée GLUT (pour "GLUcose Transporters") dont cinq membres ont été caractérisés et nommés selon l'ordre de leur découverte (GLUT1-5). Néanmoins, la suppression de ces protéines chez la souris par des techniques moléculaires n'affecte pas totalement le captage de glucose, suggérant ainsi que des transporteurs de glucose encore inconnus pourraient exister. De telles protéines ont été isolées ces dernières années et nommées selon l'ordre de leur découverte (GLUT6-14). Durant mon travail de thèse, je me suis intéressé à deux d'entre elles, GLUT8 et GLUT9, qui ont été découvertes précédemment dans le laboratoire. GLUT8 est exprimé principalement dans le cerveau. La protéine n'est pas exprimée à la surface de la cellule, mais est retenue à l'intérieur. Des mécanismes complexes doivent donc exister pour déplacer le transporteur à la surface cellulaire, afin qu'il puisse permettre l'entrée du glucose dans la cellule. Mon travail a consisté d'une part à définir où se trouve le transporteur à l'intérieur de la cellule, et d'autre part à comprendre les mécanismes capables de déplacer GLUT8 vers la surface cellulaire, en utilisant des neurones exprimant une version marquée du transporteur, permettant ainsi sa détection par des méthodes biochimiques. Cela m'a permis de montrer que GLUT8 est localisé dans une partie de la cellule encore non décrite à ce jour et qu'il n'est jamais déplacé à la surface cellulaire, ce qui suggère que le transporteur doit jouer un rôle à l'intérieur de la cellule et non à sa surface. GLUT9 est exprimé dans le foie et dans les reins. Il ressemble beaucoup à GLUT8, mais ne transporte pas le glucose, ce qui suggère que ce pourrait être un récepteur au glucose plutôt qu'un transporteur à proprement parler. Le but de mon travail a été de tester cette hypothèse, en comparant des cellules du foie exprimant GLUT9 avec d'autres n'exprimant pas la protéine. Par des méthodes d'analyses moléculaires, j'ai pu montrer que la présence de GLUT9 dans les cellules du foie augmente l'expression de HNF4α, une protéine connue pour réguler la sécrétion d'insuline dans le pancréas ainsi que la production de glucose dans le foie. Des expériences complémentaires seront nécessaires afin de mieux comprendre par quels mécanismes GLUT9 influence l'expression de HNF4α dans le foie, ainsi que de définir l'importance de GLUT9 dans la régulation de la glycémie chez l'animal entier.

The early IL-4 response to Leishmania major responsible for progressive disease in BALB/c mice is subject to the control of autocrine IL-2 production and regulatory CD4+C25+ T cells

Résumé : La majorité des souches de souris de laboratoire sont résistantes à l'infection par le parasite Leishmania major (L. major). A l'opposé, les souris de la souche BALB développent une maladie évolutive. La résistance et la sensibilité sont corrélées avec l'apparition de lymphocytes T CD4+ spécifiques du parasite, Th1 (de l'anglais T helper) ou Th2 respectivement. La réponse aberrante Th2 chez les souris de la souche BALB/c dépend, au moins en partie, de façon critique de la production rapide d'IL-4 suite à l'infection. Ce pic précoce d'IL-4 est produit par une population de lymphocytes T CD4+ restreinte aux molécules du MHC de classe II, exprimant les chaînes du récepteur des cellules T Vß4-Va8. Ces lymphocytes sont spécifiques d'un épitope de l'homologue Leishmania de la molécule RACK1 des mammifères, appelée LACK. Il a été clairement démontré que l'IL-4 rapidement produite par ces cellules T CD4+ Vß4-Va8 induit la maturation Th2 responsable de la sensibilité vis-à-vis de L. major. Des expériences ont été entreprises pour étudier la régulation de cette réponse précoce d'IL-4. Dans ce travail, nous avons documenté, dans les cellules provenant des ganglions de souris sensibles infectées par L. major, une augmentation de la transcription de l'ARNm de l'IL-2 qui précède la réponse précoce d'IL-4. La neutralisation de l'IL-2 durant les premiers jours d'infection induit la maturation des cellules Thl et la résistance vis-à-vis de L. major. Ces effets de l'anticorps anti-IL-2 neutralisant sont liés à sa capacité d'interférer avec la transcription rapide d'IL-4 des cellules CD4+ réactives à l'antigène LACK. Une augmentation similaire d'IL-2 survient chez les souris résistantes C57BL/6 qui sont incapables de générer la réponse précoce d'IL-4. Cependant, la protéiné LACK induit une transcription précoce d'IL-2 uniquement chez les souris sensibles. Des expériences de reconstitution utilisant des souris C.B.-17 SCID et des cellules T CD4+ réactives à LACK provenant de souris BALB/c IL-2-~démontrent un mode d'action autocrine de l'IL-2 sur la régulation de la réponse précoce d'IL4. Par conséquent, chez les souris C57BL/6, l'absence du pic précoce d'ARNm de l'IL-4 important pour la progression de la maladie paraît liée à l'incapacité des cellules T CD4+ réactives à LACK de produire de l'IL-2. Un rôle dans le contrôle de la production précoce d'IL-4 par les cellules T régulatrices CD4+CD25+ a été investigué en déplétant in vivo cette population de cellules. La déplétion induit une élévation du pic précoce de l'ARNm de l'IL-4 dans les ganglions drainant de souris BALB/c, ainsi qu'une exacerbation du cours de la maladie avec des taux augmentés d'IL-4 dans les ganglions. La réponse rapide d'IL-2 vis-à-vis de L. major est aussi significativement augmentée chez les souris BALB/c déplétées en cellules CD4+CD25+. De plus, nous avons démontré que le transfert de 10puissance(7) cellules provenant de la rate de souris BALB/c déplétées en cellules T régulatrices CD4+CD25+ rend les souris SCID sensibles à l'infection et permet la différentiation Th2. Au contraire, les souris SCID reconstituées avec 10' cellules de la rate de souris BALB/c contrôle sont résistantes à infection par L. major et développent une réponse Thl. Chez les souris SCID reconstituées avec des cellules de rate déplétées en cellules exprimant le marqueur CD25, le traitement avec un anticorps neutralisant l'IL-4 au moment de l'infection par L. major prévient le développement de la réponse Th2 et rend ces souris résistantes à l'infection. Ces résultats démontrent que les cellules T régulatrices CD4+CD25+ jouent un rôle dans la régulation du pic précoce d'IL-4 responsable du développement cellulaire Th2 dans ce modèle d'infection. Summary Mice from most strains are resistant to infection with Leishmania major (L. major). In contrast, BALB mice develop progressive disease. Resistance and susceptibility result from parasite-specific CD4+ Thl or Th2 cells, respectively. The aberrant Th2 response in BALB/c mice depends, at least in part, upon the production of IL-4 early after infection. The CD4+ T cells responsible for this early IL-4 response to L. major express a restricted TCR repertoire (Vß4-Va8) and respond to an I-Ad-restricted epitope of the Leishmania homologue of mammalian RACK1, designated LACK. The role of these cells and the IL-4 they produce for subsequent Th2 cell development and disease progression in BALB/c mice was demonstrated. Experiments have been undertaken to study the regulation of the rapid IL-4 production to L. major. In this report, we document an IL-2 mRNA burst, preceding the reported early IL-4 response, in draining lymph nodes of susceptible mice infected with L. major. Neutralization of IL-2 during the first days of infection redirected Thl cell maturation and resistance to L. major, through interference with the rapid IL-4 transcription in LACKreactive CD4+ cells. A burst of IL-2 transcripts also occurred in infected C57BL/6 mice that do not mount an early IL-4 response. However, although the LACK protein induced IL-2 transcripts in susceptible mice, it failed to trigger this response in resistant C57BL/6 mice. Reconstitution experiments using C.B.-17 SCID mice and LACK-reactive CD4+ T cells from IL-2-/- BALB/c mice showed that triggering of the early IL-4 response required autocrine IL2. Thus, in C57BL/6 mice, the inability of LACK-reactive CD4+ T cells to express early IL-4 mRNA transcription, important for disease progression, appears due to an incapacity of these cells to produce IL-2. A role for CD4+CD25+ regulatory T cells in the control of this early IL-4 production was investigated by depleting in vivo this regulatory T cell population. Depletion induced an increase in the early burst of IL-4 mRNA in the draining lymph nodes of BALB/c mice, and exacerbated the course of disease with higher levels of IL-4 mRNA and protein in their lymph nodes. The rapid IL-2 response to L. major is also significantly enhanced in BALB/c mice depleted of CD4+CD25+ cells. We further showed that transfer of 10~ BALB/c spleen cells that were depleted of CD4+CD25+ regulatory T cells rendered SCID mice susceptible to infection and allowed Th2 differentiation while SCID mice reconstituted with 10 control BALB/c spleen cells were resistant to infection with L. major and developed a Thl response. Treatment with a mAb against IL-4 upon infection with L. major in SCID mice reconstituted with CD25-depleted spleen cells prevented the development of Th2 polarization and rendered them resistant to infection. These results demonstrate that CD4+CD25+ regulatory T cells play a role in regulating the early IL-4 mRNA and the subsequent development of a Th2 response in this model of infection.

Differential miRNA and IncRNA expression in embryonic stem cells lacking the Notch1 receptor

Embryonic stem (ES) cells-derived cardiomyocytes represent an attractive source of cells in cell replacement therapies for heart disease. However, controlled cardiogenic differentiation of ES cells requires a complete understanding of the complex molecular mechanisms regulating the differentiation process. We have previously shown that differentiation of ES cells into cardiomyocytes is favored by inactivation of the Notch 1 receptor pathway. In the present study, we therefore compared two ES cell lines, one with normal Notchl expression and one carrying deleted Notchl receptor alleles (Notchl-deleted ES cells) in order to identify genes responsible for the increased propensity of Notchl-deleted ES cells to produce cardiomyocytes. Using RNA-sequencing, we found approximately 300 coding and noncoding transcripts, which are differently expressed in undifferentiated Notchl-deleted ES cells. Since accumulating evidences indicate that long noncoding RNAs (IncRNAs) play important roles in ES cell pluripotency and differentiation, we focused our analysis on modulated IncRNAs. In particular, two IncRNAs, named here lnc 1230 and lnc 1335, are highly induced in the absence of Notchl receptor expression. These represent therefore prime candidates that could favor cardiogenic commitment in undifferentiated ES cells. Indeed, we demonstrate that forced expression of these two IncRNAs in wild-type ES cells result in a significant increase of the number of cardiac progenitor cells and cardiomyocytes in the differentiated progeny of these ES cells. Furthermore, we also identify several microRNAs that are differentially modulated in absence of Notchl expression. Among these are miR-142-5p and miR- 381-3p. Interestingly, both lncl230 and lncl335 are targets of these two microRNAs. Altogether, these data suggest that Notchl-dependent noncoding gene networks, implicating microRNAs and IncRNAs, control embryonic stem cell commitment into the mesodermal and cardiac lineages already at the undifferentiated state. - Les cardiomyocytes issus cellules souches embryonnaires sont une source très prometteuse pour les thérapies cellulaire de remplacement dans le cadre des maladies cardiaques. Cependant, l'utilisation de telles cellules requiert une compréhension poussée des mécanismes moléculaire régulant la différenciation. Nous avons par le passé démontré que la différenciation des cellules souches embryonnaires en cardiomyocytes est favorisée par l'inactivation de la voie d'activation intracellulaire dépendante du récepteur Notch 1. Nous avons donc comparé deux lignées de cellules souches embryonnaires, une présentant une voie d'activation Notchl normale et une chez laquelle les allèles codant pour le récepteur Notchl avaient été invalidés, de façon à identifier les gènes impliqués dans la capacité augmentée des cellules déficientes à produire des cardiomyocytes. En utilisant du séquençage d'ARN à haut débit, nous avons trouvé environ 300 gènes différemment exprimés dans les cellules déficientes pour Notchl. Par ailleurs, des évidences de plus en plus nombreuses suggèrent qu'une nouvelle classe de molécules appelée « long noncoding RNAs » joue un rôle prépondérant dans la maintenance de l'état non différencié et de la capacité de différenciation des cellules souches embryonnaires. Nous avons trouvé que plusieurs « long noncoding RNAs » étaient modulés en l'absence de Notchl, et en particulier deux molécules que nous avons appelées lncl230 et lncl335. Ces derniers représentent des candidats potentiels devant permettre de favoriser la production de cardiomyocytes. Nous avons en effet démontré que la surexpression de ces deux candidats dans des cellules souches embryonnaires résultait en une surproduction de cardiomyocytes. De plus, nous avons également identifié plusieurs microRNAs dont l'expression était modulée dans les cellules souches embryonnaires déficientes dans la voie Notchl. De façon intéressante, parmi ces microRNAs, le miR-142-5p et le miR-381-3p sont capables de cibler lncl230 and lncl335. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent donc que des réseaux d'interaction dépendant de la voie d'activation Notch 1 et impliquant des ARNs non codant existent dans les cellules souches embryonnaires pour réguler leur différenciation en différent types cellulaires spécifiques.

Molecular characterization of the Carma1-related protein card9

ABSTRACT : Fungal infections have become a major source of diseases in immuncompromised patients, but are quite benign in healthy individuals. As fungi are eukaryotes, and share many biological processes with humans, many antifungal drugs can cause toxicity in the patients. Therefore, the characterization of signaling pathways specific to the anti-fungal immune response is relevant for the better understanding of the disease and the development of new therapeutic approaches. Dectin-1 is the major mammalian pattern recognition receptor for the fungal component zymosan. Dectin-1 is an innate non-Toll-like receptor containing immunoreceptor tyrosine-based activation motifs (ITAMs). Card9, Bc110 and Maltl are proteins that have been shown to play a key role in the Dectin-l-induced signaliñg pathway by controlling Dectin-l-mediated cell activation, cytokine production and innate anti-fungal immunity in mice. Here we investigate the role of the Card9-Bc110-Maltl complex in humans using the monocytic cell line THP-1. We show that Card9 interacts with Bc110 through a CARD-CARD interaction and that interaction of Card9 with Bc110 is required for NF-xB activation. We further demonstrate that Card9 is phosphorylated in its C-terminal part on serine residues. The phosphorylation status of Card9 can influence its ability to active NF-xB, since mutation of the phosphorylation sites increases its ability to activate NF-xB. We find that Card9 is expressed in myeloid derived cells, such as the human monocytic cell lines THP1 and U937, and in human monocyte-enriched PBLs and monocyte-derived DCs. Our findings demonstrate that Card9 is implicated in anti-fungal responses, since silencing of Card9 as well as of Bc110 and Maltl diminishes the capacity of THP1 cells to produce TNF-a in response to zymosan. Interestingly, activation of the NF-xB and MAPK pathway remained normal and levels of TNF-a mRNA produced were also not affected in THP 1 cells silenced for the expression of Card9, Bc110 or Malt1. Using a Malt1 inhibitor, we provide evidence that the proteolytic activity of Malt1 is needed for zymosan-induced TNF-a production in THP 1 cells and bone marrow-derived macrophages of mice, but further experiments are required to confirm these findings and identify the substrate(s) of Malt1. In conclusion, our results reveal an important role for Card9 in the innate immune response of human macrophages to fungi. RÉSUMÉ : Les infections fongiques sont une source majeure de maladie chez les patients immunodéprimés, alors qu'elles sont plutôt bénignes chez les individus sains. Comme les champignons sont des eucaryotes et partagent beaucoup de processus biologiques avec les humains, les médicaments antifongiques peuvent être source de toxicité chez les patients. Il est donc important de mieux caractériser les voies de signalisation intracellulaire des réponses anti-fongiques pour pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques. La protéine Dectin-1 est le récepteur principal du composé fongique zymosan. Les protéines Card9, Bc110 et Maltl ont été décrites comme jouant un rôle primordial dans les signaux d'activation induits par Dectin-l, en contrôlant l'activité cellulaire, la production de cytokines et la défense anti-fongique dans les souris. Dans cette étude, nous investiguons le rôle du complexe Card9-Bc110-Maltl dans la lignée monocytaire humaine THP1. Nous montrons que Card9 interagit avec Bc110 par une interaction CARD-CARD et que cette interaction est requise pour activer le facteur de transcription NF-xB. Nous observons que Card9 est phosphorylé dans sa partie C-terminale sur des résidus serine et que l'état de phosphorylation de Card9 influence sa capacité à activer NF-xB. En effet, sa capacité à activer NF-xB est augmentée, après mutation des sites de phosphorylation. La génération d'un anticorps spécifique dirigé contre Card9 nous a permis de démontrer que Card9 est exprimé dans des cellules myéloïdes comme les lignées cellulaires monocytiques THP-1 et U-937, ainsi que dans les cellules dendritiques humaines. Nos résultats démontrent que Card9 est impliqué dans la réponse immunitaire antifongique puisque la réduction de l'expression de Card9 ainsi que de Bc110 et de Malt1 diminue la capacité des THP-1 à produire du TNF-a en réponse au zymosan. Par contre, les voies de signalisation NF-xB et MAPK ainsi que les niveaux de mRNA de TNF-a produits en réponse au zymosan ne sont pas affectés dans ces cellules. En utilisant un inhibiteur de Malt1, nous montrons que l'activité protéolytique de Malt1 est nécessaire pour la production de TNF-a induite par le zymosan dans les cellules THP-1 ainsi que dans les macrophages de souris, mais d'autres expériences seront nécessaires pour confirmer cette observation et identifier le(s) substrat(s) de Malt1 responsables de cet effet. En conclusion, nos résultats révèlent un rôle important de la protéine Card9 dans la réponse immunitaire innée antifongique dans les macrophages humains.

Modulation of pancreatic β-cell mass and insulin secretion by PPARβ/δ

SUMMARY : Peroxisome proliferator-activated receptor ß/δ protects against obesity by reducing dyslipidemia and insulin resistance via effects in various organs, including muscle, adipose tissue and liver. However, nothing is known about the function of PPARß in pancreas, a prime organ in the control of glucose homeostasis. To gain insight into so far hypothetical functions of this PPAR isotype in ß-cell function, we specifically ablated Pparß in the whole epithelial compartment of the pancreas. The mutated mice presented expanded ß-cell mass, possibly, this is due to increased burst of ß-cell proliferation at 2 weeks of age. These PPARß null pancreas mice exhibit hyperinsulinemia-hypoglycaemia starting at 4 weeks of age, due to hyperfunctionality of ß-cell. Gene expression profiling indicated a broad repressive function of PPARß impacting the vesicular and granular compartment, actin cytoskeleton, and metabolism of glucose and fatty acids. Analyses of insulin release from isolated islets revealed accelerated second-phase of glucose-stimulated insulin secretion. Higher levels of PKD and PKCS in mutated animals, in concert with F-actin disassembly, lead to an increased insulin secretion and its associated systemic effects. Enhanced palmitate potentiation of glucose-stimulated insulin secretion in PPARß mutant islets, suggests an important role of this receptor in lipid/glucose metabolism in ß-cell. Taken together, these results provide evidence for PPARß playing a repressive role on ß-cell growth and insulin exocytosis, and shed new light on its metabolic .action. RESUME : Le récepteur nucléaire PPARß (Peroxisome proliferator-activated receptor ß/δ) protège contre l'obésité en réduisant la dyslipidémie et la résistance à l'insuline dans différents organes, comme le muscle, le tissue adipeux et le foie. Cependant, il y a, à ce jour, très peu de connaissance par rapport au rôle de PPARß dans le pancréas, qui est un organe très important dans le contrôle homéostatique du glucose. Afin de comprendre le rôle de cet isotype de PPAR dans le fonctionnement des cellules beta du pancréas, nous avons invalidé le gène Pparß dans tout le compartiment pancréatique de la souris. Ces souris mutantes présentent une augmentation de la masse totale de cellules beta; Cela serait dû à une intense prolifération des cellules beta à 2 semaines après la naissance. Également, ces souris présentent une hyperinsulinémie et une hypoglycémie qui commencent à l'âge de 4 semaines; la raison de ce phénotype serait une hyperactivité des cellules beta. Le profil d'expression génique indique une fonction répressive globale de PPARß en se référant aux compartiments vésiculaire et granulaire, au cytosquelette d'actine, et au métabolisme du glucose et des acides gras. L'analyse de la sécrétion d'insuline par les cellules beta a démontré que la deuxième phase de sécrétion d'insuline après stimulation au glucose est augmentée. Les niveaux élevés de PKD et PKCS dans les îlots pancréatiques de souris mutantes, ainsi qu'une augmentation de la dépolymérisation des filaments d'active génèrent un surplus de sécrétion d'insuline après stimulation au glucose. Les îlots pancréatiques des souris mutantes secrètent plus d'insuline après stimulation au glucose et au palmitate que les îlots de souris contrôles. Ceci suggère un rôle important de PPARß dans le métabolisme des lipides et du glucose des cellules beta. En résumé, ces résultats mettent en évidence un rôle répressif de PPARß dans la croissance des cellules beta et dans l'exocytose d'insuline.

The role of Receptor Activator of NFKB Ligand (RANKL) in mammary gland development

Abstract : The female reproductive hormones estrogen, progesterone and prolactin control postnatal breast development and are important to breast carcinogenesis. The mechanisms by which they elicit proliferation and morphogenesis remain poorly understood. Using the mouse as a model to study the molecular mechanisms through which hormones elicit morphogenetic changes in the mammary gland in vivo, we found the Receptor Activator of NFκB Ligand, a Tumor Necrosis Factor family member, to be strongly induced by progesterone. Recent publications suggested that hormone dependant RANKURANK signals are involved in the terminal differentiation of mammary gland alveolar buds into lobulo-alveolar structures competent for lactation. I show that in the absence of epithelial RANKL a distinct earlier stage of mammary gland development, side branch formation, is blocked. RANKL acts as a major mediator downstream of progesterone; it is required for progesterone-induced paracrine proliferation and completely rescues the mutant phenotype when ectopically expressed in progesterone receptor (PR) KO mammary epithelia. RANKL is not required for cell autonomous division of estrogen receptor alpha (ERa) /PR positive cells. Cyclin D1, previously implicated as a mediator of RANKL, is not affected by ablation of RANKL and is not required for RANKL-induced paracrine proliferation but for the cell autonomous proliferation. Gene expression arrays to find specific RANKL downstream targets have identified Id4, ElfS and one secreted metalloprotease (Adamtsl8) as potential candidates validated by Q-RT-PCR. Interestingly, Id4 and Adamtsl8 are expressed by the myoepithelial cells. Their expression additionally coincides with RANKL mRNA expression at mid pregnancy, possibly implying a functional contribution of both genes to RANKL mediated sidebranch formation. ElfS in contrast, is found to be strongly expressed by the end of pregnancy supporting recent findings of a prolactin mediated regulation. As for RANKL, this gene was in particular induced in luminal cells. Taken together, I report that progesterone is the major proliferative stimulus in the adult mammary gland eliciting proliferation of ERaJPR positive cells by a cell autonomous, cyclin D1-dependent and a paracrine RANKL-dependent mechanism. My work moreover suggests, that RANKL acts as a major orchestrator affecting different downstream mediators, through which progesterone exerts its effects concomitantly on different cellular compartments. Résumé : Les hormones sexuelles telles que l'oestrogène, la progestérone et la prolactine contrôlent le développement postnatal du sein et sont impliquées dans la cazcinogenèse. Les mécanismes par lesquels elles induisent la prolifération et la morphogénèse demeurent incompris. En utilisant la souris comme modèle, J'ai trouvé que le ligand activateur du récepteur de NFκB, une protéine de la famille du facteur de nécrose des tumeurs, peut être fortement induit par la progestérone. Les publications récentes ont suggéré que cette protéine est nécessaire à la fin de la grossesse, quand les cellules sécrétrices du lait apparaissent. Par des techniques de transplantation d'épithélium, je montre contrairement aux études précédentes, qu'en l'absence de RANKL dans l'épithélium une partie distincte du développement mammaire, la formation de branches latérales, est bloquée. La progestérone agit de manière pazacrine par l'intermédiaire de 12ANKL pour induire la prolifération tandis que la mort cellulaire n'est pas affectée. De plus, l'injection d'une protéine recombinante RANKL dans une souris mutante pour le récepteur à la progestérone induit la prolifération des cellules épithéliales en l'absence de grossesse ; la surexpression de RANKL dans ces mêmes mutants mène à une réversion complète du phénotype. Mes expériences démontrent que la progestérone induit deux types distincts de prolifération. Un premier type direct dans laquelle les cellules positives au récepteur à la progestérone prolifèrent. Cette division cellulaire est alors indépendante de RANKL mais dépendante de la cycline D1. Le second type de prolifération est induit par un mécanisme pazacrine et dépend de RANKL mais pas de la cycline D1. Ici, les cellules négatives au récepteur à la progestérone prolifèrent. Pour détecter des gènes cibles de la voie de signalisation du RANKL, un profil d'expression des gènes a été généré. Les facteurs de transcription Id4, EIf5 et une métalloprotéase sécrétée (Adamtsl8) ont été identifiés en tant que cibles potentielles. D'autres analyses de validation démontrent qu'Id4, Adamtsl8, RANKL mais pas E1f5 sont fortement exprimés au cours de la grossesse, coïncidant avec la formation de branchements latéraux induit par progestérone. EIf5 s'est avéré être exprimé vers la fin de la grossesse appuyant des résultats récents proposant une régulation par la prolactine. Le système canalaire mammaire se compose de couches cellulaires: une couche interne de cellules luminales et une externe de cellules myoépithéliale. Les expériences génétiques d'expression ont révélé que RANKL. et E1f5 sont exprimés dans la partie luminale tandis qu'Id4 et Adamtsl8 sont dans les cellules myoépithéliales. En conclusion, je prouve que la progestérone est le stimulus principal induisant la prolifération dans la glande mammaire d'adulte. Deux mécanismes de prolifération sont impliqués: l'un direct dépendant de la cycline Dl et l'autre paracrine dépendant de RANKI.. Mon travail suggère par ailleurs que RANKL agit en tant que médiateur important, par lequel la progestérone exerce ses effets sur différents compartiments cellulaires tels que la coordination de la prolifération des cellules épithéliales avec la réorganisation de la matrice extracellulaire et de la membrane basale exigées pour la morphogénèse du système canalaire latéral.

De novo T cell generation and cell cycle analysis of CD4 and CD8 T cells during HIV-disease

RESUME POUR UN LARGE PUBLIC Parmi les globules blancs, les lymphocytes T 004 jouent un rôle primordial dans la coordination de la réponse immunitaire contre les pathogènes et les lymphocytes T CD8 dans leur élimination. Lors d'une infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1), non seulement les cellules T CD4 sont les principales cibles d'infections, mais aussi elles disparaissent progressivement tout au long de la maladie. Ce phénomène, appelé aussi épuisement des lymphocytes T CD4, est la principale cause provoquant le Syndrome d'Immunodéficience Acquise (SIDA). Malgré de grands efforts de recherche, nous ne sommes toujours pas en mesure de dire si ce phénomène est dû à un défaut dans la production de nouvelles cellules ou à une destruction massive de cellules en circulation. Dans cette étude, nous nous proposions, dans un premier temps, de comparer la production de nouvelles cellules T CD4 et CD8 chez des individus VIH-négatifs et positifs. Les cellules nouvellement produites portent un marqueur commun que l'on appelle TREC et qui est facilement mesurable. En considérant des paramètres cliniques, nous étions en mesure de déterminer le niveau de TRECs de cellules T CD4 et CD8 dans différentes phases de la maladie. De là, nous avons pu déterminer que le niveau de TREC est toujours plus bas dans les cellules T CD8 de patients VIH-positifs comparativement à notre groupe contrôle. Nous avons pu déterminer par une analyse ultérieure que cette différence est due à une forte prolifération de ces cellules chez les patients VIH-positifs, ce qui a pour effet de diluer ce marqueur. En revanche, la production de nouvelles cellules T CD4 chez des patients VIH-positifs est accentuée lors de la phase précoce de la maladie et largement réprimée lors de la phase tardive. Dans un second temps, nous avons effectué une analyse à grande échelle de l'expression de gènes associés à la division cellulaire sur des lymphocytes T CD4 et CD8 d'individus VIH-¬positifs et négatifs, avec comme contrôle des cellules proliférant in vitro. De cette étude, nous avons pu conclure que les cellules T CD8 de patients VIH-positifs étaient en état de prolifération, alors que les lymphocytes T CD4 présentaient des défauts majeurs conduisant à un arrêt de la division cellulaire. Nos résultats montrent que la capacité à produire de nouvelles cellules chez des patients VIH¬positifs reste active longtemps pendant la maladie, mais que l'incapacité des cellules T CD4 à proliférer peut enrayer la reconstitution immunitaire chez ces individus. ABSTRACT The hallmark of HIV-1 infection is the depletion of CD4 T cells. Despite extensive investigation, the mechanisms responsible for the loss of CD4 T cells have been elucidated only partially. In particular, it remains controversial whether CD4 T cell depletion results from a defect in T cell production or from a massive peripheral destruction. In this study, de novo T cell generation has been investigated by measuring T cell receptor rearrangement excision circles (TRECs) on large cohorts of HIV-negative (N=120) and HIV-1 infected (N=298) individuals. Analysis of TREC levels was performed in HIV-infected subjects stratified by the stage of HIV disease based on CD4 T cell counts (early: >500 CD4 T cells/µl; intermediate: <500>200; late: <200) and by age (20 to 60 years, n = 259). Our data show that TREC levels in CD8 T cells were significantly lower in HIV-infected subjects at any stage of disease compared to the control group. In contrast, TREC levels in CD4 T cells were significantly higher in HIV-infected subjects at early stages disease while no significant differences were observed at intermediate stages of the disease and were severely reduced only at late stages of disease. To investigate further the status of cell cycle in peripheral CD4 and CD8 T cells in HIV-1 infections, we determined the pattern of gene expression with the microarray technology. In particular, CD4 and CD8 T cells of HIV-1 infected and HIV-negative subjects were analysed by Cell Cycle cDNA expression array. The patterns of gene expression were compared to in vitro stimulated CD4 and CD8 T cells and this analysis showed that CD8 T cells of HIV-1 infected subjects had a pattern of gene expression very similar to that of in vitro stimulated CD8 T cells thus indicating ongoing cell cycling. In contrast, CD4 T cells of HIV-1 infected subjects displayed a complex pattern of gene expression. In fact, CD4 T cells expressed high levels of genes typically associated with cell activation, but low levels of cell cycle genes. Therefore, these results indicated that activated CD4 T cells of HIV-1 infected subjects were in cell cycle arrest. Taking together these results indicate that thymus function is preserved for long time during HIV- 1 infection and the increase observed in early stage disease may represent a compensatory mechanism to the depletion of CD4 T cells. However, we provide evidence for a cell cycle arrest of peripheral CD4 T cells that may prevent potentially the replenishment of CD4 T cells. RESUME Les mécanismes responsables de la perte des lymphocytes T CD4 lors de l'infection pas VIH n'ont été élucidés que partiellement. Nous ne savons toujours pas si l'épuisement des lymphocytes T CD4 résulte d'un défaut dans la production de cellules ou d'une destruction périphérique massive. Dans cette étude, la production de cellules T a été étudiée en mesurant les cercles d'excision générés lors du réarrangement du récepteur au cellules T (TRECs) chez des individus VIH-négatifs (N=120) et VIH-1 positifs (N=298). L'analyse des niveaux de TREC a été faite chez sujets HIV-infectés en considérant les phases de la maladie sur la base des comptes CD4 (phase précoce: > 500 cellules CD4/µl; intermédiaire: < 500>200; tardive: < 200) et par âge. Nos données démontrent que les niveaux de TRECs des cellules T CD8 étaient significativement plus bas chez les sujets VIH-1 infectés, à tous les stades de la maladie comparativement au groupe contrôle. En revanche, les niveaux de TRECs des cellules T CD4 étaient significativement plus élevés chez les sujets VIH-1 infectés durant la phase précoce de la maladie, tandis qu'aucune différence significative n'était observée durant la phase intermédiaire et étaient très réduits dans la phase tardive. Dans une deuxième partie, nous avons utilisé la technique des biopuces à d'ADN complémentaire pour analyser la régulation du cycle cellulaire chez les lymphocytes T CD4 et CD8 périphériques lors d'une infection au VIH-1. Des profils d'expression ont été déterminés et comparés à ceux de cellules T CD4 et CD8 stimulées in vitro, démontrant que les cellules T CD8 des sujets VIH-positifs avaient un profil d'expression très semblable à celui des cellules stimulées in vitro en prolifération. En revanche, les lymphocytes T CD4 des sujets VIH-1 positifs avaient un profil d'expression de gène plus complexe. En fait, leur profil montrait une sur- expression de gènes associés à une activation cellulaire, mais une sous-expression de ceux induisant une division. Ainsi, ces résultats indiquent que les lymphocytes T CD4 d'individus VIH-positifs présentent des dérégulations qui conduisent à un arrêt du cycle cellulaire. Ces résultats montrent que la fonction thymique est préservée longtemps pendant l'infection au VIH-1 et que l'augmentation de la quantité de TRECs dans la phase précoce de la maladie peut représenter un mécanisme compensatoire à l'épuisement des cellules T CD4. Cependant, nous démontrons aussi un clair dysfonctionnement du cycle cellulaire chez les cellules T CD4 d'individus infectés par VIH-1 ce qui peut enrayer la reconstitution du système immunitaire.

Expression des récepteurs aux facteurs de croissance (autres que KIT et PDGFRA) dans les tumeurs stromales gastro-intestinales : étude anatomo-clinique et immunohistochimique de 80 cas

Résumé Les tumeurs stromales gastro-intestinales (GISTs) sont des tumeurs de malignité variable du tractus gastro-intestinal d'évolution difficilement prévisible. Plus de 95% d'entre elles expriment les récepteurs KIT (90%) ou PDGFRA (5%), deux récepteurs aux facteurs de croissance à activité tyrosine-kinase. Peu de données existent quant à l'expression éventuelles d'autres récepteurs aux facteurs de croissance dans les GISTs. Buts de l'étude: Les buts de cette étude étaient double: 1-évaluer l'expression de plusieurs récepteurs aux facteurs de croissance, à l'exclusion de KIT et PDGFRA, au sein d'un collectif de GISTs; 2 -voir s'il existait une corrélation entre l'expression d'un ou plusieurs de ces récepteurs, les données anatomo-pathologiques et/ou l'évolution clinique Matériel et méthodes 80 GISTs ont été examinées sur le plan clinique, anatomo-pathologique, immunohistochimique et évolutif. L'immunoexpression des récepteurs aux facteurs de croissance suivants a été examinée: IGF-1r - insulin-like growth factor-1 receptor, FGFr fibroblast growth factor receptor, C-MET - hepatocyte growth factor receptor, TGFßr (type 1) - transforming growth factor beta receptor, type 1, CD105/endogline, RET et NGFr/gp75 (nerve growth factor receptor). Résultats 52.7% des GISTs exprimaient C-MET, 50% CD105iendogline, 36.7% RET, 25% NGFr/gp75, 17.5°Io TGFßr, 7.5% FGFr, et 0% IGF-lr. La présence ou non d'une expression de CD105 et son intensité étaient significativement associées à une évolution défavorable, tant pour les patients présentant une maladie localisée au diagnostic que pour ceux qui étaient métastatiques au diagnostic. L'expression de C-MET était aussi corrélée, mais de façon moins significative; à une évolution défavorable. En analyse multivariée, l'expression de CD105 est un facteur pronostique indépendant défavorable. Conclusion Les GISTs expriment de façon variable des récepteurs aux facteurs de croissance autres que KIT et PDGFRA. Les récepteurs au TGFß, au FGF et à l'IGF sont peu exprimés. L'endogline/CD105 et le récepteur C-MET sont plus fréquemment exprimés et leur expression est associée à une évolution clinique défavorable.

Role of amphiregulin in mammary gland development

Abstract Ovarian hormones are key regulators of postnatal mammary gland development and are linked to breast carcinogenesis. In particular, estrogens induce mammary epithelial cells to proliferate at the onset of puberty, leading to the elongation of the rudimental ductal tree into the fatty stromal tissue. Elucidating the molecular events underlying estrogen mitogenic activity in the mammary gland is of value in understanding how the deregulation of this signalling pathway can lead to breast tumorigenesis. Our lab has recently shown that estrogen induces mammary proliferation via epithelial estrogen receptor alpha (ERα) by a paracrine mechanism. Based on the finding that several EGF receptor (EGFR) ligands are able to substitute for estrogens and that amphiregulin (Areg), one of these ligands, is required during mammary development, we have hypothesized that Areg is a key mediator of estrogen induced paracrine signalling during ductal morphogenesis. Our analysis of the Areg -/- mice mammary phenotype reveals that epithelial Areg is required at the onset of puberty for epithelial proliferation, terminal end bud (TEB) formation and, subsequently, ductal elongation. Hormonal stimulation experiments show that among the EGFR ligands, only Arég is specifically controlled by estrogen at the transcriptional level, via ERα, in the mammary gland. Moreover, Areg is required for the estrogen-induced mammotrophic effects of epithelial proliferation and ductal elongation. We have shown that ectopic Areg expression in ERα -/- mammary epithelial cells is sufficient to induce ductal morphogenesis. Our transplantations experiment show that when Areg -/- cells are in the presence of wt cells they contribute to all aspects of ductal development, suggesting that this growth factor acts in a paracrine fashion. Moreover, this result shows that Areg -/- epithelial cells are not intrinsically impaired in proliferation. Our transplantation experiment carried out under physiological conditions confirmed previous reports showing that stromal EGFR is needed for ductal morphogenesis. This suggests that estrogen-driven Areg signalling involves an epithelium-stroma crosstalk. Thus, these data confirmed our hypothesis of Areg being an important estrogen mediator during ductal morphogenesis. Résumé Les hormones ovariennes, régulatrices clés du développement post-natal de la glande mammaire, sont également liées à la carcinogénèse du sein. En particulier, l'oestrogène induit la division des cellules épithéliales au début de la puberté. Cette prolifération amène à l'élongation du réseau canalaire rudimentaire et permet l'invasion du compartiment stromal. L'élucidation des mécanismes moléculaires responsables de l'activité mitogénique de l'oestrogène dans la glande mammaire est précieuse pour une meilleure compréhension du développement du cancer du sein. Notre laboratoire a récemment démontré que l'cestrogène induit la prolifération des cellules épithéliales par un signal paracrine, grâce au récepteur à l'oestrogène alpha (ERα). En se basant sur le fait que plusieurs ligands du récepteur à l'EGF (EGFR) sont capables de se substituer à l'cestrogène et d'induire la prolifération épithéliale et qu'amphiregulin (Areg), un de ces ligands, est essentielle au développement de la glande mammaire, nous avons émi l'hypothèse que Areg est un médiateur essentiel du signal paracrine induit par l'oestrogène pendant la croissance du système canalaire. Nos analyses phénotypiques des glandes mammaires issues de souris transgéniques Areg -/- démontrent que cette protéine est indispensable à la prolifération des cellules épithéliales mammaires au début de la puberté et à la formation des bourgeons terminaux qui conduisent à l'élongation des canaux. Nos expériences de stimulations hormonales démontrent que, parmi l'ensemble des ligands du EGFR, seule Areg est contrôlée au niveau transcriptionnel par l'cestrogène dans la glande mammaire, ceci via le récepteur ERα. De plus, Areg est essentielle pour le effets mammotrophique induit par l'cestrogène, à savoir la prolifération épithéliál et la croissance du système canalaire. Par ailleurs, l'expression ectopique d'Areg dans des cellules epithéliales mammaires de souris transgéniques ERα -/- est suffisante pour permettre la formation du réseau canalaire. En présence de cellules normales, les cellules dépourvues du gène d'Areg contribuent à la formation des canaux. Cette expérience suggère que ce facteur de croissance agit de manière paracrine. De plus, ce résultat montre que les cellules épithéliales Areg -/- conservent leur potentiel prolifératif. Nos expériences de transplantation, réalisées dans des conditions physiologiques, ont confirmé des précédentes études qui montraient que le récepteur stromal à l'EGF est nécessaire pour la morphogénèse du système canalaire. Ceci suggère que la voie de signalisation activée par l'oestrogène et dépendante d' implique une communication entre l'épithélium et le stroma. Ainsi, ces résultats valident notre hypothèse puisqu'ils confirment Areg en tant que médiateur majeur de l'oestrogène dans la morphogénèse du système canalaire.

Molecular mechanisms of follicular associated epithelium differentiation

Les muqueuses respiratoires, genitales et digestives sont continuellement exposées aux antigènes de l?alimentation, à la flore intestinale et aux pathogènes. Cela implique une activité immunologique intense et finement régulée dans ces tissus. On admet que la modulation de ces réponses immunitaires muqueuses s?effectue dans des organes sentinels spécifiques appelés o-MALT (organized mucosal associated lymphoid tissues). Ces processus de modulation et la biologie de ces sites immuno-inducteurs sont peu connus. Ceci est pourtant d?une grande relevance si l?on veut faire un design rationnel de drogues et de vaccins muqueux. Dans l?intestin grèle, ces organes sont composés de follicules multiples et sont appelés plaques de Peyer. Ils sont constitués de follicules enrichis en cellules B comprenant ou non un centre germinatif, de regions interfolliculaires comprenant des cellules T, et d?une région en d ome riche en cellules dendritiques, cellules B naives et cellules T CD4+, surmontée par un epithelium specialisé, le FAE (epithelium associé aux follicules). Le FAE contient des cellules M spécialisées dans le transport de macromolécules et micro-organismes de la lumière intestinale au tissu lymphoide sous-jacent. Ce transport des antigènes est une condition obligatoire pour induire une réponse immunitaire. Les cellules du FAE, outre les cellules M, expriment un programme de différenciation distinct de celui des cellules associées aux villosités. Ceci est characterisé par une baisse des fonctions digestives et de défenses, et l?expression constitutive des chimiokines: CCL20 et CCL25. Le but de l?étude présentée ici est de rechercher les facteurs cellulaires et/ou moléculaire responsables de cette différenciation. Certaines études ont démontré l?importance du contact entre le compartiment mésenchymateux et l?épithelium pour la morphogenèse de ce dernier. En particulier, les molécules de la matrice extracellulaire peuvent activer des gènes clefs qui, à leur tour, vont controler l?adhésion et la differenciation cellulaire. Dans l?intestin, les cellules mésenchymateuses différencient en myofibroblastes qui participent à l?élaboration de la matrice extracellulaire. Dans cette étude, nous avons décrit les différences d?expression de molécules de la matrices sous le FAE et les villosités. Nous avons également montré une absence de myofibroblastes sous le FAE. Suite à plusieurs évidences expérimentales, certains ont proposé une influence des composés présents dans la lumière sur la différenciation et/ou la maturation des plaques de Peyer. La chimiokine CCL20, capable de recruter des cellules initiatrices de la réponse immunitaire, constitue notre seul marqueur positif de FAE. Nous avons pu montrer que la flagelline, un composé du flagelle bactérien, était capable d?induire l?expression de CCL20 in vitro et in vivo. Cet effet n?est pas limité aux cellules du FAE mais est observé sur l?ensemble de l?épithelium intestinal. Molecular mechanisms of FAE differenciation. La signalement induit par la lymphotoxine ß est critique pour l?organogenèse des plaques de Peyer, car des souris déficientes pour cette molécules ou son récepteur n?ont ni plaque de Peyer, ni la plupart des ganglions lymphatiques. Nous avons obtenus plusieurs évidences que la lymphotoxine ß était impliquée dans la régulation du gène CCL20 in vitro et in vivo.<br/><br/>Mucosal surfaces of the respiratory, genital and digestive systems are exposed to food antigens, normal bacterial flora and oral pathogens. This justifies an intense and tuned immunological activity in mucosal tissues. The modulation of immune responses in the mucosa is thought to occur in specific sentinel sites, the organized mucosa associated lymphoid tissues (o-MALT). This immune modulation and the biology of these immune-inductive sites are poorly understood but highly important and relevant in the case of drugs and vaccines design. In the small intestine, these organs (gut associated lymphoid tissue : GALT) consists of single or multiple lymphoid follicles, the so-called Peyer?s patches (PP), with typical B cell-enriched follicles and germinal centers, inter-follicular T cell areas, and a dome region enriched in dendritic cells, naive B cells, and CD4+ T cells under a specialized follicle associated epithelium (FAE). To trigger protective immunity, antigens have to cross the mucosal epithelial barrier. This is achieved by the specialized epithelial M cells of the FAE that are able to take up and transport macromolecules and microorganisms from the environment into the underlying organized lymphoid tissue. The ontogeny of M cells remains controversial: some data are in favor of a distinct cell lineage, while others provide evidence for the conversion of differentiated enterocytes into M cells. In this study we mapped the proliferative, M cells and apoptotic compartments along the FAE. Enterocytes acquire transient M cell features as they leave the crypt and regain enterocyte properties as they move towards the apoptotic compartment at the apex of the FAE, favouring the hypothesis of a plastic phenotype. The follicle-associated epithelium (FAE) is found exclusively over lymphoid follicles in mucosal tissues, including Peyer?s patches. The enterocytes over Peyer?s patches express a distinct phenotype when compared to the villi enterocytes, characterized by the down regulation of digestive and defense functions and the constitutive expression of chemokines, i.e. CCL20 and CCL25. The purpose of this study was to investigate and identify the potential cells and/or molecules instructing FAE differentiation. Contact between the epithelial and the mesenchymal cell compartment is required for gut morphogenesis. Extracellular matrix molecules (ECM) can activate key regulatory genes which in turn control cell adhesion and differentiation. In the gut, mesenchymal cells differentiate into myofibroblats that participate to the elaboration of ECM. We have described a differential expression of extracellular matrix components under the FAE, correlating with the absence of subepithelial myofibroblats. Molecular mechanisms of FAE differenciation. Different studies proposed an influence of the luminal compartment in the differentiation and/or the maturation of PP. CCL20, a chemokine able to recruit cells that initiate adaptive immunity constitutes our first positive FAE molecular marker. We have shown that CCL20 gene expression is inducible in vitro and in vivo in intestinal epithelium by flagellin, a component of bacterial flagella. This effect was not restricted to the FAE. Lymphotoxin ß (LTß) signaling is critical for PPs organogenesis as LT deficient mice as well as LTß-receptor-/- mice lack PPs and most of the lymph nodes (LN). The continuous signaling via LTßR-expressing cells appears necessary for the maintenance throughout the life of PP architecture. We obtained in vitro and in vivo evidence that LTß signalling is involved in CCL20 gene expression.

Characterization of Tollip in the Interleulkin-1 Receptor/Toll Like Receptors signaling pathways

SUMMARY IL-1R and TLRs are key players in innate immunity and inflammation. Tollip was identified as a component of IL-1RI, TLR2 and TLR4 signaling complexes that activate NF-κB and MAP kinase pathways. Tollip was previously shown as a negative regulator of NF-κB and MAP Kinase activation. We have characterized the role of Tollip in IL-R/TLRs induced signaling by the analysis of the Tollip deficient mice. We showed that NF-κB and MAPK (p38, JNK, or ERK1/2) signaling appeared normal in Tollip deficient cells following stimulation with IL-1β, lipopolysaccharide (LPS), and other TLR ligands. Also IL-1β and TLRs ligands induced activation of immune cells was indistinguishable from wild-type cells. Strikingly, in Tollip deficient mice the production of the inflammatory cytokines, IL-6 or TNF-α was significantly reduced relative to control mice after treatment with physiological doses of IL-1β or LPS, whereas no difference was observed at high doses of stimulation with LPS or in LPS induced septic shock. Therefore, Tollip could be critical for regulation of optimal responses to IL-1β and LPS, in addition to its role as negative regulator of the signaling. We also studied the role of Tollip as an endocytic adaptor for IL-1R endocytosis. We could show that Il-1R is ubiquitinated after IL-1β stimulation, and that Tollip's CUE domain binds IL-1RI in an ubiquitin-dependent manner. We followed IL-1R internalization and Tollip localization by confocal microscopy. Consistent with a role for Tollip in sorting of ubiquitinated IL-1RI, a significant amount of Tollip was also localized at the late endosomal compartment. We could show that Tollip is required for efficient lysosomal targeting of ubiquitinated IL-1R1, In the absence of Tollip or in Tollip deficient cells reconstituted with a Tollip mutant (defective in ubiquitin binding) IL-1RI accumulates in enlarged late endosomes. In addition, Tollip was shown to interact with, another endocytic adapter, Toml, and both interact with IL-1RI. In conclusion, we showed that Tollip is required for IL-1β and LPS signaling for cytokine production. In addition we showed and that Tollip has a role as an endocytic adapter, necessary for efficient trafficking and lysosomal degradation of IL-1RI. Resumé Le récepteur à l'interleukine-1 (IL-1R) et les récepteurs "Toll-like" (TLRs) sont des acteurs cruciaux de la réponse immunitaire innée et de l'inflammation. La proteine Tollip a été identifiée comme étant un élément des complexes de signalisation, induits par les récepteurs IL-1RI, TLR-2 et TLR-4, qui mènent à l'activation de la voie des MAP kinases et de NF-κB. Dans de précédentes études, il a été montré que Tollip pouvait inhiber ces deux voies de signalisation. Nous avons voulu caractériser plus précisément le rôle de Tollip dans l'activation des voies de signalisation mitées par IL-1R/TLRs en utilisant une lignée murine déficiente pour la protéine Tollip. Ainsi, en absence de Tollip, les cascades d'activation de NF-κB et MAPK (p38, JNK, or ERK1/2) ne semblent pas affectées après stimulation avec IL-1β, lipopolysaccharide (LPS) ou d' autres ligands des TLR. La réponse des cellules du système immunitaire induite par la stimulation avec IL-1β et les ligands des TLR est également comparable entre les souris sauvages et les souris deficientes pour Tollip. Par contre, dans cette lignée murine, la production de cytokines proinflammatoires IL-6 et TNFα induite par la stimulation à dose physiologique de IL-1β or LPS, est réduite. Cependant, lors de stimulation à plus hautes doses de LPS ou pendant un choc septique induit par de LPS, cette réduction n'est pas observée. Ces résultats montrent que Tollip pourrait avoir un rôle déterminant dans l'activation optimale en réponse à l' IL-1β et au LPS qui s'ajoute à sa fonction inhibitrice des mêmes voies de signalisation. Nous avons aussi étudié le rôle de Tollip comme molécule adaptatatrice du mécanisme endocytique d'internalisation de l' IL-1RI. Ainsi, l' IL-1R est ubiquitiné après stimulation par l' IL-1β , permettant à Tollip de se lier au récepteur. Cette interaction est réalisée entre le domaine CUE de Tollip et l'IL-1R via l'ubiquitine. L'internalisation et la localisation intracellulaire de l'IL-1RI et de Tollip ont été observés par microscopie confocale. En accord avec le rôle de Tollip dans le triage et la recirculation des IL-1R ubiquitiné, une quantité importante de Tollip été détectée dans l' endosome tardif. Nous avons pu démontrer que Tollip était nécessaire pour diriger efficacement ubiquitiné vers les lysosomes. Dans des cellules déficientes pour Tollip, ou reconstituées avec un mutant de Tollip (MF/AA) incapable de lier l'ubiquitine, IL-1RI s'accumule dans des vesicules anormales de l'endosome tardif. Dans ce travail, nous avons pu confirmer et préciser la fonction de la protéine Tollip dans l' activation de la production de cytokines induites par l' IL-1p and le LPS lors de l'inflammation et découvrir son rôle d'adaptateur dans l' internalisation et l'endocytose de l' IL-1RI.

Capsid modified replicating adenovirus to selectively target colon cancer

Résumé: Pratiquement tous les cancers du colon contiennent des mutations dans la voie de signalisation de Wnt qui active constitutivement cette voie. Cette activation mène à la stabilisation de la β-catenine. La β-catenin est transportée dans le noyau ou elle active des gènes cible en interagissant avec le facteur de transcription de TCF/LEF. Des adénovirus qui peuvent sélectivement se répliquer dans les cellules tumorales sont les agents qui peuvent permettre la déstruction de la tumeur mais pas le tissu normal. In vitro, les adénovirus avec des sites d'attachement du facteur de transcription TCF dans les promoteurs de l'adénovirus montrent une sélectivité et une activité dans une large sélection de lignées cellulaires de cancer du colon. Au contraire, in vivo, quand les adénovirus modifiés sont injectés dans la circulation, ils sont moins efficaces à cause de leur fixation par le foie et à cause de l'absence d'expression du récepteur du Coxsackie-Adénovirus (CAR). Le but de ma thèse était de modifier la protéine principale de capside de l'adénovirus, fibre, pour augmenter l'infection des tumeurs du cancer du colon. La fibre de l'adénovirus est responsable de l'attachement aux cellules et de l'entrée virale. J'ai inséré un peptide RGD dans la boucle HI de la fibre qui dirige sélectivement le virus aux récepteurs des integrines. Les integrines sont surexprimées par les cellules du cancer du colon et l'endothélium des vesseaux de la tumeur. Le virus re-ciblé, vKH6, a montré une activité accrue dans toutes les lignées cellulaires de cancer du colon, tandis que la sélectivité était maintenue. In vivo, vKH6 était supérieur au virus avec une capside de type sauvage en retardant la croissance de la tumeur. Le virus s'est répliqué plus vite et dispersé graduellement dans la tumeur. Cet effet a été montré par hybridation in situ et par PCR quantitative. Cependant, la monothérapie avec le virus n'a pu retarder la croissance des cellules tumorales SW620 greffées que de 2 semaines, mais à cause des régions non infectées la tumeur n'a pas pu être éliminée. Bien que la combinaison avec les chimiothérapies conventionnelles soit d'intérêt potentiel, presque toutes interfèrent avec la réplication virale. Les drogues antiangiogéniques sont des agents anti-tumoraux efficaces et prometteurs. Ces drogues n'interfèrent pas avec le cycle de vie de l'adénovirus. RAD001 est un dérivé de la rapamycine et il inhibe mTOR, une protéine kinase de la voie de PI3K. RAD001 empêche la croissance des cellules et il a aussi des effets anti-angiogénique et immunosuppressifs. RAD001 in vitro n'affecte pas l'expression des gènes viraux et la production virale. La combinaison de VKH6 et RAD001 in vivo a un effet additif en retardant la croissance de la tumeur. Des nouveaux peptides plus efficaces dans le ciblage de l'adénovirus sont nécessaires pour augmenter l'infection des tumeurs. J'ai créé un système de recombinaison qui permettra la sélection de nouveaux peptides dans le contexte du génome de l'adénovirus. Summary Virtually all colon cancers have mutations in the Wnt signalling pathway which result in the constitutive activation of the pathway. This activation leads to stabilization of β-catenin. β-catenin enters the nucleus and activates its target genes through interaction with the TCF transcription factor. Selectively replicating adenoviruses are promising novel agents that can destroy the tumour but not the surrounding normal tissue. In vitro, adenoviruses with TCF binding sites in the early viral promoters show selectivity and activity in a broad panel of viruses but in vivo they are less effective due to the lack of expression of the Coxsackie-Adenovirus receptor (CAR). The aim of my thesis was to modify the major capsid protein of the adenovirus, fibre, to increase the infection of colon tumours. Fibre of adenovirus is responsible for the binding to cells and for the viral uptake. I inserted an RGD binding peptide into the HI loop of fibre that selectively targets the virus to integrins that are overexpressed on tumour cells and on tumour endothelium. The retargeted virus, vKH6, showed increased activity in all colon cancer cell lines while selectivity was maintained. In vivo, vKH6 is superior to a matched virus with a wild type capsid in delaying tumour growth. vKH6 replicates and gradually spreads within the tumour as shown by in situ hybridization and Q-PCR. The virus alone can delay the growth of SW620 xenografts by 2 weeks but due to uninfected tumour regions the tumour cannot be cured. Although combination with conventional chemotherapeutics is of potential interest, almost all of them interfere with the viral replication. Growing evidence supports that anti-angiogenic drugs are effective and promising anti-tumour agents. These drugs interfere less with the viral life cycle. RAD001 is a rapamycin derivative and it blocks mTOR, a protein kinase in the PI3K pathway. RAD001 inhibits cell growth and has strong anti-angiogenic and immunosuppressive effects. RAD001 in vitro does not affect viral gene expression and viral burst size. In vivo vKH6 and RAD001 have an additive effect in delaying tumour growth, but tumour growth is still not completely inhibited. To further increase tumour infection new tumour specific targeting peptides are needed. I created an adenovirus display library that will allow the selection of targeting peptides. This system may also facilitate the production of fibre modified viruses.

Génération d'une souris dépourvue du gène VIT32 de manière conditionnelle: étude du phénotype rénal chez les souris dépourvues de RGS2

Résumé Dans le rein, la vasopressine possède un rôle essentiel dans la régulation fine du transport d'eau et participe au contrôle de la réabsorption du sodium. Cette action est conduite par l'activation du récepteur à la vasopressine V2R situé dans l'anse de Henle, dans le tubule connecteur et dans le canal collecteur du néphron des rongeurs et conduit à la formation d'AMPc entraînant un mécanisme d'action caractérisé par deux phases distinctes. Le premier effet de la vasopressine est non génomique et a lieu rapidement après l'activation du récepteur, la deuxième phase est plus tardive et possède la caractéristique de moduler la transcription d'un réseau de gènes. Parmi ces gènes, plusieurs sont directement impliqués dans le transport d'eau et de sodium, comme l'Aqp2 et 3, ENaC et la Na,K-ATPase. L'identification des effets de la voie de signalisation de la vasopressine représente un point crucial pour la compréhension des mécanismes moléculaires de la réabsorption de l'eau et du sodium dans le néphron. L'analyse en série de l'expression de gènes (SAGE) réalisée en 2001 dans notre laboratoire a permis de caractériser le transcriptome dépendant de la vasopressine dans la lignée cellulaire mpkCCDc14,a dérivée du canal collecteur cortical (CCD) de souris. Deux des transcrits induits par la vasopressine (VIT) ont fait l'objet des études de ce travail de thèse. Le premier est VIT32 (Vasopressin induced transcript 32) qui code pour une protéine ne possédant aucune homologie avec des domaines protéiques dont la fonction est connue. Dans le système d'expression de l'ovocyte de Xenopus laevis, VIT32 induit la maturation des ovocytes et diminue le courant sensible à l'amiloride de manière dépendante de la voie des MAPK. Dans les mpkCCDc14, l'inhibition de la voie des MAPK diminue le courant sodique en diminuant l'activité de la Na,K-ATPase, mais sans modifier le courant d'ENaC. Ainsi la voie de signalisation des MAPK peut avoir des cibles différentes suivant le système dans lequel elle est étudiée. C'est pourquoi nous avons décidé de poursuivre l'étude de VIT32 dans un contexte physiologique en créant une souris dépourvue du gène codant pour VIT32 de manière conditionnelle (conditional knockout). La première partie de cette thèse a donc consisté à générer cette souris. Le deuxième transcrit induit par la vasopressine qui a été étudié dans cette thèse est RGS2 (Regulator of G protein Signaling 2). In vitro, il a été montré que RGS2 inhibe des voies de signalisation dépendantes de récepteurs couplés à des protéines Gq et Gs. Dans notre étude, nous avons montré que dans le néphron de rein de souris, RGS2 est colocalisé avec V2R. In vivo, la vasopressine sécrétée lors d'une restriction en eau imposée à des souris augmente l'expression de RGS2. De plus, l'accumulation d'AMPc engendrée par l'action de la vasopressine sur les canaux collecteurs est significativement plus grande chez les souris dépourvues de RGS2 (rgs2 -/-). Cette induction de la signalisation de la vasopressine est corrélée à une augmentation de la réabsorption d'eau chez les souris rgs2 -/-. Ainsi RGS2 serait impliqué dans le rétrocontrôle négatif de la voie de signalisation de la vasopressine. Abstract In the kidney, vasopressin plays a key role in the control of water balance and participates in salt reabsorption. These actions are induced by the activation of V2 vasopressin receptor (V2R) located in the loop of Henle, in the connecting tubule and in the collecting duct leading to an increase in intracellular cAMP levels. The V2R-mediated vasopressin action elicits a rapid, non-genomic effect, during which water and salt reabsorption is rapidly increased and a late or genomic effect characterised by the long-term regulation of water and salt reabsorption through the transcriptional activation of a gene network that includes Aqp2, Aqp3, ENaC and Na,K-ATPase. Serial analysis of gene expression (SAGE) performed in 2001 in our laboratory characterised the vasopressin induced transcripts (VIT) in the mpkCCDc14 cell line. Two of them are studied in this thesis. The first one is VIT32 (Vasopressin induced transcript 32) that encodes a protein that has no homology with any protein domain of known function. In the Xenopus laevis oocyte, VIT32 induces oocyte maturation and downregulates the ENaC amiloride sensitive current via the activation of the MAPK pathway. In mpkCCDc14 cell line, the MAPK pathway inhibition leads to a decrease of Na,K-ATPase activity without affecting ENaC current. Therefore, the MAPK pathway can act on different targets depending on the cellular context. Thus, we decided to investigate the function of VIT32 in its physiological environment by performing a conditional knockout mouse of VIT32. The first part of this thesis consisted in generating this mouse. The second studied vasopressin induced transcript is RGS2 (Regulator of G protein Signaling 2). In vitro, RGS2 has been shown to inhibit Gq and Gs protein-coupled receptor pathway. In our study we show that RGS2 is co-localized with V2R in the mouse nephron. In vivo, vasopressin secreted during water restriction up-regulates RGS2 expression. Moreover, vasopressin-dependant accumulation of CAMP is significantly increased in the cortical collecting duct of RGS2 knockout mice. This increase is correlated with an increase in water reabsorption. RGS2 could be involved in the negative feedback regulation of V2R signalling. Résumé tout public Le corps humain est composé d'environ 60% d'eau répartie à l'intérieur et à l'extérieur des cellules de notre organisme. Les cellules, unités fondamentales du vivant, puisent l'oxygène et les nutriments indispensables à leur fonctionnement dans le liquide extracellulaire. La composition du milieu doit être constante, car les variations peuvent perturber considérablement et parfois fatalement la fonction des cellules. Ainsi les organismes pluricellulaires ont développé des mécanismes permettant de contrôler la constance du milieu extracellulaire afin de maintenir l'état d'équilibre nommé homéostasie. Le rein joue un rôle majeur dans cette homéostasie grâce à sa capacité de réabsorber l'eau et les solutés en fonction des besoins de l'organisme. Cette fonction du rein est régulée par différentes hormones comme la vasopressine, qui permet de contrôler la réabsorption fine de l'eau et des solutés. Dans leurs membranes, les cellules possèdent des récepteurs leur permettant de répondre aux signaux extracellulaires comme le sont entre autres les hormones. Ainsi les cellules sensibles à la vasopressine possèdent un récepteur nommé V2R qui permet d'intégrer les signaux de la vasopressine en déclenchant tout une cascade d'événements conduisant à une modification de l'expression de certaines protéines impliquées directement ou non dans la réabsorption de l'eau et des solutés. Une étude précédente élaborée au sein de notre laboratoire a permis de répertorier les protéines dont l'expression est augmentée par de la vasopressine. Deux de ces protéines ont fait l'objet des études de cette thèse. La première protéine induite par la vasopressine est VIT32 (Vasopressin induced transcript 32). Cette protéine est entre autres impliquée dans la réabsorption du sodium, mais la fonction précise de VIT32 dans ce transport n'a pas pu être déterminée. Une des approches possibles pour l'étude de la fonction d'une protéine est de supprimer son expression chez la souris et d'étudier les conséquences de son absence. Ces souris sont appelées des souris knockout, puisque la protéine en question ne peut plus agir. La première partie de cette thèse a donc consisté à générer une souris dépourvue du gène de VIT32. La deuxième protéine étudiée est RGS2 (Regulator of G protein Signaling 2). Cette protéine inhibe certaines voies de signalisation activées par différentes hormones. Dans cette partie du travail de thèse, nous avons pu mettre en évidence que RGS2 agit comme un inhibiteur de la voie de signalisation de la vasopressine. En modifiant cette signalisation, RGS2 serait donc un médiateur du contrôle de la réabsorption d'eau dans les cellules du rein sensibles à la vasopressine.