Regulation of dendritic development by BDNF requires activation of CRTC1 by glutamate.

Dendritic growth is essential for the establishment of a functional nervous system. Among extrinsic signals that control dendritic development, substantial evidence indicates that BDNF regulates dendritic morphology. However, little is known about the underlying mechanisms by which BDNF controls dendritic growth. In this study, we show that the MAPK signaling pathway and the transcription factor cAMP response element-binding protein (CREB) mediate the effects of BDNF on dendritic length and complexity. However, phosphorylation of CREB alone is not sufficient for the stimulation of dendritic growth by BDNF. Thus, using a mutant form of CREB unable to bind CREB-regulated transcription coactivator (CRTC1), we demonstrate that this effect also requires a functional interaction between CREB and CRTC1. Moreover, inhibition of CRTC1 expression by shRNA-mediated knockdown abolished BDNF-induced dendritic growth of cortical neurons. Interestingly, we found that nuclear translocation of CRTC1 results from activation of NMDA receptors by glutamate, a process that is essential for the effects of BDNF on dendritic development. Together, these data identify a previously unrecognized mechanism by which CREB and the coactivator CRTC1 mediate the effects of BDNF on dendritic growth.

Insights into shallow magmatic processes in large silicic magma bodies: the trace element record in the Fish Canyon magma body, Colorado

Highly evolved rhyolite glass plus near-solidus mineral assemblages in voluminous, dacitic, crystal-rich ignimbrites provide an opportunity to evaluate the late magmatic evolution of granodiorite batholiths. This study reports laser-ablation ICP-MS analyses of trace element concentrations in feldspars, hornblende, biotite, titanite, zircon, magnetite, and interstitial glass of the crystal-rich Fish Canyon Tuff. The high-silica rhyolite glass is characterized by relatively high concentrations of feldspar-compatible elements (e.g., 100 ppm Sr and 500 ppm Ba) and low concentrations of Y (< 7 ppm) and HREE (&amp;SIM; 1 ppm Yb), hence high LREE/HREE (Ce/Yb > 40) compared to many well-studied high-silica rhyolite glasses and whole-rock compositions. Most minerals record some trace element heterogeneities, with, in particular, one large hornblende phenocryst showing four- to six-fold core-to-rim increases in Sr and Ba coupled with a decrease in Sc. The depletions of Y and HREE in the Fish Canyon glass relative to the whole-rock composition (concentrations in glass &amp;SIM; 30% of those in whole rocks) reflect late crystallization of phases wherein these elements were compatible. As garnet is not stable at the low-P conditions at which the Fish Canyon magma crystallized, we show that a combination of modally abundant hornblende (&amp;SIM; 4%) + titanite (&amp;SIM; 0.5-1%) and the highly polymerized nature of the rhyolitic liquid led to Y and HREE depletions in melt. Relatively high Sr and Ba contents in glass and rimward Sr and Ba increases in euhedral, concentrically zoned hornblende suggest partial feldspar dissolution and a late release of these elements to the melt as hornblende was crystallizing, in agreement with textural evidence for feldspar (and quartz) resorption. Both observations are consistent with thermal rejuvenation of the magma body prior to eruption, during which the proportion of melt increased via feldspar and quartz dissolution, even as hydrous and accessory phases were crystallizing. Sr/Y in Fish Canyon glass (13-18) is lower than the typical ``adakitic'' value (> 40), confirming that high Sr/Y is a reliable indicator of high-pressure magma generation and/or differentiation wherein garnet is implicated.

Azithromycin inhibits expression of the GacA-dependent small RNAs RsmY and RsmZ in Pseudomonas aeruginosa.

Azithromycin at clinically relevant doses does not inhibit planktonic growth of the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa but causes markedly reduced formation of biofilms and quorum-sensing-regulated extracellular virulence factors. In the Gac/Rsm signal transduction pathway, which acts upstream of the quorum-sensing machinery in P. aeruginosa, the GacA-dependent untranslated small RNAs RsmY and RsmZ are key regulatory elements. As azithromycin treatment and mutational inactivation of gacA have strikingly similar phenotypic consequences, the effect of azithromycin on rsmY and rsmZ expression was investigated. In planktonically growing cells, the antibiotic strongly inhibited the expression of both small RNA genes but did not affect the expression of the housekeeping gene proC. The azithromycin treatment resulted in reduced expression of gacA and rsmA, which are known positive regulators of rsmY and rsmZ, and of the PA0588-PA0584 gene cluster, which was discovered as a novel positive regulatory element involved in rsmY and rsmZ expression. Deletion of this cluster resulted in diminished ability of P. aeruginosa to produce pyocyanin and to swarm. The results of this study indicate that azithromycin inhibits rsmY and rsmZ transcription indirectly by lowering the expression of positive regulators of these small RNA genes.

BAFF and the regulation of B cell survival.

The TNF family member BAFF is a fundamental survival factor for B cells. BAFF binds to three receptors, only one of which, BAFF-R, does not cross-react with the BAFF-related ligand APRIL. The survival function of BAFF on B cells is mediated mainly by BAFF-R and is particularly effective in transitional B cells. BAFF depletion leads to a considerable decrease in mature B cells, without apparent effect on B cell genesis. Consistently, BAFF overexpression results in an expanded B cell compartment and autoimmunity in mice. Elevated amounts of BAFF can be found in the serum of patients suffering from autoimmune diseases. The BAFF system is a promising target for the treatment of autoimmune diseases.

Functional characterization of E- and P-cadherin in invasive breast cancer cells

BACKGROUND Alterations in the cadherin-catenin adhesion complexes are involved in tumor initiation, progression and metastasis. However, the functional implication of distinct cadherin types in breast cancer biology is still poorly understood. METHODS To compare the functional role of E-cadherin and P-cadherin in invasive breast cancer, we stably transfected these molecules into the MDA-MB-231 cell line, and investigated their effects on motility, invasion and gene expression regulation. RESULTS Expression of either E- and P-cadherin significantly increased cell aggregation and induced a switch from fibroblastic to epithelial morphology. Although expression of these cadherins did not completely reverse the mesenchymal phenotype of MDA-MB-231 cells, both E- and P-cadherin decreased fibroblast-like migration and invasion through extracellular matrix in a similar way. Moreover, microarray gene expression analysis of MDA-MB-231 cells after expression of E- and P-cadherins revealed that these molecules can activate signaling pathways leading to significant changes in gene expression. Although the expression patterns induced by E- and P-cadherin showed more similarities than differences, 40 genes were differentially modified by the expression of either cadherin type. CONCLUSION E- and P-cadherin have similar functional consequences on the phenotype and invasive behavior of MDA-MB-231 cells. Moreover, we demonstrate for the first time that these cadherins can induce both common and specific gene expression programs on invasive breast cancer cells. Importantly, these identified genes are potential targets for future studies on the functional consequences of altered cadherin expression in human breast cancer.

Regulation of the expression of components of the exocytotic machinery of insulin-secreting cells by microRNAs

Fine-tuning of insulin secretion from pancreatic beta-cells participates in blood glucose homeostasis. Defects in this process can lead to chronic hyperglycemia and diabetes mellitus. Several proteins controlling insulin exocytosis have been identified, but the mechanisms regulating their expression remain poorly understood. Here, we show that two non-coding microRNAs, miR124a and miR96, modulate the expression of proteins involved in insulin exocytosis and affect secretion of the beta-cell line MIN6B1. miR124a increases the levels of SNAP25, Rab3A and synapsin-1A and decreases those of Rab27A and Noc2. Inhibition of Rab27A expression is mediated by direct binding to the 3'-untranslated region of Rab27A mRNA. The effect on the other genes is indirect and linked to changes in mRNA levels. Over-expression of miR124a leads to exaggerated hormone release under basal conditions and a reduction in glucose-induced secretion. miR96 increases mRNA and protein levels of granuphilin, a negative modulator of insulin exocytosis, and decreases the expression of Noc2, resulting in lower capacity of MIN6B1 cells to respond to secretagogues. Our data identify miR124a and miR96 as novel regulators of the expression of proteins playing a critical role in insulin exocytosis and in the release of other hormones and neurotransmitters

Endocannabinoid regulation of acute and protracted nicotine withdrawal: effect of FAAH inhibition.

Evidence shows that the endocannabinoid system modulates the addictive properties of nicotine. In the present study, we hypothesized that spontaneous withdrawal resulting from removal of chronically implanted transdermal nicotine patches is regulated by the endocannabinoid system. A 7-day nicotine dependence procedure (5.2 mg/rat/day) elicited occurrence of reliable nicotine abstinence symptoms in Wistar rats. Somatic and affective withdrawal signs were observed at 16 and 34 hours following removal of nicotine patches, respectively. Further behavioral manifestations including decrease in locomotor activity and increased weight gain also occurred during withdrawal. Expression of spontaneous nicotine withdrawal was accompanied by fluctuation in levels of the endocannabinoid anandamide (AEA) in several brain structures including the amygdala, the hippocampus, the hypothalamus and the prefrontal cortex. Conversely, levels of 2-arachidonoyl-sn-glycerol were not significantly altered. Pharmacological inhibition of fatty acid amide hydrolase (FAAH), the enzyme responsible for the intracellular degradation of AEA, by URB597 (0.1 and 0.3 mg/kg, i.p.), reduced withdrawal-induced anxiety as assessed by the elevated plus maze test and the shock-probe defensive burying paradigm, but did not prevent the occurrence of somatic signs. Together, the results indicate that pharmacological strategies aimed at enhancing endocannabinoid signaling may offer therapeutic advantages to treat the negative affective state produced by nicotine withdrawal, which is critical for the maintenance of tobacco use.

Munc18c in adipose tissue is downregulated in obesity and is associated with insulin.

OBJECTIVE Munc18c is associated with glucose metabolism and could play a relevant role in obesity. However, little is known about the regulation of Munc18c expression. We analyzed Munc18c gene expression in human visceral (VAT) and subcutaneous (SAT) adipose tissue and its relationship with obesity and insulin. MATERIALS AND METHODS We evaluated 70 subjects distributed in 12 non-obese lean subjects, 23 overweight subjects, 12 obese subjects and 23 nondiabetic morbidly obese patients (11 with low insulin resistance and 12 with high insulin resistance). RESULTS The lean, overweight and obese persons had a greater Munc18c gene expression in adipose tissue than the morbidly obese patients (p<0.001). VAT Munc18c gene expression was predicted by the body mass index (B = -0.001, p = 0.009). In SAT, no associations were found by different multiple regression analysis models. SAT Munc18c gene expression was the main determinant of the improvement in the HOMA-IR index 15 days after bariatric surgery (B = -2148.4, p = 0.038). SAT explant cultures showed that insulin produced a significant down-regulation of Munc18c gene expression (p = 0.048). This decrease was also obtained when explants were incubated with liver X receptor alpha (LXRα) agonist, either without (p = 0.038) or with insulin (p = 0.050). However, Munc18c gene expression was not affected when explants were incubated with insulin plus a sterol regulatory element-binding protein-1c (SREBP-1c) inhibitor (p = 0.504). CONCLUSIONS Munc18c gene expression in human adipose tissue is down-regulated in morbid obesity. Insulin may have an effect on the Munc18c expression, probably through LXRα and SREBP-1c.

Major, minor, trace element, Sm-Nd and Sr isotope compositions of mafic rocks from the earliest oceanic crust of the Alpine Tethys

Recent isotopic and biochronologic dating has demonstrated that the Gets nappe contains remnants of the oldest part of the oceanic crust of the Alpine Tethys. The ophiolites are associated with deep sea sediments, platform carbonates and continental crustal elements suggesting a transitional environment between continental and oceanic crust. Therefore, the ophiolites from the Gets nappe provide the opportunity to assess the nature of mantle source and the magma evolution during the final rifting stage of the European lithosphere. Trace clement analyses of mafic rocks can he divided into two sets: (1) P, Zr and Y contents are consistent with those of mid-ocean ridge basalts and REE patterns have a P-MORB affinity. (2) P,Zr Ti and Y contents are compatible with within-plate basalts and are characterized by REE spectra similar to that of T-MORB. Both have Nd isotopic compositions similar to those of synrift magma of the Red Sea and to the Rhine Graben. The model ages are in agreement with an LREE-enriched subcontinental mantle source derived from depleted mantle 800 to 900 Ma ago. Minor, trace element and Sm-Nd compositions suggest that these rocks are basaltic relies of an earliest stage of oceanic spreading i.e. an embryonic ocean. Comparison between REE patterns, Nd and Sr isotope compositions, isotopic and biochronologic ages from different Alpine Tethys ophiolites shows that samples with enriched LREE are from the older ophiolitic suites and are relies of the embryonic ocean floor. Later phases of ocean spreading are characterized by basalts that are depleted in LREE.

Update of the FANTOM web resource: from mammalian transcriptional landscape to its dynamic regulation.

The international Functional Annotation Of the Mammalian Genomes 4 (FANTOM4) research collaboration set out to better understand the transcriptional network that regulates macrophage differentiation and to uncover novel components of the transcriptome employing a series of high-throughput experiments. The primary and unique technique is cap analysis of gene expression (CAGE), sequencing mRNA 5'-ends with a second-generation sequencer to quantify promoter activities even in the absence of gene annotation. Additional genome-wide experiments complement the setup including short RNA sequencing, microarray gene expression profiling on large-scale perturbation experiments and ChIP-chip for epigenetic marks and transcription factors. All the experiments are performed in a differentiation time course of the THP-1 human leukemic cell line. Furthermore, we performed a large-scale mammalian two-hybrid (M2H) assay between transcription factors and monitored their expression profile across human and mouse tissues with qRT-PCR to address combinatorial effects of regulation by transcription factors. These interdependent data have been analyzed individually and in combination with each other and are published in related but distinct papers. We provide all data together with systematic annotation in an integrated view as resource for the scientific community (http://fantom.gsc.riken.jp/4/). Additionally, we assembled a rich set of derived analysis results including published predicted and validated regulatory interactions. Here we introduce the resource and its update after the initial release.

Epigenetic regulation of human cancer/testis antigen gene, HAGE, in chronic myeloid leukemia.

BACKGROUND AND OBJECTIVES Cancer testis antigens (CTA) provide attractive targets for cancer-specific immunotherapy. Although CTA genes are expressed in some normal tissues, such as the testis, this immunologically protected site lacks MHC I expression and as such, does not present self antigens to T cells. To date, CTA genes have been shown to be expressed in a range of solid tumors via demethylation of their promoter CpG islands, but rarely in chronic myeloid leukemia (CML) or other hematologic malignancies. DESIGN AND METHODS In this study, the methylation status of the HAGE CTA gene promoter was analyzed by quantitative methylation-specific polymerase chain reaction (MSP) and sequencing in four Philadelphia-positive cell lines (TCC-S, K562, KU812 and KYO-1) and in CML samples taken from patients in chronic phase (CP n=215) or blast crisis (BC n=47). HAGE expression was assessed by quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction. RESULTS The TCC-S cell line showed demethylation of HAGE that was associated with over-expression of this gene. HAGE hypomethylation was significantly more frequent in BC (46%) than in CP (22%) (p=0.01) and was correlated with high expression levels of HAGE transcripts (p<0.0001). Of note, in CP-CML, extensive HAGE hypomethylation was associated with poorer prognosis in terms of cytogenetic response to interferon (p=0.01) or imatinib (p=0.01), molecular response to imatinib (p=0.003) and progression-free survival (p=0.05). INTERPRETATIONS AND CONCLUSION: The methylation status of the HAGE promoter directly correlates with its expression in both CML cell lines and patients and is associated with advanced disease and poor outcome.

Characterization of a cAMP-regulated enhancer-binding protein.

The transcription regulation of many hormone genes is modulated by intracellular second messengers such as cAMP. The cAMP response element binding protein, CREB, binds to the 8 base pair CRE enhancer, TGACGTCA, that is found in the 5'-flank of certain genes including those for somatostatin and the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. The recent characterization of CREB and CREB-related cDNA clones, combined with Southwesterns and Northern blot analyses, reveals a family of transcription factors that dimerize via a leucine zipper motif and bind to the CRE through positively charged basic regions. The CREB cDNA encoding a 327 residue protein is transcriptionally activated via phosphorylation by protein kinases, including the cAMP-dependent protein kinase-A.

Function and regulation of the scaffold protein IB1/JIP-1 in the uro-genital tract.

RESUME Ce mémoire de thèse traite de l'étude de la « scaffold »protéine ou protéine «échafaud», « Islet-Brain1/ JNK Interacting Protein 1 » (IB1/JIP-1) dans la vessie et la prostate, deux organes importants de l'appareil uro-genital. Cette protéine, mise en évidence dans notre laboratoire à la fin des année 90, a été reconnue pour réguler la voie de signalisation des « Mitogen-Activated Protein Kinases » (MAPKs), et en particulier de la MAPK appelée c-Jun N-terminal Kinase (JNK). Le réseau de voie de signalisation permet aux cellules de percevoir les changements dans le milieu extracellulaire et de permettre une réponse appropriée à ces différents stimuli. La connaissance des voies de signalisation a permis de mettre en évidence leur rôle crucial tant dans l'homéostase des tissus sains que dans des processus pathologiques comme l'oncogenèse. Parmi une vingtaine de voie de signalisation, la voie de signalisation des «MAPKinases » est une des plus importantes et a été montrée pour participer à diverses fonctions cellulaires telles que la différentiation, la motilité, la division et la mort cellulaire. La voie de signalisation des « MAPKinases » est typiquement constituée d'un module de trois kinases qui s'activent séquentiellement par phosphorylation. On note la présence d'une MAPK, d'un activateur de MAPK et d'un activateur de l'activateur de MAPK. Une fois la MAPK activée, elle permettra la régulation de différentes cibles dont certain facteur de transcription. Chez les mammifères, il existe 3 grands groupes de MAPKs : the extracellular signal-regulated kinase 1 and 2 (ERK 1/2) cascade, qui régule préférentiellement la croissance et la différentiation cellulaire, ainsi que les cascades JNK et p38 qui régulent préférentiellement la réponse à différents stress cellulaires telle que l'inflammation ou l'apoptose. JNK est activé par différents stress cellulaire telle que les cytokines inflammatoires. JNK est également requis au cours du développement embryonnaire et contribue à la mort (apoptose) ou à la prolifération cellulaire. Plusieurs études ont mis en évidence le rôle de JNK durant le processus tumoral, sans que son rôle soit clairement identifié. JNK pourrait avoir des fonctions différentes durant l'initiation puis de la progression tumorale. Chez les mammifères, les voies de signalisation intracellulaires forment un réseau complexe et elles interagissent entre elles, ce qui permet aux cellules une réponse adéquate aux multitudes de stimuli existants dans les organismes pluricellulaires. Parmi plusieurs mécanismes de régulation, les protéines dites « scaffold » ou «échafaud » jouent un rôle crucial dans l'homéostase de la voie de signalisation des «MAPKinase ». L'introduction revoit brièvement ces différents aspects, de la voie de signalisation des «MAPKinase et des connaissance sur IB1/JIP-1. Les premières études effectuées sur IB1/JIP-1 ont montré une expression relativement spécifique de cette protéine dans certains types de neurones ainsi que dans la cellule beta-sécrétrice d'insuline. IB1/JIP-1 régule la voie de signalisation JNK par interaction avec les différents composants du module, modifiant ainsi le spectre de substrats activés par JNK. La fonction précise de IB1/JIP-1 n'était pas encore élucidée, mais plusieurs travaux mettaient en lumière un rôle dans la régulation, et la sous-location cellulaire des composants de la voie de signalisation JNK, ainsi que dans la survie cellulaire à certain stress. Cette expression relativement spécifique est intrigante car elle suggère que sa présence serait nécessaire à une régulation spécifique de la MAPKinase JNK ou à certaines autres fonctions cellulaires également spécifiques de certains tissus. Le premier but de ce travail a consisté à mettre en évidence l'expression de IB1/JIP-1 dans l'appareil uro-génital et plus particulièrement dans la vessie et la prostate. Nos résultats ont montré que IB1/JIP-1 est spécifiquement exprimé au niveau de l'urothélium vésical, mais pas dans le muscle lisse. Il en est de même au niveau de la prostate où IB1/JIP-1 est exprimé spécifiquement au niveau de l'épithélium sécrétoire et absent au niveau du stroma fibro-musculaire. La vessie et la prostate sont des organes ou l'activité JNK pourrait être crucial tant dans l' homeostase tissulaire que dans le développement de pathologies bénignes ou malignes. La vessie et la prostate sont le siège fréquent de tumeur. La base pour le développement du cancer est complexe et implique plusieurs anomalies génétiques. Ce processus complexe lié au développement tumoral est encore loin d`être complètement élucidé, raison pour laquelle il est crucial de poursuivre l'étude des différents gènes pouvant être impliqué dans ces processus ou pouvant être utilisé comme outil thérapeutique. Dans l'urothelium de la vessie, la fonction de la MAPK JNK n'a été que très peu étudiée. Il existe quelques études, in vitro, suggérant une implication possible de cette voie de signalisation dans des processus telle que le développement ou la progression tumorale. Le chapitre 1 décrit une étude in vivo dans la vessie un modèle de stress mécanique, connu pour activer les MAPKinase. La dilatation vésicale, due à une obstruction urétrale, a mis en évidence une diminution de l'expression de IB1/JIP-1 ainsi qu'une activation de la MAPKinase JNK. Dans ce modèle, la régulation de IB1/JIP-1, par l'intermédiaire d'un vecteur viral, a permis de démontrer que IB1/JIP-1 régulait l'activité de JNK dans ce tissu. Pour poursuivre l'étude de cette fonction d' IB1/JIP-1 dans l'urothélium, nous avons investigué l'activité JNK dans des souris génétiquement modifiées et porteuse d'une délétion de 1 des 2 allèles du gène codant pour IB1/JIP-1, avec un contenu en IB1/JIP-1 diminué de moitié. L'activation de JNK est également augmentée dans l'urothelium au repos de ces souris, ce qui confirme la fonction régulatrice de JNK par IB1/JIP-1. Ces résultats ont permis de mettre en évidence un rôle critique de celle-ci dans l'homéostase de I`urothelium et suggère une nouvelle cible pour réguler la voie de signalisation dans ce tissu. En outre, la modulation des niveaux d'expression d'IB1/JIP-1 dans la vessie, in vivo, par l'intermédiaire de vecteurs viraux s'est révélée réalisable et indique un moyen élégant pour développer une thérapie génique dans cet organe. Un autre élément de ce travail de thèse, révélée au chapitre 2, a été d'étudier la régulation dans la vessie de rat de la communication intercellulaire de type « GAP ». Les cellules adjacentes partagent des ions, messagers secondaires et des petits métabolites par l'intermédiaire de canaux intercellulaire qui forment les jonctions de type « GAP ». Ce type de communications intercellulaire permet une activité cellulaire coordonnée, une caractéristique importante pour l'homéostase des organismes multicellulaire. Ce type de communication intercellulaire est formé de 2 demi-canaux appelés connexons. Chaque connexon est formé de six protéines appelées connexins (Cx). Il existe environ vingt connexines différentes nommées par leur poids moléculaire respectif. Les jonctions de type canaux "GAP" permettent aux cellules de communiquer avec les cellules voisines au quelles elles sont mécaniquement ou électriquement couplées. La vessie peut être particulièrement dépendante de la communication intercellulaire par les canaux « Gap » qui permettrait de coordonner la réponse de la musculature ainsi que de l'urothélium à l'augmentation de la pression transmurale du à l'accumulation d'urine, situation fréquemment observée dans le cadre de l'hyperplasie bénigne de la prostate. Dans la vessie de rat, la connexine26 est exprimée uniquement dans l'urothelium. La Cx26, a été montrée pour être un possible « tumor suppressor gene » dans le cancer de vessie. Une augmentation de la Cx26 ainsi que du couplage des cellules urothéliales a été démontré dans notre modèle de stress mécanique sur la vessie de rat et est dépendante de 2 éléments de réponses connues pour interagir avec AP-1. La régulation de IB1/JIP-1 a permis de montrer que celle-ci régulait l'activité JNK, ainsi que l'activité du facteur de transcription AP-1, composé de c-Jun lui-même cible de JNK. Cette réduction de l'activité de AP-1 est associée à une diminution de l'expression du transcipt de la Cx26. En résumé, la Cx26 pourrait être régulée par le complexe AP-1 lui-même dépendant du contenu en IB1/JIP-1. Dans le chapitre 3, l'étude de IB1/J1P-1 s'est portée sur la prostate. Cet organe, siège fréquent de pathologie telle que le cancer ou l'hyperplasie bénigne de la prostate, exprime IB1/JIP-1 au niveau de son épithélium sécrétoire. Cette expression est maintenue dans une lignée cellulaire humaine largement étudiée est reconnue comme un modèle adéquat de cellules tumorales de type androgène-sensible. IB1/JIP-1 a été investigué dans un modèle in vitro d'apoptose en réponse à un agent appelé N-(4-hydroxyphenyl)retinamide (4-HPR) qui induit une activation de la MAPK JNK ainsi que également un diminution du contenu en IB1/JIP-1. La surexpression de IB1/JIP-1 en utilisant à nouveau des virus comme vecteur a démontré que IB1/JIP-1 était capable de réguler l'activité de JNK ainsi que les taux d'apoptose. Dans le cancer de la prostate, certains travaux ont montré que la différentiation neuroendocrine des cellules tumorales est associée à la progression tumorale et à la perte de sensibilité aux androgènes. Ce travail a permis de dévoiler l'augmentation d'expression de IB1/JIP-1 dans un modèle de neurodifferentiation des cellules d'une lignée prostatique humaine (LNCaP). Les mécanismes qui permettent une expression spécifique de IB1/JIP-1 ont été partiellement investiguée dans notre laboratoire. Son promoteur humain contient un « Neuron Restricive Silencer Element » (NRSE) connu pour se lier a répresseur transcriptionel appelé « RE-1 Silencer Transcription Factor » ou « Neuron Restrictive Silencer Factor » (REST/NRSF). NRSF/REST est capable de réprimer l'expression de gènes neuronaux en dehors du système neuronal. Il prend part à la différentiation terminale des gènes neuronaux. Dans le chapitre 3, on observe que l'activité de REST/NRSF est diminuée dans les cellules LNCaP qui se transdifferencient de manière neuroendocrine, et que REST/NRSF est capable de moduler l'expression de ces gènes cibles dans ce type cellulaire. Ces travaux laissent suggérer que NRSF/REST participe à l'acquisition du phénotype neuroendocrinien et pourrait être une cible pour réguler ce phénomène. En conclusion, ce travail de thèse présente l'expression de IB1/JIP-1 dans 2 organes de l'appareil uro-génital ; la vessie et la prostate. La fonction de IB1/JIP-1 a été étudiée in vivo dans la vessie de rat, ce qui a mis en évidence sa fonction régulatrice de l'activité de la MAPKinase JNK, et de l'activité du facteur de transcription AP-1 ; ainsi que sa possible implication régulatrice de gène cible tel que la Connexin 26 (Cx26). AP-1 et la Cx26 pourraient jouer un rôle dans le processus oncologique, tant dans le control de l'invasion cellulaire ou le control de la croissance cellulaire. Dans la prostate, IB1/JIP-1 régule également l'activité JNK; crucial dans la transmission de certains stimulis pro-apoptotiques. Dans un modèle de transdifférenciation neuroendocrinienne, phénotype possiblement lié au caractère agressif du cancer de la prostate, l'expression de IB1/JIP-1 est augmenté, suggérant soit un rôle possible dans le développement du phénotype neuronal ou une implication dans une fonction anti-apoptotique. Ce travail a donc permis d'élargir nos connaissances sur la régulation et le control de la voie de signalisation des MAPKinases par IB1/JIP-1, qui pourrait avoir encore d'autres fonctions dans ces tissus.

A study of the translational regulation exerted by some neuroactive substances on the expression of the monocarboxylate transporter MCT2 in cultured cortical neurons

Summary of the thesis Glucose has been considered the major, if not the exclusive, energy substrate for the brain. But under certain conditions other substrates, namely monocarboxylates (lactate, pyruvate, and ketone bodies), can contribute significantly to satisfy brain energy demands. These monocarboxylates need to be transported across the blood brain barrier as well as out of astrocytes into the extracellular space and taken up into neurons. It has been shown that monocarboxylates are transported by a family of proton-linked transporters called monocarboxylate transporters (MCTs). In the central nervous system, MCT2 is the predominant neuronal form and little is known about the regulation of its expression. The neurotransmitter noradrenaline (NA) was shown previously to enhance the expression of MCT2 in cultured cortical neurons via a translational mechanism. Here, we demonstrate that two other substances, namely, insulin and IGF-1 enhance MCT2 protein expression in cultured mouse cortical neurons in a time- and concentrationdependent manner without affecting MCT2 mRNA levels. This result confirmed that MCT2 protein expression is translationally regulated and extend the observation to different types of neuroactive substances. Then we sought to determine by which signaling pathway(s) NA, insulin and IGF-1 can induce MCT2 protein expression. First, we observed by Western blot that all three substances cause activation of the MAP kinase ERK as well as the kinase Akt via their phosphorylation. Moreover, the mTOR/S6K pathway which is known to play an important role in translation initiation regulation was also strongly stimulated by all three substances. Second, we sought to determine the implication of these signaling pathways on the NA-, insulin- and IGF-1-induced enhancement of MCT2 protein expression and used specific inhibitors of these signaling pathways. We observed that the Pia kinase and mTOR inhibitors LY294002 and rapamycin respectively, strongly prevent the enhancement. of MCT2 expression caused by either NA, insulin ar IGF-1. In contrast, the MEK inhibitor PD98059 and the p38 MAP kinase inhibitor SB202190 had only a slight effect on the enhancement of MCT2 expression in all three cases. These results suggest that NA, insulin and IGF-1 regulate MCT2 protein expression by a common mechanism most likely involving the Akt/PKB pathway and translational activation via mTOR. In conclusion, considering the roles of NA, insulin and IGF-1 in synaptic plasticity, the tight translational regulation of MCT2 expression by these substances may represent a common mechanism through which supply of potentiated synapses with nonglucose energy substrates can be adapted to the level of activity. Résumé du travail de thèse Le glucose représente le substrat énergétique majeur pour le cerveau. Cependant, dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques, le cerveau a la capacité d'utiliser des substrats énergétiques appartenant à la classe des monocarboxylates (lactate, pyruvate et corps cétoniques) afin de satisfaire ses besoins énergétiques. Ces monocarboxylates doivent être transportés à travers la barrière hématoencéphalique mais aussi hors des astrocytes vers l'espace extracellulaire puis re-captés par les neurones. Leur transport est assuré par une famille de transporteurs spécifiques, protons-dépendants, appelés transporteurs aux monocarboxylates (MCTs). Dans le système nerveux central, les neurones expriment principalement l'isoforme MCT2 mais peu d'informations sont disponibles concernant la régulation de son expression. Il a été montré que le neurotransmetteur noradrénaline (NA) augmente l'expression de MCT2 dans les cultures de neurones corticaux de souris par le biais d'un mécanisme de régulation traductionnel. La présente étude nous a permis de démontrer que deux autres substances, l'insuline et 17GF-1, induisent une augmentation de la protéine MCT2 dans ces mêmes cultures selon un décours temporel et une gamme de concentrations particulière. Etonnamment, aucun changement n'a été observé concernant les niveaux d'ARNm de MCT2. Ce résultat .confirme que la protéine MCT2 est régulée de manière traductionnelle et révèle que différentes substances neuro-actives peuvent réguler l'expression de MCT2. Compte tenu de ces observations, nous avons voulu déterminer par quelle(s) voie(s) de signalisation la NA, l'insuline et l'IGF-1 exercent leur effet sur l'expression de MCT2. Dans un premier temps, nous avons pu observer par Western blot que ces trois substances activent la MAP kinase ERK ainsi que la kinase Akt via leur phasphorylation. De plus, la voie mTOR/S6K, connue pour son implication dans la régulation de l'initiation de la traduction est aussi fortement activée par ces trois substances. Dans un second temps, nous avons voulu déterminer I implication de chacune de ces voies de signalisation dans l'augmentation de l'expression de la protéine MCT2 observée après stimulation à la NA, à l'insuline et à l'IGF-1. Pour ce faire, nous avons utilisé des inhibiteurs spécifiques de chacune de ces voies. (Vous avons observé que les inhibiteurs des voies PI3 kinase et mTOR (LY294002 et rapamycin respectivement), prévenaient fortement l'augmentation de l'expression de MCT2 induite par la NA, l'insuline ou (IGF-1. A l'inverse, les inhibitions de la MAP kinase .kinase MEK ainsi que de la MAP kinase p38 (par l'utilisation des inhibiteurs spécifiques PD98059 et SB202190 respectivement) n'ont eu qu'un léger effet dans ces mêmes conditions. Ces résultats suggèrent que la NA, 'l'insuline et I~GF-1 régulent l'expression de la protéine MCT2 par un mécanisme commun impliquant probablement la voie Akt/PKB et l'activation de la traduction via mTOR. En conclusion, considérant l'implication de la NA, de l'insuline et de I`IGF-1 dans la plasticité synaptique, le contrôle traductionnel étroit exercé par ces substances sur l'expression de MCT2 pourrait être un moyen d'alimenter en substrats énergétiques autres que le glucose les synapses activées et également d'adapter l'approvisionnement en substrats énergétiques au niveau d'activité. Résumé « grand public » Le cerveau est un organe qui réalise des tâches complexes nécessitant un apport important en énergie. La principale source d'énergie du cerveau est le glucose. Bien que le cerveau ne représente que 2% de la masse corporelle, il consomme à lui seul plus de 25% du glucose et 20% de l'oxygène provenant de la circulation sanguine. La nécessité d'un tel apport en énergie réside dans la nature -même du fonctionnement des milliards de neurones qui utilisent des signaux électriques et chimiques pour communiquer entre eux. Hormis l'utilisation massive du glucose comme source d'énergie, le cerveau est capable de consommer d'autres substrats énergétiques dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques. Les monocarboxylates (lactate, pyruvate et corps cétoniques) font partie de ces autres sources d'énergie. Contrairement au glucose, les monocarboxylates ne diffusent pas facilement de la circulation sanguine vers les neurones. Afin de pouvoir être consommés par les neurones, ils doivent être transportés par un système adapté. Ce sont des transporteurs appelés transporteurs aux monocarboxylates ou MCT qui permettent le passage de ces substrats énergétiques du sang vers les neurones. Le but de ce travail de thèse a été de comprendre comment est régulée l'expression de MCT2, l'un de ces transporteurs exprimé spécifiquement à la surface des neurones. Cette étude nous a permis de mettre en évidence que le neurotransmetteur noradrénaline ainsi que les hormones insuline et IGF-1 (insulinlike growth factor-1) sont capables d'induire une augmentation d'expression de MCT2 à la surface des neurones en culture. Nous avons ensuite voulu déterminer par quels mécanismes de signalisation ces substances agissent sur l'expression de MCT2. Nous avons pu observer que la surexpression de la protéine MCT2 est due à une augmentation d'activité traductionnelle (la traduction étant une des étapes qui permet la synthèse des protéines) induite par le biais d'une voie de signalisation particulière. En conclusion, lorsque la noradrénaline, l'insuline ou 17GF-1 agissent sur les neurones, la traduction de la protéine MCT2 est activée et on observe une augmentation de l'expression de MCT2. Ce mécanisme pourrait permettre d'augmenter l'apport énergétique au niveau des neurones en augmentant le nombre de transporteurs pour les substrats énergétiques que sont les monocarboxylates. D'un point de vue physiologique, cette régulation d'expression pourrait jouer un rôle primordial dans des situations d'apprentissage et de mémorisation. Sur le plan pathologique, cela pourrait permettre de prévenir les dommages causes aux neurones dans certains cas d'atteintes cérébrales.