Biosynthesis and uptake of copper nanoparticles by dead biomass of Hypocrea lixii isolated from the metal mine in the Brazilian Amazon Region

A biological system for the biosynthesis of nanoparticles (NPs) and uptake of copper from wastewater, using dead biomass of Hypocrea lixii was analyzed and described for the first time. The equilibrium and kinetics investigation of the biosorption of copper onto dead, dried and live biomass of fungus were performed as a function of initial metal concentration, pH, temperature, agitation and inoculum volume. The high biosorption capacity was observed for dead biomass, completed within 60 min of contact, at pH 5.0, temperature of 40 °C and agitation speed of 150 rpm with a maximum copper biosorption of 19.0 mg g(-1). The equilibrium data were better described using the Langmuir isotherm and kinetic analysis indicated that copper biosorption follows a pseudo-second-order model. The average size, morphology and location of NPs biosynthesized by the fungus were determined by scanning electron microscopy (SEM), energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS) and transmission electron microscopy (TEM). NPs were mainly spherical, with an average size of 24.5 nm, and were synthesized extracellularly. The X-ray diffraction (XRD) analysis confirms the presence of metallic copper particles. Infrared spectroscopy (FTIR) study revealed that the amide groups interact with the particles, which was accountable for the stability of NPs. This method further confirmed the presence of proteins as stabilizing and capping agents surrounding the copper NPs. These studies demonstrate that dead biomass of Hypocrea lixii provides an economic and technically feasible option for bioremediation of wastewater and is a potential candidate for industrial-scale production of copper NPs.

Synthesis of self-assembled tubes in direct conjugated porphyrin-gold nanohybrid solution

We report on the formation of self-assembled meso-tetrakis (p-sulfonatofenyl) porphyrin (H2 TPP'S POT. 4-''IND. 4') tubes stabilized by gold nanoparticles (NPs) in basic solution and on their spectroscopic chareterization. The role of the gold NPs in the aggregation dynamics of free-base sulfonated porphyrin (H2TPP'S POT. 4-''IND. 4') is also investigated. The direct conjugation of the gold NPs to the H2TPPS4 molecule quenches the fluorescence intensity, while absorption peaks are blue-shifted, indicating predominant H-type aggregation. It is observed that porphyrin molecules adsorbed on the surface of the gold NP interact and form tubes of maximum diameter ∼1.5 μm and length >100 μm. Steady-state and time-resolved spectroscopic techniques confirm nonradiative energy transfer from porphyrin to gold NP.

Charakterisierung und Einsatz poröser und unporöser Kieselgelpartikel in der Kapillar–Elektrochromatographie

Der Elektroosmotische Fluß (EOF) ist der Motor der Kapillarelektrochromatographie. Er ist abhängig von der Oberflächenladung, von dem Teilchendurchmesser der verwendeten Packungsmaterialien, von der Pufferkonzentration, von dem pH - Wert und von dem Anteil des organischen Lösemittels im Fließmittel. In dieser Arbeit wurde der Einfluß dieser Parameter untersucht. Das Zetapotential als Maß für die Ladungsdichte an der Oberfläche eignet sich zur Charakterisierung der Packungsmaterialien und der damit gepackten Kapillaren. Es wurden in dieser Arbeit _-Potentiale mehrerer chemisch modifizierter Kieselgele mit nativen Kieselgelen verglichen. Die pH-Abhängigkeit der _-Potentiale spiegelt sich im EOF wider.Chemisch modifizierte Kieselgele mit gemischtfunktionellen Gruppen oder Ionenaustauschergruppen zeigen ein großes Zeta – Potential ohne pH-Abhängigkeit. Wie experimentell gezeigt wurde, sind Kapillaren, die mit diesen Materialien gepackt wurden, nicht reproduzierbar in Bezug auf den EOF und die Effizienz der Trennung. Deswegen wurden in dieser Arbeit Additive zu dem Fließmittelgemisch gegeben, die die Ladung des Puffers erhöhen und damit den EOF beschleunigen sollen. Durch dynamisches Benetzen der Oberfläche, durch Micellenbildung und durch Addukte mit den Analyten können diese Additive die Selektivität der Trenung beeinflussen, wie am Beispiel mehrerer Testgemische gezeigt wurde, die Geschwindigkeit des EOF bleibt davon unberührt. Kapillaren, die mit porösen und unporösen Kieselgelen gepackt wurden, verhalten sich in der CEC gleich: bei niedrigen pH-Werten und niedrigen Pufferkonzentrationen werden die kleinsten Bodenhöhen und die größten EOF – Geschwindigkeiten gemessen. Das Minimum der H vs u Kurven liegt für CEC – Kapillaren mit porösen 3 µm - Materialien (Hypersil ODS) bei dem Zwei- bis Dreifachen (H ª 2 - 3 dp), mit unporösen 3 µm - Materialien (MICRA NPS ODS) bei dem Doppelten (H ª 2 dp) und mit unporösen 1,5 µm - Materialien (MICRA NPS ODS) bei dem Eineinhalbfachen (H ª 1,5 µm) des mittleren Teilchendurchmessers, d.h es ergibt sich für kleinere Teilchendurchmesser eine höhere Effizienz. Kapillaren mit unporösen Teilchen haben ein geringeres Totvolumen als mit porösen Teilchen gefüllte, deshalb scheint der EOF besonders schnell zu sein. Trennungen auf Kapillaren, die mit unporösen Teilchen gefüllt sind, erweisen sich als besonders schnell, da der geringe Kohlenstoffgehalt eine schnelle Einstellung des Verteilungsgleichgewichts bewirkt. Fließmittel mit einem hohen Anteil an polaren organischen Lösemitteln (Acetonitril bzw. Methanol) machen diesen Vorteil zunichte, die Analyten werden nicht getrennt.Aus mehreren kommerziell erwerbbaren Komponenten wurde ein Instrument aufgebaut, das sich als Kapillar Elektrophorese, als Kapillar Elektrochromatographie, als µ-HPLC und als spannungsunterstützte µ-HPLC verwenden läßt. Dieses Gerät eignet sich besonders zur Kombination der CEC mit der µ-HPLC, die man vielleicht spannungsunterstützte µ-HPLC nennen darf. Mit diesem Gerät konnte der Einfluß des elektrischen Feldes auf den EOF gemessen werden, da mit wesentlich kürzeren gepackten Kapillaren gearbeitet werden kann. Der EOF, wie er aus der CEC bekannt ist, kann in der spannungsunterstützten µ-HPLC neben dem hydrodynamischen Fluß nachgewiesen werden. Beide Effekte arbeiten neben einander, damit lassen sich hydrodynamisch betriebene Anlagen mit elektrokinetisch betriebenen koppeln. Das scheint auf den ersten Blick ein Schritt zurück zu sein, bietet jedoch ungeahnte Möglichkeiten für die Zukunft, da die geringen Flüsse, die man zum Betreiben dieser Anlagen braucht, mit modernen Spritzenpumpen leicht handhabbar sind. Die Vorteile dieses Systems zeigen sich in dem geringen Fließmittelverbrauch, dem geringen Probenmengenbedarf, der hohen Selektivität und dem universellen Einsatz.

Strategies to identify and further characterize novel and known genes involved in regulation of skeletogenesis

372 osteochondrodysplasias and genetically determined dysostoses were reported in 2007 [Superti-Furga and Unger, 2007]. For 215 of these conditions, an association with one or more genes can be stated, while the molecular changes for the remaining syndromes remain illusive to date. Thus, the present dissertation aims at the identification of novel genes involved in processes regarding cartilage/ bone formation, growth, differentiation and homeostasis, which may serve as candidate genes for the above mentioned conditions. Two different approaches were undertaken. Firstly, a high throughput EST sequencing project from a human fetal cartilage library was performed to identify novel genes in early skeletal development (20th week of gestation until 2nd year of life) that could be investigated as potential candidate genes. 5000 EST sequences were generated and analyzed representing 1573 individual transcripts, corresponding to known (1400) and to novel, yet uncharacterized genes (173). About 7% of the proteins were already described in cartilage/ bone development or homeostasis, showing that the generated library is tissue specific. The remaining profile of this library was compared to previously published libraries from different time points (8th–12th, 18th–20th week and adult human cartilage) that also showed a similar distribution, reflecting the quality of the presented library analyzed. Furthermore, three potential candidate genes (LRRC59, CRELD2, ZNF577) were further investigated and their potential involvement in skeletogenesis was discussed. Secondly, a disease-orientated approach was undertaken to identify downstream targets of LMX1B, the gene causing Nail-Patella syndrome (NPS), and to investigate similar conditions. Like NPS, Genitopatellar syndrome (GPS) is characterized by aplasia or hypoplasia of the patella and renal anomalies. Therefore, six GPS patients were enrolled in a study to investigate the molecular changes responsible for this relatively rare disease. A 3.07 Mb deletion including LMX1B and NR5A1 (SF1) was found in one female patient that showed features of both NPS and GPS and investigations revealed a 46,XY karyotype and ovotestes indicating true hermaphroditism. The microdeletion was not seen in any of the five other patients with GPS features only, but a potential regulatory element between the two genes cannot be ruled out yet. Since Lmx1b is expressed in the dorsal limb bud and in podocytes, proteomic approaches and expression profiling were performed with murine material of the limbs and the kidneys to identify its downstream targets. After 2D-gel electrophoresis with protein extracts from E13.5 fore limb buds and newborn kidneys of Lmx1b wild type and knock-out mice and mass spectrometry analysis, only two proteins, agrin and carbonic anhydrase 2, remained of interest, but further analysis of the two genes did not show a transcriptional down regulation by Lmx1b. The focus was switched to expression profiles and RNA from newborn Lmx1b wild type and knock-out kidneys was compared by microarray analysis. Potential Lmx1b targets were almost impossible to study, because of the early death of Lmx1b deficient mice, when the glomeruli, containing podocytes, are still immature. Because Lmx1b is also expressed during limb development, RNA from wild type and knock-out Lmx1b E11.5 fore limb buds was investigated by microarray, revealing four potential Lmx1b downstream targets: neuropilin 2, single-stranded DNA binding protein 2, peroxisome proliferative activated receptor, gamma, co-activator 1 alpha, and short stature homeobox 2. Whole mount in situ hybridization strengthened a potential down regulation of neuropilin 2 by Lmx1b, but further investigations including in situ hybridization and protein-protein interaction studies will be needed.

Functional hydrogels: ferrogel thin films

Die Kombination magnetischer Nanopartikel (NP) mit temperatursensitiven Polymeren führt zur Bildung neuer Komposit-Materialien mit interessanten Eigenschaften, die auf vielfältige Weise genutzt werden können. Mögliche Anwendungsgebiete liegen in der magnetischen Trennung, der selektiven Freisetzung von Medikamenten, dem Aufbau von Sensoren und Aktuatoren. Als Polymerkomponente können z.B. Hydrogele dienen. Die Geschwindigkeit der Quellgradänderung mittels externer Stimuli kann durch eine Reduzierung des Hydrogelvolumens erhöht werden, da das Quellen ein diffusionskontrollierter Prozess ist. rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde ein durch ultraviolettes Licht vernetzbares Hydrogel aus N-isopropylacrylamid, Methacrylsäure und dem Vernetzer 4-Benzoylphenylmethacrylat hergestellt (PNIPAAm-Hydrogel) und mit magnetischen Nanopartikeln aus Magnetit (Fe3O4) kombiniert. Dabei wurde die Temperatur- und die pH-Abhängigkeit des Quellgrades im Hinblick auf die Verwendung als nanomechanische Cantilever Sensoren (NCS) untersucht. Desweiteren erfolgte eine Charakterisierung durch Oberflächenplasmonen- und optischer Wellenleitermoden-Resonanz Spektroskopie (SPR/OWS). Die daraus erhaltenen Werte für den pKa-Wert und die lower critical solution Temperatur (LCST) stimmten mit den bekannten Literaturwerten überein. Es konnte gezeigt werden, dass eine stärkere Vernetzung zu einer geringeren LCST führt. Die Ergebnisse mittels NCS wiesen zudem auf einen skin-effect während des Heizens von höher vernetzten Polymeren hin.rnDie Magnetit Nanopartikel wurden ausgehend von Eisen(II)acetylacetonat über eine Hochtemperaturreaktion synthetisiert. Durch Variation der Reaktionstemperatur konnte die Größe der hergestellten Nanopartikel zwischen 3.5 und 20 nm mit einer Größenverteilung von 0.5-2.5 nm eingestellt werden. Durch geeignete Oberflächenfunktionalisierung konnten diese in Wasser stabilisiert werden. Dazu wurde nach zwei Strategien verfahren: Zum einen wurden die Nanopartikel mittels einer Silika-Schale funktionalisiert und zum anderen Zitronensäure als Tensid eingesetzt. Wasserstabilität ist vor allem für biologische Anwendungen wünschenswert. Die magnetischen Partikel wurden mit Hilfe von Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), und superconductive quantum interference device (SQUID) charakterisiert. Dabei wurde eine Größenabhängigkeit der magnetischen Eigenschaften sowie superparamagnetisches Verhalten beobachtet. Außerdem wurde die Wärmeerzeugung der magnetischen Nanopartikel in einem AC Magnetfeld untersucht. rnDie Kombination beider Komponenten in Form eines Ferrogels wurde durch Mischen Benzophenon funktionalisierter magnetischer Nanopartikel mit Polymer erreicht. Durch Aufschleudern (Spin-Coaten) wurden dünne Filme erzeugt und diese im Hinblick auf ihr Verhalten in einem Magnetfeld untersucht. Dabei wurde eine geringes Plastikverhalten beobachtet. Die experimentellen Ergebnisse wurden anschließend mit theoretisch berechneten Erwartungswerten verglichen und mit den unterschiedlichen Werten für dreidimensionale Ferrogele in Zusammenhang gestellt. rn

Synthesis and surface modification of silver and gold nanoparticles. Nanomedicine applications against Glioblastoma Multiforme.

In the last decades noble metal nanoparticles (NPs) arose as one of the most powerful tools for applications in nanomedicine field and cancer treatment. Glioblastoma multiforme (GBM), in particular, is one of the most aggressive malignant brain tumors that nowadays still presents a dramatic scenario concerning median survival. Gold nanorods (GNRs) and silver nanoparticles (AgNPs) could find applications such as diagnostic imaging, hyperthermia and glioblastoma therapy. During these three years, both GNRs and AgNPs were synthesized with the “salt reduction” method and, through a novel double phase transfer process, using specifically designed thiol-based ligands, lipophilic GNRs and AgNPs were obtained and separately entrapped into biocompatible and biodegradable PEG-based polymeric nanoparticles (PNPs) suitable for drug delivery within the body. Moreover, a synergistic effect of AgNPs with the Alisertib drug, were investigated thanks to the simultaneous entrapment of these two moieties into PNPs. In addition, Chlorotoxin (Cltx), a peptide that specifically recognize brain cancer cells, was conjugated onto the external surface of PNPs. The so-obtained novel nanosystems were evaluated for in vitro and in vivo applications against glioblastoma multiforme. In particular, for GNRs-PNPs, their safety, their suitability as optoacoustic contrast agents, their selective laser-induced cells death and finally, a high tumor retention were all demonstrated. Concerning AgNPs-PNPs, promising tumor toxicity and a strong synergistic effect with Alisertib was observed (IC50 10 nM), as well as good in vivo biodistribution, high tumor uptake and significative tumor reduction in tumor bearing mice. Finally, the two nanostructures were linked together, through an organic framework, exploiting the click chemistry azido-alkyne Huisgen cycloaddition, between two ligands previously attached to the NPs surface; this multifunctional complex nanosystem was successfully entrapped into PNPs with nanoparticles’ properties maintenance, obtaining in this way a powerful and promising tool for cancer fight and defeat.

Interactions of inhaled nanoparticles with the alveolar-capillary barrier of the human respiratory tract

In dieser Arbeit wurden zytotoxische Effekte sowie die inflammatorische Reaktionen des distalen respiratorischen Traktes nach Nanopartikelexposition untersucht. Besondere Aufmerksamkeit lag auch auf der Untersuchung unterschiedlicher zellulärer Aufnahmewege von Nanopartikeln wie z.B. Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose oder auch Clathrin- und Caveolae-unabhängige Endozytose (mit möglicher Beteiligung von Flotillinen). Drei unterschiedliche Nanopartikel wurden hierbei gewählt: amorphes Silica (aSNP), Organosiloxan (AmorSil) und Poly(ethyleneimin) (PEI). Alle unterschiedlichen Materialien gewinnen zunehmend an Interesse für biomedizinische Forschungsrichtungen (drug and gene delivery). Insbesondere finden aSNPs auch in der Industrie vermehrt Anwendung, und stellen somit ein ernstzunehmendes Gesundheitsrisiko dar. Dieser wird dadurch zu einem begehrten Angriffsziel für pharmazeutische Verabreichungen von Medikamenten über Nanopartikel als Vehikel aber bietet zugleich auch eine Angriffsfläche für gesundheitsschädliche Nanomaterialien. Aus diesem Grund sollten die gesundheitsschädigenden Risiken, sowie das Schicksal von zellulär aufgenommenen NPs sorgfältig untersucht werden. In vivo Studien an der alveolaren-kapillaren Barriere sind recht umständlich. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit ein Kokulturmodel benutzt, dass die Alveolar-Kapillare Barrier in vivo nachstellt. Das Model besteht aus dem humanen Lungenepithelzelltyp (z.B. NCI H441) und einem humanen microvasculären Endothelzelltyp (z.B. ISO-HAS-1), die auf entgegengesetzten Seiten eines Transwell-Filters ausgesät werden und eine dichte Barriere ausbilden. Die NP Interaktion mit Zellen in Kokultur wurde mit denen in konventioneller Monokultur verglichen, in der Zellen 24h vor dem Experiment ausgesät werden. Diese Studie zeigt, dass nicht nur die polarisierte Eigenschaft der Zellen in Kokultur sondern auch die unmittelbare Nähe von Epithel und Endothelzelle ausschlaggebend für durch aSNPs verursachte Effekte ist. Im Hinblick auf inflammatorische Marker (sICAM, IL-6, IL8-Ausschüttung), reagiert die Kokultur auf aSNPs empfindlicher als die konventionelle Monokultur, wohingegen die Epithelzellen in der Kokultur auf zytotoxikologischer Ebene (LDH-Ausschüttung) unempfindlicher auf aSNPs reagierten als die Zellen in Monokultur. Aufnahmestudien haben gezeigt, dass die Epithelzellen in Kokultur entschieden weniger NPs aufnehmen. Somit zeigen die H441 in der Kokultur ähnliche epitheliale Eigenschaften einer schützenden Barriere, wie sie auch in vivo zu finden sind. Obwohl eine ausreichende Aufnahme von NPs in H441 in Kokultur erreicht werden konnte, konnte ein Transport von NPs durch die epitheliale Schicht und eine Aufnahme in die endotheliale Schicht mit den gewählten Inkubationszeiten nicht gezeigt werden. Eine Clathrin- oder Caveolae-vermittelte Endozytose von NPs konnte mittels Immunfluoreszenz weder in der Mono- noch in der Kokultur nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich eine Akkumulation von NPs in Flotillin-1 und-2 enthaltende Vesikel in Epithelzellen aus beiden Kultursystemen. Ergebnisse mit Flotillin-inhibierten (siRNA) Epithelzellen, zeigten eine deutlich geringere Aufnahme von aSNPs. Zudem zeigte sich eine eine reduzierte Viabilität (MTS) von aSNP-behandelten Zellen. Dies deutet auf eine Beteiligung von Flotillinen an unbekannten (Clathrin oder Caveolae -unabhängig) Endozytosemechanismen und (oder) endosomaler Speicherung. Zusammenfassend waren die Aufnahmemechanismen für alle untesuchten NPs in konventioneller Monokultur und Kokultur vergleichbar, obwohl sich die Barriereeigenschaften deutlich unterscheiden. Diese Arbeit zeigt deutlich, dass sich die Zellen in Kokultur anders verhalten. Die Zellen erreichen hierbei einen höheren Differenzierungsgrad und eine Zellkommunikation mit anderen relevanten Zelltypen wird ermöglicht. Durch das Einbringen eines dritten relevanten Zelltyps in die Kokultur, des Alveolarmakrophagen (Zelllinie THP-1), welcher die erste Verteidigungsfront im Alveolus bildet, wird diese Aussage weiter bekräftigt. Erste Versuche haben gezeigt, dass die Triplekultur bezüglich ihrer Barriereeigenschaften und IL-8-Ausschüttung sensitiver auf z.B. TNF- oder LPS-Stimulation reagiert als die Kokultur. Verglichen mit konventionellen Monokulturen imitieren gut ausgebildete, multizelluräre Kokulturmodelle viel präziser das zelluläre Zusammenspiel im Körper. Darum liefern Nanopartikelinteraktionen mit dem in vitro-Triplekulturmodel aufschlussreichere Ergebnisse bezüglich umweltbedingter oder pharmazeutischer NP-Exposition in der distalen Lung als es uns bisher möglich war.

Impact of metal and metal oxide engineered nanoparticles in soil and plant systems

Nanotechnology promises huge benefits for society and capital invested in this new technology is steadily increasing, therefore there is a growing number of nanotechnology products on the market and inevitably engineered nanomaterials will be released in the atmosphere with potential risks to humans and environment. This study set out to extend the comprehension of the impact of metal (Ag, Co, Ni) and metal oxide (CeO2, Fe3O4, SnO2, TiO2) nanoparticles (NPs) on one of the most important environmental compartments potentially contaminated by NPs, the soil system, through the use of chemical and biological tools. For this purpose experiments were carried out to simulate realistic environmental conditions of wet and dry deposition of NPs, considering ecologically relevant endpoints. In detail, this thesis involved the study of three model systems and the evaluation of related issues: (i) NPs and bare soil, to assess the influence of NPs on the functions of soil microbial communities; (ii) NPs and plants, to evaluate the chronic toxicity and accumulation of NPs in edible tissues; (iii) NPs and invertebrates, to verify the effects of NPs on earthworms and the damaging of their functionality. The study highlighted that NP toxicity is generally influenced by NP core elements and the impact of NPs on organisms is specie-specific; moreover experiments conducted in media closer to real conditions showed a decrease in toxicity with respect to in vitro test or hydroponic tests. However, only a multidisciplinary approach, involving physical, chemical and biological skills, together with the use of advanced techniques, such as X-ray absorption fine structure spectroscopy, could pave the way to draw the right conclusions and accomplish a deeper comprehension of the effects of NPs on soil and soil inhabitants.

Design of nanoparticle systems with antimicrobial properties

Infektiöse Komplikationen im Zusammenhang mit Implantaten stellen einen Großteil aller Krankenhausinfektionen dar und treiben die Gesundheitskosten signifikant in die Höhe. Die bakterielle Kolonisation von Implantatoberflächen zieht schwerwiegende medizinische Konsequenzen nach sich, die unter Umständen tödlich verlaufen können. Trotz umfassender Forschungsaktivitäten auf dem Gebiet der antibakteriellen Oberflächenbeschichtungen ist das Spektrum an wirksamen Substanzen aufgrund der Anpassungsfähigkeit und Ausbildung von Resistenzen verschiedener Mikroorganismen eingeschränkt. Die Erforschung und Entwicklung neuer antibakterieller Materialien ist daher von fundamentaler Bedeutung.rnIn der vorliegenden Arbeit wurden auf der Basis von Polymernanopartikeln und anorganischen/polymeren Verbundmaterialien verschiedene Systeme als Alternative zu bestehenden antibakteriellen Oberflächenbeschichtungen entwickelt. Polymerpartikel finden Anwendung in vielen verschiedenen Bereichen, da sowohl Größe als auch Zusammensetzung und Morphologie vielseitig gestaltet werden können. Mit Hilfe der Miniemulsionstechnik lassen sich u. A. funktionelle Polymernanopartikel im Größenbereich von 50-500 nm herstellen. Diese wurde im ersten System angewendet, um PEGylierte Poly(styrol)nanopartikel zu synthetisieren, deren anti-adhesives Potential in Bezug auf P. aeruginosa evaluiert wurde. Im zweiten System wurden sog. kontakt-aktive kolloide Dispersionen entwickelt, welche bakteriostatische Eigenschaften gegenüber S. aureus zeigten. In Analogie zum ersten System, wurden Poly(styrol)nanopartikel in Copolymerisation in Miniemulsion mit quaternären Ammoniumgruppen funktionalisiert. Als Costabilisator diente das zuvor quaternisierte, oberflächenaktive Monomer (2-Dimethylamino)ethylmethacrylat (qDMAEMA). Die Optimierung der antibakteriellen Eigenschaften wurde im nachfolgenden System realisiert. Hierbei wurde das oberflächenaktive Monomer qDMAEMA zu einem oberflächenaktiven Polyelektrolyt polymerisiert, welcher unter Anwendung von kombinierter Miniemulsions- und Lösemittelverdampfungstechnik, in entsprechende Polyelektrolytnanopartikel umgesetzt wurde. Infolge seiner oberflächenaktiven Eigenschaften, ließen sich aus dem Polyelektrolyt stabile Partikeldispersionen ohne Zusatz weiterer Tenside ausbilden. Die selektive Toxizität der Polyelektrolytnanopartikel gegenüber S. aureus im Unterschied zu Körperzellen, untermauert ihr vielversprechendes Potential als bakterizides, kontakt-aktives Reagenz. rnAufgrund ihrer antibakteriellen Eigenschaften wurden ZnO Nanopartikel ausgewählt und in verschiedene Freisetzungssysteme integriert. Hochdefinierte eckige ZnO Nanokristalle mit einem mittleren Durchmesser von 23 nm wurden durch thermische Zersetzung des Precursormaterials synthetisiert. Durch die nachfolgende Einkapselung in Poly(L-laktid) Latexpartikel wurden neue, antibakterielle und UV-responsive Hybridnanopartikel entwickelt. Durch die photokatalytische Aktivierung von ZnO mittels UV-Strahlung wurde der Abbau der ZnO/PLLA Hybridnanopartikel signifikant von mehreren Monaten auf mehrere Wochen verkürzt. Die Photoaktivierung von ZnO eröffnet somit die Möglichkeit einer gesteuerten Freisetzung von ZnO. Im nachfolgenden System wurden dünne Verbundfilme aus Poly(N-isopropylacrylamid)-Hydrogelschichten mit eingebetteten ZnO Nanopartikeln hergestellt, die als bakterizide Oberflächenbeschichtungen gegen E. coli zum Einsatz kamen. Mit minimalem Gehalt an ZnO zeigten die Filme eine vergleichbare antibakterielle Aktivität zu Silber-basierten Beschichtungen. Hierbei lässt sich der Gehalt an ZnO relativ einfach über die Filmdicke einstellen. Weiterhin erwiesen sich die Filme mit bakteriziden Konzentrationen an ZnO als nichtzytotoxisch gegenüber Körperzellen. Zusammenfassend wurden mehrere vielversprechende antibakterielle Prototypen entwickelt, die als potentielle Implantatbeschichtungen auf die jeweilige Anwendung weiterhin zugeschnitten und optimiert werden können.

Uptake mechanism, intracellular trafficking and endo-lysosomal pH monitoring of polystyrene nanoparticles

What is the intracellular fate of nanoparticles (NPs) taken up by the cells? This question has been investigated for polystyrene NPs of different sizes with a set of molecular biological and biophysical techniques.rnTwo sets of fluorescent NPs, cationic and non-ionic, were synthesized with three different polymerization techniques. Non-ionic particles (132 – 846 nm) were synthesized with dispersion polymerization in an ethanol/water solution. Cationic NPs with 120 nm were synthesized by miniemulsion polymerization Particles with 208, 267 and 603 nm were produced by seeding the 120 nm particle obtained by miniemulsion polymerization with drop-wise added monomer and polymerization of such. The colloidal characterization of all particles showed a comparable amount of the surface groups. In addition, particles were characterized with regard to their size, morphology, solid content, amount of incorporated fluorescent dye and zeta potential. The fluorescent intensities of all particles were measured by fluorescence spectroscopy for calibration in further cellular experiments. rnThe uptake of the NPs to HeLa cells after 1 – 24 h revealed a much higher uptake of cationic NPs in comparison to non-ionic NPs. If the same amount of NPs with different sizes is introduced to the cell, a different amount of particles is present in the cell medium, which complicates a comparison of the uptake. The same conclusion is valid for the particles’ overall surface area. Therefore, HeLa cells were incubated with the same concentration, amount and surface area of NPs. It was found that with the same concentration always the same polymer amount is taking up by cells. However, the amount of particles taken up decreases for the biggest. A correlation to the surface area could not be found. We conclude that particles are endocytosed by an excavator-shovel like mechanism, which does not distinguish between different sizes, but is only dependent on the volume that is taken up. For the decreased amount of large particles, an overload of this mechanism was assumed, which leads to a decrease in the uptake. rnThe participation of specific endocytotic processes has been determined by the use of pharmacological inhibitors, immunocytological staining and immunofluorescence. The uptake of NPs into the endo-lysosomal machinery is dominated by a caveolin-mediated endocytosis. Other pathways, which include macropinocytosis and a dynamin-dependent mechanism but exclude clathrin mediated endocytosis, also occur as competing processes. All particles can be found to some extent in early endosomes, but only bigger particles were proven to localize in late endosomes. No particles were found in lysosomes; at least not in lysosomes that are labeled with Lamp1 and cathepsin D. However, based on the character of the performed experiment, a localization of particles in lysosomes cannot be excluded.rnDuring their ripening process, vesicles undergo a gradual acidification from early over late endosomes to lysosomes. It is hypothesized that NPs in endo-lysosomal compartments experience the same change in pH value. To probe the environmental pH of NPs after endocytosis, the pH-sensitive dye SNARF-4F was grafted onto amino functionalized polystyrene NPs. The pH value is a ratio function of the two emission wavelengths of the protonated and deprotonated form of the dye and is hence independent of concentration changes. The particles were synthesized by the aforementioned miniemulsion polymerization with the addition of the amino functionalized copolymer AEMH. The immobilization of SNARF-4F was performed by an EDC-coupling reaction. The amount of physically adsorbed dye in comparison to covalently bonded dye was 15% as determined by precipitation of the NPs in methanol, which is a very good solvent for SNARF-4F. To determine influences of cellular proteins on the fluorescence properties, a intracellular calibration fit was established with platereader measurements and cLSM imaging by the cell-penetrable SNARF-4F AM ester. Ionophores equilibrated the extracellular and intracellular pH.rnSNARF-4F NPs were taken up well by HeLa cells and showed no toxic effects. The pH environment of SNARF-4F NPs has been qualitatively imaged as a movie over a time period up to 1 h in pseudo-colors by a self-written automated batch program. Quantification revealed an acidification process until pH value of 4.5 over 24 h, which is much slower than the transport of nutrients to lysosomes. NPs are present in early endosomes after min. 1 h, in late endosomes at approx. 8 h and end up in vesicles with a pH value typical for lysosomes after > 24 h. We therefore assume that NPs bear a unique endocytotic mechanism, at least with regards to the kinetic involvedrn

Qualitative and absolute quantitative studies of the cell-nanoparticle interaction

This thesis focused on the polymer’s influence on the interaction of polymeric NPs with epithelial cells. Furthermore, the measurement of single submicron nanoparticles in a commercially available flow cytometer was established, to provide a new method in the toolbox for nanoparticle-cell studies. This gave way to develop a routine for the absolute quantification of intracellular NPs via flow cytometry. rnThe cellular uptake of poly(methyl methacrylate) (PMMA), polystyrene (PS) and poly(L-lactide) (PLLA) nanoparticles was investigated via flow cytometry. PLLA-NPs were internalized the most efficiently. But upon co-incubation of PS and PLLA particles with cells, the two particles mutually influenced their uptake, slightly shifting the relative uptake efficiencies. This phenomenon should be based on specific properties of the different polymer materials. The findings indicated a competition (which is strongly influenced by properties of the respective polymeric material) for the uptake into the cells, allegedly due to competition for specific coatings with serum components that enhances the NPs’ cellular uptake. The fluorescence of single 150 nm particles was determined with a benchtop cytometer, breaching the machine’s detection limit but yielding precise NP fluorescence standardization factors. Up to now, these standardization factors are mostly determined by spectroscopic analysis of the particles’ dye content. Finally a flow cytometric routine for absolute particle counting in cells was devised. This quantitation revealed a low uptake efficiency for un-functionalized PMMA NPs of less than 150 NPs (approx. 0,001 % of added) per cell.rn

Molekulare Mechanismen der Knochenmetastasierung des Nierenzellkarzinoms

Die schlechte Prognose des Nierenzellkarzinoms (NZK) kommt nicht durch den Primärtumor an sich zustande, sondern durch das Vorhandensein von Fernmetastasen. Obwohl bereits vieles über die Mechanismen der Metastasierung bekannt ist, sind die Hintergründe der Organspezifität metastasierender Tumorzellen weitgehend ungeklärt. In 30% der Fälle kommt es zur Entstehung von Knochenmetastasen. Diese hohe Frequenz deutet darauf hin, dass NZK-Zellen bevorzugt in dieses Organ metastasieren, da die Knochenmatrix ein günstiges Mikromilieu für ihr Wachstum bietet. Hierbei könnte extrazellulärem Calcium und dem für die Detektion zuständigen Calcium-sensitiven Rezeptor (CaSR) eine entscheidende Rolle zukommen, da sich Knochen durch ihren hohen Gehalt an Calcium auszeichnen und von anderen Organen unterscheiden. Das Ziel der vorliegenden Dissertation lag in der Aufklärung der Mechanismen, die zu einer Knochenmetastasierung des NZK führen.rnrnIn ersten Analysen konnte gezeigt werden, dass sich bereits der Primärtumor durch eine von Calcium unabhängige charakteristische Expression bestimmter Signalmediatoren auszeichnet, die Metastasierungspotenzial und –ort bestimmen. So wurden in Gewebeproben und primären Tumorzellen von NZK-Patienten, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie Knochenmetastasen entwickelten, in Westernblot-Analysen eine sehr hohe Expression der α5-Integrine, eine starke Aktivität von Akt, FAK und eine Reduktion der PTEN-Expression detektiert. Diese Veränderungen begünstigten die chemotaktische Migration in Richtung Fibronektin (bestimmt in einer Boyden-Kammer) und die Adhäsion dieser NZK-Zellen an Komponenten der Extrazellularmatrix (Fibronektin und Kollagen I – beides ist Bestandteil der Knochenmatrix). Migration und Adhäsion sind essentielle Schritte beim Austreten der Tumorzellen aus dem Primärtumor und Infiltration des Knochens. In NZK-Zellen von Patienten, die keine Metastasen oder Lungenmetastasen entwickelten, waren diese Charakteristika nicht oder deutlich schwächer ausgeprägt. Bestimmte Primärtumore sind somit prädestiniert Knochenmetastasen auszubilden.rnrnUm die Bedeutung von extrazellulärem Calcium und dem CaSR darzustellen, wurde die Expression des CaSR mittels Real-Time PCR, Westernblot-Analysen und durchflusszytometrisch in NZK-Gewebeproben und –Zellen von Patienten untersucht, die innerhalb von fünf Jahren nach Nephrektomie keine bzw. Lungen- oder Knochenmetastasen ausbildeten. Proben von Patienten mit Knochenmetastasen zeigten die stärkste Expression von CaSR-mRNA und CaSR-Protein. Durch eine Behandlung der NZK-Zellen mit Calcium in physiologischen Konzentrationen, konnte Calcium als möglicher Regulator der CaSR-Expression ausgeschlossen werden. Der Einfluss von Calcium auf die Metastasierungsfähigkeit der primären NZK-Zellen wurde anhand eines weiteren chemotaktischen Migrationsversuchs mit Calcium als Chemotaxin analysiert. Die Zellproliferationsrate konnte nach Behandlung der Zellen mit Calcium mittels BrdU-Inkorporation gemessen werden. NZK-Zellen, die aus dem Primärtumor von Patienten mit Knochenmetastasen kultiviert wurden, konnten durch eine erhöhte extrazelluläre Calcium-Konzentration verstärkt zu Migration und Proliferation (Konzentrations-abhängige Steigerung) angeregt werden. Diese stellen weitere essentielle Schritte bei der Infiltration und Vermehrung der NZK-Zellen in den Knochen dar. Die Effekte traten bei NZK-Zellen aus Patienten, die keine oder Lungenmetastasen ausbildeten, nicht auf. Die Identifizierung der beteiligten Signalwege erfolgte in Westernblot-Analysen und einem Phospho-Kinase Array. Hierdurch konnten eine verstärkte Aktivierung des Akt-, JNK-, p38α- und PLCγ-1-Signalwegs und eine beinahe vollständige Reduktion der PTEN-Expression nach Calcium-Behandlung in Knochen-metastasierenden NZK-Zellen aufgedeckt werden. Durch Blockierung des CaSR mittels des Inhibitors NPS 2143 konnte bestätigt werden, dass die metastasierungs-fördernde Wirkung von Calcium über den CaSR zustande kommt. rnrnNZK-Zellen zeichnen sich somit bereits im Primärtumor durch eine charakteristische Expression verschiedener Signalmediatoren aus, die ihr Metastasierungspotenzial und die mögliche Lokalisation der Metastase bestimmen. Gelangen metastasierende NZK-Zellen auf ihrem Weg durch den Blutkreislauf in das Knochenmilieu, verhilft ihnen hier eine hohe Expression des CaSR zu einem wichtigen Überlebensvorteil. Extrazelluläres Calcium wirkt über den CaSR, verstärkt ihre metastatischen Eigenschaften und fördert schließlich die Ausbildung einer Knochenmetastase. Aus diesem Grund kommt dem CaSR eine Rolle als möglicher prognostischer Marker hinsichtlich der Knochenmetastasierung beim NZK zu. Die Charakteristika des Primärtumors sollten daher die Auswahl des adjuvanten Therapeutikums und die Nachsorgeuntersuchungen beeinflussen. um die Medizin dem Ziel einer individualisierten Therapie näher zu bringen.rn

Tailoring properties and functionalities of TiO2 and Ag nanoparticles involved in surfaces engineering processes

The functionalization of substrates through the application of nanostructured coatings allows to create new materials, with enhanced properties. In this work, the development of self-cleaning and antibacterial textiles, through the application of TiO2 and Ag based nanostructured coatings was carried out. The production of TiO2 and Ag functionalized materials was achieved both by the classical dip-padding-curing method and by the innovative electrospinning process to obtain nanofibers doped with nano-TiO2 and nano-Ag. In order to optimize the production of functionalized textiles, the study focused on the comprehension of mechanisms involved in the photocatalytic and antibacterial processes and on the real applicability of the products. In particular, a deep investigation on the relationship between nanosol physicochemical characteristics, nanocoating properties and their performances was accomplished. Self-cleaning textiles with optimized properties were obtained by properly purifying and applying commercial TiO2 nanosol while the studies on the photocatalytic mechanism operating in self-cleaning application demonstrated the strong influence of hydrophilic properties and of interaction surface/radicals on final performance. Moreover, a study about the safety in handling of nano-TiO2 was carried out and risk remediation strategies, based on “safety by design” approach, were developed. In particular, the coating of TiO2 nanoparticles by a SiO2 shell was demonstrated to be the best risk remediation strategy in term of biological response and preserving of photoreactivity. The obtained results were confirmed determining the reactive oxygen species production by a multiple approach. Antibacterial textiles for biotechnological applications were also studied and Ag-coated cotton materials, with significant anti-bacterial properties, were produced. Finally, composite nanofibers were obtained merging biopolymer processing and sol-gel techniques. Indeed, electrospun nanofibers embedded with TiO2 and Ag NPs, starting from aqueous keratin based formulation were produced and the photocatalytic and antibacterial properties were assessed. The results confirmed the capability of electrospun keratin nanofibers matrix to preserve nanoparticle properties.

Transport of nanoparticles into polymersomes : a minimal model system of particles passage through biological membranes

This thesis focuses on the design and characterization of a novel, artificial minimal model membrane system with chosen physical parameters to mimic a nanoparticle uptake process driven exclusively by adhesion and softness of the bilayer. The realization is based on polymersomes composed of poly(dimethylsiloxane)-b-poly(2-methyloxazoline) (PMDS-b-PMOXA) and nanoscopic colloidal particles (polystyrene, silica), and the utilization of powerful characterization techniques. rnPDMS-b-PMOXA polymersomes with a radius, Rh ~100 nm, a size polydispersity, PD = 1.1 and a membrane thickness, h = 16 nm, were prepared using the film rehydratation method. Due to the suitable mechanical properties (Young’s modulus of ~17 MPa and a bending modulus of ~7⋅10-8 J) along with the long-term stability and the modifiability, these kind of polymersomes can be used as model membranes to study physical and physicochemical aspects of transmembrane transport of nanoparticles. A combination of photon (PCS) and fluorescence (FCS) correlation spectroscopies optimizes species selectivity, necessary for a unique internalization study encompassing two main efforts. rnFor the proof of concepts, the first effort focused on the interaction of nanoparticles (Rh NP SiO2 = 14 nm, Rh NP PS = 16 nm; cNP = 0.1 gL-1) and polymersomes (Rh P = 112 nm; cP = 0.045 gL-1) with fixed size and concentration. Identification of a modified form factor of the polymersome entities, selectively seen in the PCS experiment, enabled a precise monitor and quantitative description of the incorporation process. Combining PCS and FCS led to the estimation of the incorporated particles per polymersome (about 8 in the examined system) and the development of an appropriate methodology for the kinetics and dynamics of the internalization process. rnThe second effort aimed at the establishment of the necessary phenomenology to facilitate comparison with theories. The size and concentration of the nanoparticles were chosen as the most important system variables (Rh NP = 14 - 57 nm; cNP = 0.05 - 0.2 gL-1). It was revealed that the incorporation process could be controlled to a significant extent by changing the nanoparticles size and concentration. Average number of 7 up to 11 NPs with Rh NP = 14 nm and 3 up to 6 NPs with Rh NP = 25 nm can be internalized into the present polymersomes by changing initial nanoparticles concentration in the range 0.1- 0.2 gL-1. Rapid internalization of the particles by polymersomes is observed only above a critical threshold particles concentration, dependent on the nanoparticle size. rnWith regard possible pathways for the particle uptake, cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM) has revealed two different incorporation mechanisms depending on the size of the involved nanoparticles: cooperative incorporation of nanoparticles groups or single nanoparticles incorporation. Conditions for nanoparticle uptake and controlled filling of polymersomes were presented. rnIn the framework of this thesis, the experimental observation of transmembrane transport of spherical PS and SiO2 NPs into polymersomes via an internalization process was reported and examined quantitatively for the first time. rnIn a summary the work performed in frames of this thesis might have significant impact on cell model systems’ development and thus improved understanding of transmembrane transport processes. The present experimental findings help create the missing phenomenology necessary for a detailed understanding of a phenomenon with great relevance in transmembrane transport. The fact that transmembrane transport of nanoparticles can be performed by artificial model system without any additional stimuli has a fundamental impact on the understanding, not only of the nanoparticle invagination process but also of the interaction of nanoparticles with biological as well as polymeric membranes. rn

Functionalization and characterization of magnetic nanoparticles for biomedical applications

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Oberflächenfunktionalisierung von MnO Nanopartikeln (NP). Durch die Verwendung und Verbesserung verschiedener Polymere durch die Einbindung von Poly (Ethylen Glycol) (PEG), gelang es, die Löslichkeit dieser Nanopartikel in wässrigen Lösungen sowie in Körperflüssigkeiten zu erhöhen. Zusätzlich konnten diese Nanopartikel deutlich besser steril filtriert werden und zeigten eine erhöhte Aktivität alsrnKontrastmittel im MRT. Vorläufige Ergebnisse für die Verwendung von Silika als Schutzhülle für MnO NP werden ebenfalls kurz erläutert. Die verwendeten Polymere besaßen dabei zugängliche Aminogruppen, die eine weitere Funktionalisierung durch Bio-aktiver Gruppen ermöglichte. Der Nachweis einer erfolgreichen Bindung durch verschiedene Methoden wie SDS-PAGE, Western- und Northern Blot sowie die Verwendung unterschiedlicher FluoreszenzMessungen wird ebenfalls diskutiert. MnO NP und anderer magnetischer NP werden weiterhin auf ihr toxisches Verhalten gegenüber Caki1 und HeLa Zellen getestet. Dabei zeigte sich, dass MnO NP, im Gegensatz zu einigen Kupferoxiden, quasi nicht toxisch waren und das Proliferationsverhalten dieser Zellen quasi nicht beeinflussten. Weiterhin wurde ein Fluoreszenzfarbstoff, konkret Protoporphyrin IX, an die Oberfläche von MnO NP angebracht.Diese konnten dann erfolgreich als Kontrastmittel in der MRT verwendet werden und zeigten vielversprechende Ergebnisse für die Photodynamische Therapie. Desweiteren wird die Synthese des Antikörpers gegen p53 ausführlich erläutert. Dabei wurde genau darauf geachtet,dass dieser Antikörper dann an MnO NP gebunden werden kann.