Membranas fluorescentes para fototerapia regenerativa: produção e caracterização

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Biodispositivos electrónicos implantáveis e biodegradáveis: estudo de nano/microfibras de polivinilpirrolidona-PVP

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biomédica

Proteínas recombinantes de Plasmodium Falciparum para deteção de malária por nanoimunoensaios

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Imunobiossensores capacitivos interdigitais com camadas sensíveis micro e nano-estruturadas

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia

Revestimentos hidrofóbicos

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Materiais

Nanoestruturas orgânicas anfifílicas: síntese e caraterização

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Materiais

Tópicos especiais em microbiologia.

Taxonomia bacteriana ? aspectos atuais e perspectivas. Aggregatibacter actinomycetemcomitans: fatores de virulência e modulação do sistema imune. Escherichia coli diarreiogênica em animais. Fatores de virulência em escherichia coli patogênica Extraintestinal. Enterococcus sp em alimentos: paradigmas. Resistência a carbapenêmicos em enterobactérias. Resistência em Staphylococcus aureus. Relação mútua entre Candida albicans e imunidade. Switching fenotípico em Candida spp Phytomonas spp.: modelo para estudo de processos biológicos da família Trypanosomatidae? Rotavirus. Antimicrobianos naturais produzidos por microrganismos: da busca à identificação. Antivirais naturais. Nanopartículas metálicas com atividade antimicrobiana. Plantas medicinais: A busca de novos fármacos no tratamento de doenças causadas por protozoários tripanossomatídeos. Introdução, estabelecimento e adaptação de Bradirrizóbios simbiontes da soja em solos brasileiros. Microrganismos e processos microbianos como bioindicadores de qualidade ambiental.

Lab on paper: biossensores colorimétricos de papel para a detecção de membros do complexo Mycobacterium tuberculosis

Este trabalho foi realizado no âmbito do projecto Lab on Paper, desenvolvido no Centro de Investigação de Materiais (CENIMAT) da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa (FCT - UNL)

Nanoimunoensaios para a detecção de antigénios da malária em amostras clínicas

Sendo a malária uma doença infecciosa que põe em risco uma elevada percentagem da população mundial, a presente dissertação apresenta o desenvolvimento de um teste de diagnóstico rápido (RDT) para a detecção da infecção. Para a detecção dos antigénios de Plasmodium falciparum (Pf), parasita da malária, foram estudadas nanopartículas de ouro (AuNPs) com dois diâmetros médios diferentes, 17nm e 48nm, funcionalizadas e conjugadas com anticorpos específicos, formando os bionanoconjugados. Este trabalho abrange dois focos de investigação, interligados, de forma a atingir-se o objectivo prosposto: i) Caracterização físico-quimica das AuNPs e dos bionanoconjugados em solução, usando a espectrocopia de UV-Visível, variando a força iónica e o pH do meio. A compreensão do comportamento e estabilidade das partículas consoante o seu diâmetro e revestimento tem em vista o melhoramento do RDT, tanto em sensibilidade como em custo; ii) Desenvolvimento do RDT usando um método que envolve uma ligação competitiva entre o antigénio e o anticorpo específico imobilizado à superfície das AuNPs. Os antigénios correspondem a biomarcadores da presença de Pf: Heat Shock Protein 70 (PfHsp70) e Histidine Rich Protein II (PfHRPII). Como superfícies para o desenvolvimento do RDT foram usados a nitrocelulose e o papel de filtro. Quanto maior é o diâmetro das AuNPs, maior é a estabilidade apresentada em solução quando aumentada a força iónica. Quando é variado o valor de pH do meio, as partículas adoptam um comportamento dependente do seu revestimento, independente do diâmetro. Os bionanoconjugados formados com AuNPs de ambos os diâmetros revelaram-se muito estáveis em solução, numa gama de forças iónicas de 0 a 0,5M de cloreto de sódio, e de pH de 2 a 7. Uma vez que a proteína Hsp70 é produzida constitutivamente em diversas células humanas, é necessário trabalhar com proteínas específicas da infecção, que nesta dissertação foi a PfHRPII. Foram efectuados testes no suporte de nitrocelulose que provaram o reconhecimento da PfHRPII pelos bionanoconjugados AuNPs-MUA-anti-PfHRPII. Estes ensaios necessitam ainda de algumas optimizações. Ensaios de Western-Blot permitiram a identificação da presença da PfHRPII em culturas infectadas, bem como a confirmação da sua ligação ao anticorpo específico, anti-PfHRPII. Um novo método de revelação é introduzido nesta técnica, efectuado através do uso dos bionanoconjugados. Este método mostrou-se promissor na medida em que é rápido, específico e de baixo custo. O principal contributo do trabalho consistiu no desenvolvimento, com sucesso, de um RDT para diagnóstico de malária, usando o antigénio PfHsp70, tendo como base a detecção colorimétrica com AuNPs de 17nm de diâmetro. Usando uma tira de nitrocelulose foi estabelecido um limite de detecção correspondente a 1600parasitas/μL, valor este considerado válido pela OMS para um correcto diagnóstico de malária. O limite de detecção obtido para as AuNPs de 48nm foi superior, não tendo trazido melhorias para o teste desenvolvido com AuNPs de menor diâmetro.

Desenvolvimento de microgéis híbridos para a sua aplicação em tratamentos de hipertermia magnética

A adição de nanopartículas magnéticas a polímeros termossensíveis permite desenvolver sistemas híbridos com possíveis aplicações biomédicas no âmbito do diagnóstico e/ou da terapia. A variedade de aplicações ao nível biomédico advêm da capacidade de resposta a vários estímulos, podendo tornar estes sistemas multifuncionais. O presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de microgéis híbridos termossensíveis com capacidade de resposta tanto à temperatura como ao campo magnético aplicado. Os microgéis híbridos sintetizados por polimerização por emulsão sem tensioativo (polimerização por precipitação) são constituídos por poli (N-isopropilacrilamida) (PNIPAAm) reticulado e quitosano (CS), sendo a componente inorgânica composta por nanopartículas magnéticas de óxido de ferro (IONPs), previamente sintetizadas por precipitação química. Foram sintetizados microgéis com diferentes percentagens (%m/m) de CS: 2, 10, 15, 20 e 40; bem como com diferentes percentagens (%m/m) de IONPs: 5 e 10%. Os microgéis sintetizados foram caracterizados de forma a otimizar o seu processo de produção. Para tal foi avaliada a sua estrutura, as propriedades físico-químicas e magnéticas e a capacidade de inchamento dos diferentes microgéis produzidos. Por último, foi avaliado o potencial destes microgéis híbridos funcionarem como agentes de hipertermia magnética. Confirmou-se que os microgéis obtidos apresentam uma morfologia esférica com diâmetros médios inferiores a um micrómetro. A introdução tanto do CS como das IONPs não alterou a termossensíbilidade dos microgéis, embora tenha provocado uma diminuição nas suas capacidades de inchamento. Verificou-se ainda que o encapsulamento das nanopartículas de óxido de ferro não alterou as propriedades superparamagnéticas das mesmas. Estes dados, em conjunto com os resultados de hipertermia magnética, revelam um potencial para a aplicação destes microgéis híbridos em hipertermia magnética.

Desenvolvimento de um sensor colorimétrico em papel para a deteção de bactérias eletroquimicamente ativas

Bactérias eletroquimicamente ativas possuem a capacidade de transferir eletrões extracelularmente, durante a respiração celular. Esta característica tem sido atualmente explorada para aplicação na produção de eletricidade, tratamento de águas residuais, biorremediação e em diversas áreas da biotecnologia, onde a transferência eletrónica ocorre na presença de aceitadores insolúveis (tais como, óxidos metálicos e ânodos metálicos). Contudo, o número de espécies identificadas, isoladas e caracterizadas até à data é bastante reduzido. Os métodos atualmente disponíveis para deteção de bactérias eletroquimicamente ativas são morosos, dispendiosos e complexos de operar, tornando-se necessário o desenvolvimento de outros métodos mais rápidos, simples e menos dispendiosos que auxiliem na otimização das aplicações mencionadas. O objetivo principal deste trabalho foi o desenvolvimento de um sensor colorimétrico de papel utilizando um material eletrocrómico, trióxido de tungsténio, como camada ativa para a deteção destas bactérias. Para isso, foram definidos no papel poços delimitados por barreiras hidrofóbicas, através da impressão e difusão de uma camada de cera. As várias amostras de nanopartículas de WO3, sintetizadas por um método hidrotermal assistido por micro-ondas, foram depositadas nos poços por drop casting. As nanopartículas com estrutura cristalográfica hexagonal, impregnadas no sensor de papel, foram capazes de detetar com sucesso uma bactéria eletroquimicamente ativa, Geobacter sulfurreducens, desde uma fase de crescimento bastante inicial (Abs600 nm = 0,1, correspondente a 0,07 g/L com um rácio RGB de 1,10 ± 0,040) até à fase exponencial-tardia (Abs600 nm = 0,5, correspondente a 0,33 g/L com um rácio RGB de 1,33 ± 0,005), com P <0,0001. O sensor de papel e respetivo método de deteção colorimétrico desenvolvido neste trabalho, revelou ser sensível e específico à deteção destas bactérias, de uma forma rápida, simples e pouco dispendiosa.

Desenvolvimento de um papel de filtro de baixo custo para tratamento de água

É sabido que devido à escassez de água potável, nomeadamente em países sub-desenvolvidos, morrem milhares de pessoas por ano, com a procura de fontes de água alternativas, que por sua vez se encontram contaminadas com microrganismos patogénicos; a este facto também se salienta a possibilidade de ocorrência de catástrofes naturais, tornando-se necessário o desenvolvimento de sistemas de desinfecção prácticos, de baixo custo e eficientes. O trabalho experimental desenvolvido focou-se nestas realidades, tendo por objectivo principal o desenvolvimento de um papel bactericida, em particular, um papel de baixo custo como é o caso do papel de filtro de café, para aplicação em desinfecção de água. Este papel foi funcionalizado com nanopartículas sintetizadas de prata, óxido de zinco e com ambas, assim como com nanopartículas comerciais, cuja caracterização foi feita por Microscopia Electrónica de Varrimento (SEM, Scanning Electron Microscopy), Energia Dispersiva de Raios-X (EDS, Energy-dispersive X-ray Spectroscopy), Espectroscopia de Ultravioleta-Visível (UV-VIS Uv-Visible Spectroscopy), Difracção de Raios-X (DRX, X-Rays Diffraction), Análise Termogravimétrica (TA, Thermal Analysis), e Calorimetria Diferencial de Varrimento (DSC, Differencial Scanning Calorimetry) e a actividade anti-bacteriana dos papéis foi avaliada através de Testes de Sensibilidade aos Antibióticos, pelo Método de Kirby-Bauer, contra as bactérias S.a.ATCC25923 e E.coli ATCC25922. No decorrer das sínteses variaram-se alguns parâmetros consoante o tipo de nanopartícula, para as np´s de prata variou-se essencialmente a metodologia de síntese e o tipo de redutor, para as np´s de óxido de zinco, dado ser um composto fotossensível, submeteu-se o papel á luz ultravioleta, o que, por outro lado também esterelizava o papel, e para ter uma comparação, esterelizou-se também o papel pela autoclave, constatando-se, pelas técnicas de caracterização, nomeadamente DRX, que os papeis não continham nanopartículas de óxido de zinco mas sim de acetato de zinco. Surpreendentemente, nos papéis autoclavados já se detectou a presença de óxido de zinco. Com os papéis que evidenciararam maior actividade anti-bacteriana realizaram-se filtrações de membrana com amostras de água contaminada e a determinação da concentração de metal no filtrado foi realizada pela técnica de Espectroscopia de Absorção Atómica de Chama (Flame Atomic Absorption Spectroscopy) conseguindo-se uma taxa de redução bacteriana de practicamente 100% para E.coli NCTC 9001 e E.f NCTC775 com os papéis contendo acetato de zinco numa concentração de 50 mM e np´sAg e acetato de zinco, numa concentração de 10 mM. De forma a validar o trabalho desenvolvido a parte final consistiu em testar os filtros com melhores propriedades em águas contaminadas, tendo esse trabalho sido feito no Laboratório de Água de Consumo dos Serviços Municipalizados de Água e Saneamento de Almada.

Complexos Organometálicos: caracterização preliminar de compostos de vanádio e de moléculas libertadoras de CO como potenciais fármacos

Vários complexos metálicos têm sido explorados visando uma melhoria de atuais tratamentos das mais variadas doenças. Os compostos de vanádio apresentam uma capacidade de mimetizar a ação da insulina, insurgindo-se assim como uma aposta no tratamento da doença Diabetes mellitus. O monóxido de carbono (CO), outrora visto como apenas um agente tóxico, atualmente é explorado pelas suas capacidades anti-inflamatórias, tendo-se desenvolvido moléculas libertadoras de CO, os CORMs, de modo a tirar partido dos seus efeitos biológicos. Com vista a determinar a formação de aductos entre os complexos organometálicos de vanádio e diferentes proteínas e caracterizar o tipo de interação estabelecida recorreu-se à Cristalografia de raios-X. A estrutura cristalográfica do aducto VOIV(picolinato)2–tripsina bovina foi obtida a 1,09 Å de resolução, mostrando o complexo VOIV(pic)2 no centro ativo da enzima, coordenado à cadeia lateral da serina catalítica (Ser195), numa geometria octaédrica. Ensaios cinéticos preliminares realizados com o complexo VO(pic)2 foram efetuados para determinar potenciais efeitos inibitórios na atividade das enzimas lisozima da clara do ovo (HEWL) e tripsina. O potencial terapêutico dos CORMs associado à Nanotecnologia foi explorado para o [Ru(CO)3Cl(glicinato)] (CORM-3), visando desenvolver nanopartículas de ouro (AuNPs) funcionalizadas com o composto e diferentes proteínas. A toxicidade celular direta do CORM-3, bem como alguns potenciais efeitos biológicos de CORM-3–albumina de soro humano (BSA) e CORM-3–HEWL foram também avaliados, recorrendo a ensaios de viabilidade celular , riscados celulares, e RT-qPCR em várias linhas celulares tumorais e linha primária de fibroblastos humanos. Foi possível iniciar o desenvolvimento de nanosistemas de AuNPs@PEG@BSA e AuNPs@PEG@HEWL, seguindo-se futuramente a conjugação com o CORM-3. Não foi possível determinar o efeito anti-inflamatório do CORM-3 e seus conjugados através da análise dos genes de resposta por RT-qPCR em tempo real, no entanto determinou-se que o composto CORM-3 não possui toxicidade em linhas celulares tumorais, e que aparenta fomentar a regeneração celular em fibroblastos e células tumorais NINA, sendo este efeito potenciado aquando conjugação com BSA.

Desenvolvimento e avaliação in vitro de um revestimento multifuncional para possível aplicação em implantes ósseos

As fraturas ósseas têm sido consideradas como um problema sócio económico mundial afetando sobretudo os jovens e idosos. No caso de pequenas correções de fraturas ou defeitos ósseos é necessário a aplicação de implantes biodegradáveis que atuem de forma temporária durante o período de formação do novo tecido ósseo. Uma das grandes vantagens da sua aplicação é evitar uma segunda intervenção cirúrgica para a sua remoção. Para isso, o Magnésio (Mg) e as suas ligas têm vindo a ser considerados como uma boa opção para este tipo de implantes temporários pois para além de serem biodegradáveis e biocompatíveis possuem propriedades semelhantes ao osso. No entanto, a sua elevada taxa de degradação em ambiente biológico é uma desvantagem para a sua utilização que conduz à perda da sua funcionalidade. O objetivo deste trabalho foi desenvolver revestimentos multifuncionais biocompatíveis, para a superfície do implante biodegradável, que permitam controlar a taxa de degradação do Mg e em simultâneo promovam a adesão e proliferação celular no local afetado. Neste trabalho, foram desenvolvidos três tipos de revestimentos biocompatíveis: Fosfatos, Fosfatos com nanopartículas de hidroxiapatite e fosfatos com nanopartículas de hidroxiapatite e óxido de grafeno aplicados na superfície da liga de Mg AZ31 através do método de eletrodeposição/eletroforese química. Foi realizado um tratamento térmico e avaliada a sua influência na resposta celular e na sua resistência à degradação. As propriedades físico-químicas do revestimento foram obtidas por microscopia electrónica de varrimento e de transmissão, microscopia de Raman, difração de raios-X e microscopia de força atómica. Foram ainda analisadas medições do ângulo de contacto da superfície dos revestimentos e realizados ensaios de degradação em soluções fisiológicas. A resposta celular aos revestimentos foi testada in vitro através da avaliação da adesão e proliferação de células osteoblásticas (Saos-2). Os resultados obtidos demonstram que o tratamento térmico modifica a estrutura do revestimento e promove a adesão celular. A incorporação do óxido grafeno no revestimento de fosfatos e hidroxiapatite permite aumentar a resistência à degradação e promover uma melhor resposta celular.

Desenvolvimento de um teste de diagnóstico rápido para a deteção de malária em amostras clínicas

A malária é uma doença infeciosa transmitida através da picada de um mosquito fêmea Anopheles infetado com o parasita protozoário do género Plasmodium (P.), sendo o P. falciparum a espécie mais mortal. É responsável pela morte de milhares de pessoas por ano, nomeadamente nos países em vias desenvolvimento, países esses que não detêm as condições necessárias para a prática da microscopia ótica em larga escala, que continua nos dias de hoje a ser a técnica de eleição para o diagnóstico da doença. A conceção de testes de baixo custo e de fácil utilização tais como os testes de diagnóstico rápido (TDR) são uma mais-valia no diagnóstico deste tipo de doenças. A presente dissertação centra-se no desenvolvimento de um TDR num formato competitivo, baseado em nanopartículas de ouro (AuNP) funcionalizadas com ácido mercaptoundecanoico (MUA) ou com o pentapétido Cys-Ala-Leu-Asn-Asn (CALNN) e conjugadas com um anticorpo monoclonal anti-PfHRP2 que reconhece especificamente a proteína rica em histidina 2 produzida pelo P. falciparum (PfHRP2). Para isso, utilizou-se uma tecnologia inovadora na conceção do TDR, a tecnologia lab on paper, que utiliza o papel Whatman nº1. Os estudos de estabilidade de AuNP funcionalizadas com citrato de sódio, MUA ou CALNN por variação da força iónica e pH do meio mostraram que o pentapéptido CALNN é o agente de revestimento mais resistente a oscilações de força iónica, comparativamente com o citrato de sódio e o MUA e que apenas as AuNP revestidas com citrato de sódio atingiram o ponto de agregação ao pKa da molécula de revestimento. Os principais resultados obtidos aquando do desenvolvimento do TDR revelaram que o valor de diluição ótima de anticorpo anti-IgG (solução mãe a 11 mg.mL-1) imobilizado na linha de controlo é de 1:40 e 1:90, utilizando para deteção os bionanoconjugados AuNP-MUA-Anticorpo e AuNP-CALNN-Anticorpo, respetivamente. Com a aplicação da solução AuNP-CALNN-Anticorpo visualizou-se o aparecimento de cor vermelha na linha de teste, o que demonstra a deteção do antigénio pelos bionanoconjugados. A deteção ocorreu com a aplicação de 2,5 μL de PfHRP2 a 1,5 mg.mL-1. Numa análise global após a aplicação de culturas de sangue não infetadas ou infetadas com o parasita da malária, obteve-se cor na linha de controlo com uma diluição de 1:20 do anticorpo anti-IgG imobilizado. Em relação à linha de teste, na presença de culturas não infetadas, obteve-se sinal na mesma aplicando bionanoconjugados AuNP-MUA-Anticorpo e 2,5 μL de PfHRP2 a 2,6 mg.ml-1.