Role of NOX enzymes in phagocyte response and signaling upon Chlamydia infection

Les membres de l'ordre des Chlamydiales peuvent infecter un choix étendu d'animaux, insectes, et protistes. Comme toutes bactéries intracellulaires obligatoires, les Chlamydiales ont besoin d'une cellule hôte pour se répliquer. Chaque fois qu'une cellule est infectée une lutte commence entre les mécanismes de défense de la cellule et l'arsenal de facteurs de virulence de la bactérie. Dans cette thèse nous nous sommes intéressés à déterminer le rôle de deux mécanismes de l'immunité innée de l'hôte. En premier, nous avons étudié les NADPH oxidases, une source de molécules superoxydantes (MSO). Leur rôle dans la restriction de la réplication de Waddlia chondrophila et Estrella iausannensis a été étudié dans l'organisme modèle Dictyostelium discoideum et les macrophages humains. Différentes protéines Nox étaient nécessaires pour contrôler la réplication de W. chondrophila ou E. Iausannensis. De plus, nous avons déterminé que parmi les Chlamydiales, cinq espèces possédaient une catalase. Cette enzyme peut dégrader l'eau oxygénée, une MSO. L'activité de la catalase a été démontrée in vitro et dans les corps élémentaires. Avant de pouvoir étudier le rôle de NOX2 dans des macrophages infectés avec E. Iausannensis, nous avons dû établir la capacité de la bactérie à se répliquer clans les macrophages avec son trafic intracellulaire. Le deuxième mécanisme d'immunité innée que nous avons étudié est l'autophagie. Dans les cellules infectées l'autophagie permet de digérer les bactéries envahissantes. Deux protéines de la voie autophagique (Atg1 et Atg8) jouent un rôle dans la restriction de la croissance de W. chondrophila dans D. discoideum. D'avantage d'études sur l'immunité innée et les bactéries apparentés aux Chlamydia sont indispensables, car les réponses paraissent être spécifiques pour chaque espèce. - Members of the Chlamydiales order are able to infect a large variety of animals, insects, and protists. These obligate intracellular bacteria require a host cell for replication. Each time a cell is infected a struggle begins between the virulence arsenal of the bacteria and the defense mechanisms activated by the host. Each bacterial species will exhibit a selection of virulence factors that will allow it to overcome the defense of the host in some species, but not others. In this thesis we were interested in dissecting the role of two host innate immunity mechanisms. First we determined the role of NADPH oxidases, a source of reactive oxygen species (ROS), in restricting replication of Waddlia chondrophila and EstreHa lausannensis in the model organism Dictyostelium discoideum and human macrophages. Different Nox proteins were required to restrict growth of W. chondrophila and E. lausannensis. Additionally, we determined that five Chlamydia- related bacterial species encode for catalase, an enzyme that is able to degrade hydrogen peroxide, a ROS. The activity of the catalase was demonstrated in vitro and in elementary bodies. To study the role of NOX2 in macrophages for E. lausannensis we first had to determine the ability of E. lausannensis to grow in macrophages. Besides demonstrating its replication we also determined the intracellular trafficking of E. lausannensis. The second innate immunity mechanism studied was autophagy. Through autophagy bacteria can be targeted to degradation. Atg1 and Atg8, two autophagic proteins appeared restrict W. chondrophila replication in D. discoideum. More studies on innate immunity and Chlamydia-related bacteria are required. It appears that the responses to innate immunity are species specific and it will be difficult to generalize data obtained for W. chondrophila to the Chlamydiales order.

« L'esthétique du chant dans la piété calviniste aux premiers temps de la Réforme (1536-1545) »

Contrairement aux idées reçues, l'esthétique assume bien une fonction dans les formes rituelles adoptées par les Eglises issues de la Réforme calviniste. Mais il revient moins à l'image, considérée avant tout comme une source de distraction, qu'à la musique de porter cette dimension dans la piété réformée. Retraçant la formation de la pensée calvinienne sur la question des rapports entre culte et musique entre 1536 et 1543, cette étude montre comment le théologien en vient durant ces années à considérer que le chant des psaumes permet de concilier dans la dévotion, un processus cognitif, guidé par le sens des paroles, et un mouvement affectif, suscité par la mélodie. C'est, aux yeux de Calvin, de la jonction de ces deux dynamiques que naît l'élévation spirituelle à laquelle le culte doit conduire. Notwithstanding common belief, aesthetics had an important function in ritual forms implemented by Reformed Calvinist Churches. The impact of aesthetics on reformed piety rested less on images, considered to be a source of distraction, than on music. By reconsidering the evolution of Calvin's thoughts on the relationship between music and religious services between 1536 and 1543, this study reveals how Calvin came to consider that by singing the psalms, Christians could conciliate in prayer a cognitive process which was to be guided by both the meaning of the words and the emotions triggered by the tune. For Calvin, the spiritual elevation to which religious services should lead was to emerge from the conjunction of these two impetuses.

Genomics of "chlamydia"-related bacteria

AbstractThe Chlamydiales order is an important bacterial phylum that comprises some of the most successful human pathogens such as Chlamydia trachomatis, the leading infectious cause of blindness worldwide. Since some years, several new bacteria related to Chlamydia have been discovered in clinical or environmental samples and might represent emerging pathogens. The genome sequencing of classical Chlamydia has brought invaluable information on these obligate intracellular bacteria otherwise difficult to study due to the lack of tools to perform basic genetic manipulation. The recent emergence of high-throughput sequencing technologies yielding millions of reads in a short time lowered the costs of genome sequencing and thus represented a unique opportunity to study Chlamydia-re\ated bacteria. Based on the sequencing and the analysis of Chlamydiales genomes, this thesis provides significant insights into the genetic determinants of the intracellular lifestyle, the pathogenicity, the metabolism and the evolution of Chlamydia-related bacteria. A first approach showed the efficacy of rapid sequencing coupled to proteomics to identify immunogenic proteins. This method, particularly useful for an emerging pathogen such as Parachlamydia acanthamoebae, enabled us to discover good candidates for the development of diagnostic tools that would permit to evaluate at larger scale the role of this bacterium in disease. Second, the complete genome of Waddlia chondrophila, a potential agent of miscarriage, encodes numerous virulence factors to manipulate its host cell and resist to environmental stresses. The reconstruction of metabolic pathways showed that the bacterium possesses extensive capabilities compared to related organisms. However, it is still incapable of synthesizing some essential components and thus has to import them from its host. Third, the genome comparison of Protochlamydia naegleriophila to its closest known relative Protochlamydia amoebophila revealed a particular evolutionary dynamic with the occurrence of an unexpected genome rearrangement. Fourth, a phylogenetic analysis of P. acanthamoebae and Legionella drancourtii identified several genes probably exchanged by horizontal gene transfer with other intracellular bacteria that might occur within their amoebal host. These genes often encode mechanisms for resistance to metal or toxic compounds. As a whole, the analysis of the different genomes enabled us to highlight a large diversity in size, GC percentage, repeat content as well as plasmid organization. The abundant genomic data obtained during this thesis have a wide impact since they provide the necessary bases for detailed investigations on countless aspects of the biology and the evolution of Chlamydia-related bacteria, whether in wet lab or by bioinformatical analyses.RésuméL'ordre des Chlamydiales est un important phylum bactérien qui comprend de nombreuses espèces pathogènes pour l'homme et les animaux, dont Chlamydia trachomatis, responsable du trachome, la cause majeure de cécité d'origine infectieuse à travers le monde. Durant ces dernières décennies, de nombreuses bactéries apparentées aux Chlamydia ont été découvertes dans des échantillons environnementaux ou cliniques mais leur éventuel rôle pathogène dans le développement de maladies reste peu connu. Ces bactéries sont des intracellulaires obligatoires car elles ont besoin d'une cellule hôte pour se multiplier, ce qui rend leur étude particulièrement difficile. Le développement de nouvelles technologies permettant de séquencer le génome d'un organisme rapidement et à moindre coût ainsi que l'essor des méthodes d'analyse s'y rapportant représentent une opportunité exceptionnelle d'étudier ces organismes. Dans ce contexte, cette thèse démontre l'utilité de la génomique pour développer de nouveaux outils diagnostiques ainsi que pour étudier le métabolisme de ces bactéries, leurs facteurs de virulence et leur évolution.Ainsi, une première approche a illustré l'utilité d'un séquençage rapide pour obtenir les informations nécessaires à l'identification de protéines qui sont reconnues par des anticorps humains ou animaux. Cette méthode, particulièrement utile pour un pathogène émergent tel que Parachlamydia acanthamoebae, a permis de découvrir de bons candidats pour le développement d'un outil diagnostique qui permettrait d'évaluer à plus large échelle le rôle de cette bactérie notamment dans la pneumonie. L'analyse du contenu génique de Waddlia chondrophila, un autre germe qui pourrait être impliqué dans les avortements et tes fausses-couches, a en outre mis en évidence la présence de nombreux facteurs connus qui lui permettent de manipuler son hôte. Cette bactérie possède de plus grandes capacités métaboliques que les autres Chlamydia, mais elle est incapable de synthétiser certains composants et doit donc les importer de son hôte pour subvenir à ses besoins. La comparaison du génome de Protochlamydia naegleriophila à son plus proche parent, Protochlamydia amoebophila, a dévoilé une évolution dynamique particulière avec l'occurrence d'un réarrangement majeur inattendu après la séparation de ces deux espèces. En outre, ces études ont montré l'occurrence de plusieurs transferts de gène avec d'autres organismes plus éloignés, notamment d'autres intracellulaires d'amibes, souvent pour l'acquisition de mécanismes de résistances à des composés toxiques. Les données génomiques acquises durant ce travail posent les fondements nécessaires a de nombreuses analyses qui permettront progressivement de mieux comprendre de nombreux aspects de ces bactéries fascinantes.

Characterization of the effects of IL-17F on CHO cell line generation

CHO is the most commonly used mammalian host for the generation of cell lines allowing for the production of high quality therapeutic proteins. The generation of such cell lines is a lengthy and resource-intensive process requiring extensive screening in order to isolate candidates with optimal characteristics, such as growth, stability and productivity. For this reason, the biotechnology industry invests much effort in attempts to optimize CHO expression systems in order to streamline and shorten the cell line selection process. Based on preliminary observations of a facilitated selection of CHO-GS cell lines expressing members of the IL-17 cytokine family, this study investigates the use of IL-17F as a novel enhancing factor for CHO cell line generation. Using two different CHO expression systems (exploiting GS and DHFR-based selection), we demonstrated that IL-17F expression caused a significant increase in the occurrence of colonies during the selection process. All colonies selected produced substantial amounts of IL-17F, suggesting that benefits were conferred, during selection, to those cells expressing the cytokine. Furthermore, transgene expression levels were significantly increased when the selection pressure was raised to a level that would not normally be permissive for colony selection (i.e. 100 |o.M MSX for the CHO-GS expression system or 1000 nM MTX for the CHO-DHFR system). Finally, IL-17F expression was also found to enhance the rate of appearance of clones during single cell subcloning in the absence of selection pressure. Overall, these benefits have the potential to allow a substantial reduction in the length of cell line generation while significantly increasing cell line productivity. Nevertheless, we found that the high IL-17F expression levels required to convey enhancing effects was a limitation when attempting to co-express IL-17F and a recombinant soluble protein of therapeutic interest from independent CMV promoters within the same expression vector. In order to understand and overcome this limitation, studies were designed to characterize the IL-17F enhancing effect at the molecular and cellular level. Regular supplementation of recombinant biologically-active IL-17F into the culture medium during cell line selection was not able to reproduce the enhancing effects of endogenous IL-17F expression. In addition, increased IL-17F expression correlated with increased CHO-GS selection transgene expression at the single cell level. This data suggested a possible effect of IL-17F on viral promoter activity or transgene mRNA stability. It also provided direct evidence that the cells expressing the highest amounts of IL-17F obtained the most benefit. Overall data obtained from these study implied that IL-17F may act through an intracellular mechanism, possibly exerted during secretion. We therefore initiated experiments designed to determine the specific compartment(s) within which IL-17F triggers its effect. This work has identified IL-17F as a potentially powerful tool to optimize the CHO cell line generation process. The characterization of this enhancing effect at the molecular level has given us several insights into overcoming the current limitations, thus paving the way for the development of a viable technology that can be exploited within the biotechnology industry. - La CHO est la cellule hôte de mammifere la plus couramment utilisée dans la création de lignée cellulaire produisant des protéines thérapeutiques de haute qualité. La génération de ces lignées cellulaires est un processus long et exigeant l'utilisation de techniques de sélection robustes afin d'isoler des candidats possédants les caractéristiques optimales de croissance, de productivité et de stabilité d'expression. Les industries biopharmaceutiques ont investi beaucoup d'efforts afin d'optimiser les systèmes d'expression CHO dans le but raccourcir la longueur du procédé de sélection de lignées cellulaires et aussi d'en augmenter l'efficacité. A partir d'observations préliminaires obtenues lors de la génération de lignées cellulaires CHO- GS exprimant une cytokine appartenant à la famille des IL-17, nous avons réalisé une étude portant sur l'utilisation de l'IL-17F humaine (IL-17F) comme nouveau facteur d'optimisation pour la génération de lignées cellulaires CHO. Nous avons démontré, en utilisant les deux systèmes de sélection et d'expression CHO couramment utilisés (le premier exploitant la GS et l'autre basée sur la DHFR), que l'expression de l'IL-17F permet une augmentation significative de la fréquence d'apparition de colonies durant le processus de sélection de lignées cellulaires. Les différentes colonies sélectionnées expriment des quantités substantielles d'IL-17F, suggérant un effet bénéfique lors de la sélection qui serait exclusivement conféré aux cellules exprimant la cytokine. En outre, le niveau d'expression du transgene se trouve significativement augmenté lorsque la pression de sélection est portée à un niveau habituellement trop élevé pour permettre la sélection de colonies (soit 100 |JM MSX pour le système d'expression CHO-GS ou 1000 nM MTX pour le système CHO- DHFR). Enfin, l'expression d'IL-17F permet également d'améliorer la vitesse d'apparition de clones pendant une étape de sous-clonage en l'absence de pression de sélection. L'ensemble de ces effets bénéfiques permettent une réduction substantielle de la durée de génération de lignées cellulaires tout en augmentant considérablement la productivité des lignées obtenues. Néanmoins, nous avons constaté que la nécessité d'exprimer des niveaux élevés d'IL-17F afin obtenir l'ensemble de ses effets bénéfiques devient une contrainte lors de l'utilisation d'un vecteur d'expression composé de deux promoteurs CMV indépendants pour la co-expression de la cytokine et d'une protéine soluble présentant un intérêt thérapeutique. Afin de mieux comprendre et de surmonter cette limitation, plusieurs études ont été effectuées dans le but de mieux caractériser l'effet de IL-17F au niveau subcellulaire. L'apport régulier en IL-17F recombinante et biologiquement active dans le milieu de culture lors de la sélection de lignées cellulaires ne permet pas de reproduire les effets bénéfiques observés par l'expression endogène d'IL-17F. En outre, nous avons constaté que, lors de l'utilisation du système CHO- GS, l'augmentation d'expression de 1TL-17F est corrélée à un accroissement de l'expression du marqueur de sélection au niveau cellulaire. Ces résultats suggèrent un possible effet d'IL- 17F sur l'activité des promoteurs viraux et ainsi fournissent une preuve directe que les cellules exprimant de haut niveau d'IL-17F sont celles qui en profitent le plus. L'ensemble de ces observations mettrait en avant que l'effet d'IL-17F se ferait selon un mécanisme intracellulaire. Nous avons donc étudié le(s) compartiment(s) spécifique(s) dans lequel IL-17F pourrait exercer son effet. Ce travail a permis de définir IL-17F comme un puissant outil pour l'optimisation des procédés de génération de lignées cellulaires CHO. La caractérisation de cette amélioration de l'effet au niveau moléculaire nous a donné plusieurs indications sur la manière de dépasser les limitations actuelles, ouvrant ainsi la voie au développement d'une technologie viable qui peut être exploitée pars l'industrie biotechnologique.

Renoncement aux soins: comment appréhender cette réalité en médecine de premier recours [Patients forgoing health care for economic reasons: how to identify this in a primary care setting?].

Although the performance of the Swiss health system is high, one out of ten patients in general practitioner's (GP) office declares having foregone care in the previous twelve months for economic reasons. Reasons for foregoing care are several and include a lack of knowledge of existing social aids in getting health insurance, unavailability of GPs and long waiting lists for various types of care. Although long term knowledge of patients or a psychosocial history of deprivation or poverty may help identify individuals at risk of foregoing care, many may remain undetected. We propose then a few instruments to help GPs to identify, in a simple and structured approach, patients at risk of forgoing care for economic reasons; these patients are frequently deprived and sometimes poor.

Maladie de Behçet: d'Hippocrate aux antagonistes du TNF-alpha

Behçet's disease is a systemic vasculitis affecting small and large vessels (arteries, veins, veinules), characterized by recurrent oral ulcerations, genital ulcerations, inflammation of the eye and skin lesions. It can also involve articulations, central nervous system and gastro-intestinal tract. The etiology of this disease is still unknown, but the most largely discussed hypothesis is that of an important inflammatory response triggered by an infectious agent in a genetically susceptible host. The diagnostic is a based on clinical elements, because no specific diagnostic test exists. The treatment of Behçet's disease is depending on the clinical involvement and has been enlarged in recent years by TNF-alpha-blockers which constitute undoubtedly an important progress in the management of this complex disease.