Moving from surfactant-stabilized aqueous rhodium (0) colloidal suspension to heterogeneous magnetite-supported rhodium nanocatalysts: Synthesis, characterization and catalytic performance in hydrogenation reactions

Wet impregnation of pre-synthesized surfactant-stabilized aqueous rhodium (0) colloidal suspension on silica was employed in order to prepare supported Rh-0 nanoparticles of well-defined composition, morphology and size. A magnetic core-shell support of silica (Fe(3)O4@SiO2) was used to increase the handling properties of the obtained nanoheterogeneous catalyst. The nanocomposite catalyst Fe3O4@SiO2-Rh-0 NPs was highly active in the solventless hydrogenation of model olefins and aromatic substrates under mild conditions with turnover frequencies up to 143,000 h(-1). The catalyst was characterized by various transmission electron microscopy techniques showing well-dispersed rhodium nanoparticles (similar to 3 nm) mainly located at the periphery of the silica coating. The heterogeneous magnetite-supported nanocatalyst was investigated in the hydrogenation of cyclohexene and compared to the previous surfactant-stabilized aqueous Rh-0 colloidal suspension and various silica-supported Rh-0 nanoparticles. Finally, the composite catalyst could be reused in several runs after magnetic separation. (C) 2011 Elsevier B. V. All rights reserved.

Function of C1A barley peptidases and their inhibitors (cystatins) in barley seed germination : Funcion de las peptidasas C1A de cebada y sus inhibidores (cistatinas) en la germinacion de la semilla

Plant proteolysis is a metabolic process where specific enzymes called peptidases degrade proteins. In plants, this complex process involves broad metabolic networks and different sub-cellular compartments. Several types of peptidases take part in the proteolytic process, mainly cysteine-, serine-, aspartyl- and metallo- peptidases. Among the cysteine-peptidases, the papain-like or C1A peptidases (family C1, clan CA) are extensively present in land plants and are classified into catepsins L-, B-, H- and Flike. The catalytic mechanism of these C1A peptidases is highly conserved and involves the three amino acids Cys, His and Asn in the catalytic triad, and a Gln residue which seems essential for maintaining an active enzyme conformation. These proteins are synthesized as inactive precursors, which comprise an N-terminal signal peptide, a propeptide, and the mature protein. In barley, we have identified 33 cysteine-peptidases from the papain-like family, classifying them into 8 different groups. Five of them corresponded to cathepsins L-like (5 subgroups), 1 cathepsin B-like group, 1 cathepsin F-like group and 1 cathepsin H-like group. Besides, C1A peptidases are the specific targets of the plant proteinaceous inhibitors known as phytocystatins (PhyCys). The cystatin inhibitory mechanism is produced by a tight and reversible interaction with their target enzymes. In barley, the cystatin gene family is comprised by 13 members. In this work we have tried to elucidate the role of the C1A cysteine-peptidases and their specific inhibitors (cystatins) in the germination process of the barley grain. Therefore, we selected a representative member of each group/subgroup of C1A peptidases (1 cathepsin B-like, 1 cathepsin F-like, 1 cathepsin H-like and 5 cathepsins L-like). The molecular characterization of the cysteine-peptidases was done and the peptidase-inhibitor interaction was analyzed in vitro and in vivo. A study in the structural basis for specificity of pro-peptide/enzyme interaction in barley C1A cysteine-peptidases has been also carried out by inhibitory assays and the modeling of the three-dimensional structures. The barley grain maturation produces the accumulation of storage proteins (prolamins) in the endosperm which are mobilized during germination to supply the required nutrients until the photosynthesis is fully established. In this work, we have demonstrated the participation of the cysteine-peptidases and their inhibitors in the degradation of the different storage protein fractions (hordeins, albumins and globulins) present in the barley grain. Besides, transgenic barley plants overexpressing or silencing cysteine-peptidases or cystatins were obtained by Agrobacterium-mediated transformation of barley immature embryos to analyze their physiological function in vivo. Preliminary assays were carried out with the T1 grains of several transgenic lines. Comparing the knock-out and the overexpressing lines with the WT, alterations in the germination process were detected and were correlated with their grain hordein content. These data will be validated with the homozygous grains that are being produced through the double haploid technique by microspore culture. Resumen La proteólisis es un proceso metabólico por el cual se lleva a cabo la degradación de las proteínas de un organismo a través de enzimas específicas llamadas proteasas. En plantas, este complejo proceso comprende un entramado de rutas metabólicas que implican, además, diferentes compartimentos subcelulares. En la proteólisis participan numerosas proteasas, principalmente cisteín-, serín-, aspartil-, y metalo-proteasas. Dentro de las cisteín-proteasas, las proteasas tipo papaína o C1A (familia C1, clan CA) están extensamente representadas en plantas terrestres, y se clasifican en catepsinas tipo L, B, H y F. El mecanismo catalítico de estas proteasas está altamente conservado y la triada catalítica formada por los aminoácidos Cys, His y Asn, y a un aminoácido Gln, que parece esencial para el mantenimiento de la conformación activa de la proteína. Las proteasas C1A se sintetizan como precursores inactivos y comprenden un péptido señal en el extremo N-terminal, un pro-péptido y la proteína madura. En cebada hemos identificado 33 cisteín-proteasas de tipo papaína y las hemos clasificado filogenéticamente en 8 grupos diferentes. Cinco de ellos pertenecen a las catepsinas tipo L (5 subgrupos), un grupo a las catepsinas tipo-B, otro a las catepsinas tipo-F y un último a las catepsinas tipo-H. Las proteasas C1A son además las dianas específicas de los inhibidores protéicos de plantas denominados fitocistatinas. El mecanismo de inhibición de las cistatinas está basado en una fuerte interacción reversible. En cebada, se conoce la familia génica completa de las cistatinas, que está formada por 13 miembros. En el presente trabajo se ha investigado el papel de las cisteín-proteasas de cebada y sus inhibidores específicos en el proceso de la germinación de la semilla. Para ello, se seleccionó una proteasa representante de cada grupo/subgrupo (1 catepsina tipo- B, 1 tipo-F, 1 tipo-H, y 5 tipo-L, una por cada subgrupo). Se ha llevado a cabo su caracterización molecular y se ha analizado la interacción enzima-inhibidor tanto in vivo como in vitro. También se han realizado estudios sobre las bases estructurales que demuestran la especificidad en la interacción enzima/propéptido en las proteasas C1A de cebada, mediante ensayos de inhibición y la predicción de modelos estructurales de la interacción. Finalmente, y dado que durante la maduración de la semilla se almacenan proteínas de reserva (prolaminas) en el endospermo que son movilizadas durante la germinación para suministrar los nutrientes necesarios hasta que la nueva planta pueda realizar la fotosíntesis, en este trabajo se ha demostrado la participación de las cisteínproteasas y sus inhibidores en la degradación de las diferentes tipos de proteínas de reserva (hordeinas, albúmins y globulinas) presentes en el grano de cebada. Además, se han obtenido plantas transgénicas de cebada que sobre-expresan o silencian cistatinas y cisteín-proteasas con el fin de analizar la función fisiológica in vivo. Se han realizado análisis preliminares en las semillas T1 de varias líneas tránsgenicas de cebada y al comparar las líneas knock-out y las líneas de sobre-expresión con las silvestres, se han detectado alteraciones en la germinación que están además correlacionadas con el contenido de hordeinas de las semillas. Estos datos serán validados en las semillas homocigotas que se están generando mediante la técnica de dobles haploides a partir del cultivo de microesporas.

Resistance to malathion and lambda-cyhalothrin in Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae)

La mosca mediterránea de la fruta, Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera: Tephritidae), es una de las plagas de mayor incidencia económica en cítricos y otros frutales a nivel mundial. En España las medidas de control de esta plaga en cítricos, desde mediados de los 90 hasta 2009, se basaron principalmente en el monitoreo de las poblaciones y en la aplicación de tratamientos aéreos y terrestres con malatión cebo. Sin embargo, desde la retirada en la Unión Europea en 2009 de los productos fitosanitarios que contienen malatión, los insecticidas más utilizados para el control de esta plaga han sido lambda-cihalotrina y spinosad. En 2004-2005 se detectaron poblaciones españolas de C. capitata resistentes a malatión. Esta resistencia se ha asociado a una mutación (G328A) en la acetilcolinesterasa (AChE), a una duplicación del gen de la AChE (Ccace2) (una de las copias lleva la mutación G328A) y a resistencia metabólica mediada por esterasas (posiblemente aliesterasas). Sin embargo, cuando se secuenció la aliesterasa CcE7 en individuos de una línea resistente a malatión, no se encontró ninguna de las mutaciones (G137D y/o W251L/S/G) asociadas a resistencia en otras especies, si bien se encontraron otras mutaciones al compararlos con individuos de una línea susceptible. Asimismo, mediante la selección en laboratorio de una línea resistente a malatión (W-4Km) con lambda-cihalotrina, se ha podido obtener una línea resistente a lambda-cihalotrina (W-1K). Finalmente, se ha demostrado la capacidad de esta especie para desarrollar resistencia a spinosad mediante selección en laboratorio. Los múltiples mecanismos de resistencia identificados evidencian el potencial de esta especie para desarrollar resistencia a insecticidas con diferentes modos de acción. Los objetivos de esta tesis doctoral son: 1) evaluar la susceptibilidad de poblaciones españolas de campo de C. capitata a lambda-cihalotrina y dilucidar los mecanismos de resistencia en la línea W-1Kλ; 2) comparar la herencia, el coste biológico y la estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A); y 3) investigar el papel de las mutaciones identificadas en la aliesterasa CcαE7 en la resistencia a malatión. Estos estudios son de utilidad para el desarrollo de estrategias de manejo de la resistencia que puedan prevenir o retrasar la aparición de resistencia y aumentar la sostenibilidad de los insecticidas disponibles para el control de esta plaga. Nuestros resultados indican que las poblaciones españolas de C. capitata analizadas han desarrollado resistencia a lambda-cihalotrina. Los valores de CL50 estimados para las poblaciones recogidas en la Comunidad Valenciana, Cataluña y Andalucía oscilaron entre 129 ppm y 287 ppm, igualando o sobrepasando la concentración recomendada para los tratamientos de campo (125 ppm). Estos resultados contrastan con los obtenidos con tres poblaciones de campo recogidas en Túnez, cuya susceptibilidad fue similar a la de la línea control (C). La línea resistente a lambda-cihalotrina W-1K se continuó seleccionando en el laboratorio alcanzándose unos niveles de resistencia de 205 veces con respecto a la línea C, siendo su CL50 (4224 ppm) más de 30 veces superior a la concentración recomendada para los tratamientos de campo. Esta línea resistente mostró altos niveles de resistencia cruzada a deltametrina (150 veces) y a etofenprox (240 veces), lo que sugiere que el desarrollo de resistencia a lambda-cihalotrina podría comprometer la eficacia de otros piretroides para el control de esta plaga. Hemos demostrado que la resistencia de la línea W-1K a lambda-cihalotrina fue casi completamente suprimida por el sinergista PBO, lo que indica que las enzimas P450 desempeñan un papel muy importante en la resistencia a este insecticida. Sin embargo, tanto las moscas de la línea susceptible C como las de la línea resistente W-1K perdieron inmediatamente la capacidad de caminar (efecto “knock-down”) al ser tratadas tópicamente con lambda-cihalotrina, lo que sugiere que la resistencia no está mediada por alteraciones en la molécula diana (resistencia tipo “kdr”). La resistencia metabólica mediada por P450 fue analizada comparando la expresión de 53 genes CYP (codifican enzimas P450) de las familias CYP4, CYP6, CYP9 y CYP12 en adultos de la línea resistente W-1K y de la línea susceptible C. Nuestros resultados muestran que el gen CYP6A51 (número de acceso GenBank XM_004534804) fue sobreexpresado (13-18 veces) en la línea W-1K. Por otra parte, la expresión del gen CYP6A51 fue inducida tanto en adultos de la línea W-1K como de la línea C al ser tratados con lambda-cihalotrina. Sin embargo, no se obtuvieron diferencias significativas entre la línea susceptible C y la línea resistente W-1K al comparar la cantidad de P450 y la actividad NADPH-citocromo c reductasa presente en fracciones microsomales obtenidas a partir de abdómenes. Asimismo, no hemos podido correlacionar el metabolismo de deltametrina, estimado in vitro mediante la incubación de este insecticida con fracciones microsomales, con el nivel de resistencia a este piretroide observado en los bioensayos con la línea W-1K. Por otro lado, no se encontró ninguna alteración en la región promotora 5'UTR del gen CYP6A51 (-500 pb desde el inicio de la traducción) que pudiera explicar su sobreexpresión en la línea W-1K. Los datos obtenidos sugieren que la resistencia a lambda-cihalotrina en la línea W-1K está mediada por P450 y que la sobreexpresión de CYP6A51 puede desempeñar un papel importante, aunque se necesitan más evidencias para establecer una asociación directa de la resistencia con este gen. Hemos estudiado la herencia, el coste biológico y la estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A). La línea susceptible C, donde no se encuentra la mutación G328A (genotipo S/S), se cruzó con dos isolíneas establecidas para representar genotipos únicos correspondientes a los dos mecanismos de resistencia asociados a la molécula diana: 1) la isolínea 267Y (genotipo R/R) establecida a partir de una pareja que portaba la mutación G328A en homocigosis; 2) la isolínea 306TY (genotipo RS/RS) establecida a partir de una pareja que portaba en homocigosis la duplicación del gen Ccace2. No se realizaron cruces recíprocos, ya que mediante experimentos de hibridación in situ en cromosomas politénicos se pudo comprobar que el locus de la AChE y la duplicación (probablemente en tándem) se localizan en el cromosoma autosómico 2L. La susceptibilidad al malatión de los parentales resistentes (R/R o RS/RS) y susceptibles (S/S), los cruces F1 (S/R, S/RS y R/RS) y los retrocruzamientos indican que la resistencia a malatión es semi-dominante en ambos casos. Sin embargo, nuestros resultados no fueron concluyentes con respecto a la naturaleza monogénica de la resistencia a malatión en estas isolíneas. Por lo tanto, no podemos descartar que otros genes que contribuyan a la resistencia, además de la mutación G328A (isolínea 267Y) y de la duplicación del gen Ccace2 (isolínea 306TY), puedan haber sido seleccionados durante el proceso de selección de 267Y y 306TY. Varios parámetros biológicos fueron evaluados para determinar si estos dos mecanismos de resistencia a malatión suponen un coste biológico para los genotipos resistentes. Individuos con genotipo R/R mostraron un retraso en el tiempo de desarrollo de huevo a pupa, un peso de pupa reducido y una menor longevidad de los adultos, en comparación con los individuos con genotipo S/S. Sin embargo, el peso de pupa de los individuos con genotipo RS/RS fue similar al de los individuos S/S, y su desarrollo de huevo a pupa intermedio entre S/S y R/R. Estas diferencias en el coste biológico pueden estar relacionadas con la reducción de la eficiencia catalítica de la AChE mutada en los individuos R/R, y al efecto compensatorio que la copia no mutada del gen tiene en los individuos RS/RS que portan la duplicación. La estabilidad de la resistencia a malatión mediada por la mutación G328A y la duplicación se analizó mediante el seguimiento de los caracteres de resistencia en la progenie de retrocruzamientos S/R x R/R y S/RS x RS/RS a lo largo de varias generaciones en ausencia de presión de selección con insecticidas. Nuestros resultados muestran que la frecuencia del alelo que porta la mutación G328A disminuyó desde 67,5% en la primera generación del retrocruzamiento S/R x R/R (75% esperado, asumiendo segregación mendeliana y que sólo hay dos alelos: uno mutado y otro no mutado) a 12% después de 10 generaciones. Por el contrario, la frecuencia de la duplicación sólo disminuyó desde 75% en en la primera generación del retrocruzamiento S/RS x RS/RS (75% esperado, asumiendo segregación Mendeliana y que la duplicación segrega como un único alelo) a 50% en el mismo período, lo que indica que la duplicación es más estable que la mutación. Asimismo, se analizó la presencia de la mutación y de la duplicación en poblaciones de campo recogidas en seis localidades en 2004-2007, cuando todavía se usaba el malatión, y se comparó con poblaciones recogidas en los mismos campos en 2010, un año después de la prohibición del malatión en la Unión Europea. La frecuencia media del genotipo susceptible (S/S) aumentó del 55,9% en el período 2004-2007 a 70,8% en 2010, mientras que la frecuencia de los genotipos portadores de la mutación en homocigosis o heterocigosis (R/R y S/R) disminuyó del 30,4 al 9,2%, los que llevan la duplicación en homocigosis o heterocigosis (RS/RS y S/RS) aumentaron levemente desde 12,8 hasta 13,3%, y los que llevan a la vez la mutación y la duplicación (R/RS) también aumentaron del 1 al 6,7%. Estos resultados son consistentes con que la duplicación del gen Ccace2 (con una copia con la mutación G328A y la otra copia no mutada) es más ventajosa que la mutación G328A por si sola, ya que la duplicación mantiene los niveles de resistencia a la vez que limita el coste biológico. Para investigar la asociación entre la resistencia a malatión y las mutaciones encontradas previamente en CcE7, hemos generado isolíneas con mutaciones específicas seleccionadas por su ubicación próxima a la entrada al centro activo de la enzima. La isolínea Sm2 (procedente de una hembra heterocigota para la mutación V96L y un macho homocigoto para el alelo no mutado) mantuvo altos niveles de resistencia a malatión, incluso después de 30 generaciones sin presión de selección. Por el contrario, la isolínea 267Y (compuesta por individuos homocigotos para la mutación L267Y) y la línea 306TY (compuesta por individuos homocigotos para la doble mutación R306T-N307Y) mostraron una reducción significativa en los niveles de resistencia. También hemos encontrado que la resistencia a malatión de la línea Sm2 fue parcialmente revertida por DEF y TPP, y que Sm2 mostró una reducción significativa en la actividad MTB, como se ha descrito en otras especies que muestran resistencia específica a malatión mediada por aliesterases. Además, fue posible asociar la presencia de la mutación V96L en individuos de la línea Sm2 con supervivencia a una concentración discriminante de malatión (5,000 ppm) y con una baja actividad MTB. Estos resultados sugieren una posible relación entre la mutación V96L en la aliesterasa CcE7 y la resistencia a malatión, aunque todavía no se puede concluir que la resistencia es causada por esta mutación, siendo necesarios más estudios para comprobar su contribución a la resistencia. En conclusión, se ha encontrado por primera vez resistencia a lambda-cihalotrina en poblaciones de campo de C. capitata, y nuestros resultados indican que las P450 son el principal mecanismo de resistencia en la línea W-1K. Esta situación se suma al caso previamente descrito de resistencia en campo a malatión asociada a la mutación G328A, a la duplicación del gen Ccace2 (una de las copias lleva la mutación G328A) y a resistencia metabólica mediada por esterasas. Nuestros resultados también indican que la alteración de la molécula diana AChE parece ser responsable de un cierto nivel de resistencia a malatión en C. capitata, que puede ser estimada como aproximadamente 25-40 veces para la mutación G328A y 40-60 veces para la duplicación; mientras que la resistencia mediada por esterasas y que ha sido asociada en este estudio con la mutación V96L en CcE7 puede conferir un efecto multiplicativo (por un factor de 5 a 10) aumentando la resistencia a malatión a 200-400 veces. Por otra parte, hemos demostrado que los insectos resistentes que llevan la duplicación tienen un coste biológico menor y muestran una estabilidad mayor que aquellos con la mutación G328A en ausencia de presión de selección con insecticidas. Esto representa un escenario en el que los genotipos con la duplicación permanecerán en el campo en frecuencias bajas a moderadas, pero podrían ser seleccionados rápidamente si se utilizan malatión u otros insecticidas que muestren resistencia cruzada. Estos resultados tienen importantes implicaciones para los programas de manejo de la resistencia, ya que el repertorio de insecticidas eficaces para el control de C. capitata es cada vez más limitado. Además, la coexistencia de múltiples mecanismos de resistencia en poblaciones de campo ofrece el potencial para desarrollar resistencia frente a otros insecticidas disponibles para el control de esta plaga. Estrategias para de manejo de la resistencia basadas en la alternancia de insecticidas con diferentes modos de acción, y su combinación con otros métodos de control, deben ser implementadas para evitar el desarrollo de resistencia en campo. ABSTRACT The Mediterranean fruit fly (Medfly), Ceratitis capitata (Wiedemann, 1824) (Diptera: Tephritidae), is one of the most economically damaging pests of citrus and other fruit crops worldwide. Control measures in citrus crops in Spain from the mid 90's to 2009 were mainly based on field monitoring of population levels and aerial and ground treatments with malathion bait sprays. However, since the withdrawal of phytosanitary products containing malathion in the European Union in 2009, lambda-cyhalothrin and spinosad have become the most widely used insecticides for the control of this pest. Resistance to malathion was found in Spanish field populations of C. capitata in 2004-2005. This resistance has been associated with a mutation G328A in the acetylcholinesterase (AChE), a duplication of the AChE gene (Ccace2) (one of the copies bearing the mutation G328A), and metabolic resistance mediated by esterases (probably aliesterases). However, when the gene of the aliesterase CcE7 was sequenced in individuals from a malathion resistant strain of C. capitata, none of the known G137D and/or W251L/S/G mutations associated to resistance in other species were found, though other mutations were detected when compared with individuals from a susceptible strain. Noteworthy, a lambda-cyhalothrin resistant strain (W-1K) was obtained by selecting a field-derived malathion resistant strain (W-4Km) with lambda-cyhalothrin. Moreover, it has also been demonstrated the capacity of this species to develop resistance to spinosad by laboratory selection. The multiple resistance mechanisms identified highlight the potential of this species to develop resistance to insecticides with different modes of action. The objectives of this PhD Thesis are: 1) to assess the susceptibility of Spanish field populations of C. capitata to lambda-cyhalothrin and to elucidate the resistance mechanisms in the W-1Kλ strain; 2) to compare the inheritance, fitness cost and stability of the malathion resistance mediated by the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A); and 3) to investigate the role of the aliesterase CcαE7 mutations in malathion resistance. All these studies will be of use for devising proactive resistance management strategies that could prevent or delay resistance development and would increase the sustainability of the insecticides available for Medfly control. Our results indicate that Spanish field populations of C. capitata have developed resistance to lambda-cyhalothrin. The LC50 values estimated for populations collected at Comunidad Valenciana, Cataluña and Andalucía ranged from 129 ppm to 287 ppm, equaling or overpassing the recommended concentration for field treatments (125 ppm). These results contrast with those obtained with three different Tunisian field populations, whose susceptibility was similar to that of the control (C) strain. The lambda-cyhalothrin resistant W-1K strain has been further selected to achieve a 205-fold resistance compared to the C strain, being its LC50 (4,224 ppm) more than 30 times higher than the recommended concentration for field applications. This resistant strain showed high levels of cross-resistance to deltamethrin (150-fold) and etofenprox (240-fold), suggesting that the development of resistance to lambda-cyhalothrin may compromise the effectiveness of other pyrethroids for the control of this species. We have shown that the resistance of the W-1K strain to lambda-cyhalothrin was almost completely suppressed by the synergist PBO, indicating that P450 enzymes play a very important role in resistance to this insecticide. However, both susceptible C and resistant W-1K flies were knocked down after topical treatment with lambda-cyhalothrin, suggesting that kdr resistance mediated by alterations of the target site is not playing a major role. Metabolic resistance mediated by P450 was further analyzed by comparing the expression of 53 genes of the families CYP4, CYP6, CYP9 and CYP12 in adults flies from the resistant W-1K and the susceptible C strains. We found that the gene CYP6A51 (GenBank accession number XM_004534804) was overexpressed (13-18-fold) in the W-1K strain. Moreover, the expression of the CYP6A51 gene was induced when adults of the W-1K and C strains were treated with lambda-cyhalothrin. However, no significant differences were obtained between susceptible C and resistant W-1K strains for the quantity of P450 and for the activity of NADPH- cytochrome c reductase measured in microsomal fractions obtained from abdomens. Moreover, we failed to correlate the metabolism of deltamethrin, analyzed in vitro by incubating this insecticide with microsomal fractions, with the resistance level against this pyrethroid observed in bioassays with W-1K. The sequencing of the 5´UTR region of the CYP6A51 gene failed in finding an alteration in the promoter region (-500 bp from translation start site) that could explain overexpression in the W-1K strain. All data obtained suggest that resistance to lambda-cyhalothrin in the W- 1K strain is mediated by P450 and that overexpression of CYP6A51 may play a major role, although further evidences are needed to establish a direct association of resistance with this gene. We have studied the inheritance, fitness cost and stability of the malathion resistance mediated by the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A). The malathion-susceptible C strain where the G328A mutation is not found (S/S genotype) was crossed with two isolines established to represent unique genotypes corresponding to the two target-site resistance mechanisms: 1) the 267Y isoline (genotype R/R) was established from a couple bearing the mutation G328A in homozygosis; and 2) the 306TY isoline (genotype RS/RS) was established from a couple being homozygous for the duplication of the Ccace2 gene. Reciprocal crosses have not been performed, since in situ hybridization on polythene chromosomes showed that the AChE locus and the duplication (most probably in tandem) are placed at the autosomal chromosome 2L. Mortality responses to malathion of resistant isolines (R/R or RS/RS) and susceptible (S/S) genotypes, F1 crosses (S/R, S/RS, and R/RS), and the back-crosses indicated that resistance to malathion is inherited as a semi-dominant trait in both cases. However, our results were not conclusive about the monogenic nature of the resistance to malathion in these isolines. Thus, we can not discard that other genes contributing to resistance, in addition to the mutation G328A (isoline 267Y) and the duplication of the Ccace2 gene (isoline 306TY), may have been selected during the selection process of 267Y and 306TY. Several biological parameters were evaluated to determine if these two malathion resistance mechanisms impose a fitness cost for resistant genotypes. Individuals with genotype R/R have a reduced fitness in terms of developmental time from egg to pupa, pupal weight and adult longevity, when compared to susceptible individuals (genotype S/S). Interestingly, the fitness cost was substantially diminished in individuals with genotype RS/RS. These differences in fitness may be related to the reduction of the catalytic efficiency of mutated AChE in individuals R/R, and the compensatory effect that the non-mutated copy of the gene has on individuals RS/RS bearing the duplication. The stability of malathion reistance associated with the mutation G328A or the duplication was analyzed by following these resistant traits in the progeny of the back-crosses S/RS x RS/RS and S/R x R/R over consecutive generations in the absence of insecticide selection pressure. Our results show that the frequency of the allele bearing the mutation G328A decreased from 67.5% at the first generation of the back-cross S/R x R/R (75% expected, assuming Mendelian segregation and that there are only two alleles: one mutated and the other non-mutated) to 12% after 10 generations. By contrast, the frequency of the duplication only declined from 75% at the first generation of the back-cross S/RS x RS/RS (75% expected, assuming Mendelian segregation and that the duplication segregates as an unique allele) to 50% in the same period, indicating that the duplication is more stable than the mutation. The presence of the mutation and the duplication was analyzed in field populations collected in six localities in 2004-2007, when malathion was still used, and compared to populations collected in the same fields in 2010, one year after the prohibition of malathion in the European Union. The average frequency of the susceptible genotype (S/S) increased from 55.9% in the period 2004-2007 to 70.8% in 2010, whereas the frequency of those genotypes carrying the mutation in homozygosis or heterozygosis (R/R and S/R) declined from 30.4 to 9.2%, those carrying the duplication in homozygosis or heterozygosis (RS/RS and S/RS) increased slightly from 12.8 to 13.3%, and those carrying both the mutation and the duplication (R/RS) also increased from 1 to 6.7%. These results are consistent with the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A and the other copy non-mutated) being more advantageous than the G328A mutation alone by maintaining resistance while restoring part of the fitness. In order to investigate the association of malathion resistance with mutations previously found in the aliesterase CcE7, we have generated isolines bearing specific mutations selected by their putative location near the upper part of the active site gorge of the enzyme. The isoline Sm2 (originating from a female heterozygous for the mutation V96L and a male homozygous for the non-mutated allele) kept high levels of resistance to malathion, even after 30 generations without selection pressure. On the contrary, the isoline 267Y (composed by individuals homozygous for the mutation L267Y) and the strain 306TY (composed by homozygous for the double mutation R306T-N307Y) showed a significant reduction in the levels of resistance. We have found also that resistance to malathion in the Sm2 isoline was partially reverted by DEF and TPP, and that Sm2 showed a significant reduction in MTB activity, as reported for other species showing malathion-specific resistance mediated by aliesterases. Besides, it was possible to associate the presence of the mutation V96L in individuals from the Sm2 isoline with both survival to a discriminating concentration of malathion (5,000 ppm) and low MTB activity. Our results point out to a possible connection betwen the mutation V96L in the aliesterase CcE7 and resistance to malathion, though we can not yet conclude that the resistance is caused by the mutation, being needed further work to understand its contribution to resistance. In conclusion, resistance to lambda-cyhalothrin has been found for the first time in field populations of C. capitata, and metabolic resistance mediated by P450 appears to be the main resistance mechanism in the resistant strain W-1K. These findings add to the previously reported case of field resistance to malathion, associated to the G328A mutation and the duplication of the Ccace2 gene (with one of the copies bearing the mutation G328A) and to metabolic resistance mediated by esterases. Our results also indicate that altered target site AChE appears to be responsible for a certain level of resistance to malathion in C. capitata, that can be estimated as about 25-40-fold for the mutation G328A and 40-60-fold for the duplication; whereas metabolic resistance mediated by esterases and associated in this study with the mutation V96L in CcE7 may confer a multiplicative effect (by a factor of 5 to10) increasing malathion resistance to 200-400-fold. Moreover, we have shown that resistant insects carrying the duplication have better fitness and exhibit a higher stability than those with the mutation G328A in the absence of insecticide pressure. This represents a scenario where genotypes with the duplication will remain in the field at low to moderate frequencies, but could be rapidly selected if malathion or other insecticides showing cross-resistance are used. These findings have important implications for resistance management programs, as the repertoire of effective insecticides for C. capitata control is becoming very limited. Besides, multiple resistance mechanisms coexisting in field populations provide the potential to develop resistance to other available insecticides for the control of this pest. Appropriate resistance management strategies based on the alternation of insecticides with different modes of action, and their combination with other control methods, must then be implemented to avoid the evolution of resistance in the field.

Emisiones y eficiencia energética: experiencias en el ámbito de la Ingeniería Rural

El LPF_TAGRALIA es un grupo de investigación reconocido de la UPM que trabaja en diversos ámbitos de la Ingeniería Agroforestal y de Biosistemas, entre los que se encuentra el análisis de emisiones de vehículos agrícolas, y el análisis de la calidad y la eficiencia energética en el transporte a larga distancia de productos perecederos, colaborando asimismo con una variedad de grupos y centros de investigación nacionales e internacionales. El primero de estos temas: análisis de emisiones de vehículos agrícolas, es objeto de estudio en el LPF_TAGRALIA desde hace aproximadamente diez años, cuando se materializa y cobra relevancia la aplicación del standard TIER de la agencia de protección ambiental americana (EPA) cuyo disparo de salida tuvo lugar en 1996 con la publicación del TIER I. La adopción en USA y Europa de este standard que regula las emisiones de CO, óxidos de Nitrógeno y 2 partículas de materia de diversa naturaleza (PM) se está produciendo de manera paulatina en función de la potencia de matriculación de los tractores (vehículos de fuera de carretera, off-road vehicles). En la actualidad el standard TIER IV ha de ser verificado mayoritariamente por los tractores, para lo cuál existen dos estrategias básicas: la recirculación de gases de escape (EGR), y la reducción catalítica selectiva (SCR). La verificación del funcionamiento en campo de estas estrategias ha sido materia de análisis y discusión por parte del LPF_TAGRALIA que ejerce desde hace 4 años la labor de Responsable de Ensayos de Campo para el suplemento Maq-Vida Rural, una de las publicaciones más reconocidas por los técnicos que desarrollan su labor en el ámbito de la Ingeniería Rural; los diversos documentos relacionados pueden consultarse en el servicio de acceso abierto también denominado Archivo Digital de la UPM (http://oa.upm.es/).

Adaptación de una central térmica de carbón a la Directiva de Emisiones Industriales

El proyecto que se presenta a continuación recoge la adaptación de una Central Térmica de carbón al cumplimiento de la DIRECTIVA 2010/75/UE DEL PARLAMENTO EUROPEO Y DEL CONSEJO de 24 de noviembre de 2010 sobre las emisiones industriales. La Central sobre la que se realiza el proyecto tiene un grupo térmico de carbón suscritico refrigerado por agua, con una potencia a plena carga de 350 MWe y de 190 MWe a mínimo técnico. Genera 1 090 t/h de vapor a 540 °C y 168 kg/cm2 funcionando a plena carga. Actualmente las emisiones de NOx son de 650 mg/m3, (condiciones normales, seco, 6 % O2). El objeto del proyecto es reducir estas emisiones a un valor máximo de 200 mg/m3 en las mismas condiciones. El proyecto analiza detalladamente las condiciones actuales de operación de la instalación en cuanto a combustible utilizado, horas de funcionamiento, condiciones climáticas y producción. Se analiza así mismo, todas las técnicas disponibles en mercado para la reducción del NOx, diferenciando entre medidas primarias (actúan sobre los efectos de formación) y secundarias (limpieza de gases). Las medidas primarias ya están implementadas en la central, por tanto, el proyecto plantea la reducción con medidas secundarias. De las medidas secundarias analizadas se ha seleccionado la instalación de un Reactor de Reducción Selectiva Catalítica (Reactor SCR). Tras un análisis de los diferentes reactores y catalizadores disponibles se ha seleccionado un reactor de configuración High-dust, una disposición de catalizador en 3 capas más 1, cuyos componentes están basados en óxidos metálicos (TiO2, V2O5, WO3) y estructura laminar. Se ha buscado la instalación del reactor para operar a una temperatura inferior a 450 °C. Como agente reductor se ha seleccionado NH3 a una dilución del 24,5 %. El proyecto recoge también el diseño de todo el sistema de almacenamiento, evaporación, dilución e inyección de amoniaco. El resultado del proyecto garantiza una concentración en los gases de salida por la chimenea inferior 180 mg/m3(n) de NOx. La reducción del NOx a los límites establecidos, tienen un coste por MWh neto generado para la central, trabajando 60 % a plena carga y 40 % a mínimo técnico y una amortización de 10 años, de 4,10 €/MWh. ABSTRACT The following project shows the compliance adjustment of a coal-fired power station to the 2010/75/EU Directive of the European Parliament and Council 24th November 2010 on industrial emissions. The project is based on a power station with a subcritical thermal coal unit, cooled with water, with a maximum power of 350 MWe and a technical minimum of 190 MWe. It produces 1 090 t/h of steam at 540 ° C and 168 kg/cm2 operating under full load. Currently, NOx emissions are 650 mg / m3 (normal conditions, dry, 6% O2). The project aims to reduce these emissions to a maximum value of 200 mg / m3 under the same conditions. The project analyses in detail the current operating conditions of the system in terms of fuel used, hours of operation, climatic conditions and production. In addition, it also analyses every available technique of NOx reduction on the market, distinguishing between primary (acting on the effects of formation) and secondary measures (gas cleaning). Primary measures are already implemented in the plant, thus proposing reduction with secondary measures. Among the secondary measures analyzed, it has been selected to install a Selective Catalytic Reduction Reactor (SCR Reactor). Having researched the different reactors and catalysts available, for the reactor has been selected High-dust configuration, an arrangement of catalyst in 3 layers plus 1, whose components are based on metal oxides (TiO2, V2O5, WO3) and laminar structure. The reactor has been sought facility to operate at a temperature below 450 ° C. NH3 diluted to 24,5 % has been selected as reducing agent. The project also includes the design of the entire storage system, evaporation, dilution and ammonia injection. The results of the project ensure a gas concentration in the lower chimney exit below 180 mg / m3(n) NOx. The reduction of NOx to the established limits has a cost per net MWh generated in the plant, working at 60% of full load and at 40% of technical minimum, with an amortization of 10 years, 4,10 € / MWh.

Análisis tecno-económico del proceso de producción de butanol a partir de biomasa lignocelulósica por la vía termoquímica

El butanol es hoy en día en uno de los compuestos químicos más importantes en el mundo a causa de sus numerosas aplicaciones, entre las que destacan la producción de acrilato de butilo, acetato de butilo y éter de glicol (industrias de pinturas y recubrimientos). Junto a sus aplicaciones actuales, el butanol está adquiriendo una gran importancia dentro del sector de los biocombustibles, debido a su futuro prometedor como sustituto de los combustibles convencionales o para mezcla. Todo ello está moviendo a la industria química a establecer nuevas plantas de producción de butanol para satisfacer su creciente demanda. Los procesos actuales de producción de butanol se centran en dos vías: vía fermentativa y vía petroquímica. A pesar de su rentabilidad y competencia, estos procesos están limitados por múltiples factores, destacando las limitaciones en materias primas disponibles y asociadas al empleo de microorganismos en los procesos fermentativos, así como el precio del petróleo y sus derivados en los procesos petroquímicos. En la actualidad, numerosas investigaciones están desarrollando nuevos procesos de producción de butanol por rutas termoquímicas. El éxito de estas investigaciones permitiría su producción por métodos alternativos a los procesos “tradicionales”, salvando muchas de las limitaciones que presentan. El proceso de producción de butanol por vía termoquímica se basa en la transformación de biomasa lignocelulósica en gas de síntesis mediante un tratamiento termoquímico (gasificación), y su posterior conversión en butanol mediante una etapa de reacción catalítica. La principal limitación que ha impedido la viabilidad de esta ruta ha sido la falta de desarrollo en los catalizadores empleados para la síntesis de butanol a partir de gas de síntesis. Su desarrollo mejorando la selectividad hacia el butanol, será la clave para el éxito de la vía termoquímica de producción de butanol. En base a lo comentado anteriormente, en el presente Proyecto Fin de Carrera (PFC) se analiza la viabilidad tecno-económica del proceso de producción de butanol a partir de biomasa lignocelulósica por vía termoquímica. La consecución de este objetivo se ha logrado mediante la aplicación de una metodología en tres pasos: estudio del proceso, simulación del proceso y evaluación económica. En primer lugar, se ha realizado un estudio detallado del proceso de producción de butanol a partir de biomasa lignocelulósica por vía termoquímica desarrollado por Chinedu O. Okoli y Thomas A. Adams II (Universidad de McMaster, Canadá), a fin de comprender las etapas que constituyen el proceso. Mediante este estudio, se ha conseguido conocer las condiciones de operación de las diferentes unidades que integran el proceso. En segundo lugar, se ha evaluado la viabilidad técnica del proceso mediante el empleo del software Aspen Plus V8.6. La simulación se ha realizado en base a la información obtenida en el estudio preliminar. Por último, se ha analizado la viabilidad económica del proceso mediante el cálculo de los parámetros de viabilidad Valor Actual Neto (VAN) y Tasa Interna de Retorno (TIR). Para la determinación de estos parámetros se ha realizado el flujo de cajas del proceso en base a la estimación de sus ingresos, costes de producción y capital total de inversión requerido. Junto al análisis de viabilidad, se han llevado acabo distintos análisis de sensibilidad a las variables más influyentes en la rentabilidad del proceso (interés del préstamo, precio de venta del butanol, precio de venta de la mezcla de alcoholes y precio de compra de la biomasa). Las principales conclusiones que se pueden extraer del análisis realizado son las siguientes: - A través del análisis técnico se concluye que el proceso de producción de butanol por vía termoquímica es viable técnicamente, ya que existe la tecnología requerida para su implantación, así como presenta aceptables tasas de producción de butanol (82,52 kg/tonelada biomasa seca) y es posible integrar un ciclo de vapor y generación de electricidad en el proceso. Además, el margen de mejora de este proceso es amplio, siendo el catalizador requerido para la síntesis del butanol el principal foco de mejora. - En cuanto a la rentabilidad del proceso, el análisis económico muestra que el proceso de producción de butanol por vía termoquímica es viable económicamente. Sin embargo, el estudio realizado demuestra que, en el estado de desarrollo actual, los ingresos asociados a la venta del butanol son insuficientes para hacer rentable el proceso, siendo necesario tener acceso a mercados para la venta de los subproductos generados.

Polipirrol, un buen soporte para electrodos de pilas de combustible de metanol directo (DMFC)

(SPA) El polipirrol es uno de los polímeros conductores más utilizados en la preparación de electrodos debido a su alta actividad catalítica para la oxidación y reducción del metanol. En este trabajo se ha depositado electroquímicamente polipirrol a diferentes potenciales de depósito, Ed, sobre tela de carbón no tejida Freudenberg en medio ácido. Se ha analizado la morfología y la respuesta electroquímica en medio HClO4 y en presencia de HClO4+MeOH antes y después de la síntesis del polipirrol sobre ella. Lastructura de las películas obtenidas se ha estudiado por espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier, FTIR. Se observa que el polipirrol mejora las propiedades electroquímicas de la tela de carbón, obteniéndose el mejor resultado para su aplicación como soporte del catalizador en pilas de combustible con la película sintetizada a 1,0V. (ENG) Polypyrrole is one of the most used conducting polymers in electrode building due to its high catalytic activity to the methanol oxidation and reduction. By this motive, polypyrrole has been electrochemically synthesized at constant potential, Ed, on Freudenberg carbon cloth in acid medium. Carbon cloth morphology and electrochemical behaviour in HClO4 and in HClO4+MeOH before and after the polypyrrole eposition have been analysed. The structure of the films was studied by Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR. The polypyrrole improves the electrochemical properties of the studied carbon cloth. The biggest charge of the electroactive area is the one synthesized at 1.0V, being the best for its application as catalyst support in fuel cells.

Estudo da cinética da tirosinase imobilizada em nanopartícula de sílica com obtenção de revestimento de eumelanina

Melanina é um polímero constituído por uma grande heterogeneidade de monômeros tendo como característica comum a presença de grupos indóis. Por outro lado, a eumelanina produzida pela oxidação enzimática da tirosina é um polímero mais simples constituído principalmente de monômeros 5,6-dihidroxindol (DHI) e de indol-5,6-quinona (IQ). Tirosinase é a enzima chave na produção de melanina, sendo que a sua atividade cinética é medida em função da formação do intermediário dopacroma. Nanopartículas (NPs) de sílica são partículas nanométricas compostas de oxido de silício e são obtidas pelo processo sol-gel desenvolvido por Stöber de hidrólise e condensação de tetraetilortosilicato (TEOS), usando etanol como solvente em meio alcalino. As NPs foram funcionalizadas com 3-Aminopropiltrietoxissilano (ATPES) e depois com glutaraldeído. Este último permitiu a imobilização da tirosinase na superfície da sílica. Caracterizamos as NPs antes e após a reação da enzima, a atividade catalítica da enzima ligada à NP e o mecanismos de formação de melanina na superfície da sílica. As NPs foram caracterizadas por espectrofotometria de absorção e de reflectância, termogravimetria e microscopia eletrônica. A síntese da NP de sílica retornou partículas esféricas com 55nm de diâmetro e a funcionalização da partícula mostrou modificar eficientemente a sua superfície. A imobilização da tirosinase por ligação covalente foi de 99,5% contra 0,5% da adsorção física. A atividade da tirosinase foi caracterizada pela formação de dopacroma. O Km da enzima imobilizada não sofreu alteração em comparação com a tirosinase livre, mas a eficiência catalítica - que considera a eficiência recuperada - foi de apenas 1/3 para a enzima ligada covalentemente, significando que 2/3 das enzimas ligadas não estão ativas. Obtivemos NPs revestidas com melanina a partir de oxidação de tirosina solubilizada em duas preparações: NP com tirosinase ligada covalentemente na superfície e NP funcionalizada com glutaraldeido dispersa em solução de DHI e IQ. O revestimento de melanina foi na forma de um filme fino com espessura ~1,9nm, conferindo perfil de absorção luminosa equivalente ao da própria melanina. Mostramos que o mecanismo de polimerização passa pela oxidação da tirosina pela tirosinase, que gera intermediários oxidados (principalmente DHI e IQ) que vão para solução (mesmo quando a tirosinase está ligada covalentemente na sílica). Estes intermediários ligam-se ao glutaraldeido e a superfície da sílica passa a funcionar como ambiente de polimerização da melanina.

Estudo da seletividade de catalisadores a base de cobre e paládio em transformações de hidrocarbonetos insaturados

Compreender a correlação entre as características de um catalisador particular e seu desempenho catalítico tem sido um dos principais objetos da pesquisa em catálise heterogênea a fim de usar esse conhecimento para o desenho racional de catalisadores mais ativos, seletivos e estáveis. A seletividade é um dos fatores mais importantes a ser controlado pelo desenho de catalisadores, podendo ser alcançada de diversas maneiras, levando-se em consideração mudanças do tipo estrutural, química, eletrônica, de composição, de cinética e de energia. O trabalho descrito nessa tese de doutorado compreende a síntese e caracterização de catalisadores compostos de nanopartículas de óxido de cobre, paládio e cobre-paládio e seu estudo em reações de hidrogenação e oxidação seletivas de hidrocarbonetos insaturados. Os catalisadores foram preparados através da deposição de nanopartículas dos metais cataliticamente ativos sobre suportes magneticamente recuperáveis compostos de nanopartículas de magnetita revestidas por sílica com superfícies funcionalizada com diferentes grupos orgânicos. A natureza magnética do suporte permitiu a fácil separação do catalisador do meio reacional pela simples aproximação de um ímã na parede do reator. O catalisador pôde ser completamente separado da fase líquida, fazendo com que a utilização de outros métodos de separação como filtração e centrifugação, comumente utilizados em sistemas heterogêneos líquidos, fossem completamente dispensados. Os catalisadores foram inicialmente testados em reações de hidrogenação de alquenos e alquinos. As reações de hidrogenação foram realizadas utilizando hidrogênio molecular como agente redutor, dispensando a utilização de agentes redutores mais agressivos. Os catalisadores compostos de NPs de Pd mostram excelente atividade e capacidade de reutilização na hidrogenação de cicloexeno, podendo ser utilizados em até 15 ciclos sem perda de atividade. Nas reações de hidrogenação de alquinos, os catalisadores que contêm cobre mostraram maior seletividade para a obtenção dos produtos de semi-hidrogenação, com destaque para o catalisador composto de NPs de CuPd, que não apresenta nem traços do produto de hidrogenação completa na amostra final. Esse catalisador bimetálico alia as características do paládio (elevada atividade) e do cobre (elevada seletividade) para fornecer um catalisador ativo e seletivo para a transformação desejada. Além disso, os grupos funcionais presentes na superfície do suporte catalítico mostraram influência na atividade e seletividade para a hidrogenação de alquenos e alquinos. Os catalisadores sintetizados também foram testados na reação de oxidação de cicloexeno e mostraram seletividade para a produção do composto carbonílico α,β-insaturado, cicloex-2-en-1-ona, que é um reagente de partida de grande interesse para a síntese de diversos materiais na indústria química. As reações de oxidação foram realizadas utilizando-se apenas O2 como oxidante primário, dispensando o uso de oxidantes tóxicos como cromatos, permanganatos ou compostos halogenados, que não são recomendados do ponto de vista ambiental. Os catalisadores sintetizados puderam ser reutilizados em sucessivos ciclos de oxidação, mostrando seletividade para a formação dos produtos alílicos em todos os ciclos. Os catalisadores foram estáveis sob as condições reacionais e não apresentaram problemas de lixiviação da espécie ativa para o meio reacional, que é comum na catálise heterogênea. Um estudo cinético mostrou que, mesmo no início da reação, o catalisador tem seletividade para a ocorrência de oxidação alílica em detrimento da reação de oxidação direta que dá origem ao epóxidos correspondente, e se mostrou condizente com o mecanismo proposto na literatura para a reação de oxidação de alquenos via radicalar.

Oxidação eletroquímica de etanol em temperatura ambiente e intermediária: estudo quantitativo das vias reacionais por espectrometria de massas on-line

Na primeira parte do trabalho, foram investigados materiais ativos para eletro-oxidar etanol e acetaldeído seletivos para a rota C2 (Carbono 2) e, também, ativos para eletro-oxidar hidrogênio molecular, visando a aplicação em células a combustível de hidrogênio indireto. Neste tipo de célula, um processador de combustível externo desidrogena o etanol e os produtos desta reação, contendo H2, acetaldeído e, possivelmente, etanol residual, são direcionados para alimentar o ânodo. Neste sentido, o eletrocatalisador anódico pode ser ativo para a eletro-oxidação de etanol residual, bem como acetaldeído, mas este deve catalisar a reação via C2 com o objetivo de evitar a formação de espécies que envenenam a superfície catalítica (CO ou CHx), ou seja, a ligação C-C deve permanecer intacta. Os eletrocatalisadores bimetálicos foram formados por M/Pt/C (onde M = W, Ru ou Sn) e os produtos reacionais foram analisados por DEMS On-line. Os resultados mostraram que Ru/Pt/C e Sn/Pt/C apresentaram maiores taxas de reação global, no entanto, eles não foram seletivos. Por outro lado, W2/Pt3/C foi mais seletivo para a rota C2, dada a não formação de CH4 e CO2. Além disso, este material também foi ativo e estável para a eletro-oxidação de H2, mesmo na presença de acetaldeído, o que o torna um potencial catalisador para aplicação no ânodo de células a combustível de hidrogênio indireto. Na segunda parte do trabalho, o objetivo foi relacionado com o estudo de eletrocatalisadores seletivos para a rota C1 (Carbono 1). A oxidação eletroquímica do etanol e de seus produtos reacionais foram investigados por DEMS on-line em temperatura ambiente e intermediária (245oC). Para temperatura ambiente, utilizou-se solução aquosa de ácido sulfúrico (H2SO4) e, para temperatura intermediária, utilizou-se ácido sólido (CsH2PO4) como eletrólito. Os eletrocatalisadores investigados foram formados por SnOxRuOx-Pt/C e Pt/C. Em temperatura ambiente, os resultados de polarização potenciodinâmica mostraram uma maior atividade eletrocatalítica para o material SnOxRuOx-Pt/C, com eficiência de corrente para formação de CO2 de 15,6% contra 15,2% para Pt/C, sob condições estagnantes, sem controle por transporte de massa. O stripping de resíduos reacionais, após a eletro-oxidação de etanol bulk, sob condições de fluxo, mostraram o acúmulo de espécies com 1 átomo de carbono (CO e CHx) que causam o bloqueio dos sítios ativos e são oxidadas eletroquimicamente somente em mais altos potenciais (ca. 1,0 V). Por outro lado, as curvas de polarização a 245oC mostraram maiores valores de eficiências de correntes para formação de CO2 (45% para Pt/C em ambos potenciais 0,5 V e 0,8 V contra 36% e 50% para SnOxRuOx-Pt/C em 0,5 V e 0,8 V respectivamente) quando comparado com os valores obtidos em temperatura ambiente, mas com atividades similares para SnOxRuOx-Pt/C e Pt/C. Para ambos os eletrocatalisadores, os estudos de espectrometria de massas a 245oC evidenciaram que as rotas eletroquímicas ocorrem em paralelo com rotas puramente químicas, envolvendo catálise heterogênea, de decomposição do etanol, produzindo H2 e CO2 como produtos majoritários.

Estudos de proteômica, estruturais e funcionais de proteínas envolvidas na degradação da biomassa lignocelulósica: expansinas microbianas e hidrolases de glicosídeos termofílicas

O Brasil possui uma posição privilegiada quando se refere à produção de etanol. Por questões históricas e geográficas o país é responsável por mais de 30 % da produção mundial de etanol, com uma produção nacional de mais de 28 bilhões de litros em 2014. Para maximizar o rendimento desse processo, está em desenvolvimento a tecnologia associada ao etanol de segunda geração ou etanol lignocelulósico. Os principais desafios desta tecnologia são: melhorar a eficiência de conversão do substrato em produto e a produção em grande escala utilizando substratos de baixo custo. Com o objetivo de melhorar a eficiência do processo de conversão foram estudadas proteínas auxiliares (expansinas) que, em conjunto com celulases, melhoram a despolimerização de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis. Além disso, realizou-se também a caracterização de enzimas ativas de carboidratos (CAZymes) de origem termofílica do organismo Thermogemmatispora sp. T81, devido a capacidade que estas proteínas apresentam de manter a atividade e conformação estrutural em altas temperaturas por um prolongado período de tempo. A partir de análises utilizando bioinformática, os genes que codificam para expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei foram clonados e expressos em E. coli, e seus produtos gênicos (as expansinas) tiveram seus índices de sinergismo (devido atuação conjunta com coquetéis comerciais) e atividade catalítica determinados. Adicionalmente, dispondo de alinhamentos estruturais, foi proposto um mecanismo hidrolítico para elas. Em relação à bactéria Thermogemmatispora sp. T81, foram realizadas análises genômicas e proteômicas, a fim de selecionar enzimas superexpressas em meio celulósico. Seus genes foram clonados heterologamente em E. coli e o produto de expressão caracterizado bioquimicamente (cromatografia, ensaios de atividade e perfil de hidrólise) e estruturalmente (SAXS e dicroísmo circular). Os índices de sinergismo determinados foram de 2,47; 1,96 e 2,44 para as expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei, respectivamente. A partir dos alinhamentos estruturais foi proposto a díade Asp/Glu como sitio catalítico em expansinas. As análises de proteômica possibilitaram a seleção de quatro alvos de clonagem, por apresentarem alto índice de expressão quando a bactéria foi cultivada em meio celulósico. Estas proteínas foram caracterizadas quanto a atividade e apresentaram um perfil comum: temperatura ótima de ação (de 70 a 75 °C), pH ótimo de 5, e hidrolisam preferencialmente substratos hemicelulósicos (xilano). A porcentagem de estruturais secundárias das proteínas em estudo foram confirmadas com predições teóricas ao se utilizar a técnica de dicroísmo circular. Desta maneira, os objetivos iniciais propostos neste projeto foram concluídos com a determinação do grau de sinergismo das proteínas expansinas em estudo e a proposição de um mecanismo de hidrólise para as mesmas, considerando que tais proteínas por mais de 20 anos tiveram sua atividade definida exclusivamente como acessória. Além disso, este estudo contribui com a identificação e seleção de genes para CAZymes termofilícas com aplicação biotecnológica devido às propriedades termoestáveis apresentadas.

Diseño de reactores heterogéneos. Tema 2. Reactores catalíticos

Reacción catalítica. Difusión. Reacción Heterogénea.

Electrolito sólido polimérico: desde las pilas de combustible hasta la electrosíntesis orgánica

En este trabajo, en primer lugar, se presenta una nueva técnica desarrollada en nuestro laboratorio para el estudio electroquímico de las capas catalíticas de las pilas de combustible en células de tres electrodos, centrándonos en el proceso de electroxidación de ácido fórmico como reacción de test. Gracias a esta técnica se han estudiado parámetros de construcción como % en peso del metal, relación Nafion / sólidos totales y recubrimiento catalítico comprobando como la adsorción irreversible de adátomos de Bi sobre Pt soportado sobre Vulcan XC-72 favorece este proceso y como puede caracterizarse la capa catalítica de una pila de combustible de ácido fórmico (DFAFC) de forma integral utilizando estudios de sistemas nanoparticulados de Pt-Pd soportados sobre Vulcan XC-72 en el seno de ésta. En segundo lugar se ha introducido el concepto de PEMER (Polymer Electrolyte Membrane Electrochemical Reactor). De esta forma, una configuración electródica propia de las pilas de combustible se utiliza en electrosíntesis orgánica. Como reacciones test se han testeado la formación de 1-feniletanol como producto mayoritario por hidrogenación electrocatalítica de la acetofenona sobre nanopartículas de Pd soportadas sobre Vulcan XC-72 como electrocatalizador y, utilizando Pb (catalizador no noble) soportado sobre Vulcan XC-72, se ha estudiado la ruptura del puente disulfuro de L-cistina y N,N-diacetil-L-cistina (NNDAC) para obtener L-cisteína y N-acetil- L-cisteína (NAC). En ambas reacciones, hidrogenación y ruptura del puente disulfuro, se han analizado tanto parámetros constructivos de la capa catalítica como parámetros de proceso tanto a escala laboratorio con el uso de un reactor comercial de 25 cm² como a escala pre-piloto con la construcción de un reactor de 100 cm².

Alilación diastereoselectiva de N-terc-butilsulfinil iminas con bromuros alílicos: aplicación a la síntesis de heterociclos nitrogenados benzocondensados

En la presente Memoria se ha estudiado la adición estereoselectiva de diferentes bromuros alílicos mediada por indio a diferentes N-terc-butilsulfiniliminas (tBSiminas), pudiendo participar algunos de los derivados de aminas homoalílicas obtenidos en estos procesos en reacciones de ciclación intramolecular, a través de una N-arilación o una reacción de Heck, para acceder de manera estereoselectiva a estructuras más complejas. Finalmente, se ha demostrado la utilidad sintética de la metodología desarrollada aplicándola a la síntesis de algunos productos naturales y sus derivados. La Discusión de resultados aquí presentada se ha estructurado en las siguientes partes: - Alilación diastereoselectiva de tBS-cetiminas. La alilación de diferentes tBScetiminas con bromuro de alilo en presencia de indio a reflujo de THF dio lugar a los correspondientes derivados de homoalil aminas 5 con buenos rendimientos, en general, variando la diastereoselectividad encontrada con la naturaleza de las tBScetiminas de partida. Las relaciones diastereoméricas en el caso de las cetiminas aromáticas fueron moderadas (75:25-85:15 rd), teniendo lugar la alilación con total diastereoselectividad en el caso de las iminas alifáticas derivadas de metil cetonas (>98:2 rd). Por otro lado la diastereoselectividad fue baja en la alilación de iminas α,β-insaturadas no cíclicas y sorprendentemente muy elevada en los sistemas cíclicos de seis (5j) y siete (5k) eslabones (92:8 y 94:6 rd, respectivamente). - Alilación diastereoselectiva de tBS-iminas con bromuros alílicos sustituidos. La adición de reactivos de alilindio, generados a partir de bromuro de crotilo e indio, a tBS-aldiminas y –cetiminas se produjo con prácticamente total diastereoselectividad facial y buenas relaciones diastereoméricas anti/sin en el caso de tBS-iminas derivadas de benzaldehídos sustituidos y de cetonas. Sin embargo, la diastereoselectividad anti/sin fue prácticamente nula en el caso de los derivados de aldehídos alifáticos lineales. También se encontró que la adición mediada por indio de bromuro de ciclohexenilo a tBS-cetiminas tuvo lugar con alta diastereoselectividad. - Aplicaciones sintéticas de homoalilaminas con un grupo o-bromoarilo en su estructura. El tratamiento de diferentes derivados de homoalilamina 5 y 9 con un anillo aromático en su estructura, que porta a su vez en posición orto un átomo de bromo, bajo condiciones de reacción tipo Heck catalizadas por Pd, llevó a la formación de los compuestos cíclicos esperados de 5, 6 y 7 eslabones con buenos rendimientos. A su vez, también fue posible llevar a cabo la síntesis de diferentes compuestos heterocíclicos benzocondensados a través de reacciones de N-arilación intramolecular, catalizadas bien por compuestos de Cu o de Pd, en compuestos nitrogenados que portan anillos aromáticos orto-bromo sustituidos. - Síntesis estereoselectiva de alcaloides 2–alquiltetrahidroquinolínicos. Se llevó a cabo la síntesis de los productos naturales (–)-angustureína y (–)-cuspareína, siendo el primer paso de reacción en ambos casos la adición de reactivos organomagnesianos a las tBS-aldiminas 8p y ent-8p. Las síntesis se completaron tras 3 etapas adicionales: desulfinilación, N-arilación intramolecular y N-metilación, siendo los rendimientos globales del 49% y 17% respectivamente. También se preparó de manera alternativa la (–)-angustureína a partir de la N-metil-2-aliltetrahidroquinolina (23p) tras metátesis cruzada con (E)-3-hexeno e hidrogenación catalítica posterior del doble enlace olefínico. Por último y a partir del compuesto 23p, tras acoplamiento tipo Heck con 4-bromoveratrol, se llevó a cabo la síntesis de un derivado (24p) de la (–)-cuspareína.

Inmovilización de complejos organometálicos en soportes sólidos para aplicación en catálisis

La memoria de tesis titulada “Inmovilización de complejos organometálicos en soportes sólidos para aplicación en catálisis” presenta una serie de trabajos encaminados a la obtención de catalizadores híbridos, que sean estables, activos, selectivos y reutilizables en reacciones de hidrogenación e hidroformilación de olefinas. Para ello, se han estudiado diversos métodos para inmovilizar complejos metálicos en materiales carbonosos y sólidos inorgánicos: adsorción física, anclaje por formación de un enlace covalente e intercambio iónico. Estos catalizadores se han usado en las reacciones mencionadas, analizando sus propiedades catalíticas (actividad y selectividad), así como la robustez de los mismos y las posibilidades de reutilización.