Mecanismos celulares e moleculares envolvidos com alterações na expressão de glicanos durante a progressão do câncer colorretal

O câncer colorretal representa uma das maiores causas de morbidade e mortalidade relacionadas ao câncer. No Brasil, é o terceiro tipo de câncer mais frequente em homens e mulheres. Muitos estudos estão sendo desenvolvidos no sentido de esclarecer os diversos aspectos moleculares que regulam as alterações fenotípicas exibidas pelas células que constituem o câncer colorretal, no entanto, comparativamente, ainda são poucos os que são dedicados a investigar o papel de modificações co- e pós-traducionais neste processo. Entre os vários tipos destas modificações que ocorrem em proteínas, a glicosilação é a mais comum. Cogita-se que aproximadamente cinquenta por cento de todas as proteínas são glicosiladas. Durante a transformação maligna, mudanças no perfil de expressão de glicanos (carboidratos covalentemente ligados a proteínas ou lipídios) estão envolvidas em uma variedade de mecanismos celulares, tais como: perda da adesão célula-célula e célula matriz, migração, invasão e evasão da apoptose. Neste estudo, foi investigada a atividade antitumoral de inibidores da biossíntese de N-glicanos, swainsonina e tunicamicina, em células derivadas de câncer colorretal (Caco-2, HCT-116 e HT-29). Os resultados obtidos mostram que o tratamento das células HCT-116 com tunicamicina inibe mecanismos celulares relacionados ao fenótipo maligno, como formação de colônia dependente e independente de ancoragem, migração e invasão. Estes resultados sugerem que modulação da biossíntese de N-glicanos parece ser uma potencial ferramenta terapêutica para o tratamento do câncer colorretal. Em outra etapa do trabalho, foram avaliados também o impacto da estimulação com insulina e IGF-1 na expressão N-glicanos bissectados em células tumorais MDA-MB-435. Os resultados obtidos confirmaram também a existência de uma relação entre a estimulação dos receptores de insulina e IGF-1 e a regulação da expressão de N-glicanos bissectados em células tumorais MDA-MB-435, fornecendo assim informações relevantes sobre o papel desempenhado pela sinalização de insulina e IGF-1 durante a progressão de carcinomas.

Acurácia da avaliação doppler velocimétrica da velocidade máxima do pico sistólico da artéria cerebral média na detecção da anemia fetal na doença hemolítica perinatal: uma revisão sistemática

O contexto do estudo é a predição da anemia fetal em gestantes portadoras da doença hemolítica perinatal e tem como objetivo avaliar a acurácia da medida doppler velocimétrica da velocidade máxima do pico sistólico da artéria cerebral média na detecção da anemia fetal na doença hemolítica perinatal. A identificação dos estudos foi realizada com a adoção de bancos de dados gerais (MEDLINE e LILACS) e a partir de referências bibliográficas de outros autores. Os estudos selecionados tinham como critérios serem do tipo observacionais, com gestantes apresentando coombs indireto maior do que 1:8, técnica de insonação do vaso adequada, Vmax-ACM ≥ 1,5MOM, presença obrigatória de comparação com o padrão-ouro (hemoglobina fetal e/ou neonatal), e nível de evidência diagnóstica acima ou igual a 4. Os dados dos estudos selecionados foram alocados em tabelas 2x2 comparando o resultado do teste com o padrão-ouro. A acurácia diagnóstica foi expressa principalmente através da razão de verossimilhança. A revisão incluiu onze estudos, com uma amostra total de 688. Três estudos apresentaram delineamento do tipo prospectivo e nível de evidência diagnóstica categoria 1. A performance do teste em questão apresentou variação razoável. O estudo de Mari et al (2000) foi considerado o de melhor qualidade metodológica, apresentando uma RV(+) de 8,45 e uma RV(-) de 0,02. A medida do doppler da Vmax da ACM como preditor da anemia fetal na doença hemolítica perinatal está consolidada. Porém, alguns pontos precisam ser melhor esclarecidos, como o intervalo ideal dos exames em casos graves e a validade do método em fetos que já foram submetidos a transfusões intra-uterinas.

Avaliação de aspectos hematológicos, bioquímicos e de hemoparasitas em população de Didelphis aurita Wied-Neuwied, 1826 (Didelphimorphia: Didelphidae) da Serra dos Órgãos, RJ

A Floresta Tropical Atlântica apresenta uma enorme biodiversidade, e está atualmente sujeita a inúmeras pressões como a perda de área pela intensa ocupação humana, agricultura, pecuária, urbanização e industrialização. Esses impactos têm provocado desmatamento e fragmentação florestal, processos que interferem na manutenção das populações animais, inclusive afetando os ciclos silvestres de parasitas e microorganismos. Didelphis aurita é um marsupial da Mata Atlântica com alta capacidade adaptativa a ambientes perturbados. Esta espécie onívora é tolerante à fragmentação florestal, podendo sobreviver em ambientes silvestres, rurais, suburbanos e urbanos, tendo importância na conexão dos ciclos silvestres e urbanos de diversos agentes. Este trabalho teve por objetivo descrever aspectos hematológicos, bioquímicos e de hemoparasitas em Didelphis aurita de duas áreas da Serra dos Órgãos/ RJ, uma área fragmentada e outra de mata contínua. Entre julho de 2011 e fevereiro de 2012 foram capturados 61 animais que tiveram amostras de sangue avaliadas. Os resultados expressos como média desvio padrão foram: Volume Globular 38,66 % ( 4,97); Hemácias 5,40 ( 0,75) x106/mm3; Hemoglobina 12,78 ( 1,68) g/dL; VGM 71,69 ( 3,56) fl; CHGM 33,01 ( 0,63) %; Plaquetas 514,70 ( 323,10) x 103/mm3; Leucócitos 19.678,52 ( 10.152,26)/mm3; Basófilos 0,59 ( 0,72) %; Eosinófilos 13,79 ( 6,94)%; Bastonetes 0,77 ( 2,04) %; Segmentados 41,12 ( 13,95) %; Linfócitos 41,97 ( 12,97) %; Monócitos 1,75 ( 1,51)%. Para parâmetros bioquímicos encontramos os seguintes resultados: Proteínas totais 8,50 ( 1,68); albumina 3,03 ( 0,69); globulina 5,44 ( 1,66); uréia 83,57 ( 20,11); creatinina 0,44 ( 0,13); ALT 85,01 ( 65,65); AST 314,55 ( 130,58); FA 420,38 ( 371,89); GGT 19,40 ( 8,51). Os parâmetros hematócrito, hemoglobina, hematimetria, ALT, AST e FA foram maiores nos machos do que nas fêmeas. Adultos apresentaram valores de proteína plasmática total, leucócitos, hematócrito, hemoglobina, hematimetria, albumina, proteínas totais, creatinina e GGT maiores do que jovens, e o inverso ocorreu para plaquetas, globulina e FA. Animais do Fragmento apresentaram valores de massa corporal e albumina menores do que os do Garrafão, e o inverso ocorreu para GGT e globulina. Babesiasp. ocorreu em 26,6% da população, sendo mais freqüente em adultos. Estes resultados são os primeiros parâmetros de referência para Didelphis aurita na Serra dos Órgãos, contribuindo para o estudo desta espécie.

Análise da hemoglobina glicada na expressão de risco cardiovascular e renal em população acompanhada na atenção primária

Indivíduos com hemoglobina glicada (HbA1c) ≥6,5% e níveis normais de glicemia têm maior risco de complicações relacionadas ao diabetes, em médio e longo prazo. Estas evidências foram importantes na recomendação de que HbA1c ≥6,5% fosse aceita como critério diagnóstico de diabetes. Diferenças raciais/ étnicas tem sido encontradas quanto aos níveis de HbA1c. Níveis elevados de HbA1c em indivíduos sem diabetes e com níveis normais de glicemia em jejum tem sido associados a alterações micro e macrovasculares, entre elas alterações da filtração glomerular. Diversos marcadores inflamatórios, em especial a MCP-1 (proteína quimiotática de macrófagos-1), estão envolvidos no mecanismo de lesão glomerular descrito em casos de nefropatia diabética No entanto, a HbA1C ainda não foi amplamente incorporada a rotina de diagnóstico e de acompanhamento na atenção primária brasileira. O objetivo deste estudo foi o de investigar a associação entre a alteração da HbA1c e da glicemia e fatores étnicos/ raciais e de risco cardiovascular e renal em adultos assistidos pelo Programa Médico de Família de Niterói, sem diagnóstico prévio de diabetes. Trata-se de um estudo transversal, onde foram reunidas informações de participantes do Estudo Cardio Metabólico Renal (CAMELIA), colhidas entre os meses de julho de 2006 a dezembro de 2007. Observou-se que o perfil de risco cardiovascular foi mais acentuado em indivíduos com alterações simultâneas da glicemia e da HbA1c. A alteração isolada da glicemia indicou ser condição de maior risco que a alteração isolada da HbA1c. Indivíduos com HbA1c ≥ 6,5% eram em sua maioria mulheres de pele preta e apresentavam maiores níveis de LDL e creatinina sérica. Verificamos associação independente entre a alteração da HbA1c (≥ 5,7 e < 6,5% versus < 5,7%) e diminuição da taxa de filtração glomerular estimada. A HbA1c mostrou ser um marcador subclinico de alterações metabólicas em pacientes nao diabéticos e com glicemia de jejum < 126 mg/dL, em especial na população de mulheres e de indivíduos com a cor da pele preta. Os resultados apontam para a possibilidade de se utilizar a HbA1c como marcador de risco cardiovascular e renal visando propor estratégias de intervenção precoce e assim promover a prevenção de condições de agravos relacionados as alterações do metabolismo da glicose.

A influência do metabolismo redox na transmissão da doença de Chagas

As formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi proliferam e se diferenciam no interior de diferentes compartimentos do trato digestivo dos triatomíneos. Esses ambientes antagônicos, no que diz respeito à concentração de nutrientes, pH e status redox, constituem um desafio para o protozoário por conterem moléculas e fatores capazes de deflagrar diferentes sinalizações e respostas no parasito. Por isso, testamos a influência de produtos abundantes do metabolismo do vetor e de status redox distintos, frente aos processos de proliferação e diferenciação in vivo e in vitro. Como exemplo temos o heme e a hemozoína, subprodutos da digestão da hemoglobina, e o urato, rico na urina dos insetos. O heme é uma importante molécula em todos os seres vivos. Nosso grupo mostrou seu papel na proliferação in vitro de T. cruzi e que esse sinal é governado pela enzima redox-sensível CaMKII (Lara et al., 2007; Souza et al., 2009). Esse efeito parece depender de uma sinalização redox, onde o heme e não seus análigos induz a formação de EROs, modulando a atividade da CaMKII (Nogueira et al, 2011). Apesar de gerar espécies reativas de oxigênio (EROs) em formas epimastigotas, o heme não alterou a ultraestrutura desses parasitos mostrando uma adaptação a ambientes oxidantes. Além disso, a adição de FCCP inibiu a formação de EROs mitocondrial, diminuindo a proliferação dos parasitos. Em contrapartida, a AA aumentou drasticamente a produção de EROs mitocondrial levando à morte dos epimastigotas. Estes resultados confirmam a hipótese de regulação redox do crescimento de epimastigotas. A formação de β- hematina (hemozoína) constitui uma elegante estratégia para minimizar o efeito tóxico do heme nos insetos hematófagos. Contudo, a β-hematina não influenciou a proliferação ou a metaciclogênese in vitro. Já o urato, e outros antioxidantes clássicos como o GSH e o NAC prejudicaram a proliferação in vitro de epimastigotas. Estes efeitos foram parcialmente revertidos quando os antioxidantes foram incubados juntamente com o heme. Durante a metaciclogênese in vitro, o NAC e o urato induziram um aumento significativo das formas tripomastigotas e levaram a diminuição da porcentagem de formas epimastigotas. Em contrapartida, o heme e a β-hematina apresentaram o efeito oposto, diminuindo a porcentagem de formas tripomastigotas e aumentando a de epimastigotas. No intuito de confirmar a influencia do status redox na biologia do parasito in vivo, nós quantificamos a carga parasitária nas porções anterior e posterior e no reto do triatomíneo alimentado na presença ou na ausência de NAC e urato por qPCR. O tratamento com os antioxidantes aumentou a carga parasitária em todas as partes do intestino analisadas. Posteriormente, para diferenciar as formas evolutivas responsáveis pelo incremento da carga parasitária, foram realizadas contagens diferenciais nas mesmas porções do intestino do inseto vetor. Cinco dias após a infecção foi observado aumento significativo de formas tripomastigotas e diminuição de formas epimastigotas in vivo. Em conjunto, estes dados sugerem que, assim como a concentração de nutrientes e o pH, o status redox também pode influenciar a biologia do T. cruzi no interior do inseto vetor. Neste cenário, moléculas oxidantes agiriam a favor da proliferação, e em contraste, antioxidantes parecem favorecer a metaciclogênese.

Correlação do perfil lipídico e do quadro clínico de pacientes portadores de doença falciforme no Estado do Rio de Janeiro-RJ

A doença falciforme é uma síndrome hematológica genética que faz parte das hemoglobinopatias de grande abrangência na população mundial. Estima-se que 4,5% da população apresente algum tipo de hemoglobinopatia, cujos aspectos clínicos oscilam de leve à grave. O principal fator que pode influenciar o fenótipo das doenças falciformes é o genótipo da doença; homozigose para HbS ou genótipos compostos do tipo HbSC, HbS/beta-talassemia, HbSD. Este pode desenvolver distúrbios como dislipidemia, colelitíase e transtornos cardiovasculares que podem causar o óbito. O presente estudo visa correlacionar o perfil lipídico de pacientes portadores de doença falciforme. Foram avaliados 52 pacientes do Serviço de Hematologia Clínica do Hospital Universitário Pedro Ernesto HUPE-UERJ, portadores da doença falciforme confirmada pela técnica de HPLC realizada no Laboratório de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia (LACFAR)-UFRJ. As análises hematológicas compostas pelo hemograma completo e dosagens bioquímicas do perfil lipídico formado pela dosagem de triglicerídeos, colesterol total, colesterol HDL, colesterol LDL e colesterol VLDL. A população estudada é composta por 52 pacientes, sendo 22 pacientes do sexo masculino, representando 42% do total de pacientes e 30 do sexo feminino, definindo 58% do total. E com objetivo comparativo, foi constituído um grupo controle de 52 pessoas com média de idade 26 anos, variando entre 5 e 63 anos. A população de Doença Falciforme apresenta grupos etários que oscilam entre 6 e 60 anos de idade, tendo média de 28 anos. Baseada nas características fenotípicas definidas por HPLC, a classificação de hemoglobina demonstra um grupo de 83% de portadores de Hemoglobina SS (n=43), 13% portadores de Hemoglobina SC (n=7) e 4% com Hemoglobina SB0 (n=2). Em relação às dosagens bioquímicas, a análise do perfil lipídico demonstra hipocolesterolemia, cuja média da população é definida por 122mg/dL quando comparada com o grupo controle (GC) com média de 201mg/dL (p<0,001). A taxa do colesterol-HDL situa-se na média de 29mg/dL e do GC 54 mg/dL (p<0,001) e do colesterol-LDL 69mg/dL enquanto o GC 120mg/dL (p<0,001). A sistematização dos resultados hematológicos define uma média de hematimetria de 2,7. 106/mm3. Na dosagem de hemoglobina obteve-se média de 8,4g/dL. Tais resultados caracterizam que é predominante neste grupo a hipocromia sem expressão de microcitose. Dentre os processos patológicos mais comuns, a litíase biliar se destacou nos pacientes com doença falciforme, onde 25% dos pacientes estudados (n=13) apresentaram este comprometimento hepatobiliar, na qual grande parte desses pacientes foram submetidos à colecistectomia. A doença Falciforme cursa com hiperplasia medular principalmente às custas da hiperproliferação dos precursores eritróides na medula óssea. O estado hiperproliferativo nessa doença possivelmente causa redução do colesterol plasmático para atender à maior demanda deste elemento para síntese de novas membranas. Esta redução na produção endógena de colesterol pode ser entendida pela disfunção hepática que habitualmente está presente em pessoas com doença falciforme. Logo se concluiu que existe uma correlação de hipocolesterolemia total e de HDL-c baixo em pacientes com doença falciforme.

Indicadores de neuropatia autonômica cardiovascular em pacientes com diabetes tipo 1

A Neuropatia autonômica cardiovascular (NAC), apesar de ter sido apontada como fator de risco independente para doença cardiovascular (DCV) em pacientes com diabetes tipo 1 (DM1), permanece subdiagnosticada. Os objetivos do trababalho foram determinar a prevalência de NAC e seus indicadores clínicos e laboratoriais em pacientes com DM1 e a associação com outras complicações crônicas do diabetes, além de avaliar a concordância entre os critérios diagnósticos da NAC determinados pelos parâmetros da análise espectral e pelos testes reflexos cardiovasculares. Pacientes com DM1, duração da doença ≥ 5 anos e com idade ≥ 13 anos foram submetidos a um questionário clínico-epidemiológico, a coleta de sangue e de urina para determinação da concentração urinária de albumina, ao mapeamento de retina, e exame clínico para pesquisa de neuropatia diabética sensitivo motora além da realização de testes reflexos cardiovasculares. Cento e cinquenta e um pacientes com DM1, 53.6 % do sexo feminino, 45.7% brancos, com média de idade de 33.4 13 anos, idade ao diagnóstico de 17.2 9.8 anos, duração de DM1 de 16.3 9.5 anos, índice de massa corporal (IMC) de 23.4 (13.7-37.9) Kg/m2 e níveis de hemoglobina glicada de 9.1 2% foram avaliados. Após realização dos testes para rastreamento das complicações microvasculares, encontramos neuropatia diabética sensitivo motora, retinopatia diabética, nefropatia diabética e NAC em 44 (29.1%), 54 (38%), 35 (24.1%) e 46 (30.5%) dos pacientes avaliados, respectivamente. A presença de NAC foi associada com idade (p=0.01), duração do DM (p=0.036), HAS (p=0.001), frequência cardíaca em repouso (p=0.000), HbA1c (p=0.048), uréia (p=0.000), creatinina (p=0.008), taxa de filtração glomerular (p=0.000), concentração urinária de albumina (p=0.000), níveis séricos de LDL-colesterol (p=0.048), T4 livre (p=0.023) e hemoglobina (p=0.01) e a presença de retinopatia (p=0.000), nefropatia (p=0.000) e neuropatia diabética sensitivo motora (p=0.000), além dos seguintes sintomas; lipotimia (p=0.000), náuseas pós alimentares (p=0.042), saciedade precoce (p=0.031), disfunção sexual (p=0.049) e sudorese gustatória (p=0.018). No modelo de regressão logística binária, avaliando o diagnóstico de NAC como variável dependente, foi observado que apenas a FC em repouso, presença de neuropatia diabética sensitivo motora e retinopatia diabética foram consideradas variáveis independentes significativamente. A NAC é uma complicação crônica comum do DM1, atingindo cerca de 30% dos pacientes estudados e encontra-se associada à presença de outras complicações da doença. Indicadores da presença de NAC nos pacientes avaliados incluíram a idade, duração do diabetes, presença de HAS, frequência cardíaca de repouso e presença de sintomas sugestivos de neuropatia autonômica. O presente estudo ratifica a importância do rastreamento sistemático e precoce desta complicação.

植物血红蛋白基因及植物凝集素基因转化水稻的研究

植物血红蛋白在共生固氮根瘤中主要是对固氮酶进行嫌氧保护，确保固氮酶活性，在植物根中协助氧的运输或作为感觉氧压的信号分子．豆科植物凝集素功能之一是对相应专一的根瘤菌有识别作用，并有利于根瘤菌的聚集和侵染。本论文将非豆科结瘤植物Parasponia andersonii血红蛋白基因及豌豆凝集索基因转入水稻，目的是此二基因表达后，豌豆凝集素可聚集、识别豌豆根瘤菌，并有助于它们的侵染，血红蛋白则可对根瘤菌固氮酶进行嫌氧保护，保障其发挥固氮作用，从而为实现水稻结瘤和固氮打下初步基础。 本论文将带有Parasponia血红蛋白基因的pL305质粒，带有潮霉素磷酸转移酶基因及Parasponia血红蛋白基因的农杆菌双元载体质粒pLX412-Hb用花粉管通道法转化水稻l用pLX412-Hb和带有Bar基因、豌豆凝集素基因、Parasponia血红蛋白基因的质粒pLHB用基因枪法转化水稻幼胚及愈伤组织，带有pLX412-Hb的Agrobactmum tumefaciens LBA4404转化烟草，得到如下结果： 1．用pL305质粒花粉管通道法转化水稻，运作1512朵花，得到707粒种子．将230粒种子萌发，发芽220粒;白化苗4株，成苗206株;计发芽率96%，白化苗率1.7%，成苗率90%。取120株提取DNA以Parasponia血红蛋白基因为探针进行点杂交，有6株为阳性结果，阳性率5%．再取4株DNA点杂交阳性植株DNA，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southem杂交，有3株有阳性结果，阳性率为75%，照此推算转化植株约占总植株的4%．目前，这些转基因植株已开花结实。 2．用pLX412-Hb质粒花粉管通道法转化水稻，运作743朵花，得到340粒种子。将120粒种子萌发，发芽117粒，白化苗3株，成苗111株;计发芽率97. 5%，白化苗率2. 5%，成苗率92. 5%．取30株提取DNA以Parasponia血红蛋白基因为探针进行点杂交，有4株为阳性结果，阳性率13%。再取4株DNA点杂交呈阳性的植株DNA，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southern杂交，有2株有阳性结果，阳性率为50%，照此推算转化植株约占总植株的7%。目前部分转基因植株巳开花结实． 3.用pLX412 - Hb质粒基因枪法转化水稻幼胚及愈伤组织，抗性筛选得到15株再生植株，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行点杂交，有14株为阳性结果，阳性率93%．取7株DNA点杂交呈阳性的植株DNA，以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southern杂交，都为阳性结果，阳性率为100%，照此推算转化植株约占总植株的93%．目前，部分转基因植株已开花结实． 4．用pLX412 -Hb质粒通过Agrobacterrum tumeFaciens LBA4404转化烟草，抗性筛选得到的再生植株以Parasponia血红蛋白基因为探针进行Southern杂交，结果为阳性． 5．用pLHB基因枪法转化的愈伤组织，抗性筛选得到已分化出绿芽点的愈伤组织，以Parasponia血红蛋白基因为探针或以豌豆凝集素基因为探针进行Southern杂交，杂交结果均为阳性． 6．最近国外巳发现大麦有血红蛋白基因．本论文以大麦血红蛋白cDNA为探针对未转基因的水稻进行Southern杂交，结果有阳性带。说明水稻有与大麦血红蛋白基因高度同源序列。以Parasponia血红蛋白基因为探针时杂交结果为阴性，说明水稻血红蛋白基因与Parasponiaa血红蛋白基因核苷酸序列相差较大． 7．提取Southern杂交证明有Parasponia血红蛋白基因整合的水稻根及叶总RNA，以Parasponia血红蛋白基因cDNA为探针进行RNA点杂交，结果根总RNA为阳性，叶总RNA为阴性。初步证明Parasponia血红蛋白基因在水稻根中表达。 8．提取未转基因的水稻根及叶RNA，以大麦血红蛋白基因cDNA为探针进行RNA点杂交，结果：根总RNA为阳性结果，叶总RNA为阴性结果．初步证明水稻血红蛋白基因在水稻根中表达。 总之，本论文证明已将Parasponia血红蛋白基因整合进水稻植株染色体，将豌豆凝集素基因、Parasponia血红蛋白基因整合进水稻愈伤组织染色体，初步证明水稻有血红蛋白基因，内外源血红蛋白基因都有组织特异性表达，从而为本研究的战略设想奠定初步基础。

两个固氮相关的植物基因对烟草和水稻的转化及其表达

豆科植物凝集素基因和血红蛋白基因在对根瘤菌的识别作用和类菌体在低氧分压下的共生固氮中起重要作用。本文的目的是试图将这两个基因转移到非豆料植物烟草和水稻，使其能识别根瘤菌，探讨非豆科植物的共生和联合固氮的可能性。 构建了含有豌豆凝集素（P－Lec）基因、Parasponia andersonii血红蛋白基因、gus基因及植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）的两个植物表达载体pCBHL和pCBHUL;同时，还构建了含有P－Lec基因、gus基因及植物选择标记PPT乙酰转移酶基因（bar）的植物表达载体pBBUL。在pCBHL中，CaMV35S启动子调控P－Lec基因的表达，而在pCBHUL和pBBUL中，该基因由玉米Ubiquitin 1启动子调控。 用农杆菌法将pCBHL导入烟草，得到53株再生植株，PCR检测表明转化频率为88％。用基因枪法分别将pCBHUL和pBBUL导入水稻幼胚或幼胚诱导的愈伤组织。转pCBHUL的材料共得到40株再生植株，经分子检测有18株分转基因植株，转化频率为0.9%。转pBBUL的幼胚愈伤组织经PPT筛选，只得到能分化出小芽的抗性愈伤组织。 PCR检测、Southern杂交表明P-Lec基因和Paraspoina血红蛋白基因都已经整合到转基因烟草及水稻的基因组中，转基因水稻植株中两个外源目的基因的拷贝数较高。Western杂交分析转基因植物中P-Lec基因的表达情况，结果表明该基因在转基因的烟草和水稻叶片中得到正确地表达。同时，GUS组织化学染色表明转基因烟草的嫩茎和幼根，转基因水稻的嫩叶和幼根中都有gus基因的表达。转基因烟草中外源基因的表达频率高于转基因水稻。T1代转基因烟草幼根的蛋白原位免疫杂交显示P-Lec正确定位于正在生长的幼根根毛的顶端，与对照豌豆中的P-Lec基因表达部位相一致。关于Parasponia血红蛋白基因，以前本实验室对转基因烟草和水稻的研究表明有转录水平的表达，国外实验室证实转基因烟草中有转译表达。 上述结果有可能为进一步研究转基因非豆科植物与根瘤菌的相互作用奠定一定的基础。

白杄花粉管微丝骨架介导信号传导的蛋白质组学研究

在高等植物有性生殖过程中，花粉管作为运输精子到胚珠的载体，它的生长具有高度极性化，并且要依赖于微丝。由于花粉管本身所具的特性，它已经成为研究细胞相互识别、胞内和胞外信号的模式系统。本文为了研究微丝在白杄（Picea meyeri Rehd. et Wils.）花粉管生长中的作用，我们应用不同浓度的微丝聚合抑制剂Latrunculin B (LATB) 处理花粉管，并通过激光共聚焦显微镜观察微丝聚合状态的动态变化。结果发现，在低浓度下的LATB能使花粉管中的微丝严重解聚，且抑制其顶端生长。 我们进一步利用蛋白质组学的手段，分析了白杄花粉管微丝解聚后蛋白质的表达图谱。通过双向电泳分离出500个左右考马斯亮兰染色的蛋白质斑点，经过软件分析发现，其中大部分蛋白质的表达量未发生变化，而只有110个蛋白斑点有较大变化。将这些蛋白斑点从胶上切下酶解后用于质谱鉴定，最终鉴定出35个蛋白，其中有18个为上调蛋白，17个下调蛋白。根据其主要功能，通常可分为碳水化合物代谢、胁迫反应、信号和细胞扩展等几类。我们发现由于微丝解聚引起的能量代谢水平降低，可能与依赖于信号传导的微丝重组过程相关。此外，当LATB浓度增加到50 nM时，与细胞壁多糖合成相关的两个蛋白，如reversibly glycosylated polypeptide和type IIIa membrane protein cp-wap13几乎不表达，这说明当微丝聚合完全被抑制后，依赖于微丝的分泌系统也受到影响，从而引起相应蛋白质变化，最终导致细胞壁成分合成的减少。细胞骨架蛋白actin的下调，进一步说明微丝在花粉管生长过程中起着提供或支持的一种机制，也就是能调节信号介导的花粉管生长，并使其在特定的时期到达特定的部位，从而完成植物的受精作用。

Toxic effects of dietary seaweeds Sargassum bovianum, Caulera faridii and Gracilaria corticata on blood parameters of albino rats

The present communication deals with the feeding trials of brown (Sargassum bovianum), green (Caulerpa faridii) and red (Gracilaria corticola) seaweeds in albino rats for a period of thirty days in order to investigate their digestibility and acceptability as supplementary food for animals. The parameters used were: changes in blood hemoglobin, ESR, MCHC, PCV and plasma vitamin levels. The result revealed that all the three species of seaweeds had acceptability up to 5% level, as no ill effect was noted during the experiment. But at 10% and 20% levels, marked changes were observed in blood parameters with diarrhea, vomiting and convulsions indicating possibilities of either tissue and muscular dystrophy, gastrointestinal tract necrosis or functional disorder of central nervous system. A heavy mortality was noted due to excessive water loss through diarrhea and vomiting. However, no mortality was observed after 22nd day at both 10% and 20% levels with subsided clinical signs. The results suggest that these three seaweed species could be used safely as a supplementary food, in native form, in animals at low concentrations.

Haematological and biochemical alterations of Catla catla fingerlings following sublethal exposure to Nuvan

The sublethal exposure (0.24 ppm) of Nuvan on some biochemical compositions such as serum protein, blood glucose, glutamate oxaloacetate transaminase (AST) and glutamate pyruvate transaminase (ALT) and on some hematological parameters such as red blood corpuscles (RBC), white blood corpuscles (WBC), hemoglobin content (Hb), mean corpuscular concentration (MCV), mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC) of Catla catla fingerlings were studied. The hematological and biochemical parameters evoked a significant reduction (excepting MCV, ALT and AST which is significantly increased) with increasing days of Nuvan exposure.

Comparative effect of Pediococcus acidilactici and Lactococcus lactis on growth performance, survival and enzyme activity of western white leg shrimp (Litopenaeus vannamei)

This study was done in Shahid Kiani Marine Aquaculture Development Center, Choebde, Abadan in order to evaluate the effects of Pediiococcus acidilactici, Lactococcus lactis and vitamin C on growth performance, survival, enzymatic activities and immune responses of L. vannamei during three months. Treatments were included control group, Pediiococcus and Lactococcus treatments which fed with diet containing 1×10P9P cfu gP_1P bacteria and vitamin C. At the end of the experiment, the growth factors, immune parameters, digestive enzymes, intestinal, histology of intestine, carcasses and microbial flora (bacterial total count and lactic acid count) were evaluated. The results indicated that administration of lactobacillus had significant effects on the growth factors as the highest weight, increase specific growth rate, relative growth rate, feed conversion ratio and protein efficiency in the shrimps received pediococcus and then Lactococcus (P<0.05). The best immune function was also observed in the shrimps fed by probiotics, so that proteins and hemoglobin̛ hemolymph, phenoloxidase activity and challenged with V. parahaemolyticus showed a statistical difference comparing to the control group and the group received vitamin C (P<0.05). Some digestive enzymes, in pediococcus treatment showed a significant increase when compared to other treatments (P<0.05). Significant changes in bacterial intestinal flora were observed in probiotic groups compared with control and vitamin C groups (P < 0.05). Histological results showed the positive effects of probiotics in the gut (P < 0.05). While these supplements cannot caused to significant impacts on the shrimp carcass composition (P ˃ 0.05). As a result pediococcus group had the best performance among treatments.

Cloning and expression of zebra fish ferroportin and investigating its influence on anemia

Iron is required for many microbes and pathogens for their survival and proliferation including Leishmania which cause leishmaniasis. Leishmaniasis is an increasingly serious infectious disease with a wide spectrum of clinical manifestations. These range from localized cutaneous leishmaniasis (CL) lesions to a lethal visceral form. Certain strains such as BALB/c mice fail to control L. major infection and develop progressive lesions and systemic disease. These mice are thought to be a model of non-healing forms of the human disease such as kala-azar or diffuse cutaneous leishmaniasis. Progression of disease in BALB/c mice has been associated with the anemia, in last days of their survival, the progressive anemia is considered to be one of the reasons of their death. Ferroportin (Fpn), a key regulator of iron homeostasis is a conserved membrane protein that exports iron across the duodenal enterocytes as well as macrophages and hepatocytes into the blood circulation. Fpn has also critical influence on survival and proliferation of many microorganisms whose growth is dependent upon iron, thus preparation of Fpn is needed to study the role of iron in immune responses and pathogenesis of micoorganisms. To prepare and characterize a recombinant ferroportin, total RNA was extracted from Indian zebrafish duodenum, and used to synthesize cDNA by RT-PCR. PCR product was first cloned in Topo TA vector and then subcloned into the GFP expression vector pEGFP–N1. The final resulted plasmid (pEGFP-ZFpn) was used for expression of FPN-EGFP protein in Hek 293T cells. The expression was confirmed by fluorescence microscopy and flow cytometery. Recombinant Fpn was further characterized by submission of its predicted amino acid sequences to the TMHMM V2.0 prediction server (hidden Markov model), NetOGlyc 3.1 server and NetNGlyc 3.1 server. Data emphasised that obtained Fpn from indian zebrafish contained eight transmembrane domains with N- and C-termini inside the cytoplasm and harboured 78 mucin-type glycosylated amino acid. The results indicate that the prepared and characterized recombinant Fpn protein has no membrane topology difference compared to other Fpn described by other researcher. Our next aim was to deliver recombinant plasmid (pEGFP-ZFpn) to entrocyte cells. However, naked therapeutic genes are rapidly degraded by nucleases, showing poor cellular uptake, nonspecificity to the target cells, and low transfection efficiency. The development of safe and efficient gene carriers is one of the prerequisites for the success of gene therapy. Chitosan and alginate 139 polymers were used for oral gene carrier because of their biodegradability, biocompatibility and their mucoadhesive and permeability-enhancing properties in the gut. Nanoparticles comprising Alginate/Chitosan polymers were prepared by pregel preparation method. The resulting nanoparticles had a loading efficiency of 95% and average size of 188 nm as confirmed by PCS method and SEM images had showed spherical particles. BALB/c mice were divided to three groups. The first and second group were fed with chitosan/alginate nanoparticles containing the pEGFP-ZFpn and pEGFP plasmid, respectively (30 μgr/mice) and the third group (control) didn’t get any nanoparticles. The result showed BALB/c mice infected by L.major, resulted in higher hematocryte and iron level in pEGFP-ZFpn fed mice than that in other groups. Consentration of cytokines determined by ELISA showed lower levels of IL-4 and IL-10 and higher levels of IFN-γ/IL-4 and IFN-γ/IL-10 ratios in pEGFP-ZFpn fed mice than that in other groups. Morover more limited increase of footpad thickness and significant reduction of viable parasites in lymph node was seen in pEGFP-ZFpn fed mice. The results showed the first group exhibited a highr hematocryte and iron compared to the other groups. These data strongly suggests the in vivo administration of chitosan/alginate nanoparticles containing pEGFP-ZFpn suppress Th2 response and may be used to control the leishmaniasis .

Comparative study of seasonal changes in some blood parameters and genetic polymorphisms of serum antibodies and antigens on red blood cells surface in immature Caspian salmon

Seasonal sampling from 40 immature Caspian salmon were performed in summer, autumn, winter and spring. The maximum ranges of RBC counts, Hct, Hb, WBC count and clotting times were observed in spring, summer, spring, spring and winter, respectively. The minimum amounts of these factors were counted in summer, winter, winter, winter and winter, respectively. Blood Samples were taken from healthy smolt, immature and adult Caspian salmon in spawning time. Hematological determinations and biochemical serum analysis were performed in 101 fish in the three samples. The ranges of hematological values for sample mean were counted. Red blood cell counts were 866600 mm3 and 1259400 mm3 in smolt and adult respectively. Hematocrit was 48.39% in smolt and 44.29% in adult. Hemoglobin was 8.85 gr/dl in smolt and 10.91 gr/dl in adult. White blood cell count was 8781.58 mm3 in smolt and 5217.55 mm3 in adult and mean were differential of WBC, Lymphocyte 90.57%in smolt and73.22% in adult. Neutrophil was 5.12% in smolt and 16.92% in adult, Monocyte were 1.27% in smolt and 4.24% in adult, Clotting time was 282.34 Seconds in smolt and 291.47 seconds in adult MCV, MCH and MCHC also meagered in smolt and adult. Biochemical parameter in immature and mature Caspian salmon meagered .Glucose concentration was 2.97 mmol.l- in immature and 1.99 mmol.l- in mature .Cholesterol concentration was 4.26 mmol.l- in immature and 7.06 mmol.l- in mature. Triglyceride amount was 2.35 mmol.l- in immature and 2.47 mmol.l- in mature and Calcium was 2.47 in immature and 2.61 mmol.l- in mature. An in situ study was made on erythrocytic isoantigens and hetero-antigen and their corresponding iso-and hetero-antibodies of sera by means of hemoagglutination tests on the blood sample, of 450 immature and 50 mature Caspian salmon. The absence of erythrocyte iso-antigens and hetero-antigen and their corresponding iso-and hetero-antibodies were shown by the experimental. It could be indicated an intra-specific variation and differences in species for kelardasht hatchery.