Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development

The adipocyte-derived hormone leptin is required for normal pubertal maturation in mice and humans and, therefore, leptin has been recognized as a crucial metabolic cue linking energy stores and the onset of puberty. Several lines of evidence have suggested that leptin acts via kisspeptin expressing neurons of the arcuate nucleus to exert its effects. Using conditional knockout mice, we have previously demonstrated that deletion of leptin receptors (LepR) from kisspeptin cells cause no puberty or fertility deficits. However, developmental adaptations and system redundancies may have obscured the physiologic relevance of direct leptin signaling in kisspeptin neurons. To overcome these putative effects, we re-expressed endogenous LepR selectively in kisspeptin cells of mice otherwise null for LepR, using the Cre-loxP system. Kiss1-Cre LepR null mice showed no pubertal development and no improvement of the metabolic phenotype, remaining obese, diabetic and infertile. These mice displayed decreased numbers of neurons expressing Kiss1 gene, similar to prepubertal control mice, and an unexpected lack of re-expression of functional LepR. To further assess the temporal coexpression of Kiss1 and Lepr genes, we generated mice with the human renilla green fluorescent protein (hrGFP) driven by Kiss1 regulatory elements and crossed them with mice that express Cre recombinase from the Lepr locus and the R26-tdTomato reporter gene. No coexpression of Kiss1 and LepR was observed in prepubertal mice. Our findings unequivocally demonstrate that kisspeptin neurons are not the direct target of leptin in the onset of puberty. Leptin signaling in kisspeptin neurons arises only after completion of sexual maturation.

4-chlorophenol biodegradation by Arthrobacter chlorophenolicus A6

A microorganism was isolated which could grow on unusually high concentrations of the toxic pollutant 4-chlorophenol. Taxonomic studies showed that the microorganism constituted a novel species within the genus Arthrobacter and it was named Arthrobacter chlorophenolicus A6. A. chlorophenolicus A6 was chromosomally tagged with either the gfp gene, encoding the green fluorescent protein (GFP), or the luc gene, encoding firefly luciferase. When the tagged cells were inoculated into 4-chlorophenol contaminated soil they could completely remove 175 µg/g 4-chlorophenol within 10 days, whereas no loss of 4-chlorophenol was observed in the uninoculated control microcosms. During these experiments the gfp and luc marker genes allowed monitoring of cell number and metabolic status. When A. chlorophenolicus A6 was grown on mixtures of phenolic compounds, the strain exhibited a preference for 4-nitrophenol over 4-chlorophenol, which in turn was preferred over phenol. Analysis of growth and degradation data indicated that the same enzyme system was used for removal of 4-chlorophenol and 4-nitrophenol. However, degradation of unbstituted phenol appeared to be mediated by another or an additional enzyme system. The luc-tagged A. chlorophenolicus A6 gave valuable information about growth, substrate depletion and toxicity of the phenolic compounds in substrate mixtures. The 4-chlorophenol degradation pathway in A. chlorophenolicus A6 was elucidated. The metabolic intermediate subject to ring cleavage was found to be hydroxyquinol and two different pathway branches led from 4-chlorophenol to hydroxyquinol. A gene cluster involved in 4-chlorophenol degradation was cloned from A. chlorophenolicus A6. The cluster contained two functional hydroxyquinol 1,2-dioxygenase genes and a number of other open reading frames presumed to encode enzymes involved in 4-chlorophenol catabolism. Analysis of the DNA sequence suggested that the gene cluster had partly been assembled by horizontal gene transfer. In summary, 4-chlorophenol degradation by A. chlorophenolicus A6 was studied from a number of angles. This organism has several interesting and useful traits such as the ability to degrade high concentrations of 4-chlorophenol and other phenols alone and in mixtures, an unusual and effective 4-chlorophenol degradation pathway and demonstrated ability to remove 4-chlorophenol from contaminated soil.

Interazioni tra le glicoproteine D, B, H ed L critiche per la fusione indotta dal virus Herpes simplex

Four glycoproteins (gD, gB, gH, and gL) are required for herpes simplex virus (HSV) entry into the cell and for cell-cell fusion in transfected cells. gD serves as the receptor-binding glycoprotein and as the trigger of fusion; the other three glycoproteins execute fusion between the viral envelope and the plasma or endocytic membranes. Little is known on the interaction of gD with gB, gH, and gL. Here, the interactions between herpes simplex virus gD and its nectin1 receptor or between gD, gB, and gH were analyzed by complementation of the N and C portions of split enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused to the glycoproteins. Split EGFP complementation was detected between proteins designated gDN + gHC, gDN + gBC, and gHN + gBC + wtgD, both in cells transfected with two or tree glycoproteins and in cells transfected with the four glycoproteins, commited to form syncytia. The in situ assay provides evidence that gD interacts with gH and gB independently one of the other. We further document the interaction between gH and gB. To elucidate which portions of the glycoproteins interact with each other we generated mutants of gD and gB. gD triggers fusion through a specialised domain, named pro-fusion domain (PFD), located C-terminally in the ectodomain. Here, we show that PFD is made of subdomains 1 and 2 (amino acids 260–285 and 285–310) and that each one partially contributed to herpes simplex virus infectivity. Chimeric gB molecules composed of HSV and human herpesvirus 8 (HHV8) sequences failed to reach the cell surface and to complement a gB defective virus. By means of pull down experiments we analyzed the interactions of HSV-HHV8 gB chimeras with gH or gD fused to the strep-tag. The gB sequence between aa residues 219-360 was identified as putative region of interaction with gH or critical to the interaction.

Struktur, Funktion und potentielle Anwendung der PKC- und SNZ,SNO-Promotoren aus Geodia cydonium und Suberites domuncula

Die Schwämme (Porifera) sind eine reiche Quelle bioaktiver Naturstoffe. Viele dieser Naturstoffe besitzen das Potential, als Pharmazeutika, molekulare Sonden usw. eingesetzt oder weiterentwickelt zu werden. Die Beschaffung dieser Naturstoffe in ausreichenden Mengen stellt jedoch eines der größten Probleme bei der Testung und Produktion vielversprechender Substanzen dar. Der Transfer von DNA in Schwammzellen bzw. in komplette Organismen wäre ein vielversprechender Ansatz, dieses Problem zu lösen. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die Funktion und Struktur homologer Promotoren zu untersuchen und eine Methode des Gentransfers in Schwammzellen auszuarbeiten. Zu diesem Zweck wurde zusätzlich zu der bereits vorhandenen 5'-flankierenden Region des conventional PKC-Gens aus Geodia cydonium eine genomische Bibliothek von Suberites domuncula konstruiert, um diese mit Hilfe des DNA-Homologiescreenings nach den 5'-flankierenden Regionen des cPKC- und des SNZ (SnooZe)-Gens (SD_SNZG) zu durchsuchen. Die Klonierung und Sequenzierung sowohl des 5'-Bereichs als auch die Charakterisierung der Exon-Intron Struktur beider Gene wurde erfolgreich durchgeführt. In der 5'-Region des SNZ-Gens konnte dabei ein weiteres Gen (SD_SNO; SNZ proximal Open Reading Frame) identifiziert werden, das in einer 'Kopf-an-Kopf' Anordnung zu SD_SNZG orientiert ist. Sowohl SD_SNZG als auch SD_SNO wurden hochkonservierten Genfamilien zugeordnet, deren Vorkommen in Metazoen hier erstmals beschrieben wird.Funktionelle Studien mit Hilfe der Reportergene Luciferase und Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) im heterologen System der NIH 3T3 Zellen wiesen sowohl dem cPKC-Promotor aus G. cydonium als auch dem SNZ-Promotor aus S. domuncula eine starke Promotoraktivität im Verhältnis zum SV40-Promotor nach. Die Aktivität des cPKC-Promotors aus S. domuncula dagegen war relativ schwach. Darüber hinaus konnte geklärt werden, daß die 5'-flankierende Region des SNZ-Gens bidirektionale Promotoraktivität aufweist und daß der G. cydonium cPKC-Promotor keine TATA-Box besitzt, sondern eine GC-Box für die basale Funktion benötigt.Als geeignete Methode zur Transfektion von Zellen des Schwamms S. domuncula erwies sich der ballistische Gentransfer mit Hilfe der Gene Gun. Homologe Promotoren konnten die sichtbare Expression des Reportergens EGFP jedoch nicht bewirken. Nur der virale CMV-Promotor erwies sich als hierfür geeignet.

Transgene Mausmodelle zur Untersuchung von Nervenzellwanderungen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden transgene Mausmodelle hergestellt, die eine weitere Aufklärung der Rolle des Transkriptionsfaktors Pax6 bei der Wanderung von Nervenzellen ermöglichen, sowie ein Kultursystem zur Darstellung embryonaler Wanderungen außerhalb des Mutterleibs entwickelt.Bei der YAC-transgenen Mäuselinie PhPax6-taulacZ wird das Reportergen taulacZ unter der Kontrolle des Pax6-Promotors exprimiert. Dadurch ist dort, wo Pax6 im Zellkern vorliegt, der Rest der Zelle über seine gesamte Ausdehnung mit der vom taulacZ-Transgen kodierten tau-b-Galactosidase markiert. Das räumlich-zeitliche Expressionsmuster von Pax6 und dem Transgen taulacZ wurde detailliert untersucht. Dabei wurde eine hohe Übereinstimmung festgestellt. Basierend auf der Darstellung der Zellen in ihrer gesamten Ausdehnung, die durch das taulacZ-Transgen erstmals möglich ist, wurde eine Klassifizierung Pax6-positiver Zelltypen vorgenommen. Zunächst wird Pax6 in Neuroepithelzellen, später in radialen Gliazellen exprimiert.Mit der zweiten transgenen Mäuselinie, PhPax6-tTA, wurde ein Werkzeug hergestellt, das die gezielte und hoch spezifische Expression von beliebigen Transgenen in Pax6-exprimierenden Zellen ermöglicht. In Pax6-positive Zellen der Medulla wurde das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) eingeführt und das Wanderungsverhalten in vitro über mehrere Tage dargestellt. Erstmals können mit dieser Linie beliebige Expressionskonstrukte gezielt, hocheffizient und schnell in wandernde Neurone eingebracht werden, ohne störende Hinter-grundexpression in anderen Zellen.

Untersuchungen zum infektiösen Aufnahmeweg des humanen Papillomvirus HPV33

Nicht-umhüllte humane Papillomviren binden an Heparansulfatproteoglykane (HSPG) der Zelloberfläche und werden durch Endocytose in Zielzellen aufgenommen. Um eine effiziente Infektion zu etablieren, muss die virale DNA in den Zellkern transportiert werden. Auf welche Art und Weise hierbei die Endosomenmembran überwunden wird, war bislang völlig unklar. Die Suche nach potentiellen membrandestabilisierenden Eigenschaften der Kapsidproteine L1 und L2 von HPV führte im Vorfeld der vorliegenden Dissertation zur Identifizierung eines carboxyterminalen Peptids des minoren L2-Proteins, welches als sehr mikrobizid und fungizid beschrieben werden konnte. Es ist gekennzeichnet durch einen Bereich basischer und einen Bereich hydrophober Aminosäuren. Da das minore L2-Protein für den Infektionsprozess von Papillomviren essentiell ist, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Rolle des C-terminalen Peptids für den Transport des infektiösen Materials durch die zelluläre Membranbarriere genauer untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass das carboxyterminale L2-Peptid von HPV33 nach externer Zugabe eine cytotoxische Wirkung auf höhere eukaryotische Zellen hat. Es lokalisiert an zellulären Membranen und induziert eine pH-abhängige Reduktion des ATP-Gehalts von Säugerzellen. Weiter wurde nachgewiesen, dass das Peptid die Cytoplasmamembran permeabilisieren und für kleine, hydrophile Substanzen wie Propidiumjodid durchlässig machen kann. Mutationen innerhalb des Peptids verdeutlichten die Notwendigkeit beider Bereiche, basischer und hydrophober Aminosäuren, für den membrandestabilisierenden Effekt. Im Folgenden wurde die intrazelluläre Aktivität des L2-Peptids mit Hilfe von GFP2-Peptid-Fusionen analysiert. Das Peptid ist in der Lage, eine Integration des globulären GFP-Dimers in Membranen zu vermitteln, was bei einem hohen Prozentsatz der exprimierenden Zellen zum Absterben führt. Auch wt 33L2 weist im Gegensatz zu C-terminalen Deletions- und Punktmutanten die Fähigkeit zur Membranassoziation auf. Abschließend wurde der Effekt von Mutationen innerhalb dieses L2-Peptids auf die Infektiösität von L1/L2-Pseudovirionen beschrieben. Die Mutationen haben keinen Einfluss auf den Einbau des L2-Proteins in die Pseudovirionen und auf die DNA-Verpackung. Die Virusmorphogenese ist somit nicht negativ beeinträchtigt. Die Infektiösität der HPV33- wie auch von HPV16-Pseudovirionen mit C-terminal mutiertem L2-Protein ist jedoch auf das Niveau von solchen reduziert, die nur aus dem majoren L1 bestehen und geht gegen Null. Zusammenfassend kann man festhalten, dass das minore Kapsidprotein L2 von HPV am Carboxyterminus eine membrandestabilisierende Aktivität besitzt, welche unter Papillomviren konserviert und für eine effektive Infektion essentiell ist.

Tetracycline-inducible RNAi Knockdown of SCL (Stem Cell Leukaemia) in Mice

RNAi (RNA interference) is a powerful technology for sequence-specific targeting of mRNAs. This thesis was aimed at establishing conditions for conditional RNAi-mediated silencing first in vitro and subsequently also in transgenic mice. As a target the basic helix-loop-helix transcription factor encoding gene SCL (stem cell leukaemia also known as Tal-1 or TCL5) was used. SCL is a key regulator for haematopoietic development and ectopic expression of SCL is correlated with acute T-lymphoblastic leukaemias. Loss of SCL function studies demonstrated that ab initio deletion of SCL resulted in embryonic lethality around day E9 in gestation. To be able to conditionally inactivate SCL, RNAi technology was combined with the tetracycline-dependent regulatory system. This strategy allowed to exogenously control the induction of RNAi in a reversible fashion and consequently the generation of a completely switchable RNAi knockdown. First a suitable vector allowing for co-expression of tetracycline-controlled shRNAs (small hairpin RNAs) and constitutively active EGFP (enhanced green fluorescent protein) was generated. This novel vector, pRNAi-EGFP, was then evaluated for EGFP expression and tetracycline-mediated expression of shRNAs. Four sequences targeting different regions within the SCL mRNA were tested for their efficiency to specifically knockdown SCL. These experiments were performed in M1 murine leukaemia cells and subsequently in the HEK 293 cell line, expressing an engineered HA-tagged SCL protein. The second assay provided a solid experimental method for determining the efficiency of different SCL-siRNA knockdown constructs in tissue culture. Western blotting analyses revealed a down regulation of SCL protein for all four tested SCL-specific target sequences albeit with different knockdown efficiencies (between 25% and 100%). Furthermore, stringent tetracycline-dependent switchability of shRNA expression was confirmed by co-transfecting the SCL-specific pRNAi-EGFP vector (SCL-siRNA) together with the HA-tagged SCL expression plasmid into the HEK 293TR /T-REx cell line constitutively expressing the tetracycline repressor (TetR). These series of experiments demonstrated tight regulation of siRNA expression without background activity. To be able to control the SCL knockdown in vivo and especially to circumvent any possible embryonic lethality a transgenic mouse line with general expression of a tetracycline repressor was needed. Two alternative methods were used to generate TetR mice. The first approach was to co-inject the tetracycline-regulated RNAi vector together with a commercially available and here specifically modified T-REx expression vector (SCL-siRNA T-REx FRT LoxP mouse line). The second method involved the generation of a TetR expressor mouse line, which was then used for donating TetR-positive oocytes for pronuclear injection of the RNAi vector (SCL-siRNA T-REx mouse line). As expected, and in agreement with data from conditional Cre-controlled adult SCL knockout mice, post-transcriptional silencing of SCL by RNAi caused a shift in the maturation of red blood cell populations. This was shown in the bone marrow and peripheral blood by FACS analysis with the red blood cell-specific TER119 and CD71 markers which can be used to define erythrocyte differentiation (Lodish plot technique). In conclusion this study established conditions for effective SCL RNAi-mediated silencing in vitro and in vivo providing an important tool for further investigations into the role of SCL and, more generally, of its in vivo function in haematopoiesis and leukaemia. Most importantly, the here acquired knowledge will now allow the establishment of other completely conditional and reversible knockdown phenotypes in mice.

Multicelled Behaviour in E. coli: Design and experimental characterization of an engineered library of hybrid promoters.

Synthetic biology has recently had a great development, many papers have been published and many applications have been presented, spanning from the production of biopharmacheuticals to the synthesis of bioenergetic substrates or industrial catalysts. But, despite these advances, most of the applications are quite simple and don’t fully exploit the potential of this discipline. This limitation in complexity has many causes, like the incomplete characterization of some components, or the intrinsic variability of the biological systems, but one of the most important reasons is the incapability of the cell to sustain the additional metabolic burden introduced by a complex circuit. The objective of the project, of which this work is part, is trying to solve this problem through the engineering of a multicellular behaviour in prokaryotic cells. This system will introduce a cooperative behaviour that will allow to implement complex functionalities, that can’t be obtained with a single cell. In particular the goal is to implement the Leader Election, this procedure has been firstly devised in the field of distributed computing, to identify the process that allow to identify a single process as organizer and coordinator of a series of tasks assigned to the whole population. The election of the Leader greatly simplifies the computation providing a centralized control. Further- more this system may even be useful to evolutionary studies that aims to explain how complex organisms evolved from unicellular systems. The work presented here describes, in particular, the design and the experimental characterization of a component of the circuit that solves the Leader Election problem. This module, composed of an hybrid promoter and a gene, is activated in the non-leader cells after receiving the signal that a leader is present in the colony. The most important element, in this case, is the hybrid promoter, it has been realized in different versions, applying the heuristic rules stated in [22], and their activity has been experimentally tested. The objective of the experimental characterization was to test the response of the genetic circuit to the introduction, in the cellular environment, of particular molecules, inducers, that can be considered inputs of the system. The desired behaviour is similar to the one of a logic AND gate in which the exit, represented by the luminous signal produced by a fluorescent protein, is one only in presence of both inducers. The robustness and the stability of this behaviour have been tested by changing the concentration of the input signals and building dose response curves. From these data it is possible to conclude that the analysed constructs have an AND-like behaviour over a wide range of inducers’ concentrations, even if it is possible to identify many differences in the expression profiles of the different constructs. This variability accounts for the fact that the input and the output signals are continuous, and so their binary representation isn’t able to capture the complexity of the behaviour. The module of the circuit that has been considered in this analysis has a fundamental role in the realization of the intercellular communication system that is necessary for the cooperative behaviour to take place. For this reason, the second phase of the characterization has been focused on the analysis of the signal transmission. In particular, the interaction between this element and the one that is responsible for emitting the chemical signal has been tested. The desired behaviour is still similar to a logic AND, since, even in this case, the exit signal is determined by the hybrid promoter activity. The experimental results have demonstrated that the systems behave correctly, even if there is still a substantial variability between them. The dose response curves highlighted that stricter constrains on the inducers concentrations need to be imposed in order to obtain a clear separation between the two levels of expression. In the conclusive chapter the DNA sequences of the hybrid promoters are analysed, trying to identify the regulatory elements that are most important for the determination of the gene expression. Given the available data it wasn’t possible to draw definitive conclusions. In the end, few considerations on promoter engineering and complex circuits realization are presented. This section aims to briefly recall some of the problems outlined in the introduction and provide a few possible solutions.

Characterization of new molecular targets involved in iodide flux in the thyroid gland: the anoctamins

Iodide transport is necessary for the synthesis of thyroid hormones following accumulation in the follicular lumen out of thyroid cells, via channels unknown with the exception of pendrin. According to our hypothesis, TMEM16A could be the main molecular identity of the channel mediating iodide efflux in the thyroid gland. TMEM16A is the prior candidate for calcium-activated chloride conductance (CaCC). TMEM16A belongs to the TMEM16/anoctamin family comprising ten members (TMEM16A-K). Higher affinity of TMEM16A for iodide and predicted expression in the thyroid gland suggest its mediation of iodide efflux. The aim of this project was to identify the role of TMEM16A in iodide transport in the thyroid gland, by characterizing its molecular expression and functional properties. We demonstrated that TMEM16F, H, K transcripts are expressed in FRTL-5 thyroid cells, as well as TMEM16A, which is TSH-independent. Tumor tissue from human thyroid maintains TMEM16A expression. Functional in vivo experiments in FRTL-5, stably expressing YFP-H148Q/I152L fluorescent protein as a biosensor, showed that iodide efflux is stimulated by agonists of purinergic receptors with an order of potency of ATP>UTP>ADP (compatible with an involvement of P2Y purinergic receptors), and by agonists of adrenergic receptors (epinephrine, norepinephrine and phenylephrine). Iodide efflux was blocked by α-receptor antagonists prazosin and phentolamine, consistent with a role of α1 adrenergic receptors. Iodide efflux was specifically dependent on calcium mobilized from intracellular compartments and induced by the calcium ionophore ionomycin. CaCC blockers suppressed ionomycin-/ATP-/epinephrine-stimulated iodide efflux. Heterologous expression of TMEM16A in CHO K1 cells induced calcium-activated iodide fluxes. All these results support the hypothesis of the involvement of TMEM16A in calcium-dependent iodide efflux induced by receptor agonists in thyroid cells. TMEM16A may represent a new pharmacological target for thyroid cancer therapy, since its blockade may enhance the retention of radioiodide by tumour cells enhancing the efficacy of radioablative therapy.

Transgenic mice as a tool for depression research: examples from the endocannabinoid and the corticotropin-releasing hormone system

Major depression belongs to the most serious and widespread psychiatric disorders in today’s society. There is a great need for the delineation of the underlying molecular mechanisms as well as for the identification of novel targets for its treatment. In this thesis, transgenic mice of the endocannabinoid and the corticotropin-releasing hormone (CRH) system were investigated to determine the putative role of these systems for depression-like phenotypes in mice. In the first part of the thesis, we found that the endocannabinoid system was prominently involved in a brain region-specific and temporally controlled manner in acute as well as in chronic stress processing. Genetic deletion in combination with pharmacological intervention revealed the importance of a fully functional endocannabinoid system for efficient neuroendocrine and behavioral stress coping. Accordingly, cannabinoid type 1 (CB1) receptor-deficient mice displayed several depression-like symptoms and molecular alterations, including “behavioral despair”, stress hormone hypersecretion and decreased glucocorticoid receptor and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. However, the endocannabinoid system was dispensable for the efficacy of currently used antidepressant drugs. To facilitate future endocannabinoid research, a transgenic mouse was generated, which overexpressed the CB1 receptor protein fused to a fluorescent protein. In the second part of the thesis, conditional brain region-specific CRH overexpressing mice were evaluated as a model for pathological chronic CRH hyperactivation. Mutant mice showed aberrant neuroendocrine and behavioral stress coping and hyperarousal due to CRH-induced activation of the noradrenergic system in the brain. Mutant mice appeared to share similarities with naturally occurring endogenous CRH activation in wild-type mice and were sensitive to acute pharmacological blockade of CRH receptor type 1 (CRH-R1). Thus, CRH overexpressing mice serve as an ideal in vivo tool to evaluate the efficacy of novel CRH-R1 antagonists. Together, these findings highlight the potential of transgenic mice for the understanding of certain endo-phenotypes (isolated symptoms) of depression and their molecular correlates.

Oligomerisation, localisation and interaction of the sensor histidine kinases DcuS and CitA in Escherichia coli

The two-component system DcuSR of Escherichia coli regulates gene expression of anaerobic fumarate respiration and aerobic C4-dicarboxylate uptake. C4-dicarboxylates and citrate are perceived by the periplasmic domain of the membrane-integral sensor histidine kinase DcuS. The signal is transduced across the membrane by phosphorylation of DcuS and of the response regulator DcuR, resulting in activation of DcuR and transcription of the target genes.rnIn this work, the oligomerisation of full-length DcuS was studied in vivo and in vitro. DcuS was genetically fused to derivatives of the green fluorescent protein (GFP), enabling fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurements to detect protein-protein interactions in vivo. FRET measurements were also performed with purified His6-DcuS after labelling with fluorescent dyes and reconstitution into liposomes to study oligomerisation of DcuS in vitro. In vitro and in vivo fluorescence resonance energy transfer showed the presence of oligomeric DcuS in the membrane, which was independent of the presence of effector. Chemical crosslinking experiments allowed clear-cut evaluation of the oligomeric state of DcuS. The results showed that detergent-solubilised His6-DcuS was mainly monomeric and demonstrated the presence of tetrameric DcuS in proteoliposomes and in bacterial membranes.rnThe sensor histidine kinase CitA is part of the two-component system CitAB of E. coli, which is structurally related to DcuSR. CitAB regulates gene expression of citrate fermentation in response to external citrate. The sensor kinases DcuS and CitA were fused with an enhanced variant of the yellow fluorescent protein (YFP) and expressed in E. coli under the control of an arabinose-inducible promoter. The subcellular localisation of DcuS-YFP and CitA-YFP within the cell membrane was studied by means of confocal laser fluorescence microscopy. Both fusion proteins were found to accumulate at the cell poles. The polar accumulation was slightly increased in the presence of the stimulus fumarate or citrate, respectively, but independent of the expression level of the fusion proteins. Cell fractionation demonstrated that polar accumulation was not related to inclusion bodies formation. The degree of polar localisation of DcuS-YFP was similar to that of the well-characterised methyl-accepting chemotaxis proteins (MCPs), but independent of their presence. To enable further investigations on the function of the polar localisation of DcuS under physiological conditions, the sensor kinase was genetically fused to the flavin-based fluorescent protein Bs2 which shows fluorescence under aerobic and anaerobic conditions. The resulting dcuS-bs2 gene fusion was inserted into the chromosome of various E. coli strains.rnFurthermore, a protein-protein interaction between the related sensor histidine kinases DcuS and CitA, regulating common metabolic pathways, was detected via expression studies under anaerobic conditions in the presence of citrate and by in vivo FRET measurements.

The C-4-Dicarboxylate carriers DcuB and DctA of Escherichia coli: function as cosensors and topology

Das fakultativ anaerobe Enterobakterium Escherichia coli nutzt C4-Dicarboxylate sowohl unter aeroben als auch anaeroben Bedingungen als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die Aufnahme der C4-Dicarboxylaten und die Energiekonservierung mittels Fumaratatmung wird durch das Zweikomponentensystem DcuSR reguliert. Die Sensorhistidinkinase DcuS und der nachgeschaltete Responseregulator DcuR aktivieren bei Verfügbarkeit von C4-Dicarboxylaten die Expression der Gene für den Succinat Transporter DctA, den anaeroben Fumarat/Succinat Antiporter DcuB, die Fumarase B sowie die Fumaratreduktase FrdABCD. Die Transportproteine DctA und DcuB wiederum regulieren die Expression der DcuSR-abhängigen Gene negativ. Fehlen von DctA oder DcuB resultiert bereits ohne Effektor in einer maximalen Expression von dctA bzw. dcuB. Durch gerichtete und ungerichtete Mutagenese wurde gezeigt, dass die Transportfunktion des Carriers DcuB unabhängig von seiner regulatorischen Funktion ist. DcuB kann daher als Cosensor des DcuSR Systems angesehen werden.rnUnter Verwendung von Reportergenfusionen von C-terminal verkürzten Konstrukten von DcuB mit der Alkalischen Phosphatase und der β-Galactosidase wurde die Topologie des Multitransmembranproteins DcuB bestimmt. Zusätzlich wurde die Zugänglichkeit bestimmter Aminosäurereste durch chemische Modifikation mit membran-durchlässigen und membran-undurchlässigen Thiolreagenzien untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse deuten auf die Existenz eines tief in die Membran reichenden, hydrophilen Kanal hin, welcher zum Periplasma hin geöffnet ist. Mit Hilfe der Topologie-Studien, des Hydropathie-Blots und der Sekundärstruktur-Vorhersage wurde ein Modell des Carriers erstellt. DcuB besitzt kurze, periplasmatisch liegende Proteinenden, die durch 12 Transmembranhelices und zwei große hydrophile Schleifen jeweils zwischen TM VII/VIII und TM XI/XII verbunden sind. Die regulatorisch relevanten Reste K353, T396 und D398 befinden sich innerhalb von TM XI sowie auf der angrenzenden cytoplasmatischen Schleife XI-XII. Unter Berücksichtigung der strukturellen und funktionellen Aspekte wurde ein Regulationsmodell erstellt, welches die gemeinsam durch DcuB und DcuS kontrollierte C4-Dicarboxylat-abhängige Genexpression darstellt. rnDer Effekt von DctA und DcuSR auf die Expression einer dctA´-´lacZ Reportergenfusion und auf die aerobe C4-Dicarboxylat-Aufnahme wurde untersucht. In-vivo FRET-Messungen weisen auf eine direkte Wechselwirkung zwischen dem Carrier DctA und dem Sensor DcuS hin. Dieses Ergebnis stützt die Theorie der Regulation von DcuS durch C4-Dicarboxylate und durch die Cosensoren DctA bzw. DcuB mittels direkter Protein-Protein Interaktion.rn

Untersuchung neuer hochwirksamer neuroprotektiver Antioxidantien in experimentellen Modellen der Parkinsonschen Krankheit

Bei der Parkinsonschen Krankheit kommt es zu einer selektiven Degeneration der dopaminergen Neurone in der Substantia nigra pars compacta. Die Rolle des oxidativen Stresses in der Pathogenese dieser Erkrankung konnte an post mortem Untersuchungen der Parkinson-Patienten, wie auch an zahlreichen in vitro und in vivo Modellen bestätigt werden. Die Anwendung von Antioxidantien wurde als therapeutische Strategie der Parkinsonschen Krankheit vorgeschlagen. In dieser Hinsicht wurden bereits antioxidative Substanzen in klinischen Studien evaluiert. Klinische Studien mit Antioxidantien haben jedoch bislang nur wenig überzeugende Ergebnisse erbracht, mit Ausnahme des Einsatzes des Ubichinons (Coenzym Q). Eine kritische Analyse der klinischen Studien lässt zusammenfassen, dass auf Seiten der verwendeten Antioxidantien noch massiver Optimierungsbedarf besteht. Für einen erfolgreichen therapeutischen Einsatz von Antioxidantien bei dieser Krankheit sind folgende Eigenschaften der Substanzen von höchster Bedeutung: i) maximale neuroprotektive Aktivität bei geringen Dosen; ii) geringe Nebenwirkungen; iii) eine hohe Blut-Hirn-Schrankengängigkeit.In dieser Arbeit wurde das neuroprotektive Potential von drei Bisarylimin-basierten antioxidativen Strukturen (Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin) in in vitro und in vivo Parkinson-Modellsystemen evaluiert. Beide experimentellen Modelle basieren auf der Wirkung der mitochondrialen Komplex I Inhibitoren 1-Methyl-4-Phenylpyridin (MPP+) und Rotenon, welche pathophysiologische Charakteristika der Parkinsonschen Krankheit reproduzieren. Unsere in vitro Untersuchungen an primären Neuronen des Mittelhirns und der klonalen SH-SY5Y-Neuroblastomazelllinie konnten zeigen, dass die Komplex I Inhibition krankheitsspezifische zelluläre Merkmale induziert, wie die Abnahme der antioxidativen Verteidigungskapazität und Verlust des mitochondrialen Membranpotentials. Zusätzlich kommt es in primären Neuronen des Mittelhirns zur selektiven Degeneration dopaminerger Neurone, welche in der Parkinsonschen Erkrankung besonders betroffen sind. Ko-Inkubation der in vitro Modelle mit Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin in niedrigen Konzentrationen (50 nM) halten die pathologischen Prozesse fast vollständig auf. In vivo Untersuchungen am MPP+- und Rotenon-basierten Caenorhabditis elegans (C. elegans) Modell bestätigen das neuroprotektive Potential der Bisarylimine. Hierfür wurde eine transgene C. elegans Linie mithilfe einer dopaminerg spezifischen DsRed2- (Variante des rot fluoreszierenden Proteins von Discosoma sp.)-Expression und pan-neuronaler CFP- (cyan fluoreszierendes Protein)-Expression zur Visualisierung der dopaminergen Neuronenpopulation in Kontrast zum Gesamtnervensystem erstellt. Behandlung des C. elegans mit MPP+ und Rotenon im larvalen und adulten Stadium führt zu einer selektiven Degeneration dopaminerger Neurone, sowie zum Entwicklungsarrest der larvalen Population. Die dopaminerge Neurodegeneration, wie auch weitere phänotypische Merkmale des C. elegans Modells, können durch Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin in niedrigen Konzentrationen (500 nM) komplett verhindert werden. Ein systemischer Vergleich aromatischer Bisarylimine mit bekannten, gut charakterisierten Antioxidantien, wie α-Tocopherol (Vitamin E), Epigallocatechingallat und β-Catechin, zeigt, dass effektive Konzentrationen für Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin um Zehnerpotenzen niedriger liegen im Vergleich zu natürlichen Antioxidantien. Der Wirkungsmechanismus der Bisarylimine konnte in biochemischen und in vitro Analysen, sowie in Verhaltensuntersuchungen an C. elegans von der Wirkungsweise strukturell ähnlicher, neuroleptisch wirkender Phenothiazin-Derivate differenziert werden. Die Analyse des dopaminerg-gesteuerten Verhaltens (Beweglichkeit) in C. elegans konnte verdeutlichen, dass antioxidative und Dopaminrezeptor-bindende Eigenschaften der Bisaryliminstrukturen sich gegenseitig ausschließen. Diese qualitativen Merkmale unterscheiden Bisarylimine fundamental von klinisch angewandten Neuroleptika (Phenothiazin-Derivate), welche als Dopaminrezeptor-Antagonisten zur Behandlung psychischer Erkrankungen klinisch eingesetzt werden.Aromatische Bisarylimine (Phenothiazin, Iminostilben und Phenoxazin) besitzen günstige strukturelle Eigenschaften zur antioxidativ-basierter Neuroprotektion. Durch die Anwesenheit der antioxidativ wirkenden, nicht-substituierten Iminogruppe unterscheiden sich Bisarylimine grundlegend von neuroleptisch-wirkenden Phenothiazin-Derivaten. Wichtige strukturelle Voraussetzungen eines erfolgreichen antioxidativen Neuropharmakons, wie eine hohe Radikalisierbarkeit, die stabile Radikalform und der lipophile Charakter des aromatischen Ringsystems, werden in der Bisaryliminstruktur erfüllt. Antioxidative Bisarylimine könnten in der Therapie der Parkinsonschen Krankheit als eine effektive neuroprotektiv-therapeutische Strategie weiter entwickelt werden.

Synthese und Charakterisierung von multivalenten kationischen Tensiden und Polymeren

Der Einsatz von den Polyelektrolytkomplexen von DNA / RNA mit Polykationen oder Lipiden in der Gen-Therapie ist für Wissenschaftler von besonderem Interesse, da sie als Träger für den Transport von genetischem Material in lebende Zellen fungieren können. Interessant ist auch die Komplexbildung aus Gadolinium und Polykation, hier können die stabil gebildeten Aggregate als Kontrastmittel zur Anwendung in der Magnetresonanztomographie eingeführt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, strukturdefinierte, positiv geladene, polyvalente sperminanaloge Polymere zu synthetisieren. Durch die polyelektrolytische Natur erlauben solche Polymere die Komplexierung von mehr Gadolinium-Polyoxometalaten und wären deshalb sehr gut als Kontrastmittel geeignet. Aufbauend auf den Vorarbeiten, wurde insbesondere die Komplexbildung von kationischem Polymer mit der Green Fluorescent Protein DNA in physiologischem Salzgehalt untersucht. Die Beschreibung der Synthese im Rahmen dieser Arbeit zeigt, dass es mit dem entwickelten Syntheseprinzip, also unter Einsatz von orthogonaler Schutzgruppenchemie und funktionaler Transformation gelungen ist, durch einfache nukleophile Substitution die Kopplung der Elementareinheiten zu komplexeren, auch ionischen Tensiden durchzuführen. Die Komplexierung von Gadolinium-Polyoxometalat mit kationisch geladenem Polymer in reinem Wasser und in physiologischem Salzgehalt hat gezeigt, dass bei einem Ladungsverhältnis von ungefähr 2:1 stabile sphärische Komplexe gebildet werden. HeLa-Zellen zeigen keine hohe Empfindlichkeit gegenüber Polykation-POM-Komplexen, da deren toxische Wirkung nur einen Anteil toter Zellen von maximal 24 % zur Folge hatte. Die Bildqualität einer MRT-Aufnahme der gebildeten Polykation-POM-Komplexe wurde im Vergleich zu den reinen Gadolinium-Polyoxometalat-Lösungen erheblich verbessert. Die Komplexierung von DNA mit dem im Überschuss vorliegenden kationisch geladenen Polymer wurde mittels Rasterkraftmikroskopie, statischer sowie dynamischer Lichtstreuung untersucht. Die Molmasse und Größe der Polykation-DNA-Komplexe geben eindeutige Hinweise darauf, dass sich in physiologischer Salzlösung Multi-Ketten-Komplexe bilden. Neben der Untersuchung der Polymer-Komplexe wurde eine Reihe neuartiger multivalenter kationischer Tenside hergestellt, wobei ihre Eigenschaften beispielsweise mit Tensid B (C12N4), Tensid C (EG8N4) und Tensid F (EG8C12N4) in wässriger Lösung bei verschiedener Salzkonzentration im Vordergrund stehen.

Methods and strategies to identify the mode of action of phytoactive compounds

Small molecules affecting biological processes in plants are widely used in agricultural practice as herbicides or plant growth regulators and in basic plant sciences as probes to study the physiology of plants. Most of the compounds were identified in large screens by the agrochemical industry, as phytoactive natural products and more recently, novel phytoactive compounds originated from academic research by chemical screens performed to induce specific phenotypes of interest. The aim of the present PhD thesis is to evaluate different approaches used for the identification of the primary mode of action (MoA) of a phytoactive compound. Based on the methodologies used for MoA identification, three approaches are discerned: a phenotyping approach, an approach based on a genetic screen and a biochemical screening approach.rnFour scientific publications resulting from my work are presented as examples of how a phenotyping approach can successfully be applied to describe the plant MoA of different compounds in detail.rnI. A subgroup of cyanoacrylates has been discovered as plant growth inhibitors. A set of bioassays indicated a specific effect on cell division. Cytological investigations of the cell division process in plant cell cultures, studies of microtubule assembly with green fluorescent protein marker lines in vivo and cross resistant studies with Eleusine indica plants harbouring a mutation in alpha-tubulin, led to the description of alpha-tubulin as a target site of cyanoacrylates (Tresch et al., 2005).rnII. The MoA of the herbicide flamprop-m-methyl was not known so far. The studies described in Tresch et al. (2008) indicate a primary effect on cell division. Detailed studies unravelled a specific effect on mitotic microtubule figures, causing a block in cell division. In contrast to other inhibitors of microtubule rearrangement such as dinitroanilines, flamprop-m-methyl did not influence microtubule assembly in vitro. An influence of flamprop-m-methyl on a target within the cytoskeleton signalling network could be proposed (Tresch et al., 2008).rnIII. The herbicide endothall is a protein phosphatase inhibitor structurally related to the natural product cantharidin. Bioassay studies indicated a dominant effect on dark-growing cells that was unrelated to effects observed in the light. Cytological characterisation of the microtubule cytoskeleton in corn tissue and heterotrophic tobacco cells showed a specific effect of endothall on mitotic spindle formation and ultrastructure of the nucleus in combination with a decrease of the proliferation index. The observed effects are similar to those of other protein phosphatase inhibitors such as cantharidin and the structurally different okadaic acid. Additionally, the observed effects show similarities to knock-out lines of the TON1 pathway, a protein phosphatase-regulated signalling pathway. The data presented in Tresch et al. (2011) associate endothall’s known in vitro inhibition of protein phosphatases with in vivo-effects and suggest an interaction between endothall and the TON1 pathway.rnIV. Mefluidide as a plant growth regulator induces growth retardation and a specific phenotype indicating an inhibition of fatty acid biosynthesis. A test of the cuticle functionality suggested a defect in the biosynthesis of very-long-chain fatty acids (VLCFA) or waxes. Metabolic profiling studies showed similarities with different groups of VLCFA synthesis inhibitors. Detailed analyses of VLCFA composition in tissues of duckweed (Lemna paucicostata) indicated a specific inhibition of the known herbicide target 3 ketoacyl-CoA synthase (KCS). Inhibitor studies using a yeast expression system established for plant KCS proteins verified the potency of mefluidide as an inhibitor of plant KCS enzymes. It could be shown that the strength of inhibition varied for different KCS homologues. The Arabidopsis Cer6 protein, which induces a plant growth phenotype similar to mefluidide when knocked out, was one of the most sensitive KCS enzymes (Tresch et al., 2012).rnThe findings of my own work were combined with other publications reporting a successful identification of the MoA and primary target proteins of different compounds or compound classes.rnA revised three-tier approach for the MoA identification of phytoactive compounds is proposed. The approach consists of a 1st level aiming to address compound stability, uniformity of effects in different species, general cytotoxicity and the effect on common processes like transcription and translation. Based on these findings advanced studies can be defined to start the 2nd level of MoA characterisation, either with further phenotypic characterisation, starting a genetic screen or establishing a biochemical screen. At the 3rd level, enzyme assays or protein affinity studies should show the activity of the compound on the hypothesized target and should associate the in vitro effects with the in vivo profile of the compound.