Les R-loops et leurs conséquences sur l'expression génique chez Escherichia coli.

Des variations importantes du surenroulement de l’ADN peuvent être générées durant la phase d’élongation de la transcription selon le modèle du « twin supercoiled domain ». Selon ce modèle, le déplacement du complexe de transcription génère du surenroulement positif à l’avant, et du surenroulement négatif à l’arrière de l’ARN polymérase. Le rôle essentiel de la topoisomérase I chez Escherichia coli est de prévenir l’accumulation de ce surenroulement négatif générée durant la transcription. En absence de topoisomérase I, l’accumulation de ce surenroulement négatif favorise la formation de R-loops qui ont pour conséquence d’inhiber la croissance bactérienne. Les R-loops sont des hybrides ARN-ADN qui se forment entre l’ARN nouvellement synthétisé et le simple brin d’ADN complémentaire. Dans les cellules déficientes en topoisomérase I, des mutations compensatoires s’accumulent dans les gènes qui codent pour la gyrase, réduisant le niveau de surenroulement négatif du chromosome et favorisant la croissance. Une des ces mutations est une gyrase thermosensible qui s’exprime à 37 °C. La RNase HI, une enzyme qui dégrade la partie ARN d’un R-loop, peut aussi restaurer la croissance en absence de topoisomérase I lorsqu’elle est produite en très grande quantité par rapport à sa concentration physiologique. En présence de topoisomérase I, des R-loops peuvent aussi se former lorsque la RNase HI est inactive. Dans ces souches mutantes, les R-loops induisent la réponse SOS et la réplication constitutive de l’ADN (cSDR). Dans notre étude, nous montrons comment les R-loops formés en absence de topoisomérase I ou RNase HI peuvent affecter négativement la croissance des cellules. Lorsque la topoisomérase I est inactivée, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif conduit à la formation de nombreux R-loops, ce qui déclenche la dégradation de l’ARN synthétisé. Issus de la dégradation de l’ARNm de pleine longueur, des ARNm incomplets et traductibles s’accumulent et causent l’inhibition de la synthèse protéique et de la croissance. Le processus par lequel l’ARN est dégradé n’est pas encore complètement élucidé, mais nos résultats soutiennent fortement que la RNase HI présente en concentration physiologique est responsable de ce phénotype. Chose importante, la RNase E qui est l’endoribonuclease majeure de la cellule n’est pas impliquée dans ce processus, et la dégradation de l’ARN survient avant son action. Nous montrons aussi qu’une corrélation parfaite existe entre la concentration de RNase HI, l’accumulation d’hypersurenroulement négatif et l’inhibition de la croissance bactérienne. Lorsque la RNase HI est en excès, l’accumulation de surenroulement négatif est inhibée et la croissance n’est pas affectée. L’inverse se produit Lorsque la RNase HI est en concentration physiologique. En limitant l’accumulation d’hypersurenroulement négatif, la surproduction de la RNase HI prévient alors la dégradation de l’ARN et permet la croissance. Quand la RNase HI est inactivée en présence de topoisomérase I, les R-loops réduisent le niveau d’expression de nombreux gènes, incluant des gènes de résistance aux stress comme rpoH et grpE. Cette inhibition de l’expression génique n’est pas accompagnée de la dégradation de l’ARN contrairement à ce qui se produit en absence de topoisomérase I. Dans le mutant déficient en RNase HI, la diminution de l’expression génique réduit la concentration cellulaire de différentes protéines, ce qui altère négativement le taux de croissance et affecte dramatiquement la survie des cellules exposées aux stress de hautes températures et oxydatifs. Une inactivation de RecA, le facteur essentiel qui déclenche la réponse SOS et le cSDR, ne restaure pas l’expression génique. Ceci démontre que la réponse SOS et le cSDR ne sont pas impliqués dans l’inhibition de l’expression génique en absence de RNase HI. La croissance bactérienne qui est inhibée en absence de topoisomérase I, reprend lorsque l’excès de surenroulement négatif est éliminé. En absence de RNase HI et de topoisomérase I, le surenroulement négatif est très relaxé. Il semble que la réponse cellulaire suite à la formation de R-loops, soit la relaxation du surenroulement négatif. Selon le même principe, des mutations compensatoires dans la gyrase apparaissent en absence de topoisomérase I et réduisent l’accumulation de surenroulement négatif. Ceci supporte fortement l’idée que le surenroulement négatif joue un rôle primordial dans la formation de R-loop. La régulation du surenroulement négatif de l’ADN est donc une tâche essentielle pour la cellule. Elle favorise notamment l’expression génique optimale durant la croissance et l’exposition aux stress, en limitant la formation de R-loops. La topoisomérase I et la RNase HI jouent un rôle important et complémentaire dans ce processus.

Etude des inhibiteurs d'entrée de CXCR4 : corécepteur d'entrée du virus de l'immunodéficience humaine.

L’entrée virale du VIH-1 dans ses cellules cibles constitue une cible thérapeutique de choix. À l’heure actuelle, un inhibiteur de fusion et un inhibiteur ciblant le corécepteur CCR5 sont utilisés en thérapie. Dans notre étude, notre objectif était d’évaluer le profil antiviral et fonctionnel de plusieurs types moléculaires envisagés comme inhibiteurs d’entrée du corécepteur CXCR4, soient : 1) de dérivés peptidiques mimant des portions du récepteur 2) de dérivés peptidiques issus du ligand naturel de CXCR4, le SDF-1 et 3) de dérivés du puissant inhibiteur de faible poids moléculaire, le T140. Notre recherche se concentrait sur la mise au point de molécules capables d’inhiber l’entrée du VIH en ciblant sélectivement le corécepteur CXCR4 tout en conservant les fonctions naturelles de ce dernier. Parmi les molécules testées, certaines possèdent un grand potentiel dans le développement de nouveaux médicaments antirétroviraux.

Lien entre l'hémostase et le développement néoplasique : rôle spécifique du facteur tissulaire et de l'inhibiteur du facteur tissulaire

Il est reconnu, depuis une centaine d’années, que des désordres de la coagulation, regroupés sous le terme de coagulopathies, sont souvent associés au développement néoplasique. Pendant de nombreuses années, ces coagulopathies furent souvent reconnues comme une simple conséquence du développement du cancer. D’ailleurs, pour les cliniciens, l’apparition de ces anomalies sanguines constitue souvent le premier signe clinique d’un cancer occulte. Toutefois, l’étude approfondie du lien existant entre le système hémostatique et le cancer indique que différents facteurs hémostatiques vont interagir avec soit l’environnement tumoral ou soit la tumeur elle-même et influencer le développement du cancer. Au cours de nos travaux, nous avons porté une attention particulière à deux protéines jouant un rôle primordial dans l’hémostase. Le facteur tissulaire (TF) et l’inhibiteur du facteur tissulaire (TFPI) peuvent jouer des rôles pro- ou anti-néoplasique, et ce indépendamment de leurs fonctions hémostatiques normales. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons étudié les propriétés antiangiogéniques de TFPI. L’angiogenèse, soit la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau pré-existant, est reconnue comme étant une étape clée du développement tumoral. D’après nos travaux, le TFPI peut inhiber la formation de structures de type capillaire des cellules endothéliales (CEs) de la veine ombilicale humaine (HUVEC), et ce à une IC 50 de 5 nM, soit la concentration physiologique de l’inhibiteur. De plus, le TFPI bloque la migration des cellules endothéliales lorsque ces dernières sont stimulées par la sphingosine-1-phosphate (S1P), une molécule relâchée lors de l’activation des plaquettes sanguines. Cette inhibition de la migration cellulaire s’explique par l’effet du TFPI sur l’adhésion des CEs. En effet, TFPI inhibe la phosphorylation de deux protéines clées participant à la formation des complexes d’adhésion focales soit FAK (focal adhesion kinase) et PAX (paxilin). L’inhibition de ces deux protéines suggère qu’il y ait une réorganisation des complexes focaux, pouvant expliquer la perte d’adhérence. Finalement, des études de microscopie confocale démontrent que les cellules traitées au TFPI changent de morphologie au niveau du cytosquelette d’actine provoquant une désorganisation des structures migratoires (pseudopodes). Les effets du TFPI au niveau de la migration, de l’adhésion et de la morphologie cellulaire sont strictement spécifiques aux cellules endothéliales humaines, puisque aucun n’effet n’est observé en traitant des cellules cancéreuses de glioblastomes (GB) humains, qui sont normalement des tumeurs hautement vascularisées. En résumé, cette première étude démontre que le TFPI est un inhibiteur de l’angiogenèse. Dans le second volet de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux différents rôles de TF, le principal activateur de la coagulation. Cette protéine est également impliquée dans le développement néoplasique et notamment celui des médulloblastomes (MB) chez l’enfant via des fonctions hémostatiques et non-hémostatiques. Nos travaux démontrent que l’expression de TF est induite par la voie de signalisation de HGF (hepatocyte growth factor) et de son récepteur Met. Cet effet de HGF/Met semble spécifique aux MB puisque HGF ne peut stimuler l’expression de TF au niveau des cellules cancéreuses de glioblastomes. TF, exprimé à la surface des cellules médulloblastiques (DAOY), est responsable de l’activité pro-thrombogénique de ces cellules, ainsi qu’un acteur important de la migration de ces cellules en réponse au facteur VIIa (FVIIa). De plus, en étudiant 18 spécimens cliniques de MB, nous avons établi un lien entre l’intensité d’expression de TF et de Met. L’importance de cette corrélation est également suggérée par l’observation que les cellules exprimant les plus forts taux de TF et de Met sont également les plus agressives en termes d’index de prolifération et de dissémination métastatiques. En résumé, ces travaux représentent le point de départ pour la mise au point de TF comme un marqueur diagnostique clinique dans les cas de tumeurs du cerveau pédiatriques. De plus, l’élucidation de la voie de signalisation moléculaire responsable de l’expression de TF permet de mieux comprendre la biologie et le fonctionnement de ces tumeurs et de relier le profil d’expression de TF aux phénotypes agressifs de la maladie. Il est reconnu que HGF peut également jouer un rôle protecteur contre l’apoptose. Dans le troisième volet de cette thèse, nous avons remarqué que cette protection est corrélée à l’expression de TF. En réduisant à néant l’expression de TF à l’aide de la technologie des ARN silencieux (siRNA), nous démontrons que HGF ne protège plus les cellules contre l’apoptose. Donc, TF médie l’activité anti-apoptotique de HGF. TF assume cette protection en inactivant la phosphorylation de p53 sur la sérine 15, empêchant ainsi la translocation de p53 au noyau. Finalement, l’expression de TF et son interaction avec le FVIIa, au niveau des cellules médulloblastiques favorise la survie de ces dernières et ce même si elles sont soumises à de fortes concentrations de médicaments couramment utilisées en cliniques. Ce troisième et dernier volet démontre l’implication de TF en tant que facteur impliqué dans la survie des cellules cancéreuses, favorisant ainsi le développement de la tumeur. Dans son ensemble, cette thèse vise à démontrer que les facteurs impliqués normalement dans des fonctions hémostatiques (TFPI et TF) peuvent contribuer à réguler le développement tumoral. Tout système physiologique et pathologique est dépendant d’un équilibre entre activateur et inhibiteur et la participation de TF et de TFPI à la régulation du développement néoplasique illustre bien cette balance délicate. Par sa contribution anti- ou pro-néoplasique le système hémostatique constitue beaucoup plus qu’une simple conséquence du cancer; il fait partie par l’action de TF des stratégies élaborées par les cellules cancéreuses pour assurer leur croissance, leur déplacement et leur survie, alors que TFPI tente de limiter la croissance tumorale en diminuant la vascularisation.

Étiopathogenèse de la scoliose idiopathique de l'adolescent : implication de la mélatonine et de l'ostéopontine

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est une maladie dont la cause est encore inconnue, et qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin. La prévalence est de 4% dans la population adolescente au Québec. Cette pathologie affecte surtout les filles durant leur poussée de croissance pubertaire. Parmi plusieurs hypothèses émises, l’hypothèse neuroendocrinienne, impliquant une déficience en mélatonine comme agent étiologique de la SIA a suscité beaucoup d’intérêt. Cette hypothèse découle du fait que l’ablation de la glande pinéale chez le poulet produit une scoliose ressemblant sous plusieurs aspects à la pathologie humaine. La pertinence biologique de la mélatonine dans la scoliose est controversée, étant donné que la majorité des études chez l’homme n’ont pu mettre en évidence une diminution significative des niveaux de mélatonine circulante chez les patients scoliotiques. Nous avons démontré un dysfonctionnement dans la signalisation de la mélatonine au niveau des tissus musculo-squelettiques chez une série de patients atteints de SIA (Moreau & coll. 2004). Nous avons confirmé ce défaut chez un plus grand nombre de patients ainsi qu’en utilisant une nouvelle technologie (spectroscopie cellulaire diélectrique) n’ayant pas recours à un prétraitement des cellules donnant ainsi des résultats plus précis. Cette technique a montré la présence des mêmes groupes fonctionnels identifiés auparavant par la technique d’AMPc. Le dysfonctionnement de la signalisation de la mélatonine est dû à une phosphorylation accrue des protéines G inhibitrices. Ce défaut pourrait être causé par un déséquilibre de l’activité des kinases et phosphatases capables de réguler la phosphorylation des protéines Gi. Parmi ces kinases, PKCd a suscité initialement notre intérêt vu qu’elle peut phosphoryler les protéines Gi. Nous avons démontré que cette kinase interagit avec le récepteur de la mélatonine MT2 et que cette interaction varie selon le groupe fonctionnel auquel un patient SIA appartient. Par la suite nos travaux se sont dirigés vers la découverte d’effecteurs cellulaires régulés par la mélatonine et plus spécifiquement l’ostéopontine (OPN), compte tenu de son rôle présumé comme mécanorécepteur et dans certaines structures jouant un rôle dans la proprioception, le contrôle postural et la fonction vestibulaire. L’OPN a été identifiée initialement par sa surexpression au niveau protéique et de l’ARNm dans la musculature paraspinale uniquement chez les poulets scoliotiques. Nous avons également utilisé un autre modèle animal, la souris C57Bl/6 naturellement déficiente en mélatonine. Nous avons généré des souris bipèdes en amputant les membres antérieurs de souris OPN KO, des souris CD44 KO ainsi que des souris contrôles C57Bl/6. Nos résultats ont montré qu’aucune souris OPN KO (n=50) ou CD44 KO (n=60) ne développe la maladie, contrairement aux souris contrôles C57Bl/6 (n=50) dont 45% deviennent scoliotiques. Ces résultats nous ont poussés à investiguer le rôle de cette protéine dans l’étiopathogenèse de la maladie chez l’humain. Nos résultats ont montré une augmentation des niveaux circulants d’OPN chez les patients atteints de la SIA et que l’élevation en OPN corrélait avec la sévérité de la maladie. Nos études chez les enfants asymptomatiques nés de parents scoliotiques et qui sont plus à risque de développer la maladie ont aussi démontré des différences significatives au niveau des concentrations en OPN en comparaison avec les sujets sains. En effet, plusieurs enfants à risque présentaient des niveaux d’OPN supérieurs à 800ng/ml suggérant un plus grand risque de développer une scoliose indiquant aussi que l’augmentation des niveaux en OPN précède le début de la maladie.

Impact de l'haploinsuffisance du gène Sim1 sur le développement et la fonction du noyau paraventriculaire de l'hypothalamus

L’obésité provient d’un déséquilibre de l’homéostasie énergétique, c’est-à-dire une augmentation des apports caloriques et/ou une diminution des dépenses énergétiques. Plusieurs données, autant anatomiques que physiologiques, démontrent que l’hypothalamus est un régulateur critique de l’appétit et des dépenses énergétiques. En particulier, le noyau paraventriculaire (noyau PV) de l’hypothalamus intègre plusieurs signaux provenant du système nerveux central (SNC) et/ou de la périphérie, afin de contrôler l’homéostasie énergétique via des projections axonales sur les neurones pré-ganglionnaires du système autonome situé dans le troc cérébral et la moelle épinière. Plusieurs facteurs de transcription, impliqués dans le développement du noyau PV, ont été identifiés. Le facteur de transcription SIM1, qui est produit par virtuellement tous les neurones du noyau PV, est requis pour le développement du noyau PV. En effet, lors d’une étude antérieure, nous avons montré que le noyau PV ne se développe pas chez les souris homozygotes pour un allèle nul de Sim1. Ces souris meurent à la naissance, probablement à cause des anomalies du noyau PV. Par contre, les souris hétérozygotes survivent, mais développent une obésité précoce. De façon intéressante, le noyau PV des souris Sim1+/- est hypodéveloppé, contenant 24% moins de cellules. Ces données suggèrent fortement que ces anomalies du développement pourraient perturber le fonctionnement du noyau PV et contribuer au développement du phénotype d’obésité. Dans ce contexte, nous avons entrepris des travaux expérimentaux ayant pour but d’étudier l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur : 1) le développement du noyau PV et de ses projections neuronales efférentes; 2) l’homéostasie énergétique; et 3) les voies neuronales physiologiques contrôlant l’homéostasie énergétique chez les souris Sim1+/-. A cette fin, nous avons utilisé : 1) des injections stéréotaxiques combinées à des techniques d’immunohistochimie afin de déterminer l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur le développement du noyau PV et de ses projections neuronales efférentes; 2) le paradigme des apports caloriques pairés, afin de déterminer l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur l’homéostasie énergétique; et 3) une approche pharmacologique, c’est-à-dire l’administration intra- cérébroventriculaire (i.c.v.) et/ou intra-péritonéale (i.p.) de peptides anorexigènes, la mélanotane II (MTII), la leptine et la cholécystokinine (CCK), afin de déterminer l’impact de l’haploinsuffisance de Sim1 sur les voies neuronales contrôlant l’homéostasie énergétique. Dans un premier temps, nous avons constaté une diminution de 61% et de 65% de l’expression de l’ARN messager (ARNm) de l’ocytocine (Ot) et de l’arginine-vasopressine (Vp), respectivement, chez les embryons Sim1+/- de 18.5 jours (E18.5). De plus, le nombre de cellules produisant l’OT et la VP est apparu diminué de 84% et 41%, respectivement, chez les souris Sim1+/- adultes. L’analyse du marquage axonal rétrograde des efférences du noyau PV vers le tronc cérébral, en particulier ses projections sur le noyau tractus solitaire (NTS) aussi que le noyau dorsal moteur du nerf vague (X) (DMV), a permis de démontrer une diminution de 74% de ces efférences. Cependant, la composition moléculaire de ces projections neuronales reste inconnue. Nos résultats indiquent que l’haploinsuffisance de Sim1 : i) perturbe spécifiquement le développement des cellules produisant l’OT et la VP; et ii) abolit le développement d’une portion importante des projections du noyau PV sur le tronc cérébral, et notamment ses projections sur le NTS et le DMV. Ces observations soulèvent donc la possibilité que ces anomalies du développement du noyau PV contribuent au phénotype d’hyperphagie des souris Sim1+/-. En second lieu, nous avons observé que la croissance pondérale des souris Sim1+/- et des souris Sim1+/+ n’était pas significativement différente lorsque la quantité de calories présentée aux souris Sim1+/- était la même que celle consommée par les souris Sim1+/+. De plus, l’analyse qualitative et quantitative des tissus adipeux blancs et des tissus adipeux bruns n’a démontré aucune différence significative en ce qui a trait à la taille et à la masse de ces tissus chez les deux groupes. Finalement, au terme de ces expériences, les souris Sim1+/--pairées n’étaient pas différentes des souris Sim1+/+ en ce qui a trait à leur insulinémie et leur contenu en triglycérides du foie et des masses adipeuses, alors que tous ces paramètres étaient augmentés chez les souris Sim1+/- nourries ad libitum. Ces résultats laissent croire que l’hyperphagie, et non une diminution des dépenses énergétiques, est la cause principale de l’obésité des souris Sim1+/-. Par conséquent, ces résultats suggèrent que : i) l’haploinsuffisance de Sim1 est associée à une augmentation de l’apport calorique sans toutefois moduler les dépenses énergétiques; ii) l’existence d’au moins deux voies neuronales issues du noyau PV : l’une qui régule la prise alimentaire et l’autre la thermogénèse; et iii) l’haploinsuffisance de Sim1 affecte spécifiquement la voie neuronale qui régule la prise alimentaire. En dernier lieu, nous avons montré que l’injection de MTII, de leptine ainsi que de CCK induit une diminution significative de la consommation calorique des souris des deux génotypes, Sim1+/+ et Sim1+/-. De fait, la consommation calorique cumulative des souris Sim1+/- et Sim1+/+ est diminuée de 37% et de 51%, respectivement, durant les 4 heures suivant l’administration i.p. de MTII comparativement à l’administration d’une solution saline. Lors de l’administration i.c.v. de la leptine, la consommation calorique cumulative des souris Sim1+/- et Sim1+/+ est diminuée de 47% et de 32%, respectivement. Finalement, l’injection i.p. de CCK diminue la consommation calorique des souris Sim1+/- et Sim1+/+ de 52% et de 36%, respectivement. L’ensemble des résultats suggère ici que l’haploinsuffisance de Sim1 diminue l’activité de certaines voies neuronales régulant l’homéostasie énergétique, et particulièrement de celles qui contrôlent la prise alimentaire. En résumé, ces travaux ont montré que l’haploinsuffisance de Sim1 affecte plusieurs processus du développement au sein du noyau PV. Ces anomalies du développement peuvent conduire à des dysfonctions de certains processus physiologiques distincts régulés par le noyau PV, et notamment de la prise alimentaire, et contribuer ainsi au phénotype d’obésité. Les souris hétérozygotes pour le gène Sim1 représentent donc un modèle animal unique, où l’hyperphagie, et non les dépenses énergétiques, est la principale cause de l’obésité. En conséquence, ces souris pourraient représenter un modèle expérimental intéressant pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires en contrôle de la prise alimentaire.

Effet de l'initiation du traitement antirétroviral sur la diversité virale du VIH

L’épidémie du VIH-1 dure maintenant depuis plus de 25 ans. La grande diversité génétique de ce virus est un obstacle majeur en vue de l’éradication de cette pandémie. Au cours des années, le VIH-1 a évolué en plus de cinquante sous-types ou formes recombinantes. Cette diversité génétique est influencée par diverses pressions de sélection, incluant les pressions du système immunitaire de l’hôte et les agents antirétroviraux (ARV). En effet, bien que les ARV aient considérablement réduit les taux de morbidité et de mortalité, en plus d’améliorer la qualité et l’espérance de vie des personnes atteintes du VIH-1, ces traitements sont complexes, dispendieux et amènent leur lot de toxicité pouvant mener à des concentrations plasmatiques sous-optimales pour contrôler la réplication virale. Ceci va permettre l’émergence de variantes virales portant des mutations de résistance aux ARV. Ce phénomène est encore plus complexe lorsque l’on prend en considération l’immense diversité génétique des différents sous-types. De plus, le virus du VIH est capable de persister sous forme latente dans diverses populations cellulaires, rendant ainsi son éradication extrêmement difficile. Des stratégies pouvant restreindre la diversité virale ont donc été préconisées dans le but de favoriser les réponses immunes de l’hôte pour le contrôle de l’infection et d’identifier des variantes virales offrant une meilleure cible pour des stratégies vaccinales ou immunothérapeutiques. Dans cet esprit, nous avons donc étudié, chez des sujets infectés récemment par le VIH-1, l’effet du traitement ARV précoce sur la diversité virale de la région C2V5 du gène enveloppe ainsi que sur la taille des réservoirs. En deuxième lieu, nous avons caractérisé la pression de sélection des ARV sur des souches virales de sous types variés non-B, chez des patients du Mali et du Burkina Faso afin d’évaluer les voies d’échappement viral dans un fond génétique différent du sous-type B largement prévalent en Amérique du Nord. Notre étude a démontré la présence d’une population virale très homogène et peu diversifiée dans les premières semaines suivant l’infection, qui évolue pour atteindre une diversification de +0,23% à la fin de la première année. Cette diversification est plus importante chez les sujets n’ayant pas initié de traitement. De plus, ceci s’accompagne d’un plus grand nombre de particules virales infectieuses dans les réservoirs viraux des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) chez ces sujets. Ces résultats suggèrent que l’initiation précoce du traitement pourrait avoir un effet bénéfique en retardant l’évolution virale ainsi que la taille des réservoirs, ce qui pourrait supporter une réponse immune mieux ciblée et potentiellement des stratégies immunothérapeutiques permettant d’éradiquer le virus. Nous avons également suivi 801 sujets infectés par des sous-types non-B sur le point de débuter un traitement antirétroviral. Bien que la majorité des sujets ait été à un stade avancé de la maladie, plus de 75% des individus ont obtenu une charge virale indétectable après 6 mois d’ARV, témoignant de l’efficacité comparable des ARV sur les sous-types non-B et B. Toutefois, contrairement aux virus de sous-type B, nous avons observé différentes voies moléculaires de résistance chez les sous type non-B, particulièrement chez les sous-types AGK/AK/K pour lesquels les voies de résistances étaient associées de façon prédominante aux TAM2. De plus, bien que la divergence entre les virus retrouvés chez les patients d’une même région soit faible, nos analyses phylogénétiques ont permis de conclure que ces mutations de résistance se sont produites de novo et non à partir d’un ancêtre commun porteur de résistance. Cependant, notre dernière étude au Mali nous a permis d’évaluer la résistance primaire à près de 10% et des études phylogénétiques seront effectuées afin d’évaluer la circulation de ces souches résistantes dans la population. Ces études suggèrent qu’un contrôle de la réplication virale par les ARV peut freiner la diversité du VIH et ainsi ouvrir la voie à un contrôle immunologique ciblé, utilisant de nouvelles stratégies vaccinales ou immunothérapeutiques. Toutefois, une thérapie antirétrovirale sous-optimale (adhérence, toxicité) peut conduire à l’échappement virologique en favorisant l’émergence et la dissémination de souches résistantes.

Analyse du mécanisme de la dégradation du récepteur CD4 par la protéine Vpu du virus de l'immunodéficience humaine-1 (VIH-1)

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4.

Étude de la régulation du facteur de transcription NF-kB dans l'infection par le RSV

L’infection par le Virus Respiratoire Syncytial cause des affections pulmonaires aiguës en pédiatrie caractérisée par une réponse inflammatoire excessive médiée par la production de cytokines par les cellules épithéliales des voies aériennes. Les gènes codant pour ces cytokines sont régulés par le facteur de transcription NF-κB (p50/p65) dont l’activation est classiquement induite par la phosphorylation de son inhibiteur IκBα, ce qui permet l’accumulation de l’hétérodimère au noyau. Par contre, nous avons récemment identifié la phosphorylation en sérine 536 de la sous-unité p65 comme une autre étape essentielle à son activation lors de l’infection des AEC par RSV. Le travail présenté dans ce mémoire a permis de démontrer que l’inhibition de l’expression de RIG-I, de Cardif ou de TRAF6, 3 protéines impliquées dans la reconnaissance cellulaire des virus, conduit à l’inhibition de cette phosphorylation en réponse à RSV. Nous avons également établi à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques et d’ARNi que, parmi les diverses kinases connues pour phosphoryler p65 en réponse à divers stimulus, IKKα/β sont essentielles à cette phosphorylation lors d’une stimulation par RSV. Puisque TRAF6 est bien connu dans la littérature pour activer le complexe IKK, nous proposons que TRAF6, après reconnaissance de l’ARN viral de RSV par RIG-I, active le complexe IKK qui induit la phosphorylation de la sousunité p65 de NF-κB, permettant l’expression de gènes cibles. D’autre part, nous avions précédemment démontré que Nox2, un isoforme de NADPH oxydase, contrôle l’activation de NF-κB en régulant les phosphorylations de IκBα et p65. Nous montrons ici que l’inhibition de Nox2 réduit fortement l’activité du complexe kinase IKK. De plus, la présence au niveau basal de Nox2 est critique pour le niveau d’ARN messager de Cardif. Nous proposons donc que la régulation de la phosphorylation de p65 en ser536 par Nox2 soit via son effet sur Cardif en permettant la fonctionnalité de la voie RIG-I.

Caractérisation de Cks1, régulateur du cycle cellulaire, dans le cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal. La survie à 5 ans est de 30-40% chez les patientes atteintes d’une tumeur invasive(TOV), comparativement à 95% chez les patientes diagnostiquées pour une tumeur à faible potentiel de malignité (LMP). Au laboratoire, l’analyse de l’expression des gènes de la micropuce à ADN HuFL d’Affymetrix a révélé que Cks1 est un gène dont l’expression varie entre les tumeurs LMP et TOV. En effet, ce régulateur du cycle cellulaire est surexprimé dans les tumeurs TOV par rapport aux tumeurs LMP. Nous avons donc déplété Cks1 dans des lignées cellulaires tumorales invasives du cancer de l’ovaire dérivées au laboratoire, soit la TOV112D et la TOV1946, en utilisant des shRNAs sous le contrôle d’un répresseur inductible à la tétracycline. Puis, nous avons dérivé des clones stables inductibles à la tétracycline. Les résultats obtenus nous indiquent que la déplétion de Cks1 n’a pas d’effet sur la prolifération et la migration cellulaires, ni sur la formation de structures tridimensionnelles in vitro. Ainsi, nous pouvons conclure que Cks1 ne joue pas un rôle clé dans la progression tumorale par rapport aux paramètres testés. Or, des études supplémentaires seraient nécessaires pour expliquer les différences biologiques observées entre les deux types de tumeurs étudiées, et justifier cette variation observée de l’expression de Cks1.

Caractérisation fonctionnelle de la GTPase Ran dans le cancer épithélial de l'ovaire

Le cancer épithélial de l’ovaire est le plus létal des cancers gynécologiques. Les tumeurs de l’ovaire se divisent en différentes classes reflétant l’étendue de la maladie. Les tumeurs à faible potentiel de malignité présentent une survie relative à 5 ans de 90%, alors que pour les tumeurs invasives, la survie à 5 ans chute drastiquement à 35-40%. Au laboratoire, nous avons précédemment identifié la protéine Ran, un membre de la superfamille des GTPases Ras, comme marqueur fortement exprimé dans les cancers épithéliaux de l’ovaire de haut grade et de haut stade dont la surexpression est associée à un mauvais pronostic. Ran est déjà connue pour contribuer au transport nucléocytoplasmique et à la progression du cycle cellulaire, mais son rôle dans le cancer ovarien n’est pas bien défini. En utilisant une approche de shRNA inductibles à la tétracycline basée sur les lentivirus, nous avons montré que la diminution de l’expression de Ran dans des lignées cellulaires agressives du cancer de l’ovaire affecte drastiquement la prolifération cellulaire par l’induction d’une apoptose caspase-3 dépendante. Par un essai de tumeurs en xénogreffes, nous avons démontré que la déplétion de Ran résulte en une diminution de la tumorigenèse et que la formation éventuelle de tumeurs est associée à une sélection des cellules tumorales ayant la capacité de ré-exprimer la protéine Ran. Ces résultats suggèrent un rôle critique pour Ran dans la survie et la tumorigénicité des cellules du cancer ovarien, indiquant que Ran pourrait être une cible thérapeutique intéressante.

Rôle de la protéine phosphatase PPM1A dans l'homéostasie hépatique du glucose et des lipides

L’insuline est une hormone essentielle qui induit des réponses complexes dans l’organisme pour maintenir l’homéostasie du glucose et des lipides. La résistance à son action est un phénomène pathologique observé dans un large éventail de situations, allant de l’obésité et du syndrome métabolique à la stéatose hépatique et au diabète de type 2, qui aboutissent au développement de l’athérosclérose et de la mortalité. Des avancées remarquables ont été réalisées dans notre compréhension des mécanismes moléculaires responsables du développement de la résistance à l’action de l’insuline. En particulier, l’induction d’un stress cellulaire par des taux élevés d’acides gras libres (AGL) et des cytokines, via l’activation des protéines Ser/Thr kinases, qui augmente la phosphorylation sur des résidus sérine, des molécules critiques impliquées dans la signalisation insulinique (p. ex. IR, IRS et p85) et conduit à la diminution de la réponse cellulaire à l’insuline. Cependant, la plupart des chercheurs ont limité leur travail dans l’investigation du rôle des protéines kinases susceptibles de modifier la réponse cellulaire à l’insuline. Donc, peu de données sont disponibles sur le rôle des Protéines Ser/Thr phosphatases (PS/TPs), même si il est bien établi que la phosphorylation de ces protéines est étroitement régulée par un équilibre entre les activités antagonistes des Ser/Thr kinases et des PS/TPs. Parmi les PS/TPS, PPM1A (également connu sous le nom PP2Cα) est une phosphatase particulièrement intéressante puisqu’il a été suggéré qu’elle pourrait jouer un rôle dans la régulation du métabolisme lipidique et du stress cellulaire. Ainsi, en se basant sur des résultats préliminaires de notre laboratoire et des données de la littérature, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle PPM1A pourrait améliorer la sensibilité à l’insuline en diminuant l’activité des protéines kinases qui seraient activées par le stress cellulaire induit par l’augmentation des AGL. Ces effets pourraient finalement améliorer le métabolisme glucidique et lipidique dans l’hépatocyte. Ainsi, pour révéler le rôle physiologique de PPM1A à l’échelle d’un animal entier, nous avons généré un modèle animal qui la surexprime spécifiquement dans le foie. Nous décrivons ici notre travail afin de générer ce modèle animal ainsi que les premières analyses pour caractériser le phénotype de celui-ci. Tout d’abord, nous avons remarqué que la surexpression de PPM1A chez les souris C57BL/6J n’a pas d’effets sur le gain de poids sur une longue période. Deuxièmement, nous avons observé que PPM1A a peu d’effets sur l’homéostasie du glucose. Par contre, nous avons montré que sa surexpression a des effets significatifs sur l’homéostasie du glycogène et des triglycérides. En effet, nous avons observé que le foie des souris transgéniques contient moins de glycogène et de triglycérides que le foie de celles de type sauvage. De plus, nos résultats suggèrent que les effets de la surexpression de PPM1A pourraient refléter son impact sur la synthèse et la sécrétion des lipides hépatiques puisque nous avons observé que sa surexpression conduit à l’augmentation la triglycéridémie chez les souris transgéniques. En conclusion, nos résultats prouvent l’importance de PPM1A comme modulateur de l’homéostasie hépatique du glucose et des lipides. Des analyses supplémentaires restent cependant nécessaires pour confirmer ceux-ci et éclaircir l’impact moléculaire de PPM1A et surtout pour identifier ses substrats.

Le cardinal Paul Grégoire et l'Église de Montréal (1968-1990)

L’historiographie récente du catholicisme québécois a passé pratiquement sous silence la vie et l’épiscopat de Mgr Paul Grégoire, archevêque de Montréal de 1968 à 1990. Pourtant, son épiscopat s’est déployé pendant une période cruciale de l’histoire du Québec et de l’Église catholique. Lorsque Mgr Grégoire devient archevêque de Montréal en avril 1968, le Québec vit encore sa Révolution tranquille, une période qui a vu l’éclosion au Québec de mentalités et moeurs nouvelles à l’enseigne du rejet du passé, sous l’impulsion d’une sécularisation et d’une déchristianisation déferlantes. De son côté, l’Église catholique vit son propre renouveau identitaire, fruit des travaux du Concile Vatican II, terminé depuis décembre 1965. C’est au confluent de ces deux renouveaux identitaires que l’épiscopat de Mgr Grégoire va prendre forme. L’archevêque de Montréal devra faire face à de nombreux défis inédits sur les fronts externes et internes. Ad extra, il devra prendre acte des défis d’une nouvelle donne sociale extrêmement défavorable à son Église, notamment sur le flanc de la confessionnalité du système d’éducation. Ad intra, il devra implanter les réformes conciliaires dans son diocèse, non sans avoir à affronter plusieurs résistances et incompréhensions, dont certaines deviendront des crises remettant en question la qualité de son leadership comme archevêque de Montréal. Au moment de sa retraite en mars 1990, Monsieur le cardinal Grégoire aura vu l’Église catholique perdre la majeure partie de son influence morale et spirituelle sur la société montréalaise et québécoise. Même si sa personnalité ne l’avait pas desservi dans ses efforts pour imprimer à l’Église de Montréal son orientation doctrinale, sa discipline et son style, on voit mal comment il aurait pu contrer significativement une évolution toute-puissante dans sa globalité. C’est ce que révèle le bilan de son épiscopat.

Base moléculaire et rôle du courant potassique transitoire I(A) des interneurones de l'hippocampe chez le rongeur

Les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la mémoire et l’apprentissage chez les mammifères sont incomplètement compris. Le rythme thêta de l’hippocampe constitue l’état « en ligne » de cette structure qui est cruciale pour la mémoire déclarative. Dans la région CA1 de l’hippocampe, les interneurones inhibiteurs LM/RAD démontrent des oscillations de potentiel membranaire (OPM) intrinsèques qui pourraient se révéler importantes pour la génération du rythme thêta. Des travaux préliminaires ont suggéré que le courant K+ I(A) pourrait être impliqué dans la génération de ces oscillations. Néanmoins, peu de choses sont connues au sujet de l’identité des sous-unités protéiques principales et auxiliaires qui soutiennent le courant I(A) ainsi que l’ampleur de la contribution fonctionnelle de ce courant K+ dans les interneurones. Ainsi, cette thèse de doctorat démontre que le courant I(A) soutient la génération des OPM dans les interneurones LM/RAD et que des protéines Kv4.3 forment des canaux qui contribuent à ce courant. De plus, elle approfondit les connaissances sur les mécanismes qui régissent les interactions entre les sous-unités principales de canaux Kv4.3 et les protéines accessoires KChIP1. Finalement, elle révèle que la protéine KChIP1 module le courant I(A)-Kv4.3 natif et la fréquence de décharge des potentiels d’action dans les interneurones. Nos travaux contribuent à l’avancement des connaissances dans le domaine de la modulation de l’excitabilité des interneurones inhibiteurs de l’hippocampe et permettent ainsi de mieux saisir les mécanismes qui soutiennent la fonction de l’hippocampe et possiblement la mémoire chez les mammifères.

L'investissement socialement responsable imposé aux gérants de portefeuille: vrai réforme ou faux semblant de la loi "Grenelle II" en faveur de l'ISR?

L’article L. 214-12 du Code monétaire et financier modifié par la loi du 12 juillet 2010 portant engagement national pour l’environnement met à la charge des SICAV et des sociétés de gestion une obligation de prendre en compte et de divulguer les critères extrafinanciers utilisés dans leur choix d’investissement. Cette réforme législative vient enrichir la thématique de la responsabilité sociale des entreprises devenue aujourd’hui incontournable en s’intéressant à son aspect financier : l’investissement socialement responsable (ISR). Destinée à donner de l’ampleur à l’économie verte, cette position rompt avec la posture traditionnelle réservée que le droit français observait en la matière. Toutefois, elle est dans le droit fil de nombreuses réglementations étrangères et de recommandations d’organisations et d’associations professionnelles tant nationales qu’internationales mais dans le même temps va bien au-delà. Cette étude analyse le corpus et les implications de la nouvelle rédaction de l’article L. 214-12 du Code monétaire et financier. Bien que cette évolution issue de la « Loi Grenelle II » augure de conséquences positives pour l’avenir de la finance responsable, elle laisse place à de nombreux doutes susceptibles d’empêcher le droit de produire les effets désirés.

Contrôle de l'expression de la protéine PHEX et rôle de PHEX et FGF23 dans la minéralisation par les cellules MC3T3

PHEX est une protéine importante dans le processus de minéralisation osseuse. Des mutations ou la délétion d’une partie de ce gène causent l’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractérisée par une hypophosphatémie, accompagnée de défauts de minéralisation, de rachitisme et de lésions ostéomalaciques. Avec l’hypophosphatémie, les taux circulants de vitamine D devraient être augmentés, ce qui n’est pas le cas d’où une régulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgré le fait que cette protéine soit une peptidase, aucun substrat physiologique n’a encore été répertorié pour PHEX. PHEX est une protéine membranaire de type II de la famille M13 des métalloendopeptidases à zinc possédant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire d’environ 20 acides aminés et une large portion C-terminale extracellulaire où se trouve le site actif de l’enzyme. PHEX est exprimée de façon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparaît à l’initiation de la minéralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modèle animal de la maladie humaine, montrent des quantités importantes de la protéine FGF23. De plus, FGF23 est impliqué dans une autre maladie reliée au métabolisme du phosphate, l’hypophosphatémie rachitique autosomale dominante (ADHR) où des mutations de FGF23 causent sensiblement les mêmes symptômes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostéoblastes et les ostéocytes. FGF23 cause une hypophosphatémie par la diminution de l’expression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la réabsorption du phosphate rénal. L’hypothèse proposée dans la littérature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minéralisation osseuse. Plus spécifiquement, l’activation ou l’inactivation de ces peptides aurait pour rôle de réguler les quantités de FGF23. Selon l’hypothèse mentionnée précédemment, la régulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minéralisation. Une quantité croissante de données sur la régulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue l’expression de PHEX tandis que les glucocorticoïdes et l’hormone de croissance augmentent son expression. Dans une première étude, nous avons voulu déterminer si un peptide relié à la minéralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait réguler l’expression de PHEX. Nous avons déterminé que le PTHrP1-34 peut réguler de façon négative l’expression de PHEX dans les cellules UMR-106, une lignée cellulaire ostéoblastique. Cette régulation passe par la voie de l’AMPc/protéine kinase A. De plus, cette diminution d’expression est également observée au jour 7 dans des cultures primaires d’ostéoblastes de rat en minéralisation. Par la suite, nous avons étudié un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouvé chez un patient souffrant de XLH, où la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation n’interfère pas avec le site catalytique de l’enzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthétique que la protéine sauvage. Il a été déterminé que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons démontré que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX à COPII, responsable de la formation de vésicules de sécrétion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, à l’incorporation de PHEX dans des vésicules de calcification, lesdites vésicules étant importantes dans le processus de minéralisation. Finalement, des essais de compétitions ont démontré que la minéralisation pouvait être perturbée lorsque l’on surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement à la queue mutée. Ceci suggère possiblement que l’interaction avec COPII menant à l’incorporation de PHEX dans les vésicules de calcification ou d’autres protéines comprenant de tels motifs pourrait être importante pour la minéralisation. Finalement, la dernière étude porte sur la protéine FGF23. Nous avons démontré, par la surexpression de FGF23 dans la lignée MC3T3 d’ostéoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la sénescence de ces cellules. En effet, des essais de sénescence ont montré l’augmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprimé. Par contre, la prolifération n’est pas altérée. De plus, il semblerait que la différenciation soit plus rapide, tel qu’observé par une minéralisation survenant plus tôt, mais n’étant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostéoblastes se différencient plus rapidement et passent donc à un état de sénescence prématuré comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littérature où KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinité sur son récepteur, lorsqu’inactivé démontre un phénotype similaire au vieillissement incluant un phénotype de sénescence.