Convívio e Dispersão: da Tradição Poética em Ensaios de António Ramos Rosa e Haroldo de Campos

Dissertação apresentada para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Estudos Portugueses

Importância da repetição do xenodiagnóstico para avaliação da parasitemia na fase crônica da doença de Chagas

Selecionamos em Mambaí (GO) 303 chagásicos com sorologia reagenle, para estudo da parasitemia, realizada através de três xenodiagnósticos feitos com Dipetalogaster maximus e Triatoma infestans. Duzentos e dez (69,3%)pessoas apresentaram xenodiagnósticos positivos. O primeiro exame detectou parasitemia em 125 (41,2%) chagásicos, o segundo em outros 59 (19,5%) e o terceiro em mais 26 (8,6%) indivíduos. A positividade em 21 crianças de até nove anos foi 90,5%. Classificamos os chagásicos em três graus de parasitemia conforme a relação de "pools" positivos sobre "pools" examinados. Deste modo, 28 (9,2%) tiveram alta parasitemia, 73 (24,1%) média parasitemia e 202 (66,7%) baixa parasitemia. Nos indivíduos de alta e média parasitemia o Trypanosoma cruzi foi detectado nos dois primeiros xenodiagnósticos, enquanto nos de baixa parasitemia, a positividade de 22,8% no primeiro exame elevou-se para 41,1%e 54% no segundo e terceiro xenodiagnósticos, respectivamente. A repetição do xenodiagnóstico, especialmente nos indivíduos de baixa parasitemia, mostrou uma elevação significativa da positividade.

Strategic assessment of Portugal Ventures' life sciences portfolio

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Management from the NOVA – School of Business and Economics

Pesquisa da infecção natural por Yersinia pestis, em pulicídeos provenientes de focos pestosos do nordeste do Brasil

Foram avaliados três processos de acondicionamento e transporte de pulgas, objetivando análise bacteriológica para isolamento da Yersinia pestis. As três abordagens testadas foram: pulgas vivas em tubos de ensaio com tiras dobradas de papel de filtro; pulgas em solução salina; macerados de pulgas em meio de Cary-Blair. Os dois últimos métodos foram quase iguais e superiores ao primeiro. Foram analisadas pelas três técnicas, um total de 29.512 "pools" de pulicideos provenientes de focos de peste do Nordeste do Brasil no período de 1966 a 1982. Deste total, 236 (0,80%) dos "pools" foram positivos por cultura e/ou inoculação em animais sensíveis.

Corporate real estate strategies - a multinational approach

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Management from the NOVA – School of Business and Economics

Comportamento da parasitemia pelo Trypanosoma cruzi em chagásicos crônicos durante 13 anos

Foi estudada a parasitemia de 202 chagásicos crônicos por um período médio de 13 anos, através de repetidos xenodiagnósticos convencionais. Os pacientes tinham média de idade de 41,4 anos, residiam em área endêmica, sendo 124 do sexo feminino e 78 do sexo masculino. Foi observado que o nível de parasitemia aumentou em 14 indivíduos, diminuiu em 42 e permaneceu inalterado em 146. Porém, no geral, a parasitemia declinou. Os percentuais de chagásicos xenopositivos que foram 37,6%, 48,5%, 51% no primeiro, segundo e terceiro xenodiagnósticos, respectivamente, em 1976/78, passaram a ser 30,2% em 1988/91 (p = 0,00003). Os percentuais de pools positivos que foram 15,2%, 20,9%, 20,8% no primeiro, segundo e terceiro xenodiagnósticos, respectivamente, em 1976/78, passaram a ser 10,4% em 1988/91, (p = 0.00000001). Houve 62 pacientes que tiveram todos os xenodiagnósticos negativos e 23 que apresentaram todos os exames positivos. Os percentuais de chagásicos com alta, média e baixa parasitemias que, em 1976/78, foram, respectivamente, 9,4%; 20,8% e 69,8% passaram a ser, em 1988/91, respectivamente, 4,4%, 12,9% e 82,7%.

First isolation of dengue 1 virus from Aedes aegypti in Federal District, Brazil

Dengue is present in the Federal District since 1991 and virological studies of the vector began in 1998. Two strains of DEN1 were isolated from 9 pools of female Aedes aegypti (78 mosq.), collected in April in Gama county, where the Breteau index was 5.4, and 32 autochtonous human cases were notified.

Estudo comparativo entre o xenodiagnóstico artificial realizado imediatamente e quatro horas após a coleta de sangue

Foi realizado xenodiagnóstico artificial, imediatamente e quatro horas após a coleta do sangue, em 63 pacientes, sendo 29 (46%) do sexo masculino e 34 (54%) do sexo feminino. A idade mínima foi 18 anos e a máxima 68, sendo a idade média 39 anos. Onze (17,5%) pacientes apresentaram resultados positivos, sendo 8 (12,7%) no exame imediato e 7 (11,1%) no exame 4 horas após. Os oito pacientes do exame imediato apresentaram 17 pools positivos e os sete do xenodiagnóstico de quatro horas mostraram 11 pools positivos (p =0,34). Quatro pacientes foram positivos exclusivamente no xenodiagnóstico imediato, três somente no exame de 4 horas e quatro positivos em ambos. Os dados autorizam realizar o xenodiagnóstico, até quatro horas após a extração do sangue, sem prejuízo no resultado do exame.

Diagnóstico molecular da taxa de infecção natural de flebotomíneos (Psychodidae, Lutzomyia) por Leishmania sp na Amazônia maranhense

A taxa de infecção natural de três diferentes espécies de flebotomíneos por Leishmania foi estudada usando a técnica de reação em cadeia da polimerase. Primers específicos para Leishmania foram designados para examinar se os pools de flebotomíneos estavam infectadas. Um total de 1.100 fêmeas separadas em pools de 10 indivíduos foram examinados, consistindo de 50 Lutzomyia whitmani, 43 Lutzomyia triacantha e 17 Lutzomyia choti. De todos os pools analisados, 4 de Lutzomyia whitmani estavam positivos, mas nenhum pool das duas espécies restantes estava infectado. Deste modo, uma taxa de infecção de 0,4% foi verificada neste estudo. Esta taxa de infecção associada a estudos anteriores sugere que Lutzomyia whitmani transmite Leishmania aos mamíferos em Buriticupu, Maranhão.

Phage display as a tool for development of novel therapeutics for breast cancer

Phage display technology is a powerful platform for the generation of highly specific human monoclonal antibodies (Abs) with potential use in clinical applications. Moreover, this technique has also proven to be a reliable approach in identifying and validating new cancer-related targets. For scientific or medical applications, different types of Ab libraries can be constructed. The use of Fab Immune libraries allows the production of high quality and affinity antigen-specific Abs. In this work, two immune human phage display IgG Fab libraries were generated from the Ab repertoire of 16 breast cancer patients, in order to obtain a tool for the development of new therapeutic Abs for breast cancer, a condition that has great impact worldwide. The generated libraries are estimated to contain more than 108 independent clones and a diversity over 90%. Libraries validation was pursued by selection against BSA, a foreign and highly immunogenic protein, and HER2, a well established cancer target. Preliminary results suggested that phage pools with affinity for these antigens were selected and enriched. Individual clones were isolated, however, it was not possible to obtain enough data to further characterize them. Selection against the DLL1 protein was also performed, once it is a known ligand of the Notch pathway, whose deregulation is associated to breast cancer, making it an interesting target for the generation of function-blocking Abs. Selection resulted in the isolation of a clone with low affinity and Fab expression levels. The validation process was not completed and further effort will have to be put in this task in the future. Although immune libraries concept implies limited applicability, the library reported here has a wide range of use possibilities, since it was not restrained to a single antigen but instead thought to be used against any breast cancer associated target, thus being a valuable tool.

Detecção e tipagem de vírus dengue em Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) na Cidade de Manaus, Estado do Amazonas

O estudo teve por objetivo a detecção e tipagem do vírus dengue, nos vetores Aedes aegypti. Durante o período de dezembro de 2005 a dezembro de 2006, foram coletados 8.984 mosquitos, em 46 bairros da Cidade de Manaus abrangendo todas as zonas geográficas da cidade. Destes, 819 eram Aedes aegypti (414 fêmeas e 405 machos). As fêmeas de Aedes aegypti foram agrupadas em pools de 1 a 10 mosquitos totalizando 138 pools, sendo que 111 pools foram positivos para DENV 3. Porém, um pool mostrou-se positivo para dois sorotipos, DENV 1 e DENV 3. A prevalência de Aedes aegypti infectados com DENV 3, na Cidade de Manaus foi de 53%. Entretanto, a prevalência por zona foi de 70% no Centro-oeste, 60% no Sul, 53% no Oeste, 47% no Centro-Sul, 30% no Norte e 23% na zona Leste. O monitoramento da circulação viral em mosquitos com o uso da técnica da transcrição reversa-reação da polimerase em cadeia que permite o conhecimento prévio dos níveis de disseminação viral em determinadas áreas contribuindo para determinar os locais para aplicar as medidas de prevenção e controle.

Infecção natural de Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Diptera: Psychodidae) por Leishmania infantum chagasi em flebotomíneos capturados no município de Janaúba, Estado de Minas Gerais, Brasil

INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral tem sido notificada em quase todos os estados do Brasil, e principalmente no norte de Minas Gerais, onde a doença é endêmica. Este estudo visou detectar a infecção natural de Lutzomyia longipalpis e identificar através da técnica de PCR/RFLP a espécie de Leishmania encontrada nos flebotomíneos do município de Janaúba. MÉTODOS: Utilizando-se armadilhas luminosas, foram capturadas 1.550 fêmeas de L. longipalpis, que agrupadas em pool de 10 exemplares foram submetidas à extração e amplificação de DNA, através das técnicas de PCR genérico e cacofonia. RESULTADOS: Dos 155 pools, seis apresentaram-se positivos para Leishmania sp., sendo a taxa de infecção do município de 3,9%. Através da PCR/RFLP determinou-se que o padrão de digestão das amostras positivas foi semelhante ao da cepa referência Leishmania chagasi (MHOM/BR/74/PP75). CONCLUSÕES: A detecção de infecção natural associada a estudos sobre a epidemiologia da LV sugere que L. longipalpis esteja envolvida na transmissão de L. infantum chagasi em Janaúba, principalmente nas áreas de intensa transmissão de LV.

Evidência de transmissão de leishmaniose visceral por Lutzomyia cruzi no município de Jaciara, Estado de Mato Grosso, Brasil

INTRODUÇÃO: O município de Jaciara foi classificado em 2003, como área de transmissão de leishmaniose visceral em situação de surto. O trabalho objetivou determinar evidência de transmissão de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi por Lutzomyia cruzi no município de Jaciara, Estado de Mato Grosso, Brasil. MÉTODOS: O município situa-se a 127km da capital Cuiabá e é um importante ponto de atração para os praticantes de eco-turismo. Fêmeas de Lutzomyia cruzi, capturadas com armadilha de CDC, foram dissecadas para confirmação da espécie e armazenadas a -20ºC em pools de 10 indivíduos para extração de DNA, PCR genérico, RFLP específico e eletroforese em gel de poliacrilamida. RESULTADOS: O levantamento entomológico demonstrou a ocorrência abundante de Lutzomyia cruzi e ausência de Lutzomyia longipalpis, principal vetora da Leishmania (Leishmania) infantum chagasi. Uma das três amostras analisadas apresentou banda característica de DNA de Leishmania (120pb) em PCR genérico. Para confirmação da espécie de Leishmania, na RFLP utilizaram-se controles positivos de Leishmania (Leishmania) amazonensis, Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) infantum chagasi digeridas com enzima de restrição HaeIII. Constatou-se um padrão de bandas semelhante à Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em uma amostra, confirmando a detecção de infecção natural de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi em Lutzomyia cruzi. CONCLUSÕES: A ocorrência de casos humanos e cães positivos, a presença da Lutzomyia cruzi e a ausência de Lutzomyia longipalpis, bem como a detecção de infecção natural por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, evidenciam a participação de Lutzomyia cruzi na transmissão da leishmaniose visceral em Jaciara, Estado de Mato Grosso, Brasil.

Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM.

Study of infection by Rickettsiae of the spotted fever group in humans and ticks in an urban park located in the City of Londrina, State of Paraná, Brazil

INTRODUCTION: Spotted fevers are emerging zoonoses caused by Rickettsia species in the spotted fever group (SFG). Rickettsia rickettsii is the main etiologic agent of Brazilian spotted fever (BSF) and it is transmitted by Amblyomma spp. ticks. METHODS: The study aimed to investigate SFG rickettsiae in the Arthur Thomas Municipal Park in Londrina, PR, by collecting free-living ticks and ticks from capybaras and blood samples from personnel working in these areas. Samples from A. dubitatum and A. cajennense were submitted for PCR in pools to analyze the Rickettsia spp. gltA (citrate synthase gene). RESULTS: All the pools analyzed were negative. Human sera were tested by indirect immunofluorescence assay with R. rickettsii and R. parkeri as antigens. Among the 34 sera analyzed, seven (20.6%) were reactive for R. rickettsii: four of these had endpoint titers equal to 64, 2 titers were 128 and 1 titer was 256. None of the samples were reactive for R. parkeri. An epidemiological questionnaire was applied to the park staff, but no statistically significant associations were identified. CONCLUSIONS: The serological studies suggest the presence of Rickettsiae related to SFG that could be infecting the human population studied; however, analysis of the ticks collected was unable to determine which species may be involved in transmission to humans.