New ultrasonic-based methods in proteomics

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Bioquímica pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia.A presente dissertação foi preparada no âmbito do convénio bilateral existente entre a Universidade Nova de Lisboa e a Universidade de Vigo.

Freshwater arsenic detoxification through selenium-enriched food supplements. A proteomic approach

Dissertação apresentada para a obtenção do grau de doutor em Bioquímica pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Otimização da produção de biogás com recurso a redes neuronais artificiais

Numa Estação de Tratamento de Águas Residuais (ETAR), são elevados os custos não só de tratamento das águas residuais como também de manutenção dos equipamentos lá existentes, nesse sentido procura-se utilizar processos capazes de transformar os resíduos em produtos úteis. A Digestão Anaeróbia (DA) é um processo atualmente disponível capaz de contribuir para a redução da poluição ambiental e ao mesmo tempo de valorizar os subprodutos gerados. Durante o processo de DA é produzido um gás, o biogás, que pode ser utilizado como fonte de energia, reduzindo assim a dependência energética da ETAR e a emissão de gases com efeito de estufa para a atmosfera. A otimização do processo de DA das lamas é essencial para o aumento da produção de biogás, mas a complexidade do processo constitui um obstáculo à sua otimização. Neste trabalho, aplicaram-se Redes Neuronais Artificiais (RNA) ao processo de DA de lamas de ETAR. RNA são modelos simplificados inspirados no funcionamento das células neuronais humanas e que adquirem conhecimento através da experiência. Quando a RNA é criada e treinada, produz valores de output aproximadamente corretos para os inputs fornecidos. Foi esse o motivo para recorrer a RNA na otimização da produção de biogás no digestor I da ETAR Norte da SIMRIA, usando o programa NeuralToolsTM da PalisadeTM para desenvolvimento das RNA. Para tal, efetuou-se uma análise e tratamento de dados referentes aos últimos quatro anos de funcionamento do digestor. Os resultados obtidos permitiram concluir que as RNA modeladas apresentam boa capacidade de generalização do processo de DA. Considera-se que este caso de estudo é promissor, fornecendo uma boa base para o desenvolvimento de modelos eventualmente mais gerais de RNA que, aplicado conjuntamente com as características de funcionamento de um digestor e o processo de DA, permitirá otimizar a produção de biogás em ETAR.

Effect of b-Propiolactone treatment on the complement activation mediated by equine antisera

Reduction of complement activation through an alteration of the Fc fragment of immunoglobulins by b-propiolactone treatment was carried out in equine antisera raised against rabies virus, Bothrops venoms and diphtherial toxin. Results were evaluated by means of an anaphylactic test performed on guinea-pigs, and compared to the ones obtained with the same sera purified by saline precipitation (ammonium sulfate), followed or not by enzymatic digestion with pepsin. Protein purity levels for antibothropic serum were 184.5 mg/g and 488.5 mg/g in b-propiolactone treated and pepsin-digested sera, respectively. The recovery of specific activity was 100% and 62.5% when using antibothropic serum treated by b-propiolactone and pepsin digestion, respectively. The antidiphtherial and anti-rabies sera treated with b-propiolactone and pepsin presented protein purity levels of 5,698 and 7,179 Lf/g, 16,233 and 6,784 IU/g, respectively. The recovery of specific activity for these antisera were 88.8%, 77.7%, 100% and 36,5%, respectively. b-propiolactone treatment induced a reduction in complement activation, tested "in vivo", without significant loss of biological activity. This treatment can be used in the preparation of heterologous immunoglobulins for human use.

Genomic characterization of adenovirus serotype 7 isolated in Brazil from acute respiratory disease patients during the period from 1980 to 1991

Forty isolates of adenovirus type 7 were analized by restriction enzyme digestion with BamHI, SmaI, EcoRI and HindIII. These isolates were obtained from acute respiratory disease patients during the years 1980 to 1991. Only two genomic types were found: Ad7b and Ad7e, with Ad7b (87.5%) being more frequent than Ad7e (12.5%). The genomic type Ad7e appeared in the years 1980, 1981 and 1983. Ad7b appeared in 1982 and it was the only genomic type found from 1984 to 1991. Both genomic types were responsible for lower (LRTI) and upper (URTI) respiratory tract infection, but the proportion LRTI/URTI is higher for Ad7b (25/6) than for Ad7e (1/4).

Development of new methodologies in sample treatment for proteomics workflow based on enzymatic probe sonication technology and mass spectrometry

Thesis submitted to the Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia, for the degree of Doctor of Philosophy in Biochemistry

Trace elements quantification in Portuguese red wines

Dissertation for the Degree of Master in Technology and Food Safety – Food Quality

Mapping of a Leishmania major gene/locus that confers pentamidine resistance by deletion and insertion of transposable element

Pentamidine (PEN) is an alternative compound to treat antimony-resistant leishmaniasis patients, which cellular target remains unclear. One approach to the identification of prospective targets is to identify genes able to mediate PEN resistance following overexpression. Starting from a genomic library of transfected parasites bearing a multicopy episomal cosmid vector containing wild-type Leishmania major DNA, we isolated one locus capable to render PEN resistance to wild type cells after DNA transfection. In order to map this Leishmania locus, cosmid insert was deleted by two successive sets of partial digestion with restriction enzymes, followed by transfection into wild type cells, overexpression, induction and functional tests in the presence of PEN. To determine the Leishmania gene related to PEN resistance, nucleotide sequencing experiments were done through insertion of the transposon Mariner element of Drosophila melanogaster (mosK) into the deleted insert to work as primer island. Using general molecular techniques, we described here this method that permits a quickly identification of a functional gene facilitating nucleotide sequence experiments from large DNA fragments. Followed experiments revealed the presence of a P-Glycoprotein gene in this locus which role in Leishmania metabolism has now been analyzed.

Human vaccinia-like virus outbreaks in São Paulo and Goiás States, Brazil: virus detection, isolation and identification

Since October 2001, the Adolfo Lutz Institute has been receiving vesicular fluids and scab specimens of patients from Paraíba Valley region in the São Paulo and Minas Gerais States and from São Patricio Valley, in the Goiás State. Epidemiological data suggested that the outbreaks were caused by Cowpox virus or Vaccinia virus. Most of the patients are dairy milkers that had vesiculo-pustular lesions on the hands, arms, forearms, and some of them, on the face. Virus particles with orthopoxvirus morphology were detected by direct electron microscopy (DEM) in samples of 49 (66.21%) patients of a total of 74 analyzed. Viruses were isolated in Vero cell culture and on chorioallantoic membrane (CAM) of embryonated chicken eggs. Among 21 samples submitted to PCR using primers for hemagglutinin (HA) gene, 19 were positive. Restriction digestion with TaqI resulted in four characteristic Vaccinia virus fragments. HA nucleotide sequences showed 99.9% similarity with Cantagalo virus, described as a strain of Vaccinia virus. The only difference observed was the substitution of one nucleotide in the position 616 leading to change in one amino acid of the protein in the position 206. The phylogenetic analysis showed that the isolates clustered together with Cantagalo virus, other Vaccinia strains and Rabbitpox virus.

Genotypic identification of Cryptosporidium spp. isolated from hiv-infected patients and immunocompetent children of São Paulo, Brazil

Cryptosporidium isolates identified in fourteen stool samples, collected from five HIV-infected patients and nine immunocompetent children, living in the Sate of São Paulo, Brazil, were submitted to a molecular analysis using a nested PCR followed of restriction fragment length polymorphism (RFLP), for genetic characterization. The analysis was based on digestion with RsaI restriction enzyme of a DNA fragment amplified from the Cryptosporidium oocyst wall protein (COWP) gene. Based on this analysis, four samples were identified as Cryptosporidium parvum, eight as Cryptosporidium hominis and two presented a profile that correspondedto Cryptosporidium meleagridis when compared to the standards used in the analysis. The use of molecular methods can be helpful to identify source of infections and risk factors related to Cryptosporidium infection in our communities.

Municipal solid waste management system: decision support through systems analysis

Thesis submitted to the Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia for the degree of Doctor of Philosophy in Environmental Engineering

Análise da viabilidade económica da implementação de uma central de micro-cogeração no setor da agropecuária

O crescente aumento do consumo energético das sociedades desenvolvidas e emergentes, motivado pelo progresso económico e social, tem induzido a procura de alternativas focalizadas nas energias renováveis, que possam contribuir para assegurar o fornecimento de energia sem agravar o consumo de combustíveis fósseis e a emissão de gases com efeito de estufa. Nesse sentido, a produção de energia eléctrica a partir do gás metano resultante da estabilização anaeróbia de efluentes tem vindo a ser estudada e praticada desde finais do século XIX, tendo assumido maior expressão a partir dos anos 70 do século XX, na sequência das primeiras crises petrolíferas. As instalações agropecuárias reúnem dois fatores chave para o sucesso do aproveitamento energético do biogás produzido no tratamento dos efluentes: por um lado, produzem matéria-prima com potencial energético – dejeto animal com um potencial enorme de criação de biogás quando procedido de tratamento anaeróbio - e, por outro, necessitam de energia eléctrica para o funcionamento dos equipamentos electromecânicos e de calor para a manutenção das instalações. A valorização energética do biogás produzido na estabilização anaeróbia dos efluentes agro-pecuários, para além de permitir obter um retorno financeiro, que contribui para o equilíbrio dos custos de investimento e de exploração, contribui igualmente para a redução das emissões de gases com efeito de estufa, como o dióxido de carbono e o metano, e para a segurança de abastecimento energético à instalação, na medida em que assegura a alimentação de energia eléctrica em caso de falha no fornecimento pela rede nacional. A presente dissertação apresenta um contributo para estudos a desenvolver por proprietários de agropecuárias, cooperativas regionais do setor da agropecuária, empresas de projecto e estudantes de Engenharia, constituído por uma compilação da informação mais relevante associada à estabilização anaeróbia de efluentes e à valorização energética do biogás produzido. Com base em informação referente ao número real de animais existentes em Portugal, este trabalho pretende fazer ver a essas entidades que o aproveitamento energético do biogás é viável e útil para o país. Com a criação de uma aplicação informática de análise económica de investimento, provar que o investimento em pequenas propriedades, com apenas 80 cabeças normais, pode obter um retorno financeiro razoável, com um prazo de recuperação do investimento bastante baixo, aproveitando um recurso que caso contrário será desperdiçado e poluirá o ambiente.

Análise do ciclo de vida da produção do butanol

Este trabalho teve como objetivo avaliar e comparar os impactes ambientais da produção do butanol considerando três processos produtivos: um que usa fontes fósseis e dois que usam fontes renováveis, nomeadamente palha de trigo e milho. Para o primeiro caso considerouse o processo oxo e os restantes usaram o processo de produção ABE (acetona, butanol e etanol). Na primeira etapa estudaram-se e descreveram-se os diferentes processos referidos. A análise do ciclo de vida foi depois aplicada efetuando as quatro fases nomeadamente definição do âmbito e objetivo, inventário, avaliação de impactes e interpretação dos resultados obtidos. O inventário foi efetuado tendo em conta a bibliografia existente sobre estes processos e com o auxílio da base de dados Ecoinvent Versão3 Database™. Na avaliação de impactes utilizou-se o método Impact 2002 + (Endpoint). Concluiu-se que a produção do butanol pelo processo ABE utilizando o milho é a que apresenta maior impacte ambiental e a que produção do butanol pelo processo ABE usando a palha de trigo é a que apresenta um menor impacte ambiental, quando o processo de alocação foi efetuado tendo em conta as massas de todos os produtos produzidos em cada processo. Foi efetuada uma análise de sensibilidade para a produção de butanol usando palha de trigo e milho relativa aos dados de menor qualidade. No processo da palha de trigo fez-se variar a quantidade de material enviado para a digestão anaeróbia e a quantidade de efluente produzida. No processo relativo ao milho apenas se fez variar a quantidade de efluente produzida. As variações tiveram um efeito pouco significativo (<1,3%) no impacte global. Por fim, efetuou-se o cálculo dos impactes considerando uma alocação económica que foi executada tendo em conta os preços de venda para o ano 2013 na Europa, para os produtos produzidos pelos diferentes processos. Considerando o valor económico verificou-se um aumento do peso relativo ao butanol, o que fez aumentar significativamente o impacte ambiental. Isto deve-se em grande parte ao baixo valor económico dos gases formados nos processos de fermentação. Se na alocação por massa for retirada a massa destes gases os resultados obtidos são similares nos dois tipos de alocação.

Redes Neuronais Artificiais na Otimização do Processo de Digestão Anaeróbia - Aplicação a uma ETAR da AdCL

Numa sociedade com elevado consumo energético, a dependência de combustíveis fósseis em evidente diminuição de disponibilidades é um tema cada vez mais preocupante, assim como a poluição atmosférica resultante da sua utilização. Existe, portanto, uma necessidade crescente de recorrer a energias renováveis e promover a otimização e utilização de recursos. A digestão anaeróbia (DA) de lamas é um processo de estabilização de lamas utilizado nas Estações de Tratamento de Águas Residuais (ETAR) e tem, como produtos finais, a lama digerida e o biogás. Maioritariamente constituído por gás metano, o biogás pode ser utilizado como fonte de energia, reduzindo, deste modo, a dependência energética da ETAR e a emissão de gases com efeito de estufa para a atmosfera. A otimização do processo de DA das lamas é essencial para o aumento da produção de biogás. No presente relatório de estágio, as Redes Neuronais Artificiais (RNA) foram aplicadas ao processo de DA de lamas de ETAR. As RNA são modelos simplificados inspirados no funcionamento das células neuronais humanas e que adquirem conhecimento através da experiência. Quando a RNA é criada e treinada, produz valores de output aproximadamente corretos para os inputs fornecidos. Uma vez que as DA são um processo bastante complexo, a sua otimização apresenta diversas dificuldades. Foi esse o motivo para recorrer a RNA na otimização da produção de biogás nos digestores das ETAR de Espinho e de Ílhavo da AdCL, utilizando o software NeuralToolsTM da PalisadeTM, contribuindo, desta forma, para a compreensão do processo e do impacto de algumas variáveis na produção de biogás.

EXPERIMENTAL INFECTION WITH Toxocara cati IN PIGS: MIGRATORY PATTERN AND PATHOLOGICAL RESPONSE IN EARLY PHASE

Experimental inoculations of approximately 100,000 infective Toxocara cati larval eggs were done in twelve pigs. The T. cati eggs used for inoculation were collected from cat's feces. Another group of three pigs served as an uninfected control. Groups of infected pigs were euthanized at seven, 14, 21, and 28 days post-inoculation (dpi). Tissue samples were taken for digestion and histopathology changes in early phase. The number of larvae recovered from the lungs peaked at seven and 14 dpi and were also present at 21, and 28 dpi. Larvae of T. cati were present in the lymph nodes of the small and large intestine at seven, 14, and 28 dpi and at seven, 14, 21, and 28 dpi respectively. In other studied tissues, no larvae or less than one larva per gram was detected. The pathological response observed in the liver and lungs at seven and 14 dpi, showed white spots on the liver surface and areas of consolidation were observed in the lungs. The lungs showed an inflammatory reaction with larvae in center at 28 dpi. In the liver we observed periportal and perilobular hepatitis. The lymph nodes of the intestines displayed eosinophil lymphadenitis with reactive centers containing parasitic forms in some of them. The granulomatous reaction was not observed in any tissues. The role of the other examined tissues had less significance. The relevance of this parasite as an etiological agent that leads to disease in paratenic hosts is evident.