Otimização da técnica de PCR para a detecção de Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli em sementes de feijão

O crestamento bacteriano comum, causado por Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli (Xap), é a principal bacteriose do feijoeiro no Brasil, sendo transmitida principalmente por sementes. O presente trabalho teve como objetivo aperfeiçoar uma técnica, por meio de diferentes métodos de preparação do extrato, para a detecção de Xap, bem como sua detecção simultânea com Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens (Cff) nos extratos de sementes de feijão,via PCR. A partir de amostras de sementes de feijão inoculadas artificialmente com Xap e lotes comerciais, foram avaliados: extrato bruto obtido diretamente das sementes, extrato concentrado por filtração em membrana de 0,22µM de diâmetro, extrato concentrado por centrifugação e extrato plaqueado em meio semi-seletivo XCP1 com e sem antibióticos (BIO-PCR). Avaliou-se a presença simultânea de Xap e Cff em 10 lotes comerciais de sementes de feijão através da reação multiplex, utilizandos-se os primers X4c, X4e, CffFOR2 e CffREV4. A partir do extrato bruto, do extrato concentrado por centrifugação e por filtragem em membrana Millipore® não foi possível a detecção de Xap nas sementes de feijão artificialmente contaminadas nem nos 47 lotes comerciais de sementes/ grãos de feijão. A técnica de BIO-PCR permitiu a detecção de Xap a partir de extratos de sementes de feijão artificialmente contaminadas e em 18 dos 47 lotes comerciais. A técnica de detecção simultânea de Xap e Cff no mesmo gel é viável, por amplificar fragmentos de DNA típicos de cada fitobactéria. O uso do meio de cultura XCP1 sem adição de antibióticos permitiu detectar Xap com período de incubação menor em um dia em comparação à detecção utilizando-se o meio de cultura com antibióticos

Cylindrocladium spathiphylli de espatifilo (Spathiphyllum wallisii Rengel): detecção de enzimas extracelulares em isolados normais e alterados por temperatura

O fungo Cylindrocladium spathiphylli causa podridão no colo e nas raízes de espatifilo, induzindo amarelecimento e murcha nas folhas da parte aérea. Há poucos estudos com o fungo quanto às enzimas extracelulares. Assim, delineou-se ensaio inteiramente casualizado in vitro, com três tratamentos (dois isolados normais: LFEEI016 - EPAGRI/SC e MMBF 01/01 - IB/SP; mais testemunha) e seis repetições, visando a detecção de enzimas. A amilase (AM), lipase (LP), carboximetilcelulase (CMC) e lacase (LC) foram mensuradas pelo cálculo da área da coroa circular, local de atividade das enzimas. A catalase (CT) e gelatinase (GL) foram mensuradas por símbolos, depois transformados em notas (1 a 4, de ausência à intensa produção). O isolado MMBF 01/01 produziu as maiores áreas e com mais intensidade as enzimas. Das enzimas, a maior área foi a da LC e depois a LP. LFEEI016 e MMBF 01/01 não apresentaram área para AM e CMC e exibiram intensidade fraca e igual para CT. A intensidade de GT foi moderada no MMBF 01/01 (nota média 3,0) e ausente para o LFEEI016 (nota média 1,0). Após a produção das enzimas extracelulares, os isolados foram alterados vegetativamente por temperatura. Instalou-se ensaio inteiramente ao acaso, em fatorial contendo disco de micélio dos isolados do fungo versus três temperaturas [23ºC (T1); 33ºC (T2) e de 33ºC para 23ºC (T3)] versus quatro períodos (3; 6; 9 e 12 dias), com oito repetições, em placa de Petri com BDA mantida em BOD. O diâmetro das colônias foi medido diariamente (mm) em dois sentidos. As alterações de temperatura vistas foram: inócuo, fungistático (FS) e fungicida (FC). Aplicou-se estatística nas temperaturas T1 e T3 dos isolados para checar efeito FS e escolher aqueles com maior e menor efeito. O isolado LFEEIO16 mostrou efeito FS com três dias às temperaturas 33ºC e de 33ºC para 23ºC. Nos demais períodos, o isolado sofreu efeito FC. O MMBF 01/01 mostrou efeito FS em todos os períodos. Ambos isolados sofreram, estatisticamente, efeito FS. O MMBF 01/01 mostrou maior efeito FS aos nove dias, nas temperaturas referidas e menor com três dias. Após a constatação de alteração na taxa de crescimento micelial dos isolados, procurou-se verificar, novamente, a produção de enzimas extracelulares. Os isolados alterados e utilizados foram o MMBF 01/01 com três e nove dias e o LFEEIO16 com três dias. A produção e a avaliação das enzimas foram realizadas da mesma maneira para os isolados normais. O isolado MMBF 01/01 - três dias produziu as maiores áreas e com mais intensidade as enzimas. Das enzimas, a maior área foi a da LC. Após LC, a área da LP foi maior que a da CMC nos isolados. Não se detectou área de AM nos isolados. A intensidade de GL foi maior que a da CT nos isolados MMBF 01/01 com três e nove dias. Para LFEEI016 - três dias, a intensidade média de CT foi nota 2,0 e ausência de GL (nota média 1,3). Sugere-se investigar a severidade da doença na planta entre os isolados e em condições naturais investigar a evolução da LC em comparação as demais enzimas na patogênese do fungo na cultura.

Uso de RFLP-PCR para a detecção de isolados de Venturia inaequalis resistentes ao cresoxim metílico do Sul do Brasil

O principal mecanismo que confere resistência do fungo Venturia inaequalis aos inibidores de oxidação (quinol QoIs) é a ocorrência de mutações no gene citocromo b CYTB (G143A). O objetivo do trabalho foi a implementação da metodologia RFLP-PCR para caracterizar a reação de isolados de V. inaequalis à presença de Qols. Foram utilizados sete isolados monospóricos de V. inaequalis, coletados em pomares comerciais de Santa Catarina e cedidos pela Estação Experimental da EPAGRI de São Joaquim, Santa Catarina. Os isolados foram classificados como sensíveis ou resistentes após crescimento em meio BDA contendo 10 µg.mL-1 de cresoxim metílico. Para determinação da presença da mutação G143A foram utilizados os marcadores específicos ViCytB-5F e ViCytB-6071R. O DNA dos isolados foi amplificado em reação de PCR e separado em gel de agarose 1,5%. Os fragmentos foram então digeridos com a enzima de restrição Fnu4HI identificadora da mutação e os produtos da digestão foram analisados por eletroforese num gel de agarose 1,0%. Os genótipos revelados estavam associados ao fenótipo estabelecido pelo crescimento dos isolados em presença do fungicida, mostrando que 6 isolados já apresentavam o alelo de resistência. O uso de técnicas de RFLP-PCR permitiram uma avaliação rápida e confiável na detecção da resistência de V. inaequalisao cresoxim metílico.

Escolha de locais para instalação de torres de detecção de incêndio com auxílio do SIG

O objetivo deste trabalho foi realizar um teste metodológico para avaliar as potencialidades de um sistema de informações geográficas e suas rotinas no planejamento de distribuição de torres de incêndio e na determinação do número ótimo de torres para visualização de uma área de estudo. A área estudada foi de 441,81 ha, em Belo Oriente-MG, compreendendo povoamentos de eucalipto, áreas de preservação permanente e reserva legal. Foram utilizados os temas vetoriais de uso do solo, recursos hídricos, malha viária e elevação. O processamento dos dados e das imagens e a produção dos mapas temáticos foram feitos no ArcView versão 3.1. Produziu-se um mapa de relevo interpolado e criou-se um tema de pontos, indicando os locais de instalação das torres. Foram escolhidos, inicialmente, oito pontos com base na proximidade de estradas e nos pontos mais elevados do terreno. A altura de cada torre foi fixada em 30 m. Utilizando a função Visibility do ArcView, pôde-se determinar a visibilidade da área a partir de cada ponto. A torre 1 apresentou a maior porcentagem de visibilidade (66,1%). Como a área estudada era pequena, decidiu-se pela instalação somente desta torre. Concluiu-se que a metodologia utilizada pode ser aplicada de maneira eficiente na determinação do número de torres necessárias e na confirmação ou não de locais previamente determinados para instalação das torres. Assim, com a utilização do sistema de informações geográficas aumenta-se a eficiência do sistema de vigilância e minimizam-se os custos com a instalação de torres.

Hospedeiros e ciclos sucessivos de multiplicação afetam a detecção de fungos micorrízicos arbusculares em áreas impactadas por mineração gesseira

O objetivo deste trabalho foi verificar a influência de diferentes plantas hospedeiras e de ciclos de multiplicação em potes de cultura sobre a detecção e avaliação da diversidade de fungos micorrízicos arbusculares (FMA) no semiárido, em áreas de caatinga preservadas e impactadas por mineração de gesso no semiárido (Araripina, PE). Foram selecionadas quatro áreas de coleta: AN - caatinga nativa preservada, AM - arredores da mina, AR-rejeito e AI - interface entre o depósito de rejeito e uma área de caatinga degradada pela mineração, todas com solo do tipo Latossolo Amarelo, variando de franco-arenoso a argiloso, com pH de 5,7 a 7,5; 8 a 161 mg.dm-3 P e 0,23 a 79,8 mg.dm-3 Fe. Amostras foram retiradas desses solos para exame imediato e preparo de culturas-armadilha para FMA, utilizando-se como plantas hospedeiras amendoim (Arachis hypogaea L.) e sorgo granífero (Sorghum bicolor (L.) Moench) cultivar IPA-7301011. Logo após a coleta e depois de cada ciclo de multiplicação na cultura-armadilha (três ciclos de três meses cada), foram avaliados em amostras de raízes e de solo rizosférico: colonização radicular, número de esporos, diversidade e similaridade de espécies de FMAs entre as áreas. As plantas de amendoim apresentaram valores mais altos de colonização radicular (76,5 a 99,5%) que as de sorgo (21% a 73%). Maior produção de esporos ocorreu no 2º e no 3º ciclo de culturas-armadilha. Foram identificadas 25 espécies de FMAs nas áreas estudadas, onde se destacaram Glomus intraradices Schenck & Smith, Glomus mosseae Gerdemann & Trappe e Paraglomus occultum Morton & Redecker, pela alta densidade de esporos produzidos. As áreas apresentaram índice de similaridade de espécies de FMAs variando de 40 a 67%, com os maiores índices entre as áreas impactadas.

TÉCNICAS PARA DETECÇÃO DE PONTOS INFLUENTES EM VARIÁVEIS CONTÍNUAS REGIONALIZADAS

RESUMO Na análise de dados espaciais em agricultura, a presença de pontos influentes pode alterar consideravelmente os resultados das análises de dependência espacial e, consequentemente, a construção dos mapas. Quando se referem a atributos físico-químicos do solo e da produtividade, os mapas devem representar uma estimativa eficiente das condições reais do campo, já que são importantes informações utilizadas para a manutenção de um sistema agrícola de manejo localizado, com a otimização da aplicação de insumos agrícolas, visando à maior produtividade. Este trabalho teve por objetivo apresentar as técnicas gráficas hair-plot, de influência local (Ci e |Lmax|) de identificação de observações influentes em dados contínuos espaciais georreferenciados, coletados em uma área experimental de cultivo comercial, com 167,35 hectares, onde o sistema agrícola de manejo localizado é adotado. Como resultados apresentam-se os pontos potencialmente influentes e os mapas construídos com e sem eles. Na comparação entre os mapas com e sem estes pontos, as métricas de comparação dos mapas mostraram a importância da identificação dos pontos influentes em uma base de dados espaciais. Sendo assim, a existência de pontos influentes deve ser investigada para entender o motivo de seu comportamento atípico, já que eles modificam, consideravelmente, os mapas gerados.

Significado prognóstico das micrometástases nos linfonodos do carcinoma colorretal: detecção imunoistoquímica com anticorpos anticitoqueratina AE1/AE3

OBJETIVOS: Identificar por imunoistoquímica eventuais micrometástases nos linfonodos regionais previamente considerados livres pelo exame histopatológico convencional e avaliar a influência do comprometimento destes linfonodos na sobrevivência dos doentes com carcinoma colorretal extirpado com intenção curativa. MÉTODO: Foram estudados 51 doentes portadores de carcinoma colorretal nos estádios A (13 casos) e B (38 casos), segundo a classificação de Dukes. Um total de 501 linfonodos previamente considerados livres pelo exame histopatológico convencional foi investigado por meio de técnica imunoistoquímica com anticorpos monoclonais anticitoqueratina AE1/AE3 para identificar células epiteliais. Cada bloco previamente fixado em formalina e embebido em parafina foi seccionado em três partes, obtendo-se de cada uma delas três cortes com espessura de 4 milimícron cada. RESULTADOS: Em seis doentes (11,7%) no estádio B de Dukes, células neoplásicas foram identificadas em sete linfonodos do mesocolo (1,4%) previamente considerados livres de neoplasia pelo exame histopatológico convencional. Em um enfermo, a micrometástase era representada por aglomerado celular, enquanto que nos outros cinco doentes as micrometástases eram constituídas por células isoladas. A sobrevivência dos enfermos com micrometástases linfonodais foi menor do que a dos doentes com linfonodos não comprometidos, porém sem atingir diferença significativa. CONCLUSÕES: O método imunoistoquímico pode ser empregado com sucesso na detecção de células neoplásicas em linfonodos previamente considerados livres pelo exame histopatológico convencional. O acometimento dos linfonodos regionais por micrometástases não influenciou a sobrevivência dos doentes com carcinoma colorretal extirpado.

Equipamento brasileiro de detecção gama intra-operatória para biópsia de linfonodo sentinela

OBJETIVO: Testar a eficácia de equipamento de detecção gama intra-operatória (DGI) desenvolvido pelo IPEN (Brasil), em procedimentos de biópsia de linfonodo sentinela (BLS) no melanoma e no câncer de mama. MÉTODOS: Foram estudados 40 pacientes portadores de melanoma ou câncer de mama com indicação para realização de BLS.Todos pacientes foram submetidos à linfocintilografia e a BLS ocorreu entre 2 a 24 horas após a mesma. Concomitantemente à DGI, realizou-se o mapeamento linfático com corante vital. Foram feitas leituras com o equipamento convencional Neoprobe® 1500 e com o equipamento em teste (IPEN) dos valores de captação do sítio de injeção do radiofármaco, do LS in vivo e ex vivo e da captação de fundo. Foi registrado se o LS estava corado e se o cirurgião teve facilidade para encontrá-lo. Nos primeiros 20 pacientes utilizou-se o equipamento convencional e depois o de teste; nos outros 20, utilizou-se primeiro o equipamento em teste, com objetivo de verificar se o mesmo identificava primariamente o LS. RESULTADOS: Dos quarenta pacientes, 33 eram portadores de tumor de mama e sete de melanoma cutâneo; variação da idade: 21 a 68 anos (mediana= 46 anos); 35 mulheres e 5 homens. Em apenas um paciente o LS não foi encontrado, nem pela DGI nem pelo corante vital. Não houve diferença estatística entre as razões ex vivo/fundo obtidas com os dois equipamentos (p=0, 2583-ns). CONCLUSÃO: É possível realizar o procedimento de BLS com o equipamento brasileiro desenvolvido pelo IPEN, com facilidade e sem prejuízo para o paciente.

Freqüência de realização e acurácia do auto-exame das mamas na detecção de nódulos em mulheres submetidas à mamografia

Realizamos um estudo transversal prospectivo cujo objetivo foi avaliar a acurácia do auto-exame de mamas (AEM) na detecção de nódulos mamários palpáveis e a relação com sua freqüência. Foram entrevistadas 2672 mulheres que realizaram mamografia na Região do Vale dos Sinos/RS no período de janeiro de 94 a julho de 97, questionando-se quanto à freqüência da realização de AEM. As mulheres foram divididas em dois grupos: grupo I (mensalmente), grupo II (quase nunca). As mulheres que relataram realizar o AEM ocasionalmente foram excluídas da análise principal. Foi perguntado à paciente se ela ou seu médico haviam palpado alguma lesão mamária. Comparou-se os achados de palpação da paciente com os do médico (relatados pela paciente). A sensibilidade do AEM foi maior no grupo I comparado ao II (57,4% versus 33,3%; P <0,05). Concluímos que existe uma associação entre a realização mensal de AEM e uma maior sensibilidade na detecção de nódulos mamários palpáveis.

Fluxo reverso no duto venoso: nova perspectiva na detecção de anomalias cromossômicas

Objetivo: estudar o duto venoso mediante o emprego do Doppler colorido e pulsátil com a finalidade de rastrear anomalias cromossômicas entre a 10ª e 14ª semanas de gestação. Métodos: a Dopplerfluxometria referente ao duto venoso e a medida da translucência nucal (TN) precederam a biopsia de vilo corial em 26 gestações. A suspeita de defeitos cromossômicos baseou-se nos seguintes critérios: fluxo ausente ou reverso durante a contração atrial no duto venoso e translucência nucal maior ou igual a 3 mm. Verificaram-se a sensibilidade, a especificidade, o valor preditivo positivo e o negativo para cada um dos itens acima. Resultados: ocorreram 9 casos de anomalias cromossômicas (3 trissomias do 21, 2 trissomias do 13, 1 trissomia do 9, 1 trissomia do 22, 1 triploidia e 1 monossomia do cromossomo X). Na totalidade dos casos o fluxo no duto venoso, durante a contração atrial, foi ausente (1 caso) ou reverso (8 casos), com sensibilidade de 100%. No grupo de fetos normais (17 casos), a avaliação única apresentou alteração no Doppler (especificidade de 94%). Concernente à medida da TN, a sensibilidade e a especificidade foram de 88% e 76%, respectivamente. Conclusão: os resultados preliminares sugerem que a presença de anomalias cromossômicas pode ser fortemente suspeitada quando existir aumento da TN associado a fluxo ausente ou reverso no duto venoso durante a contração atrial. Especulamos que ambos os métodos sejam válidos no rastreamento dos defeitos cromossômicos.

Teste rápido para detecção da infecção pelo HIV-1 em gestantes

Objetivos: avaliar os resultados do teste de diagnóstico rápido da infecção pelo HIV-1 disponibilizado pelo Ministério da Saúde, para identificação de gestantes contaminadas por este vírus. Métodos: avaliação prospectiva de 443 gestantes sem teste sorológico para HIV no pré-natal, atendidas no Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-Universidade de São Paulo (HCFMRP-USP), entre fevereiro e junho de 2000. As amostras destas pacientes foram submetidas ao teste rápido imunocromatográfico, sendo comparadas com ELISA e confirmadas pela aglutinação. Resultados: dentre as 443 gestantes submetidas ao teste rápido (20,1% dos partos no período), 16 apresentaram resultados positivos (3,6%). Nenhuma amostra negativa pelo teste rápido foi positiva pelo ELISA. Entretanto, das 16 amostras positivas pelo teste rápido, duas foram negativas pelos testes confirmatórios. Logo, a sensibilidade do teste rápido foi de 100,0%, especificidade 99,5%, valor preditivo positivo 87,5% e valor preditivo negativo 100,0%. Conclusões: os resultados obtidos na avaliação do teste para o diagnóstico rápido da infecção pelo HIV-1 em gestantes revelaram sensibilidade, especificidade e valores preditivos que o credenciam como recurso extremamente importante na indicação de medidas que reduzem a transmissão perinatal desse vírus.

Detecção de Doenças Sexualmente Transmissíveis em Clínica de Planejamento Familiar da Rede Pública no Brasil

Objetivo: analisar a prevalência da gonorréia, infecção por clamídia, sífilis e infecção por HIV entre as mulheres de uma clínica de planejamento familiar em função da presença de sintomas de DST e de comportamentos de risco. Métodos: mulheres com as idades entre 18 e 30 anos que freqüentavam os serviços de uma clínica de planejamento familiar da rede pública no Brasil foram testadas para a gonorréia e infecção por clamídia, com o uso do teste de amplificação do DNA na urina, para a sífilis e a infecção por HIV por meio de exames de sangue. Foram feitas a todas as participantes perguntas sobre comportamento de demanda de serviços de saúde, a presença de sintomas de DST e comportamentos de risco para as doenças sexualmente transmissíveis. Resultados: a infecção por clamídia foi encontrada em 11,4%, a sífilis em 2%, a gonorréia em 0,5% e a infecção por HIV em 3%. Aproximadamente 60% das mulheres que estavam infectadas por clamídia não apresentavam sintomas. Mulheres que nunca usavam preservativos apresentaram um risco de DST muito mais alto do que aquelas que sempre ou na maioria das vezes usavam preservativos. Houve tendência para as mulheres que nunca haviam feito uso de qualquer método anticoncepcional de apresentar risco mais alto para as DST do que as mulheres que usavam um método anticoncepcional (p=0,09). Muito poucas mulheres reportaram problemas com o uso de álcool ou de drogas ilegais, mas entre aquelas que reportaram tal uso, o risco de DST foi muito alto, particularmente para o uso de maconha. Conclusões: os achados mais significativos foram as altas taxas de doenças numa população de mulheres que reportaram de modo geral comportamentos de baixo risco de saúde. Com base nos nossos achados é essencial que se ofereça o rastreamento de DST/HIV a todas as mulheres com menos de 30 anos que visitam uma clínica de planejamento familiar. Se não se fizer esse rastreamento mais da metade das mulheres infectadas não serão identificadas ou tratadas. Considerando-se a alta sensibilidade e especificidade da nova tecnologia disponível para o rastreamento da infecção por clamídia, gonorréia e infecção por HIV, e a facilidade de se coletarem espécimes de urina para o diagnóstico, mais esforços devem ser dirigidos para a vigilância das populações de risco, para que a prática clínica corrente possa refletir o risco verdadeiro das populações servidas.

Detecção do linfonodo sentinela em câncer da mama: comparação entre métodos

Objetivos: avaliar a eficiência da cintilografia mamária, do detector manual de raios gama (probe) e do corante azul vital para a localização do linfonodo sentinela (LNS), estabelecendo a sensibilidade, o valor preditivo negativo (VPN) e a acurácia do mapeamento do LNS. Métodos: neste estudo estão incluídas 88 pacientes com câncer de mama atendidas consecutivamente e com axila clinicamente negativa. Foi utilizado o radiofármaco tecnécio ligado ao colóide dextran 500 (Dextran 99mTc), para cintilografia pré-operatória, realizada em 58 pacientes, e detecção transoperatória com o probe em 53 pacientes. Destas, 47 tiveram as contagens de irradiação gama anotadas e também o intervalo de tempo decorrido entre a injeção e a cirurgia. Foram empregados 2 mL do corante vital Bleu Patente V, injetado em torno do tumor, 5 minutos antes da incisão cirúrgica na axila em todos os casos. O LNS foi avaliado por congelação em 77 casos e todos pela coloração por hematoxilina e eosina. Resultados: a linfocintilografia, realizada em 58 casos, foi útil em 62,1%, sendo que em nove ocorreu mapeamento de dois linfonodos, e com o probe foram confirmados 45 casos (84,9%) dos 53 avaliados. Das 47 com anotação de contagens de raios gama e do tempo decorrido da injeção do radiofármaco até a cirurgia, constituíram-se dois grupos para análise, o grupo dia (27 casos) e o grupo outro dia (20 casos), que se mostraram diferentes, com significância estatística, tanto no tempo decorrido quanto nas contagens de raios gama, porém sem interferência nos resultados de detecção do LNS. A associação do probe e do corante azul resultou em sucesso nos 53 casos avaliados, assim como em 32 dos 35 casos em que só o corante foi usado. A média de idade das pacientes foi 58 anos. Quarenta e uma pacientes tiveram linfonodos axilares com metástase e apenas duas com LNS falsamente negativo, dando sensibilidade de 95,3%, VPN de 95,5% e acurácia de 97,6. Conclusões: o mapeamento do LNS é factível tanto com o uso do tecnécio, aplicado com intervalo variável de 3:00 a 17:00 horas, quanto com o azul vital. Com a associação dos métodos a eficácia foi de 100%. A confirmação histopatológica, em 97,6% dos LNS negativos, torna real a possibilidade de evitar a linfadenectomia nestes casos.