Germline-Specific MATH-BTB Substrate Adaptor MAB1 Regulates Spindle Length and Nuclei Identity in Maize

Germline and early embryo development constitute ideal model systems to study the establishment of polarity, cell identity, and asymmetric cell divisions (ACDs) in plants. We describe here the function of the MATH-BTB domain protein MAB1 that is exclusively expressed in the germ lineages and the zygote of maize (Zea mays). mab1 (RNA interference [RNAi]) mutant plants display chromosome segregation defects and short spindles during meiosis that cause insufficient separation and migration of nuclei. After the meiosis-to-mitosis transition, two attached nuclei of similar identity are formed in mab1 (RNAi) mutants leading to an arrest of further germline development. Transient expression studies of MAB1 in tobacco (Nicotiana tabacum) Bright Yellow-2 cells revealed a cell cycle-dependent nuclear localization pattern but no direct colocalization with the spindle apparatus. MAB1 is able to form homodimers and interacts with the E3 ubiquitin ligase component Cullin 3a (CUL3a) in the cytoplasm, likely as a substrate-specific adapter protein. The microtubule-severing subunit p60 of katanin was identified as a candidate substrate for MAB1, suggesting that MAB1 resembles the animal key ACD regulator Maternal Effect Lethal 26 (MEL-26). In summary, our findings provide further evidence for the importance of posttranslational regulation for asymmetric divisions and germline progression in plants and identified an unstable key protein that seems to be involved in regulating the stability of a spindle apparatus regulator(s).

1031-1034delTAAC (Leu125Stop): a novel familial UBE3A mutation causing Angelman syndrome in two siblings showing distinct phenotypes

Background More than 50 mutations in the UBE3A gene (E6-AP ubiquitin protein ligase gene) have been found in Angelman syndrome patients with no deletion, no uniparental disomy, and no imprinting defect. Case Presentation We here describe a novel UBE3A frameshift mutation in two siblings who have inherited it from their asymptomatic mother. Despite carrying the same UBE3A mutation, the proband shows a more severe phenotype whereas his sister shows a milder phenotype presenting the typical AS features. Conclusions We hypothesized that the mutation Leu125Stop causes both severe and milder phenotypes. Potential mechanisms include: i) maybe the proband has an additional problem (genetic or environmental) besides the UBE3A mutation; ii) since the two siblings have different fathers, the UBE3A mutation is interacting with a different genetic variant in the proband that, by itself, does not cause problems but in combination with the UBE3A mutation causes the severe phenotype; iii) this UBE3A mutation alone can cause either typical AS or the severe clinical picture seen in the proband.

UVB-induced cell death signaling is associated with G1-S progression and transcription inhibition in primary human fibroblasts

DNA damage induced by ultraviolet (UV) radiation can be removed by nucleotide excision repair through two sub-pathways, one general (GGR) and the other specific for transcribed DNA (TCR), and the processing of unrepaired lesions trigger signals that may lead to cell death. These signals involve the tumor suppressor p53 protein, a central regulator of cell responses to DNA damage, and the E3 ubiquitin ligase Mdm2, that forms a feedback regulatory loop with p53. The involvement of cell cycle and transcription on the signaling to apoptosis was investigated in UVB-irradiated synchronized, DNA repair proficient, CS-B (TCR-deficient) and XP-C (GGR-deficient) primary human fibroblasts. Cells were irradiated in the G1 phase of the cell cycle, with two doses with equivalent levels of apoptosis (low and high), defined for each cell line. In the three cell lines, the low doses of UVB caused only a transient delay in progression to the S phase, whereas the high doses induced permanent cell cycle arrest. However, while accumulation of Mdm2 correlated well with the recovery from transcription inhibition at the low doses for normal and CS-B fibroblasts, for XP-C cells this protein was shown to be accumulated even at UVB doses that induced high levels of apoptosis. Thus, UVB-induced accumulation of Mdm2 is critical for counteracting p53 activation and apoptosis avoidance, but its effect is limited due to transcription inhibition. However, in the case of XP-C cells, an excess of unrepaired DNA damage would be sufficient to block S phase progression, which would signal to apoptosis, independent of Mdm2 accumulation. The data clearly discriminate DNA damage signals that lead to cell death, depending on the presence of UVB-induced DNA damage in replicating or transcribing regions.

Molecular characterization of the human gut microbiota: the effect of aging

Age-related physiological changes in the gastrointestinal tract, as well as modification in lifestyle, nutritional behaviour, and functionality of the host immune system, inevitably affect the gut microbiota. The study presented here is focused on the application and comparison of two different microarray approaches for the characterization of the human gut microbiota, the HITChip and the HTF-Microb.Array, with particular attention to the effects of the aging process on the composition of this ecosystem. By using the Human Intestinal Tract Chip (HITChip), recently developed at the Wageningen University, The Netherland, we explored the age-related changes of gut microbiota during the whole adult lifespan, from young adults, through elderly to centenarians. We observed that the microbial composition and diversity of the gut ecosystem of young adults and seventy-years old people is highly similar but differs significantly from that of the centenarians. After 100 years of symbiotic association with the human host, the microbiota is characterized by a rearrangement in the Firmicutes population and an enrichment of facultative anaerobes. The presence of such a compromised microbiota in the centenarians is associated with an increased inflammation status, also known as inflamm-aging, as determined by a range of peripheral blood inflammatory markers. In parallel, we overtook the development of our own phylogenetic microarray with a lower number of targets, aiming the description of the human gut microbiota structure at high taxonomic level. The resulting chip was called High Taxonomic level Fingerprinting Microbiota Array (HTF-Microb.Array), and was based on the Ligase Detection Reaction (LDR) technology, which allowed us to develop a fast and sensitive tool for the fingerprint of the human gut microbiota in terms of presence/absence of the principal groups. The validation on artificial DNA mixes, as well as the pilot study involving eight healthy young adults, demonstrated that the HTF-Microb.Array can be used to successfully characterize the human gut microbiota, allowing us to obtain results which are in approximate accordance with the most recent characterizations. Conversely, the evaluation of the relative abundance of the target groups on the bases of the relative fluorescence intensity probes response still has some hindrances, as demonstrated by comparing the HTF.Microb.Array and HITChip high taxonomic level fingerprints of the same centenarians.

Die Rolle Prolin-reicher Sequenzmotive des Core-Proteins in der Morphogenese des Hepatitis-B Virus

Diese Arbeit hatte zum Ziel, den Ausschleusungsmechanismus des Hepatitis-B Virus zu beleuchten. Es ist bisher unbekannt, wie das virale Nukleokapsid umhüllt und das reife Virion aus der Leberzelle freigesetzt wird. Bei einigen RNA-Viren, beispielsweise HIV-1, Ebola oder RSV, vermitteln so genannte Late-Domänen im viralen Kapsid- oder Matrix-Protein die Knospung der Viren an intrazellulären Membranen oder der Plasmamembran. Da das HBV-Core-Protein ähnliche Sequenzen trägt, wurde in der vorliegenden Arbeit überprüft, welche Rolle diese im viralen Replikationszyklus spielen. Meine Ergebnisse zeigen, dass die beiden Prolin-reichen Sequenzen PPAY (129-132) und PPNAP (134-138), die retroviralen Late-Domänen ähneln, für die HBV-Morphogenese essentiell sind. Mutationen einzelner Aminosäuren innerhalb dieser Motive führen zu Phänotypen mit verändertem Kapsid-, Nukleokapsid- und Virus-Bildungs-Vermögen. Insbesondere sind die Aminosäure Tyrosin 132 des Motivs PPAY und die Prolinreste 134 und 135 des Motivs PPNAP erforderlich, da diese schon für die Bildung der Kapside unentbehrlich sind. Charakteristisch für beide Motive sind auch die hier gezeigten Interaktionen mit speziellen Wirtszellfaktoren, deren physiologische Funktion es ist, zelluläre Proteine in den endosomalen Sortierungsprozess einzuschleusen. Im Vordergrund stehen hier die E3 Ub-Ligase Nedd4, welche Proteine mit Ub konjugiert und diese so signifikant für die Einschleusung in das endosomale System markiert, und Tsg101, das als zentrale Komponente des ESCRT-I-Komplexes für die Erkennung von ubiquitinierten Proteinen zuständig ist und diese dadurch in die ESCRT-Kaskade des multivesikulären Endosoms einführt. Für die genannten Interaktionen ist das Motiv PPAY und hier wieder speziell das Tyrosin 132 des HBV-Core-Proteins für die Wechselwirkung mit Nedd4 notwendig. Hingegen vermittelt die L-Domänen-ähnliche Sequenz PPNAP die Assoziation von Core mit Tsg101, wobei die beiden Prolinreste 134 und 135 und auch das Asparagin 136 für die Interaktion essentiell sind. Sowohl Nedd4 als auch Tsg101 wirken im Zusammenhang mit Ubiquitin, weshalb eine Ubiquitinierung von Core, trotz bislang negativer Nachweise, wahrscheinlich ist. Zugunsten dieser Annahme spricht auch mein Nachweis, dass der Lysinrest an Position 96 des Core-Proteins, als potentieller Ub-Akzeptor, gerade in späten Schritten eine essentielle Rolle spielt. Weiterhin klärungsbedürftig ist auch die Frage, ob Core direkt mit Tsg101 und Nedd4 interagiert, oder ob andere Faktoren dazwischen geschaltet sind. Auch könnte mit Hilfe von siRNA-vermittelten Depletionsversuchen die physiologische Relevanz der Tsg101/Core-und Nedd4/Core-Interaktion weiterführend untersucht werden. Zudem zeigen meine Arbeiten, dass Core mit intrazellulären Membranen assoziiert, weshalb es interessant wäre, zu untersuchen, ob es sich hierbei um Membranen des endosomalen Systems handelt, an denen die finalen Schritte der Virus-Morphogenese stattfinden könnten.

Virus-Wirt-Interaktionen bei Hepatitis-B-Virus-Infektionen: Die Rolle von Gamma2-Adaptin

Mit etwa 350 Millionen chronisch-infizierten Menschen gehört die Hepatitis-B neben der Tuberkulose und AIDS zu den häufigsten Infektionskrankheiten der Welt. Der einzig sichere Schutz vor dem bis zur Leberzirrhose persistierenden Virus bietet eine vorbeugende Impfung. Eine angemessene Therapie chronisch-erkrankter Patienten ist durch die Unkenntnis über viele Bereiche des HBV-Lebenszyklus nur eingeschränkt möglich. Gegenstand dieser Arbeit war vor allem etwas Licht in das Wechselspiel zwischen HBV und der Wirtszelle zu bringen und zelluläre Komponenten und Mechanismen zu identifizieren, die am Sortierungs- und Transportmechanismus viraler Substrukturen zur sogenannten Assembly-Plattform beteiligt sind, um dort die Freisetzung des Virus zu initiieren. Mit der vorliegenden Arbeit habe ich Methoden der Zellbiologie, Mikrobiologie, Molekularbiologie und Virologie vereint, um neue Einblicke in den HBV-Lebenszyklus zu gewinnen. Für die Ausschleusung von HBV wird seither der konstitutive Weg der Sekretion angenommen. In Anlehnung an den Mechanismus umhüllter RNA-Viren kann die Hypothese aufgestellt werden, dass das MVB (Multivesicular Body) im Prozess der HBV-Freisetzung beteiligt sein könnte. Die Freisetzung des Hepatitis-B-Virus aus einer infizierten Zelle ist ein streng organisierter Prozess, der sowohl das HBV-Coreprotein als auch die HBV-Hüllproteine zu benötigen scheint. (max. 5.000 Zeichen)Inhaltszusammenfassung in einer weiteren Sprache deutschenglischfranzösischrussischmehrsprachigsonst.Ausgangspunkt der Arbeit war eine spezifische Interaktion des großen HBV-Hüllproteins (L) mit einem neuen Mitglied der Adaptor-Protein-Komplex-Familie (AP-Komplex), dem g2?Adaptin (Hartmann-Stühler und Prange, 2001), das mutmaßlich an endosomalen Sortierungs- und Transportprozessen beteiligt ist. In Analogie zur Funktionsweise von Adaptin-Molekülen wurde vom g2-Adaptin eine Rolle in der Initiation und Steuerung der Sprossung und Freisetzung von HBV vermutet. Die im Rahmen dieser Arbeit erweiterte Charakterisierung der g2/L-Interaktion zeigte zum einen, dass die Ohrdomäne des Adaptins für die Interaktion essentiell ist und zum anderen, dass die Rekrutierung des Adaptins durch das L-Protein zu cis-Golgi-Strukturen innerhalb kleiner Transportvesikel entlang des Nukleus (perinukleär) erfolgt. Erste Ergebnisse dieser Arbeit deuteten bereits an, dass das virale Coreprotein mit demselben Adaptorprotein zu interagieren vermag. Für die g2/Core-Interaktion erwies sich in Folgearbeiten die Kopfregion des g2-Adaptins als die entscheidende Bindungsdomäne (Rost et al., 2006). Sowohl eine funktionelle Inaktivierung des g2-Adaptins durch RNA-Interferenz als auch eine g2-Adaptin- Überexpression störten die Virusmontage in späten Phasen der Morphogenese. Während ein g2-Adaptin-Überschuss die HBV-Produktion indirekt durch die Induktion dysfunktioneller endosomaler Kompartimente blockierte, verhinderte der siRNA-induzierte g2-Adaptin-Verlust die späte Ausschleusung des Virus aus der Zelle. Das Silencing von g2-Adaptin zeigte dabei weder einen Einfluss auf endosomale Strukturen noch auf die Freisetzung subviraler Partikel (Viren ohne Genom). Demzufolge scheinen sich die Mechanismen der Produktion von subviralen und viralen HBV-Partikeln bezüglich ihrer Anforderungen an Zellfunktionen und Transportwegen deutlich voneinander zu unterscheiden. Es konnten erste Hinweise darauf gefunden werden, dass die Virusmontage an endosomalen Kompartimenten (zum Beispiel dem MVB) erfolgen könnte, was durch bereits weitergeführte Untersuchungen bestätigt werden konnte (Lambert et al., J Virol, epub ahead of print). Darüber hinaus ist inzwischen bekannt, dass das Hepatitis-B-Virus für den Zusammenbau und die Freisetzung nicht nur das Adaptor-verwandte g2-Adaptin, sondern auch die endosomale Ubiquitin Ligase Nedd4, wahrscheinlich in Zusammenhang mit Ubiquitin selbst (Rost et al., 2006), benötigt. Eine Untersuchung dieser weiterführenden Aspekte war jedoch nicht mehr Inhalt dieser Arbeit. Insgesamt weisen die Daten darauf hin, dass die Sortierung und der Transport der Substrukturen des Hepatitis-B-Virus durch den MVB-Komplex zu erfolgen scheint. Dabei könnte das g2-Adaptin mit Hilfe einer Reihe von Kofaktoren (wie zum Beispiel Nedd4, Ubiquitin, etc.) eine entscheidende Rolle an der Sortierung und Anbindung des viralen L- und Coreproteins an die Assembly-Plattform spielen. Doch der genaue Mechanismus, welcher große Ähnlichkeit mit dem umhüllter RNA-Viren (wie zum Beispiel HIV-1) aufweist, bleibt noch ungeklärt. Ob weitere zelluläre Kofaktoren an der HBV-Sprossung und Freisetzung beteiligt sind, bleibt ebenfalls unbekannt und bedarf weiterer Untersuchungen.

Alkylantien induzierte Zytotoxizität, DNA-schadensinduzierte Reparaturkapazität und Apoptoseinduktion von Immunzellen

Monozyten und Monozyten-abgeleitete Dendritische Zellen (DCs) spielen eine bedeutende Rolle im Immunsystem. Da DCs bei der Tumorabwehr mitwirken, ist es wichtig, dass Monozyten als auch DCs sich gegenüber zytotoxischen Agenzien aus der Chemotherapie wehren können. Chemotherapeutika reagieren mit der DNA, jedoch die DNA-Reparaturkapazität von Monozyten und DCs wurde noch nicht untersucht. Dazu wurde die Sensitivität in Monozyten und DCs gegenüber verschiedene genotoxische Agenzien untersucht. Dabei wurde herausgefunden, dass Monozyten sensitiv auf methylierende Agenzien (MNNG, MMS und Temozolomid) reagieren und ein verstärktes Zellsterben und Apoptoseinduktion zeigen. Im Vergleich zu weiteren Zytostatika wie Fotemustin, Mafosfamid und Cisplatin reagierten Monozyten und DCs gleich sensitiv. Diese Ergebnisse weisen auf einen Defekt in der Reparatur von DNA-Methylierungsschäden in Monozyten hin. Da die Expression des Reparaturproteins O6-Methylguanin-DNA Methyltransferase (MGMT) in Monozyten höher war als in DCs und deren Inhibierung durch O6-Benzylguanin keinen Effekt auf die Sensitivität von Monozyten hatte, wurde der Reparaturweg der Basenexzisionsreparatur untersucht. Im Vergleich zu DCs waren die Monozyten unfähig die BER durchzuführen, welche durch Einzelzellgelelektrophorese gemessen wurde. Expressionsuntersuchungen ergaben, dass in Monozyten XRCC1 und Ligase IIIα fehlen im Vergleich zu DCs, Makrophagen, hämatopoetische Stammzellen und Lymphozyten, welche diese Proteine exprimieren. Diese Ergebnisse zeigen einen spezifischen DNA-Reparaturdefekt in einer bestimmten Blutzellpopulation. Durch den BER Defekt in Monozyten kann es durch methylierende Tumorwirkstoffe während einer Chemotherapie zur Depletion und zu einer abgeschwächten Immunantwort kommen.

Funktionsanalyse von Gamma2-Adaptin: ein zellulärer Adaptor der Hepatitis-B-Virus-Morphogenese

Im Replikationszyklus umhüllter Viren entstehen neue Viruspartikel durch die Knospung an Membranen der Wirtszelle. An diesem Prozess sind verschiedene zelluläre Faktoren und Mechanismen beteiligt, speziell die ESCRT-Proteinkomplexe, welche die Vesikelbildung an den MVBs steuern. Auch bei HBV ist davon auszugehen, dass Komponenten der Wirtszelle an der Umhüllung und Freisetzung der Virionen beteiligt sind, allerdings sind diese noch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die zellulären Faktoren genauer zu charakterisieren und ihre Funktion bei der Virusumhüllung aufzuklären. Den Ausgangspunkt für die hier durchgeführten Untersuchungen bildeten vorangegangene Arbeiten, in denen die spezifische Interaktion des L-Hüllproteins von HBV mit g2-Adaptin nachgewiesen werden konnte. Diese ist für die Morphogenese von HBV essentiell, allerdings ist die zelluläre ebenso wie die virusspezifische Funktion von g2-Adaptin bislang unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, wo und wie g2-Adaptin in der Zelle funktionell ist, um daraus Rückschlüsse auf die Vorgänge bei der Morphogenese von HBV ziehen zu können. Die Grundlage für die Charakterisierung von g2-Adaptin bildete seine Ähnlichkeit zu zellulären Clathrin-Adaptorproteinen. So konnte hier gezeigt werden, dass auch g2-Adaptin ein Clathrin-Bindungsmotiv besitzt, welches eine Interaktion mit Clathrin ermöglicht. Außerdem konnte ein Ubiquitin-Interaktions-Motiv (UIM) identifiziert werden, das die Bindung an ubiquitinierte Proteine vermittelt. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass g2-Adaptin zu einer Gruppe monomerer Adaptorproteine zählen könnte, welche als Ubiquitin-Rezeptoren in der Zelle funktionell sind. Die folgenden Analysen zeigten eine weitere Gemeinsamkeit, da auch g2-Adaptin selbst durch Ubiquitin modifiziert wird, wobei die Ubiquitinierung von einem intakten UIM abhängt. Dieser als Coupled Monoubiquitination bezeichnete Prozess wird hierbei durch die Ubiquitin-Ligase Nedd4 vermittelt, die direkt mit g2-Adaptin interagiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die C2-Domäne von Nedd4 ebenfalls mit Ubiquitin modifiziert ist, wodurch der Kontakt zum UIM von g2-Adaptin erfolgt. Die meisten der bislang bekannten Ubiquitin-bindenden Adaptorproteine, spielen bei der Vesikelentstehung an verschiedenen zellulären Membranen eine Rolle, wo sie an der Sortierung der vorwiegend ubiquitinierten Membranproteine beteiligt sind und zelluläre Komponenten rekrutieren, welche die Vesikelabschnürung vermitteln. Die Adaptorproteine sind dabei meist mit der jeweiligen Membran assoziiert, was auch für g2-Adaptin nachgewiesen werden konnte. Diese Membranbindung wird durch den N-terminalen Proteinbereich von g2-Adaptin vermittelt und erfolgt unabhängig von den Ubiquitin-bindenden Eigenschaften und von Nedd4. Allerdings scheint die Ubiquitin-Modifikation von g2-Adaptin ausschließlich in membrangebundener Form zu erfolgen. An welchen Membranen g2-Adaptin lokalisiert ist, wurde in Immunfluoreszenzstudien untersucht, wobei eine enge Assoziation von g2-Adaptin mit späten Endosomen bzw. MVBs zu beobachten war. Bei weiteren Analysen konnte auch ein funktioneller Einfluss auf die Vesikelentstehung an den MVBs nachgewiesen werden, da durch die Depletion von g2-Adaptin stark vergrößerte, defekte MVBs induziert wurden. Dies deutet darauf hin, dass g2-Adaptin als Ubiquitin-Rezeptor an diesen Prozessen beteiligt sein könnte. Ebenso wie andere Adaptorproteine könnte es hier an die Cargo-Proteine binden, diese durch den Kontakt zu Clathrin lokal konzentrieren und die Vesikelabschnürung durch die Rekrutierung der MVB-Maschinerie vermitteln. Möglicherweise stellt g2-Adaptin hierbei den bislang nicht identifizierten Adaptor dar, der die Verbindung zwischen Nedd4 und der MVB-Kaskade herstellt. Eine ähnliche Funktion für g2-Adaptin ist auch bei der Morphogenese von HBV denkbar. Aufgrund der durchgeführten Lokalisationsstudien ist anzunehmen, dass die Umhüllung der HBV-Partikel direkt an den MVBs erfolgt. Vermutlich bindet g2-Adaptin hier an das L-Hüllprotein, wobei es durch die Rekrutierung von Clathrin zu einer lokalen Anreicherung der Hüllproteine kommt. g2-Adaptin interagiert zudem in UIM-abhängiger Weise mit dem Nukleokapsid, wobei der Kontakt direkt erfolgen könnte oder durch die Ubiquitin-Ligase Nedd4 vermittelt wird, welche über eine Late-Domäne ebenfalls mit dem Nukleokapsid verbunden ist. Anscheinend gelangt das Nukleokapsid durch den Einfluss von g2-Adaptin und Nedd4 zum Ort der Virusmorphogenese, wo die eigentliche Umhüllung und die Abschnürung der Viruspartikel erfolgen. Vermutlich sind auch hier Komponenten der MVB-Maschinerie beteiligt, die womöglich durch g2-Adaptin rekrutiert werden.

The characterization of the Atxn2-CAG42-knock-in mouse as a model for Spinocerebellar Ataxia Type 2

Die Ursache der neurodegenerativen Erkrankung Spinozerebelläre Ataxie Typ 2 (SCA2) ist eine expandierte Polyglutamin-Domäne im humanen ATXN2-Gen von normalerweise 22 auf über 31 CAGs. Von der Degeneration sind vorwiegend die zerebellären Purkinje Neuronen betroffen, in denen zunehmend zytoplasmatische Aggregate sichtbar werden. Auch wenn die genaue Funktion von ATXN2 und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen noch immer ungeklärt sind, werden ein toxischer Funktionsgewinn sowie der Verlust der normalen Proteinfunktion als mögliche Ursachen diskutiert.rnUm ein wirklichkeitsgetreues Tiermodell für die SCA2 zu haben, wurde eine knock-in Maus generiert, deren einzelnes CAG im Atxn2-Gen durch 42 CAGs ersetzt wurde. Dieses Mausmodell ist durch eine stabile Vererbung der Expansion charakterisiert. Weiterhin zeigt sie ein verringertes Körpergewicht sowie eine spät beginnende motorische Inkoordination, was dem Krankheitsbild von SCA2 entspricht. rnIm Weiteren konnte gezeigt werden, dass, obwohl die Atxn2 mRNA-Spiegel in Großhirn und Kleinhirn erhöht waren, die Menge an löslichem ATXN2 im Laufe der Zeit abnahm und dies mit einem Auftreten an unlöslichem ATXN2 korrelierte. Dieser im Kleinhirn progressive Prozess resultierte schließlich in zytoplasmatischen Aggregaten innerhalb der Purkinje Neuronen alter Mäuse. Der Verlust an löslichem ATXN2 könnte Effekte erklären, die auf einen partiellen Funktionsverlust von ATXN2 zurückzuführen sind, wobei die Aggregatbildung einen toxischen Funktionsgewinn wiederspiegeln könnte. Neben ATXN2 wurde auch sein Interaktor PABPC1 zunehmend unlöslich. Während dies im Großhirn eine Erhöhung der PABPC1 mRNA- und löslichen Proteinspiegel zur Folge hatte, konnte keine kompensatorische Veränderung seiner mRNA und zudem eine Verminderung an löslichem PABPC1 im Kleinhirn beobachtet werden. Auch PABPC1 wurde in Aggregate sequestriert. Diese Unterschiede zwischen Großhirn und Kleinhirn könnten zu der spezifischen Vulnerabilität des Kleinhirns beitragen.rnUm die Folgen auf mRNA-Prozessierung zu untersuchen, wurde ein Transkriptomprofil im mittleren sowie fortgeschrittenen Alter der Mäuse erstellt. Hierbei war eine erhöhte Expression von Fbxw8 im Kleinhirn alter Mäuse auffällig. Als Komponente eines Ubiquitin-E3-Ligase-Komplexes, hilft FBXW8 in der Degradierung von Zielproteinen und könnte somit die Toxizität des expandieren ATXN2 verringern. rnZur näheren Beschreibung der physiologischen Funktion von ATXN2, konnte in ATXN2-knock-out Mäusen gezeigt werden, dass das Fehlen von ATXN2 zu einer reduzierten globalen Proteinsyntheserate führte und somit eine Rolle als Translationsaktivator möglich erscheint. Kompensatorisch wurde eine erhöhte S6-Phosphorylierung gemessen.

DNA-Reparatur und Zelltod nach gentoxischem Stress in Monozyten, dendritischen Zellen und Makrophagen

Monozyten wie auch dendritische Zellen (DCs) und Makrophagen sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenenen unspezifischen Immunsystems. Ein Kennzeichen dieser Zellen ist die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zur Abtötung von Pathogenen. Im Fall von chronischen Entzündungen oder Infekten kann es zu einer explosionsartigen Freisetzung freier Radikale kommen ('Oxidative Burst'). Aus vorangegangenen Untersuchungen war bekannt, dass die Expression der beiden Basen Exziosions Reparatur (BER)-Proteine XRCC1 und Ligase III während der Ausreifung humaner Monozyten zu DCs induziert wird (Briegert and Kaina, 2007). Dies lies vermuten, dass Monozyten aufgrund einer defekten BER eine hohe Sensitivität gegenüber ROS aufweisen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde die Wirkung von ROS auf humane Monozyten und daraus abgeleiteten DCs und Makrophagen untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Monozyten eine hohe Sensitivität gegenüber oxidativem Stress aufweisen, was auf eine höhere Einzelstrangbruch-Rate zurückzuführen war. Ursache hierfür ist das Fehlen der BER-Proteine XRCC1, Ligase III und PARP-1. Die fehlende Expression dieser Proteine resultierte letztendlich in Monozyten in einem Defekt der BER und DNA-Einzelstrangbruchreparatur. rnDie Proteine XRCC1, Ligase III und PARP-1 sind auch Bestandteil des Apparats des B-NHEJ ('backup-non homologous end joining'), was auf eine Beeinträchtigung der Monozyten hinsichtlich der Prozessierung von Doppelstrangbrüchen (DSBs) schließen lässt. Zur Untersuchung dieser Vermutung, wurde die Wirkung von Ionisierender Strahlung ('ionizing radiation'; IR) auf Monozyten, DCs und Makrophagen bestimmt. Monozyten zeigten eine signifikant höhere Sensitivität gegenüber IR als DCs und Makrophagen, was auf eine erhöhte DSB-Rate in den Monozyten nach IR zurückzuführen war. Expressionsanalysen und ein DNA-PK-Aktivitäts-Assay zeigten zusätzlich, dass Monozyten keine DNA-PKcs, ein bedeutender Faktor des C-NHEJ, exprimieren. Somit haben Monozyten sowohl einen Defekt im B-NHEJ als auch im C-NHEJ und sind demnach nicht in der Lage, DSBs zu reparieren.rnAuch gegenüber dem Alkylanz und Chemotherapeutikum Temozolomid bewirken die Reparaturdefekte eine hohe Sensitivität der Monozyten. Zur Therapie von Hirntumoren werden neben der Operation, die Bestrahlung und Chemotherapie mit Temozolomid angewendet. Die hohe Sensitivität von Monozyten gegenüber IR und Temozolomid könnte eine Erklärung für die starke Immunsuppression bei einer derartigen Therapie sein.rn

Die Interaktion von VHL und PTEN bei der Tumorinitiation und Progression

Das VHL-Syndrom umfasst Erkrankungen, die mit einem Funktionsverlust von VHL einhergehen. Das Tumorspektrum umfasst retinale und zerebrale Hämangioblastome, Nierenzysten und klarzellige Nierenkarzinome, Zysten und Tumore des Pankreas, Phäochromocytome, Adenome der Hoden und Tumore des Mittelohrs. Obwohl aufgrund klinischer Studien bekannt ist, welche VHL-Mutation mit welchen Neoplasien assoziiert werden können, konnte bisher kein VHL-Mausmodell das Krankheitsbild des VHL-Syndroms widerspiegeln. Daher ist vermutlich eine zusätzliche Fehlregulation weiterer Gene nötig ist, um die Tumorgenese in den verschiedenen Geweben zu induzieren. In mehreren klarzelligen Nierenkarzinomen konnte bereits eine PTEN-Defizienz nachgewiesen werden, der Verlust von PTEN wird außerdem auch mit der Tumorgenese von Phäochromocytomen assoziiert. Möglicherweise wirken VHL und PTEN also in der Tumorsuppression in der Niere und der Nebenniere zusammen.rnIm Rahmen dieser Arbeit konnte erstmals eine VHL-vermittelte Stabilisierung der PTEN-Konzentration sowohl in embryonalen als auch in Tumor-Zellen der Niere nachgewiesen werden. Die Analyse des Regulationsmechanismus ergab erstens eine Hypoxie-abhängige Abnahme der Transkription von PTEN. Des Weiteren konnte eine VHL-vermittelte Ubiquitinylierung von NEDD4-1, welches als E3-Ligase von PTEN dessen Degradation und Kerntransport reguliert, ermittelt werden. rnIn Nierenkarzinom-Zellen wurde weiterhin eine VHL- bzw. PTEN-Restitution induziert, um die Auswirkungen der beiden Tumorsuppressoren auf das Zellverhalten in vitro und in vivo zu untersuchen. Sowohl VHL als auch PTEN hatten dieselben Effekte lediglich in unterschiedlicher Intensität auf das Verhalten der Zellen. So konnte VHL- und PTEN-abhängig eine Verstärkung der Adhäsion, eine Inhibierung der Migration und eine Verminderung der Überlebens- und Metastasierungsfähigkeit nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden Mausmodelle mit einem ubiquitären, heterozygoten Pten-Verlust generiert, die teilweise eine zusätzliche Haploinsuffizienz von Vhl bzw. eine heterozygote VHL Typ II-Mutation (V2B oder V2C) trugen. Sporadisch entwickelten diese Mäuse Vhl-abhängig Lebertumore und Pten-abhängig Lymphome und Ovarialkarzinome. Einige Mäuse mit einer kombinierten Vhl- und Pten-Defizienz bildeten zusätzlich Nierenzysten aus, die teilweise das gesamte Volumen der Niere einnahmen. Besonders häufig entstanden in Pten-haploinsuffizienten Mäusen Phäochromocytome, die durch eine zusätzliche V2B- oder V2C-Mutation in gleichaltrigen Mäusen deutlich weiterentwickelt waren. Demnach induziert erst der gemeinsame Verlust von Vhl und Pten die Bildung von Nierenzysten und Phäochromocytomen, welche dem Krankheitsbild des VHL-Syndroms zugeordnet werden.rnDie Untersuchungen innerhalb dieser Arbeit zeigen erstmalig die Interaktion und Kooperation von VHL und PTEN in der Tumorsuppression. Die Resultate bieten außerdem die Grundlage für weitere Analysen der Auswirkung der VHL-vermittelten PTEN-Stabilisierung und für detailliertere Untersuchungen der durch die kombinierte Vhl- und Pten-Defizienz induzierten Neoplasien der Niere und der Nebennieren-Tumore in in vivo Mausmodellen.rn

Die Rolle von gamma2-Adaptin im endo-lysosomalen Proteintransport von Säuger-Zellen

Ziel der Arbeit war es, die physiologische Funktion von 2-Adaptin zu charakterisieren. 2 Adaptin wurde 1998 erstmals von Takatsu et al. und Lewin et al. als mögliches Mitglied der Clathrin-Adapter-Proteinfamilie beschrieben. Seine genaue physiologische Funktion ist aber bis heute noch unklar. Bisherige Ergebnisse deuten darauf hin, das 2-Adaptin unabhängig von den AP-Komplexen wirkt. rnIn der HBV-Morphogenese ist eine spezielle Funktion von 2-Adaptin bekannt, da es dort nach seiner Ubiquitinierung durch Nedd4 als Adapter zwischen dem HBV L- und Core-Protein fungiert und Änderungen in der 2 Konzentration die HBV-Freisetzung blockieren.rn2-Adaptin besitzt neben den für die Clathrin-Adapter Proteine typischen Clathrin-bindenden Eigenschaften auch die Fähigkeit, Ubiquitin über sein UIM zu binden. Darüberhinaus wird 2-Adaptin durch seine Interaktion mit der Ubiquitin-Ligase Nedd4 selbst ubiquitiniert. Damit besitzt 2-Adaptin typische Eigenschaften eines Ubiquitin-Adapters. 2-Adaptin ist an MVBs lokalisiert und Abweichungen in der 2 Konzentration verändern die MVB-Morphologie. Zudem führt die Überexpression von 2-Adaptin zur Blockade der Freisetzung retroviraler VLPs und die 2 Depletion blockiert den lysosomalen Abbau von EGF, einem Substrat des endo-lysosomalen Proteintransports. Dies alles deutet auf eine mögliche Funktion von 2-Adaptin in diesem Transportsystem hin, welche in dieser Arbeit näher untersucht wurde.rnEs konnte gezeigt werden, dass die Depletion von 2-Adaptin den Abbau von endogenen (z.B. EGF, ubiquitinierte Proteine) und exogenen (z.B. das retrovirale MLV.gag-Polyprotein) Substraten des endo-lysosomalen Weges inhibiert, während sie bei 2 Überexpression verstärkt abgebaut werden. Alle bisher identifizierten „Substrate“ von 2 Adaptin, also Proteine, die durch überschüssiges 2-Adaptin abgebaut werden, besitzen eine Verbindung zum endo-lysosomalen System und / oder zur Ubiquitin-Maschinerie der Zelle. Weitere Hinweise auf eine Rolle von 2 Adaptin im MVB-Weg lieferte die Identifikation von Vps28 und Chmp2A als spezifische Interaktionspartner von 2-Adaptin. Über Vps28 erhält -Adaptin direkten Zugang zum ESCRT-I- und über Chmp2A zum ESCRT-III-Komplex. rnZudem konnte neben dem UIM eine PH-Domäne in 2-Adaptin als wichtige funktionelle Domäne identifiziert werden. Sie stellt das Modul für die Interaktion mit Rab7 dar, welche erstmals gezeigt werden konnte. Auch die Interaktion mit Rab7 deutet auf eine Rolle von 2 Adaptin im endo-lysosomalen Transportsystem hin, da Rab7 an späten Endosomen lokalisiert ist und u.a. die Fusion der MVBs mit den Lysosomen vermittelt. Da die Auswirkungen der Rab7-Überexpression und Depletion auf MLV.gag denen der 2 Überexpression bzw. Depletion entsprechen, liegt die Vermutung nahe, dass 2-Adaptin an einem ähnlich späten Schritt im endo-lysosomalen Transportsystem wirkt wie Rab7. Jedoch blockiert überschüssiges 2 Adaptin die ESCRT-abhängige VLP-Ausschleusung an der Plasmamembran und fungiert daher möglicherweise als negativer Regulator der ESCRT-Kaskade. Da die Überexpression von -Adaptin aber gleichzeitig zum vermehrten lysosomalen Abbau führt, ist eine Funktion von 2-Adaptin bei der MVB-Lysosomen-Fusion wenig wahrscheinlich. Einer solchen Funktion widerspricht auch, dass die intrazelluläre Konzentration von Rab7 und Vps28 durch überschüssiges 2-Adaptin reduziert werden. rnAls dritte funktionell wichtige Domäne in 2-Adaptin konnte ein LIR-Motiv identifiziert werden, über welches -Adaptin mit dem Autophagie-Markerprotein LC3 interagieren kann. Die Interaktion mit LC3, und damit die Verbindung zur Autophagie-Machinerie, liefert eine mögliche Erklärung für den vermehrten Abbau bei 2-Überexpression und den Abbau von Proteinen auf der MVB-Oberfläche. Dabei induziert 2-Adaptin nicht die Autophagie per se, sondern scheint als Autophagie-Adapter zu wirken, der seine Substrate, z.B. MVBs, selektiv dem Abbau durch Autophagie zuführt. rnrnEine mögliche Rolle von 2-Adaptin im zum Lysosom hin gerichteten zellulären Transport konnte bestätigt werden, wobei 2-Adaptin dabei verschiedene Funktionen übernimmt: rn als Ubiquitin-Adapter im endo-lysosomalen System, rn als negativer Regulator der ESCRT-Kaskadern und / oder als Autophagie-Adapter.rn

Die Regulation der Ubiquitinligase CHIP durch das Cochaperon BAG2 im zellulären System und im Kontext der replikativen Seneszenz

Eine funktionierende Proteinqualitätskontrolle ist essenziell für die Vitalität einer Zelle. Das dynamische Gleichgewicht zwischen Proteinfaltung und -degradation wird von molekularen Chaperonen aufrechterhalten, deren Aktivität wiederum durch die Interaktion mit zahlreichen Cochaperonen moduliert wird. Das Cochaperon CHIP ist ein zentraler Faktor in Proteintriage-Entscheidungsprozessen, da es als Ubiquitinligase Chaperonsubstrate dem Abbau zuführt und somit die Chaperonmaschinerie direkt mit den Systemen der Proteindegradation verbindet. Um Polypeptide vor einem vorzeitigen Abbau zu schützen, wird die destruktive Aktivität von CHIP durch weitere Cochaperone reguliert. rnIn dieser Arbeit konnte die Hemmung der Ligaseaktivität von CHIP durch das Cochaperon BAG2 mechanistisch erstmals in einem zellulären System nachgewiesen werden. Dazu wurde die humane IMR-90 Fibroblasten Zelllinie verwendet. Die Ubiquitinierungsaktivität von CHIP wurde anhand von HSP72 als Modell-CHIP-Substrat untersucht. Durch die verringerte Ubiquitinierung, und damit dem reduzierten Abbau von HSP72, regulierte BAG2 dessen intrazelluläre Proteinspiegel, ohne dabei selbst eine Hitzeschockantwort zu induzieren. Überexprimiertes BAG2 wirkte sich trotz stabilisierter HSP72-Spiegel bei einem appliziertem Hitzestresses negativ auf die Zellvitalität aus, vermutlich da BAG2 durch die Inhibition von CHIP-vermittelter Ubiquitinierung massiv in das Gleichgewicht zwischen Substratfaltung und -degradation eingreift.rnDa sich die Mechanismen der Proteinqualitätskontrolle in der Alterung stark verändern und sich den wandelnden Bedingungen in der Zelle anpassen, wurde in einem zweiten Teil dieser Arbeit mit Hilfe des IMR-90 Zellsystems als etabliertes Modell zellulärer Seneszenz analysiert, inwieweit sich die Aktivität und die Regulation von CHIP durch BAG2 in der zellulären Alterung ändern. In seneszenten Zellen war HSP72 erheblich weniger ubiquitiniert als in jungen Fibroblasten, was auf eine reduzierte CHIP-Aktivität hinweist. Diese blieb jedoch durch BAG2 weiterhin modulierbar. Die Funktion von BAG2 als Inhibitor der Ubiquitinligase CHIP blieb demnach in seneszenten Zellen bestehen. In gealterten Fibroblasten regulierte BAG2 außerdem die Proteinspiegel des CHIP-Substrates und Seneszenzinitiators p53, was BAG2 eine mögliche Rolle in der Etablierung des Seneszenz-Phänotyps zuspricht. Weiterhin unterlagen die Proteinspiegel der beiden funktionell redundanten CHIP-Modulatoren BAG2 und HSPBP1 in der zellulären Alterung einer reziproken Regulation. In gealterten Mäusen trat die gegenläufige Veränderung der beiden Cochaperone gewebsspezifisch in der Lunge auf. Außerdem waren die BAG2-Proteinspiegel im Hippocampus gealterter Tiere signifikant erhöht.rnZusammenfassend konnte anhand der erzielten Ergebnisse die Funktion von BAG2 als Inhibitor von CHIP im zellulären System bestätigt werden. Außerdem durchlaufen die Aktivität und die Regulation von CHIP einen seneszenzspezifischen Adaptationsprozess, welcher für die Erhaltung der Proteostase in der Alterung relevant sein könnte und in welchem die Funktion von BAG2 als CHIP-Modulator möglicherweise eine wichtige Rolle spielt.rnZukünftige Studien könnten die komplexen Mechanismen weiterführend aufklären, mit denen CHIP-Aktivität reguliert wird. Dies kann helfen, der altersbedingten Abnahme an proteostatischer Kontrolle entgegenzuwirken und aberrante Proteinaggregation in altersassoziierten Erkrankungen vorzubeugen.rn

Nedd4-1 and beta-arrestin-1 are key regulators of Na+/H+ exchanger 1 ubiquitylation, endocytosis, and function

The ubiquitously expressed mammalian Na(+)/H(+) exchanger 1 (NHE1) controls cell volume and pH but is also critically involved in complex biological processes like cell adhesion, cell migration, cell proliferation, and mechanosensation. Pathways controlling NHE1 turnover at the plasma membrane, however, are currently unclear. Here, we demonstrate that NHE1 undergoes ubiquitylation at the plasma membrane by a process that is unprecedented for a mammalian ion transport protein. This process requires the adapter protein ?-arrestin-1 that interacts with both the E3 ubiquitin ligase Nedd4-1 and the NHE1 C terminus. Truncation of NHE1 C terminus to amino acid 550 abolishes binding to ?-arrestin-1 and NHE1 ubiquitylation. Overexpression of ?-arrestin-1 or of wild type but not ligase-dead Nedd4-1 increases NHE1 ubiquitylation. siRNA-mediated knock-down of Nedd4-1 or ?-arrestin-1 reduces NHE1 ubiquitylation and endocytosis leading to increased NHE1 surface levels. Fibroblasts derived from ?-arrestin-1 and Nedd4-1 knock-out mice show loss of NHE1 ubiquitylation, increased plasmalemmal NHE1 levels and greatly enhanced NHE1 transport compared with wild-type fibroblasts. These findings reveal Nedd4-1 and ?-arrestin-1 as key regulators of NHE1 ubiquitylation, endocytosis, and function. Our data suggest a broader role for ?-arrestins in the regulation of membrane ion transport proteins than currently known.

Nedd4-2-dependent ubiquitylation and regulation of the cardiac potassium channel hERG1

The voltage-gated cardiac potassium channel hERG1 (human ether-à-gogo-related gene 1) plays a key role in the repolarization phase of the cardiac action potential (AP). Mutations in its gene, KCNH2, can lead to defects in the biosynthesis and maturation of the channel, resulting in congenital long QT syndrome (LQTS). To identify the molecular mechanisms regulating the density of hERG1 channels at the plasma membrane, we investigated channel ubiquitylation by ubiquitin ligase Nedd4-2, a post-translational regulatory mechanism previously linked to other ion channels. We found that whole-cell hERG1 currents recorded in HEK293 cells were decreased upon neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 4-2 (Nedd4-2) co-expression. The amount of hERG1 channels in total HEK293 lysates and at the cell surface, as assessed by Western blot and biotinylation assays, respectively, were concomitantly decreased. Nedd4-2 and hERG1 interact via a PY motif located in the C-terminus of hERG1. Finally, we determined that Nedd4-2 mediates ubiquitylation of hERG1 and that deletion of this motif affects Nedd4-2-dependent regulation. These results suggest that ubiquitylation of the hERG1 protein by Nedd4-2, and its subsequent down-regulation, could represent an important mechanism for modulation of the duration of the human cardiac action potential.