Preparação e caracterização de bionanocompósitos à base de gelatina e magnetita reticulados com sacarose

Nesta dissertação, foram estudadas a preparação e a caracterização debionanocompósitos à base de gelatina e magnetita. Sacarose foi empregada comoagente de reticulação e gelatina tipo A e gelatina tipo B foram comparadas nautilização para a preparação das microesferas por meio de emulsão água-em-óleo.As microesferas foram caracterizadas por VSM, DSC, TGA, FTIR, testes deinchamento, espectroscopia de absorção atômica, microscopia ótica e microscopiaeletrônica de varredura. Um planejamento de experimentos variando-se aconcentração de gelatina e de sacarose, a temperatura e a velocidade de agitaçãofoi realizado a fim de encontrar quais parâmetros influenciam o diâmetro dasmicroesferas. A concentração de gelatina e velocidade de agitação foram osparâmetros diretamente associados com os tamanhos de partículas. A distribuiçãode tamanho das partículas revelou que o diâmetro das microesferas variou de 5 a 60micrômetros, com predominância na faixa de 11 a 30 micrômetros. A extensão dareticulação foi aumentada com o aumento do tempo de aquecimento na etapa depreparação das microesferas. Todos os bionanocompósitos apresentaramsuperparamagnetismo. Os resultados mostraram que não há diferença significativa entre a utilização de gelatina do tipo A e gelatina do tipo B. Além disso, o estudo de reticulação degelatina revelou que, ao contrário do que diz a literatura, a sacarose não é umagente de reticulação para as cadeias proteicas, pois não foram encontradasevidências de uma reação química entre a sacarose e gelatina

Papel das hemaglutininas 67-72p de Corynebacterium diphtheriae na ligação a proteínas plasmáticas, superfícies celulares, invasão e indução de apoptose

Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae

Resposta adaptativa e efeitos das substâncias oxidantes - K2TeO3, H2O2 e paraquate - na produção de biofilme de amostras de Corynebacterium diphtheriae isolados de origens diversas

A difteria é uma doença imunoprevinível que permanece endêmica em diversas regiões do mundo. Além dos casos de difteria clássica, doenças invasivas como endocardite, osteomielite, pneumonia e infecções relacionadas à cateter, tem acometido indivíduos adultos parcialmente imunizados. A natureza multifatorial dos fatores de virulência que favorecem a formação de biofilme e sobrevivência em macrófagos tem sido evidenciada para o Corynebacterium diphtheriae. Entretanto, escassos são os trabalhos que investigaram a influência de condições ambientais na virulência do patógeno. Uma vez que agentes oxidantes são capazes de gerar radicais livres e levar ao estresse oxidativo que, consequentemente, podem resultar em resposta adaptativa e influenciar na formação do biofilme e na virulência bacteriana, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar os efeitos do peróxido de hidrogênio (H2O2), paraquate e telurito de potássio (K2TeO3) em propriedades biológicas de cepas de C. diphtheriae de origens diversas. Os resultados demonstraram que as amostras de C. diphtheriae apresentaram níveis de resistência ao K2TeO3, H2O2 e paraquate, porém em intensidades variadas e independentes da capacidade de produção da toxina diftérica. Algumas amostras, toxinogênicas ou não, isoladas do trato respiratório superior demonstraram resposta adaptativa para H2O2 passando, portanto, a expressar resistência aumentada após uma prévia exposição ao referido agente oxidante. C. diphtheriae não exibiu respostas adaptativas para o K2TeO3 e paraquate. C. diphtheriae foi capaz de produzir biofilme na superfície de substratos abióticos de natureza hidrofílica (vidro) e hidrofóbica (poliestireno) na presença de agentes oxidantes K2TeO3, H2O2 e paraquate. A presença dos agentes oxidantes influenciou na formação de biofilme de algumas amostras. O paraquate inibiu a produção de biofilme de todas amostras. A amostra TR241 teve a produçao de biofilme inibida na presença dos três agentes oxidantes analisados. Por outro lado, a presença de H2O2 e do K2TeO3 estimulou a produção de biofilme de algumas amostras. Para todas as amostras de C. diphtheriae testadas, independentes das origens, biotipos e da capacidade de produção de toxina diftérica, os ensaios moleculares indicaram a presença de sequências gênicas cromossômicas homólogas, codificadores da proteína DIP 0906 (TeR) e da proteína DIP 1421 (OxyR), envolvidos na resistência ao telurito e na proteção contra o estresse oxidativo, respectivamente. Não foi observada correlação da suscetibilidade e a resposta adaptativa aos agentes oxidantes com as diferentes características bacterianas: origem, sítio de isolamento, produção de toxina diftérica, metabolização de sacarose e produção de biofilme. Em conclusão, o estresse oxidativo foi capaz de influenciar fatores de virulência do C. diphtheriae, como a capacidade de produçao de biofilme, que podem estar contribuindo para a patogenia da difteria clássica assim como de doenças invasivas causadas por cepas atoxinogênicas.

Dieta rica em sacarose: perfil inflamatório e danos hepáticos em camundongos

Ainda não está bem definido na literatura se uma dieta rica em sacarose, mesmo sendo isoenergética, provoca danos à saúde. Camundongos C57BL/6 foram alimentados com uma dieta controle (10% da energia proveniente de gordura, 8% da energia proveniente da sacarose - SC), uma dieta rica em sacarose (10% de energia proveniente da gordura, 32% da energia proveniente da sacarose - HSu), uma dieta hiperlipídica (42% da energia proveniente de gordura, 8% da energia proveniente da sacarose - HF) ou uma dieta combinada HF/HSu (42% da energia proveniente de gordura, 32% da energia proveniente da sacarose), durante oito semanas. Apesar da massa corporal e do índice de adiposidade não terem sofrido alteração, o grupo HSu apresentou hipertrofia dos adipócitos, o que também foi observado nos grupos HF e HF/HSu. Os grupos HF, HSu e HF/HSu foram intolerantes à glicose e apresentaram níveis séricos de insulina elevados. Os níveis séricos de leptina, resistina e proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1) aumentaram, enquanto adiponectina sérica reduziu nos grupos HF, HSu e HF/HSu. No tecido adiposo, os animais HF, HSu e HF/HSu apresentaram maiores níveis de expressão protéica de leptina e níveis mais baixos de expressão protéica de adiponectina, em comparação ao grupo SC. Colesterol hepático foi maior nos grupos HF e HF/HSu, enquanto TG hepático foi maior nos grupos HSu e HF/HSu. Os animais dos grupos HF, HSu e HF/HSu apresentaram esteatose hepática, aumento da expressão protéica hepática de elemento regulador de esterol ligante da proteína 1 (SREBP-1c) e diminuição da expressão protéica do receptor ativador de proliferação peroxissomal alfa (PPAR-α). Em conclusão, a dieta rica em sacarose não provoca obesidade nos animais, mas provoca alterações nos adipócitos (hipertrofia), intolerância à glicose, hiperinsulinemia, hiperlipidemia, esteatose hepática e aumento de citocinas inflamatórias. Os efeitos prejudiciais da dieta rica em sacarose, mesmo quando a sacarose substitui isocaloricamente o amido na alimentação, pode ter consequências para a saúde.

Pharmacological Blockade of Cannabinoid CB1 Receptors in Diet-Induced Obesity Regulates Mitochondrial Dihydrolipoamide Dehydrogenase in Muscle

Cannabinoid CB1 receptors peripherally modulate energy metabolism. Here, we investigated the role of CB1 receptors in the expression of glucose/pyruvate/tricarboxylic acid (TCA) metabolism in rat abdominal muscle. Dihydrolipoamide dehydrogenase (DLD), a flavoprotein component (E3) of alpha-ketoacid dehydrogenase complexes with diaphorase activity in mitochondria, was specifically analyzed. After assessing the effectiveness of the CB1 receptor antagonist AM251 (3 mg kg(-1), 14 days) on food intake and body weight, we could identified seven key enzymes from either glycolytic pathway or TCA cycle-regulated by both diet and CB1 receptor activity-through comprehensive proteomic approaches involving two-dimensional electrophoresis and MALDI-TOF/LC-ESI trap mass spectrometry. These enzymes were glucose 6-phosphate isomerase (GPI), triosephosphate isomerase (TPI), enolase (Eno3), lactate dehydrogenase (LDHa), glyoxalase-1 (Glo1) and the mitochondrial DLD, whose expressions were modified by AM251 in hypercaloric diet-induced obesity. Specifically, AM251 blocked high-carbohydrate diet (HCD)-induced expression of GPI, TPI, Eno3 and LDHa, suggesting a down-regulation of glucose/pyruvate/lactate pathways under glucose availability. AM251 reversed the HCD-inhibited expression of Glo1 and DLD in the muscle, and the DLD and CB1 receptor expression in the mitochondrial fraction. Interestingly, we identified the presence of CB1 receptors at the membrane of striate muscle mitochondria. DLD over-expression was confirmed in muscle of CB1-/- mice. AM251 increased the pyruvate dehydrogenase and glutathione reductase activity in C2C12 myotubes, and the diaphorase/oxidative activity in the mitochondria fraction. These results indicated an up-regulation of methylglyoxal and TCA cycle activity. Findings suggest that CB1 receptors in muscle modulate glucose/pyruvate/lactate pathways and mitochondrial oxidative activity by targeting DLD.

Dieta hiperlipídica e/ou rica em sacarose em camundongos suíços: metabolismo de carboidratos, fígado e tecido adiposo

A doença hepática gordurosa não alcoólica é uma desordem multifatorial causada principalmente por excesso nutricional e resistência à insulina, com prevalência estimada de 20-40% nos países ocidentais. A dieta hiperlipídica e/ou rica em sacarose pode influenciar no desenvolvimento da esteatose hepática associada à obesidade e a resistência à insulina. O fígado, por assumir papel central no controle metabólico, é um órgão alvo nos casos de excesso alimentar, ocasionando, principalmente, acúmulo de gotículas de gordura nos hepatócitos. Este trabalho teve como objetivo avaliar o início das alterações morfológicas e metabólicas no fígado e no tecido adiposo de camundongos suíços machos alimentados com dieta hiperlipídica e/ou rica em sacarose. Camundongos suíços machos aos três meses de idade foram divididos em quatro grupos nutricionais: dieta padrão (SC), dieta hiperlipídica (HF), dieta rica em sacarose (HSu) e dieta hiperlipídica rica em sacarose (HFHSu). Os animais receberam as respectivas dietas durante quatro semanas. A massa corporal, a ingestão alimentar e a tolerância oral à glicose foram avaliados. Ao sacrifício, o fígado e os depósitos de gordura corporal foram removidos e processados para análises histomorfométricas e moleculares. As amostras de sangue foram obtidas para análises bioquímicas plasmáticas. Os dados foram expressos como média e erro padrão da média e as diferenças foram testadas por one-way ANOVA com pós-teste de Holm-Sidak, e foi considerado o nível de significância de p<0,05. Os grupos HF e HFHSu apresentaram-se mais pesados quando comparados aos grupos SC e HSu. Os animais dos grupos HF, HSu e HFHSu apresentaram intolerância à glicose, esteatose hepática e aumento de triglicerídeos hepáticos quando comparados ao grupo SC (p<0,0005). Adicionalmente, houve elevação na expressão hepática das proteínas transportador de glicose 2 (GLUT-2), proteína de ligação ao elemento regulador do esterol 1-c (SREBP1-c), fosfoenolpiruvato carboxiquinase (PEPCK), glicose -6- fosfatase (G6PASE), substrato do receptor da insulinaI-1 (IRS-1) e proteína quinase B (AKt/ou PKB) e redução da expressão no fígado do receptor ativador de proliferação peroxissomal (PPAR-α) nos grupos experimentais em comparação com o grupo SC (p<0,0005). A administração de dieta hiperlipídica e/ou rica em sacarose promoveu intolerância à glicose e danos hepáticos (hepatomegalia, esteatose, redução da beta-oxidação, aumento na lipogênese e na produção de glicose) em camundongos machos adultos.

Conservação in vitro de germoplasma de Petiveria alliacea L. utilizando cultura de tecidos e criopreservação

A implementação de estratégias visando à conservação de espécies medicinais apresenta grande importância, tanto do ponto de vista ecológico quanto econômico. Petiveria alliacea L., espécie da família Phytolacaceae, conhecida como guiné, erva-de alho, erva-tipi ou amansa-senhor, pode ser encontrada desde a América Central até a América do Sul. Esta espécie possui ampla utilização medicinal, devido à presença, em sua composição, de vários polissulfetos, como o DTS (dibenziltrissulfeto), com propriedades antifúngica, antineoplásica e imunomodulatória, entre outras. O objetivo deste trabalho foi a conservação in vitro de germoplasma de Petiveria alliacea obtido de diferentes populações ocorrentes no Rio de Janeiro, através de métodos baseados em cultura de tecidos e criopreservação. Plantas obtidas através da germinação in vitro foram utilizadas como matrizes para a micropropagação através da multiplicação de meristemas pré-existentes em meio MS sem reguladores de crescimento, e embriões somáticos foram obtidos de forma direta a partir da cultura de explantes foliares das linhagens estudadas (Magé MG; Marechal Hermes MH; Niterói NT; Vila Isabel VI e Planta envasada AL), em presença de PIC (20μM) e 2,4D (22,6 μM), após 60 dias de cultivo. Os ápices caulinares das plantas micropropagadas e os embriões somáticos obtidos foram submetidos à criopreservação através de técnicas de vitrificação, encapsulamento-vitrificação e encapsulamento-desidratação, com a avaliação da pré-cultura e de soluções crioprotetoras (PVS2 e PVS3), em diferentes concentrações e tempos de exposição. Os resultados mostraram uma taxa de 100% de germinação in vitro. As condições para a pré-cultura de ápices foram padronizadas, entretanto não foram obtidos resultados positivos após o descongelamento. Por outro lado, os embriões da linhagem AL (linhagem embriogênica em cultura há 24 meses) mantiveram sua capacidade multiplicativa (100%) (embriogênese secundária) quando submetidos à desidratação em sacarose (0,5M) e expostos às soluções de vitrificação PVS2 e PVS3 pelos menores tempos (15 e 30 minutos). Os diferentes meios de recuperação apresentaram respostas variáveis em relação à capacidade multiplicativa dos embriões. O encapsulamento/vitrificação foi a técnica que promoveu maior tolerância dos embriões ao congelamento. A recuperação dos embriões através de multiplicação após a criopreservação abre uma perspectiva de conservação de genótipos com alta produção de polissulfetos, de interesse para a indústria farmacêutica

Dietas ricas em gordura, frutose e sacarose: alterações no fígado

Hábitos inadequados no estilo de vida, pelo consumo exacerbado de dietas ricas em gorduras e açúcares (frutose e sacarose), correlacionam-se positivamente com o desenvolvimento da obesidade, da resistência à insulina (RI) e da esteatose hepática não alcoólica (NAFLD). O estudo teve como objetivo avaliar a magnitude dos efeitos da administração crônica de dietas ricas em gordura e/ou frutose, e ainda, comparar os efeitos dos açúcares isoladamente (frutose e sacarose) sob as alterações bioquímicas, o perfil inflamatório, as respostas morfofuncionais e as expressões proteicas e gênicas de fatores de transcrição envolvidos na lipogênese, na beta-oxidação, na gliconeogênese e no estresse oxidativo no fígado. Camundongos machos C57BL/6 foram divididos em dois experimentos: 1) Dieta controle/standard chow (SC), dieta high fat (HF 42%), dieta high frutose (HFr 34%) e dieta high fat + high frutose (HFHFr - 42% fat + 34% frutose) por 16 semanas; 2) Dieta controle/standard chow (SC), dieta high frutose (HFru 50%) e dieta high sacarose (HSu 50%) por 15 semanas. Ao final dos experimentos foram observados: 1) Não houve diferença na massa corporal entre os animais HFr e SC, só foi observado ganho de peso nos grupos HF e HFHFr. Houve ainda aumento do colesterol total, dos triglicerídeos plasmáticos e hepáticos e RI nos grupos HF, HFr e HFHFr. No fígado, foi observado NAFLD com aumento na expressão de SREBP-1c e PPAR-γ, e redução de PPAR-α. A gliconeogênese mediada pelo GLUT-2 e PEPCK também foi aumentada nos grupos HF, HFr e HFHFr em relação ao grupo SC. Áreas de necroinflamação também foram observadas nos animais HFr e HFHFr; 2) Não houve diferença na massa corporal entre os grupos SC, HFru e HSu. Porém, houve aumento do colesterol total, dos triglicerídeos plasmáticos e hepáticos, da RI, das adipocinas (IL-6, resistina, MCP-1 e leptina), e redução da adiponectina. No fígado, abundante NAFLD com predominância da expressão proteica e gênica de SREBP-1c, PPAR-γ e redução de PPAR-α; e desequilíbrio antioxidante com redução da SOD, da Catalase e da GRx nos grupos HFru e HSu quando comparados ao SC. Não houve diferença na GPx entre os três grupos. Ainda foi observado aumento na expressão proteica de G6Pase, PEPCK e GLUT-2, envolvidos na gliconeogênese hepática nos grupos HFru e HSu. Áreas de necroinflamação, característico da transição NAFLD-NASH, também foram observados. Os resultados permitem concluir que, independente do aumento da massa corporal, a administração crônica de dietas ricas em frutose e sacarose tem efeitos similares aos observados com o consumo de dieta hiperlipídica. Parece que a RI e a NAFLD sejam os precursores destas alterações.

Estabelecimento de culturas de raízes in vitro e avaliação da produção de metabólitos secundários de Cleome spinosa Jacq. (Cleomaceae)

Cleome spinosa é uma espécie herbácea de uso na medicina popular, especialmente no Nordeste do Brasil. A cultura in vitro de raízes adventícias da espécie foi iniciada com segmentos radiculares (0,5 e 1,0 cm) obtidos a partir de duas fontes de explantes: plantas propagadas in vitro e plantas oriundas do processo de germinação in vitro. Os explantes foram inoculados em meio MS líquido suplementado ou não com as auxinas ANA, AIA e AIB em diferentes concentrações (0,5; 1,0; 1,5; 3,0; 5,0 mg.L-1). As culturas foram mantidas em sala de crescimento, sob agitação (100 rpm) e sob fotoperíodo de 16h ou no escuro, com subculturas a cada 45 dias. Explantes oriundos de plantas propagadas in vitro também foram cultivados em meio contendo a citocinina BAP em associação com auxinas, na presença de sorbitol (isoladamente ou em associação com sacarose), em meio MS contendo redução na concentração total de sais minerais (MS1/2 e MS1/4) e em meio sólido. Os resultados mostraram que a adição de auxinas ao meio de cultura foi essencial à multiplicação das raízes, uma vez que em meio MS0 ocorreu significativo desenvolvimento de brotos. A suplementação com ANA não foi eficiente para a produção de raízes e acarretou no calejamento dos explantes, enquanto que a presença de AIA e AIB resultaram na multiplicação das raízes. Ainda assim, independentemente das manipulações realizadas no meio de cultivo, a capacidade de multiplicação mostrou-se reduzida. Uma expressiva multiplicação de raízes foi observada em culturas iniciadas a partir de explantes oriundos de plantas obtidas por germinação in vitro. A maior produção de biomassa foi alcançada em culturas iniciadas com segmentos radiculares de plantas obtidas por germinação in vitro cultivadas em meio contendo com 3,0 mg.L-1 de AIB e mantidas no escuro. Culturas estabelecidas nas melhores condições para acúmulo de biomassa foram acompanhadas por três subculturas, sendo avaliados períodos de cultura de 45 dias e de 60 dias. Culturas mantidas a intervalos de 45 dias apresentaram maior produção de raízes durante a segunda subcultura, enquanto que para o intervalo de 60 dias, embora tenha sido observada a capacidade de multiplicação das raízes, a maior produção de biomassa ocorreu nos primeiros 60 dias de cultivo. A partir de materiais in vivo e in vitro foram realizadas extrações com solventes de polaridade crescente (hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol) e os extratos foram submetidos a avaliações cromatográficas. As análises por cromatografia em camada delgada mostraram a presença de terpenos nos extratos obtidos com hexano e diclorometano, tanto em material obtido a campo como naqueles produzidos in vitro e de compostos fenólicos nos extratos em acetato de etila obtidos a partir de material de campo. Pelas análises por cromatografia líquida associada à espectrometria de massas foi possível observar a presença de flavonoides nas culturas in vitro, não detectados no material de campo. As análises por cromatografia de fase gasosa associada à espectrometria de massas apontaram a presença de esteroides nos extratos em hexano de raízes coletadas a campo e nas culturas in vitro de raízes. Os resultados obtidos mostraram a viabilidade da produção de culturas de raízes in vitro para a espécie C. spinosa e o potencial deste material para a produção de substâncias bioativas, algumas não encontradas em material coletado a campo

Efeito da suplementação dietética com cálcio sobre a plasticidade ontogenética no modelo de superalimentação pós-natal

A obesidade está relacionada com o desenvolvimento da diabetes, estresse oxidativo, esteatose hepática, alteração da sensibilidade hormonal e redução da capacidade termogênica pelo tecido adiposo marrom (TAM). Na obesidade, alterações do sistema dopaminérgico mesocorticolímbico podem levar ao vício por alimentos palatáveis. Todas estas características contribuem para o baixo gasto energético e o alto consumo alimentar. Para estudar os efeitos em longo prazo da obesidade infantil, utilizamos o modelo de redução do tamanho da ninhada. Para induzir a superalimentação neonatal, o tamanho da ninhada foi reduzido para 3 filhotes machos de PN3 21 (grupo SL). O grupo controle permaneceu com 10 filhotes (grupo NL). Em PN120, o grupo SL foi dividido em: SL que recebeu ração controle e SL-Ca que recebeu dieta controle suplementada com 10g/kg de CaCO3. Os sacrifícios ocorreram em PN120 e PN180. Durante todo o período experimental, avaliamos o consumo alimentar e peso corporal. Em PN175, avaliamos a preferência alimentar dos animais por uma dieta rica em açúcar ou em lipídio. Avaliamos os hormônios por ELISA, RIA e quimioluminescência; o conteúdo proteico por Western blotting no fígado, tecido adiposo branco (TAB) e marrom (TAM), adrenal e regiões cerebrais; as atividades enzimáticas no soro e no fígado por cinética enzimática. Em PN21, PN120 e PN180, avaliamos in vivo a atividade simpática do TAM. Ao desmame, os ratos SL apresentaram maior estado pró-oxidativo no fígado e plasma e menor sensibilidade às catecolaminas no TAB. Na idade adulta, a suplementação é capaz de melhorar o estado pró-oxidativo no fígado e plasma, a sensibilidade à insulina e a microesteatose no fígado. Tanto a alteração de metabolismo/ação da vitamina D e do glicocorticóide no tecido adiposo como a menor capacidade termogênica do TAM contribuem para a maior adiposidade dos animais do grupo SL. A suplementação com cálcio corrigiu parte dessas alterações. A superalimentação pós-natal levou a redução da via dopaminérgica e a maior preferencia por gordura, enquanto a suplementação com cálcio normalizou esta via apenas a nível hipotalâmico e corrigiu a preferência alimentar. Nossos dados destacam o impacto benéfico da suplementação dietética com cálcio, que pode ter um papel nutricional promissor para auxiliar a perda de peso e minimizar os distúrbios relacionados a obesidade e a síndrome metabólica dos animais obesos que foram superalimentados na lactação.

青蒿的遗传转化及青蒿素生物合成的调控

利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)1601，1000，1500，15834，A4，均成功地转化了中药青蒿(Artemisia annua L.)并且建立了pRi1601，pRi15834，pRiA4诱导的发根培养。pRi1601，pRi15834的发根诱导率比其它质粒高。太老或太幼的叶片不利子发根的诱导;发根主要从叶脉的伤口处萌发;带顶芽或带侧芽的叶片容易诱导根，但不一定是发根。光照有利于发根的诱导和发根的生长。以每个发根的“绝对生长速率”(Gtowth Ratio，GR)和绝对“侧根”数量(Number of Side Roots，NSR），通过大量的发根系的筛选，建立了8个发根系，1601-L-1, 1601-L-2, 1601-L-3, 1601-L-4, 15834-L-1, 1601-P-I, 16 01-P-2，15834-L-2。Southern分子检测表明，160l-1-1，1801-L-2, 1601-L-3，1601-L-4，1601-P-1，1601-P-2均为转化子。8个建立的发根系之间无论生长或者QHS的合成存在明显的差异。比较光／暗(16/8hrs)，25℃条件下培养的16 01-L-1，1601-L-2，1601-L-3，1601-L-4，1601-P-l，和1601-P-2，其中16 01-L-3的生长最快，160l-L-1的生长最慢;但是，1601-L-1的QHS的含量最高（可达1. 048%），1601-1-3的QHS的含量最低。160Z-L-3，15834 -L-1和2583:1-L-2的生长速率相差不大。用盛有l000mLMS液体培养基的3000mL的锥形瓶扩大培养1601-L -3，15834-L-1和15834-L-2，转速为ll0rlpm，培养过程中发根容易形成发根球（Hairy Root Balis，HRB），HRB的形成严重影响发根的生长和QHs的合成，HpLC分析表明扩大培养发根中QHS的含量比较低。 改变MS基本培养基中的无机离子的浓度，研究不同无机离子对发根生长和QHS的合成的影响。 l、KN03为18.79×10-3M时有利于1601- L-1生长，为14. 84×10-3M时有利于QHS的合成。NH-4N0-3浓度在10.93-12. 49×10—3M范围内有利于1601-L-1生长，在0-20.62×10-3M范围内对QHS的合成影响不大，大于20. 62×lO-3M不利QHS的合成。培养基中NH-4+／N0-3-比值为0. 37-0. 4-0.52:1时有利于发根的生长，比值为0.52 - 0.58:1时有利于QHS的合成。 2、H-2P0-4-浓度为2.498×10-3M时有利于发根的生长在0-2. 498×l0-3M范围内，随着浓度的提高，促进发根的生长。培养基中的H2P4 -的浓度在0-1.249×lO-3M的范围内，随着浓度的提高，促进QHS的合成，为1.249×10-3M时QHS的含量最高。 3、培养基中最适16 01-L-1生长的Ca-2+浓度为0.198- 0.766×10-3M，大于或小于该浓度范围，显著地抑制发根的生长。但是，在0-3.695×10-3M范围内，随着培养基中Ca-2+浓度提高，促进QHS的合成，最适Ca-2+浓度为3.695×l0-3M。 4、培养基中不加Mg-2+时，完全抑制发根生长，在0. 142×10-3M-7.506×l0-3M浓度范围内，对发根生长影响没有明显的差别。但是，HPLC和UV分析发根中QHS含量，培养基中不加Mg-2+时，发根中QHS含量最高。 5、培养基中的Fe-2+浓度在0. 25 -1．0×10-3M范围内，同时有利于16 01- L-1的生长和QHS的形成。 6、培养基中最适合予16 01- L-3生长的KI浓度为2.5ppm，大于或小予该浓度均显著地抑制发根的生长，培养基中加入KI明显地降低发根中的QHS的含量。 7、H2BO3对l601-L-l生长影响不大，HPLC分析QHS的含量，培养基中的H3BO3浓度为100ppm和400ppm，QHS的含量分别为1.69mg/g和1.80mg/g(DW)。 8、Cu-2+对1601-L-3的生长影响显著，最适合1601-L-3生长的Cu-2+浓度为1.00ppm，在0 -1.00ppm的浓度范围内，随着培养基中的Cu+浓度的提高，发根的生物量不断增加。培养基中QHS合成的最适Cu2+浓度为0.05ppm，大于或小于该浓度均显著地抑制发根中QHS的合成。 比较光培养和暗培养对发根生长的影响，结果表明光照明显地促进1601-L-l的生长，暗培养明显不利于发根的生长。最适合于发根生长的温度为25℃，大于35℃显著地抑制发根的生长，影响发根的根尖细胞的正常分裂。 改变培养基中的蔗糖浓度和在发根培养的不同时期给培养基中添加蔗糖，试验结果表明蔗糖作为碳源对1601-L-3和1601-L-1的生长具有显著的影响。 (1)培养基中缺少蔗糖显著地抑制发根的生长。 (2)发根培养的前5天时间内，蔗糖浓度为30- 60glL昀培养基最有利于发根的生长，50glL的培养基中的发根生长最快，培养基中的蔗糖浓度大于60g/L小于30g／L时，发根的生物量增加较少。 (3)发根培养至第15天时，蔗糖浓度为60g/L的培养基最有利予发根的生物量的增加。发根培养至30天时，蔗糖浓度为60-90g/L的培养基，发根的生物量的增加相差不大，但是为蔗糖浓度为30-40g/L的培养基中的发根生物量一倍。 (4)发根培养过程中，分别于第5和15天给蔗糖浓度为30g/L的培养基中添加一次或二次蔗糖，使培养基中的蔗糖终浓度相当于60g/L或90g/L，培养至30天时，添加蔗糖的培养基中的发根的干重生物量相当于不添加蔗糖培养基中的发根生物量一倍，相当于初始蔗糖浓度为60g/L和90g/L培养基中发根的生物量。 (5)随着培养基中蔗糖浓度的提高，发根干重/鲜重比显著增加。培养基中的蔗糖的消耗量与发根生物量的增加呈正相关，蔗糖消耗越多，发根生物量的增加越大。 比较pH值对发根生长和QHS合成的影响表明，灭菌前pH值在5.O-6.5范围内的培养基适合予1601-L-1的生长，小于5.O不利于发根的生长，pH5.8有利于1601-1-1生长和QHS的生物合成。发根收获时培养基中的pH值一般为4.5-5.2. pH7.O抑制发根的生长，pHl0.O对发根具有强烈的致死作用。发根在培养过程中，对培养基中的pH值具有显著的调节作用，发根能在很短的时间内(24- 48hrs)使pl:l值为5.8、6.4、7.0培养基降低到pH4. 5-5.2，pH为5.8的培养基有利于QHS合成。 比较不同基本培养基对发根生长和QHS合成的影响，试验结果表明N6、DCR、Litvay培养基有利于1601-L-1的生长，WS、White、B5培养基不利于发根的生长。DCR培养基中的QHS含量最高。 根据三水平试验选用三水平正交表来安排试验的原则，选用三水平正交表L7(3-)，研究多因子效应对发根生长和QHS合成的影响，试验结果表明，Mg2+，Fe2+，Mn-2+，NH4NO3，KN03 ,KI,Ca-2+为发根生长的主要因子，NH4N03，KNOs，Mg2+，Ca2+，肌醇为QHS合成的主要因子。 通过TLC分析发根中QHS和其它化学成分，同时比较发根和无菌苗及野生植株的化学成分，发根和无菌苗均能合成包括QHS在内的野生青蒿叶片中的大部分非挥发性的化台 物。 研究青蒿植株在发育过程中QHS的含量的变化以及发根、无菌苗和野生青蒿中QHS的合成，HP分析结果表明，l、不同的单株青蒿之间的QHS量相差很大。2、同一植株幼 叶的QHS含量比老叶的QHS含量高。3、不同单株青蒿之间达到最高QHS含量的时间不一样，开花期或开花之前。4、无菌苗（带根）或者不带根丛生芽均能合成QHS，但是带根的无菌蕾的QHS量比丛生芽中的QIS的含量高。5、不同发根农杆菌转化的发根系1601-L-1和15834-L-1都能合成ＱＨＳ。

玉米的单倍体育种及基因转化的研究

玉米的单倍体育种，是利用花药培养或孤雌生殖产生单倍体后，进行人工或自然加倍，迅速获得稳定的新品种的育种方法。单倍体育种可以缩短育种时间，单倍体培养体系如果作为转基因的受体，可保证外源基因在后代中稳定遗传，而不发生分离。因此，玉米单倍体育种无论在实践中还是在理论研究方面都具有重大的意义。 本文针对玉米花药培养中长期以来未能解决的诱导频率低、基因型之间差异大、小苗移栽不容易成活等问题，重点探讨了各种因素对玉米花药培养的影响。结果表明：不同基因型之间的诱导频率差异明显，杂交种的诱导频率比纯系高，并选择出诱导频率高达20%的材料“中0198”;接种时花药中的花粉处于单核中期时，其诱导频率最高;采用液体培养基比采用固体培养基诱导频率提高一倍;培养基中加入0.5%的活性炭，可使诱导频率由5.25%提高到9.35%;15%的蔗糖浓度对玉米的花药培养是最适宜的，培养2周后，将培养基的蔗糖浓度从15%调整为10%，将明显提高诱导频率;培养基中高浓度的KT和低浓度的BA有利于诱导体细胞胚的发生，而低浓度的KT和高浓度的BA有利于诱导芽的发生;接种前将花药在4℃条件下进行低温预处理，可将诱导频率从3.13%提高到11.71%;培养基中添加2 mg/l的多效唑，可有效地促进小苗的生根;再生植株于冬季拿到海南种植，可明显提高移栽的成活率。 在玉米孤雌生殖的实验中，将未受粉的玉米雌穗接种在成份为N6 + 2,4-D 1mg/L + NAA 1mg/L + BA 1mg/L + CH 200mg/L + colchicine 2 mg/L + sucrose 5% + agar 0.7% 的培养基上。第一轮实验共接种了三个材料的26个雌穗（约3900个未受精的子房）。每种材料均有单性结实，诱导频率由高到低分别3.06%，2.29%，1.90%。直接获得了5株再生植株，通过染色体检查，发现其中3株为单倍体（n=10），另外2株为二倍体。移栽到土壤中后，有4株成活，其中一株二倍体植株能够正常开花、结实。得到的种子播种于实验田中，表现整齐一致，有纯系的特征，而且出现了2株白化苗。通过石蜡切片初步观察了孤雌生殖的胚胎发生过程，发现胚胎发生是从胚囊里的单倍体细胞起源的。第二、三轮实验又接种了10个基因型的玉米材料，证实了上述结果。 外源基因转导是利用生物技术进行玉米育种的一个有效途径。本文首次尝试了用离体子房注射法对玉米进行基因转化。首先构建了含有开花促进因子基因FPF1及植物选择标记抗除草剂基因pat的植物表达载体pFBR，采用离体注射培养法，取授粉24小时后的玉米雌穗，剥去苞叶，在超净工作台进行微量注射，然后切成小块接种在培养基上，在光照培养箱内培养，3-4周可直接获得种子或小植株。种子萌发后进行植株抗性筛选和分子检测，共注射了3个品种的47个雌穗（约16450个子房）得到再生植株109株，其中经PPT筛选有抗性的植株为23株，占再生植株的21.1%。经PCR检测，13株植株有阳性反应。但Southern杂交检测有杂带出现。出现杂带的原因、RNA水平的分子检测、转基因后代T1代的分子检测和早开花农艺性状的观察，由于时间关系没有完成，还需要进一步的实验。实验初步证明了离体子房注射法对玉米进行基因转化的可行性，而且与田间注射法相比，此方法具有省力省时，容易控制污染，转化效率提高的优点, 克服了玉米培养再生植株受基因型限制的困境, 将为玉米分子育种的基因工程提供更易行的手段。 同时，也为子房较大的其它植物的基因转化提供了方法。

牛耳草光合作用的脱水保护和复苏机理

本文以复苏植物牛耳草成熟植株的离体叶片为实验材料，以光合作用、蔗糖、抗氧化剂系统和离子渗漏等在脱水复苏过程中的变化为切入点，从生理生化水平上探讨其耐脱水复苏的机制;同时应用mRNA差异显示技术，从分子水平上探讨其耐脱水复苏的机制。 牛耳草叶片光系统II光化学活性参数和叶黄素循环色素在脱水复苏过程中的变化结果表明，极微弱光强（3μmol.m-2.s-1）下，脱水8天的牛耳草叶片诱导了叶黄素循环，叶黄素循环可能介导了牛耳草叶片脱水过程中的光保护作用。 利用不同浓度的磷酸盐溶液处理牛耳草叶片的结果表明，0.1mol/L以上的磷酸盐溶液对牛耳草叶片具有损伤作用，极大的影响了其光系统II的光化学活性，使得牛耳草叶片在脱水后不能很好的复苏。 牛耳草叶片在脱水复苏过程中，抗坏血酸（AsA）、还原型谷胱甘肽（GSH）和蔗糖含量在脱水时很快增加，复苏时又迅速恢复到原来水平，表明它们可能对脱水的牛耳草叶片具有保护作用，但对复苏的牛耳草叶片可能不重要;其离子渗漏情况表明质膜结构的完整性和稳定性在脱水复苏过程中能得到很好的保持，这可能是其耐脱水复苏的重要机制之一。 利用mRNA差异显示技术分离到牛耳草叶片脱水过程中一些脱水和磷酸盐特异诱导表达的cDNA。对其中5个脱水特异诱导表达和3个磷酸盐特异诱导表达的cDNA进行克隆测序、同源性探测和Northern 杂交检测表明，牛耳草脱水过程中诱导表达的基因可能涉及到脱水胁迫的信号转导、调节基因的级联和结构基因产物调节细胞结构在脱水胁迫中的稳定性等。

水母雪莲类黄酮次生代谢分子调控研究—cDNA 文库构建、关键酶及Myb 转录因子基因的克隆及其功能的初步鉴定

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim）为名贵珍稀中药材，其主要药用成分为类黄酮，尤其是3-脱氧类黄酮。目前关于雪莲的研究主要集中在采用细胞培养生产类黄酮等方面，但对于雪莲类黄酮生物合成的分子机制了解甚少，极大限制了这一珍贵资源的利用。本研究采用水母雪莲红色系愈伤组织及悬浮细胞为材料，构建cDNA文库，从中克隆水母雪莲类黄酮次生代谢中的相关基因并对这些基因进行了深入的生物信息学分析、转基因研究初步确定其功能，以期了解雪莲类黄酮次生代谢的分子机制，为提高类黄酮的合成奠定基础。主要结果如下： 1. 成功地构建了水母雪莲红色系愈伤组织与悬浮细胞cDNA文库，原始文库滴度达到4×106pfu/ml，扩增文库滴度接近1011 pfu/ml，重组率达98%。PCR检测插入片段，均在0.5kb到3kb之间，1kb以上占62%。从文库中检测到了chs、dfr及Myb转录因子SmP，文库覆盖度达到要求且为PCR筛选文库提供了可能。 2. 采用部分简并引物，通过RT-PCR克隆了水母雪莲查尔酮异构酶基因Smchi特异探针，并根据这一探针序列设计特异引物，采用TD-PCR法筛选cDNA文库，获得Smchi cDNA序列，全长831bp，编码一个232氨基酸残基的蛋白。根据cDNA序列克隆了Smchi DNA序列，结果表明Smchi基因无内含子。Smchi cDNA序列与翠菊chi基因高度同源，ORF区域同源性高达84%，但推测氨基酸序列则只有79.3%。Smchi mRNA具有复杂的二级结构。SmCHI具有典型的Chalcone结构域，其二级结构与苜蓿CHI蛋白十分相似，7个α-螺旋与8个延伸链由随机结构联系起来。但其活性中心的第三个关键氨基酸残基N115为M115所取代，这一取代可能导致该蛋白无生物活性，也可能使它具有一般CHI不同的功能。构建Smchi正义、反义真核表达载体，通过农杆菌介导导入烟草，获得转正义、反义Smchi基因的烟草。转基因烟草花色未改变，但叶片总黄酮发生了显著的变化，50%转正义基因烟草总黄酮含量显著提高，最高比对照提高6倍，70%转反义基因烟草总黄酮含量显著下降，最多达85.1%，初步证明Smchi具有功能，并能有效调控烟草类黄酮次生代谢。因此，SmCHI可能是不同于已知CHI的一类新的CHI蛋白，它催化的反应可能与花色素合成无关，其反应机制也可能有所不同。 3. 伴随Smchi的克隆获得了一个黄烷酮3-羟化酶类似基因Smf3h的cDNA，全长1334bp，编码一个343aa的蛋白。根据这一cDNA序列克隆了Smf3h DNA序列，全长1630bp，结果表明该基因由4个外显子和3个内含子组成。Smf3h mRNA具有十分复杂的二级结构。 推测蛋白氨基酸同源性分析表明，SmF3H属于2OG-FeII_Oxy家族，与同一家族的的颠茄H6H的同源性为45%，与拟南芥F3H的同源性为40%，但对SmF3H、典型F3H及典型H6H推测蛋白二级结构、活性中心关键氨基酸残基的位置与相对距离、软件进行功能预测分析，发现SmF3H与F3H更相似。构建Smf3h的正义与反义真核表达载体，通过农杆菌介导导入烟草，但只获得一批转正义基因的烟草，反义基因导致烟草不能再生而未获得转反义基因烟草。转基因烟草花色未改变，叶片总黄酮也与对照相似，初步确认Smf3h与烟草类黄酮生物合成无关，而是一个既不属于f3h也不属于h6h的功能未确定的新基因。 4. 采用与克隆Smchi基因相似的方法，从cDNA文库中克隆了SmP基因cDNA，全长969bp，编码一个256 aa的蛋白质。根据cDNA序列克隆了SmP基因的DNA序列，结果表明，SmP基因无内含子。SmP基因cDNA 一级结构及mRNA二级结构预测分析表明，该基因A+T含量很高（63%），所形成二级结构以A-T配对为主，其稳定性可能较差。SmP推测蛋白序列具有R2R3-Myb转录因子的典型特征，在N-端具有两个Myb DNA-binding Domain，其二级结构与鸡Myb转录因子1A5J十分相似，与其他基因如水稻OsMYB、番茄ThMYB的同源区域主要集中在这一结构域，分别为71.3%和70.8%;C-端富含丝氨酸，与烟草NtMYB、葡萄VlMYB等类黄酮调控因子相似，都呈寡聚体分布，并具有相同的保守磷酸化位点S170与S206。构建SmP基因真核表达载体，通过农杆菌介导导入烟草，获得大量转基因烟草。转基因烟草花色未发生改变，但51%的转基因烟草叶片总黄酮含量都显著提高（0.5-6倍），表明SmP具有促进烟草类黄酮生物合成的功能，但所调控的支路与花色素合成无关。初步试验结果表明，转SmP基因烟草对蚜虫具有很高的抗性，可有效地抑制蚜虫在烟草上的生长，抑制率最高可达92%-100%。这一抗性与烟草中类黄酮的积累可能具有直接的联系，但还需要进一步的试验证明。 5. 与美国俄亥俄州立大学Erich Grotewold 博士实验室合作，完成了微型EST库50个克隆的测序并进行了分析，从中获得了水母雪莲花色素合酶基因SmANS及醛脱氢酶基因SmALDH的特异探针。根据SmANS特异探针设计引物，采用PCR从这50个克隆中筛选获得了SmANS的cDNA序列，全长1229bp，编码一个356aa的蛋白质。SmANS在cDNA水平上与同属的翠菊ANS基因高度同源，但同源区域集中在ORF区域，达到80%，mRNA 预测二级结构十分复杂;推测氨基酸序列与翠菊ANS同源性达到82.9%。SmANS属于2OG-FeII_Oxy家族，在2OG-FeII_Oxy结构域高度保守，与翠菊、甜橙ANS保守结构域同源性达到94%。预测蛋白二级结构以α-螺旋-β-折叠为主，由7个主螺旋和11个主β-折叠及随机结构连接而成，并具有2OG-FeII_Oxy家族活性中心的三个保守的组氨酸残基（His84、His235、His291）和一个天冬氨酸残基（Asp237）。 6. 根据微型EST库中获得的SmALDH特异探针设计引物，采用PCR从这50个克隆中筛选获得了SmALDH基因cDNA 序列，全长1664bp，编码一个491aa的蛋白质。SmALDH基因cDNA具有独特的碱基组成，3/-UTR富含A+T，占该区域碱基总量的80%，5/-UTR的A+T和G+C各占50%，比ORF区域（52%）还低，因此其mRNA二级结构中5/-UTR可以单独形成自身二级结构并且十分稳定，这可能影响基因的表达。这一现象在水稻、玉米等植物中也存在。SmALDH在cDNA水平上在ORF区域与拟南芥、藏红花、水稻等具有较高同源性，分别为64.03%、63.89%、63.72%，但在推测蛋白氨基酸序列水平上同源性反而较低，分别为54.9%、54.3%、54.0%。SmALDH缺少线粒体定位信号，为胞质醛脱氢酶，具有一个Aldedh 保守结构域，还具有与1OF7-H相似的以α-螺旋-β-折叠为主的二级结构，由10个主螺旋和15个主β-折叠及随机结构连接而成。由于ALDH在植物细胞乙醇发酵中具有解除醛类物质毒害的功能，因此SmALDH基因的克隆为改造细胞自身以适应发酵培养条件，解决水母雪莲细胞大规模培养中需氧问题提供了可能。

缺失nifZ的棕色固氮菌突变株DJ194的钼铁蛋白研究—纯化、结晶及金属簇的组成与分布

从棕色固氮菌DJ194菌株得到的固氮酶粗提液经DEAE－52、Sephacryl S－200及Q－Sepharose等柱厌氧层析，分离纯化得到nifZ基因缺失的固氮酶MoFe蛋白（ΔnifZ Av1）制备物。通过天然电泳和SDS变性电泳发现早期纯化所得的ΔnifZ Av1制备物中残存相当比例的三个主要污染蛋白：属于热激蛋白60家族（Hsp 60 family）成员的分子伴侣GroEL、糖酵解过程的一个多功能酶——6-磷酸葡萄糖异构酶（6-Phosphate Glucose Isomerase，PGI）及棕色固氮菌细菌铁蛋白（Bacterioferritin，Bfr）。初步鉴定表明，它们分别为由约55kD亚基组成的14聚合体，62kD亚基组成的10聚体和20kD亚基组成的24聚体。首次发现PGI有如此高的聚合体。虽然GroEL和PGI在天然电泳中的迁移率小于ΔnifZ Av1蛋白，但它们的亚基在SDS变性电泳中与ΔnifZ Av1亚基具有相似的迁移率，互相重叠，从而使变性电泳比天然电泳显出更高的ΔnifZ Av1纯度;而细菌铁蛋白虽然不会在变性电泳中污染ΔnifZ Av1，但往往会在ΔnifZ Av1制备物的结晶中优先或较多地结晶出来,从而给它的晶体生长和解析研究带来干扰（Zhao等，2004）。 通过Sephacryl S－200柱洗脱峰收集精度的调整及Q－Sepharose柱的NaCl浓度梯度洗脱，得到了纯度大于90%的ΔnifZ Av1制备物。它的厌氧天然电泳及其免疫印渍（Western blotting），以及SDS-变性凝胶电泳显出，ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等均与野生种钼铁蛋白（OP Av1）相似，表明nifZ基因缺失并未改变ΔnifZ Av1的α2β2四聚体构成。ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号（g≈4.3, 3.65和2.01）和520-660 nm附近的圆二色摩尔消光系数（Δε）也都与OP Av1较相似，从而表明ΔnifZ Av1含有与OP Av1数量相当的具有3/2自旋态的还原FeMoco。然而，ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物（C2H2、H+和N2）的还原活性都较低, 分别约为OP Av1的74%和46-50%;而反映P-cluster状况的450nm附近的Δε也明显低于OP Av1。此外，与OP Av1相同的ΔnifZ Av1在g≈2.01的EPR信号却与推测含由双[4Fe-4S]簇组成的P-cluster前体的His-tagged ΔnifZ Av1（Hu等，2004）的信号明显不同。这就表明，ΔnifZ Av1与OP Av1的差别不在于FeMoco的结构、含量和氧还状态，也不在于P-cluster的结构和氧还状态，而仅在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少（约一半）。据此推测出与国外提出的His-tagged ΔnifZ Av1模型不同的ΔnifZ Av1(DJ194)的如下结构模型。一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster，而另一个αβ亚基对只含FeMoco，其P-cluster区域则是空的。由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中两个P-cluster中的一个不能组装，因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响。根据Lee等（1998）对nifZ产物（NifZ）和nifW产物（NifW）可以形成[NifWx-NifZy]多聚体，并可能是通过同一途径来影响固氮酶的合成的研究，提出NifZ的如下的可能作用机理。[NifWx-NifZy]多聚体影响与P-cluster合成相关的金属簇(如[4Fe-4S])的进入和P-cluster的最终合成，而其中的一个αβ对上的P-cluster的形成可能较多的受到NifZ的影响;nifZ的某些突变或缺失虽然不影响[NifWx-NifZy]多聚体的形成，但对于更依赖于NifZ的那个αβ对上的P-cluster的合成可能会产生不同的影响。 对这一高纯度的ΔnifZ Av1制备物结晶的研究表明，使用Tris缓冲系统的25%PEG 6K/MgCl2晶体培养液可以在较短的晶体培养时间内得到较大的晶体;在一定条件下，pH为7.5和8.3的培养液对出晶数和晶体大小的影响不明显;PEG 6K的浓度与MgCl2的浓度对出晶大小的影响有一定的相关性，即较低的PEG浓度在较低的MgCl2浓度下和较高的PEG浓度搭配较高的MgCl2浓度较易长出较大的晶体。虽然ΔnifZ Av1制备物的纯度达到90%以上，并且在染铁实验中表明其基本不含细菌铁蛋白，但我们在对得到的晶体进行电泳鉴定中仍然发现了一种与以前报导的砖红色晶体不同的深棕红色的细菌铁蛋白晶体，之所以颜色不同可能和所含的铁元素的氧化状态有关。不过在所鉴定的5支结晶管中只在一个管内发现了与固氮酶晶体同时存在的这种细菌铁蛋白晶体，说明通过蛋白纯度的提高减少细菌铁蛋白的含量以及晶体培养条件的优化，细菌铁蛋白晶体形成的几率就可大大降低。