The role of α2,3- and α2,6-sialylation

RESUMO: Os glicoconjugados que decoram a superfície celular e os lípidos e proteínas secretados ocupam o ponto de encontro onde normalmente ocorrem interacções críticas homólogas (hospedeiro-hospedeiro) e heterólogas (hospedeiro-patogénio). Apesar de ser largamente aceite que os glicanos são parte integrante do processo de imunidade, continua a não ser claro qual o papel que os glicanos, em toda a sua diversidade, tomam no quadro geral da imunidade. Os glicanos, que são frequentemente terminados por resíduos de ácido siálico, podem ser alterados por factores externos, tais como patogénios, ou por acontecimentos fisiológicos celulares específicos. Normalmente em posição terminal, as glico-estruturas que contêm ácido siálico assumem um papel fundamental numa quantidade substancial de receptores imunes envolvidos na adesividade e tráfico celular, tal como as Selectinas e as Siglecs, das quais se sabe apresentarem uma relevante função imune. À altura do início desta tese, era sabido que os ácidos siálicos expressos à superfície das células poderiam modular mecanismos importantes nas respostas imunes adaptativas. Considerando a posição de charneira que as células dendríticas (DCs) ocupam na transição da resposta imune inata para a adaptativa, antecipámos que os ácidos siálicos poderiam também modular mecanismos relevantes nas DCs humanas. As DCs têm uma função muito relevante na verificação e captura antigénica, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica aos linfócitos, uma sequência de funções que conduz, em ultima instância, à indução da resposta inata adaptativa. Considerando estas premissas, a nossa hipótese principal foi que os ácidos siálicos podem influenciar funções relevantes das DCs, tais como captura de antigénios, maturação, migração para os gânglios linfáticos e apresentação antigénica às células Para testar esta hipótese, dividimos o trabalho em quatro partes: 1) Analisámos os glicanos sialilados de superfície, expressos durante a diferenciação de monócitos humanos em DCs (moDCs). Os nossos dados mostraram que a expressão dos glicanos com ligações em O (O-glicanos) e sialilados em α2,3, assim como glicanos com ligações em N (N-glicanos) sialilados em α2,6 e α2,3 aumentou durante o processo de diferenciação das moDCs. Contribuindo para esta nova configuração glicosídica, três sialiltransferases (STs) poderão estar envolvidas: a ST6Gal-1 correlaciona-se com a expressão aumentada de N-glicanos sialilados em α2,6; a ST3Gal-1 contribui para a sialilação em α2,3 de O-glicanos, em especial de antigénios T; e a ST3Gal-4 poderá ser responsável pelo aumento de N-glicanos sialilados em α2,3. Após estímulo e consequente maturação das moDCs, ambos os níveis de expressão génica de ST6Gal-1 e ST3Gal-4 são negativamente modificados sendo, também, que a expressão de ST3Gal-1 varia consoante o estímulo. 2) Estudámos posteriormente as consequências da modulação dos ácidos siálicos de superfície nas funções das DCs. Observámos que a remoção dos ácidos siálicos de superfície diminui significativamente a capacidade de macropinocitose e endocitose mediada por receptores nas moDCs. Em contrapartida, o tratamento com sialidase aumentou significativamente a capacidade das moDCs para fagocitar Escherichia coli. Determinou-se também que este mecanismo requer a existência de ácido siálico presente nas E. coli indicando um mecanismo de interacção hospedeiro-patogénio dependente de ácido siálico em ambas as partes envolvidas. As moDCs tratadas com sialidase também apresentam um nível superior de expressão de moléculas de MHC e moléculas co-estimulatórias, sugerindo um fenótipo celular mais maduro. Recorrendo ao modelo de ratinho, utilizaram-se DCs derivadas de células da medula (BMDCs) de ratinhos deficientes em ST3Gal-1 e ST6Gal-1. Estes ensaios revelaram que quer a endocitose quer a maturação são influenciadas por modificações 37 nos glicanos sialilados em α2,3 ou α2,6. A detecção e quantificação de proteínas Nglicosiladas e sialiladas em α2,6 apontou para um potencial envolvimento de integrinas β2 nestes mecanismos. 3) O efeito da sialilação em α2,6 na migração das DCs para os gânglios linfáticos foi também analisado. Observámos que BMDCs deficientes para ST6Gal-1 apresentam uma redução de cerca de 50% nos níveis de migração das DCs para os gânglios linfáticos, tal como aferido em ensaios de inflamação in situ e estudos de transferência adoptiva de células. Uma redução dos níveis deste tipo de migração foi também observada quando BMDCs nativas foram transferidas para ratinhos receptores deficientes em ST6Gal-1. São, contudo, necessários mais ensaios de forma a identificar as moléculas envolvidas neste processo. 4) Por último, analisámos o impacto da sialilação na estimulação antigénica das DCs às células T. Assim, concluiu-se que moDCs tratadas com sialidase apresentam um nível de expressão superior de IL-12, TNF-ɑ, IL-6 e IL-10, e activação do factor de transcrição nuclear kappa B (NF-κB). As DCs tratadas com sialidase induziram uma maior proliferação nas células T, com expressão correspondente de interferão-γ. Este dado sugere que a remoção de ácidos siálicos de superfície contribui para o desenvolvimento de uma resposta pro-inflamatória do tipo 1 por células T auxiliares (resposta Th1). Considerando estes dados no seu todo, concluímos que o ácido siálico tem um papel marcante nas funções imunes das DCs. Alterações à concentração de ácido siálico à superfície das células podem alterar a endocitose/fagocitose, maturação, migração para os tecidos e gânglios linfáticos e capacidade estimulatória para com as células T. Complementando estes dados, as ligações glicosídicas de ácidos siálicos criados por ST6Gal-1 e ST3Gal-1 são funcionalmente relevantes. A modulação programada da sialilação do glicocálice, mediada por sialidases individuais ou sialiltransferases é uma possibilidade aceitável para a melhoria da fagocitose por DCs e da sua potência imunológica. Este facto tem um significado particular para imunoterapias baseadas em DCs, podendo provar-se decisivo para a sua eficiência e aplicabilidade num futuro muito próximo.-------------------------------ABSTRACT: Glycans decorating cell surface and secreted proteins and lipids occupy the junction where critical host–host and host-pathogen interactions occur. In spite of the wide acceptance that glycans are centrally implicated in immunity, exactly how glycans and their variety and variability contribute to the overall immune response remains poorly defined. Glycans, frequently terminated by sialic acid residues, may be modified by external factors such as pathogens or upon specific physiological cellular events. The terminal, privileged positions of sialic acid-modified structures makes them key, fundamental determinants for a number of immune receptors with known involvement in cellular adhesiveness and cell trafficking, such as Selectins and Siglecs, with known relevant immune functions. At the time this thesis was initiated, it was established that sialic acids expressed at cell surface could modulate important mechanisms of the adaptive immune responses. Given the key role of dendritic cells (DCs) in the transition from innate to the adaptive immune responses, we anticipated that sialic acids could also modulate important mechanisms of human DCs. DCs have a relevant role in antigen screening and uptake, migration to lymph nodes and antigen presentation to lymphocytes, ultimately triggering the adaptive immune response. Therefore, our primary hypothesis was that sialic acids may modulate DC functions, such as antigen uptake, maturation, homing to lymph nodes and antigen presentation to T cells. To test this hypothesis, we divided our work in four parts. 1) Surface sialylated glycans expressed during differentiation from human monocytes to DCs (moDCs) were analyzed. Our data showed that α2,3-sialylated O-glycans and α2,6- and α2,3-sialylated N-glycans expression increased during moDC differentiation. Three main sialyltransferases (STs) are committed with this new glycan configuration: ST6Gal- 1 correlates with the increased expression of α2,6-sialylated N-glycans; ST3Gal-1 32 contributes for the α2,3-sialylation of O-glycans, especially T antigens; and ST3Gal-4 may contribute for the increased α2,3-sialylated N-glycans. Upon moDC maturation, ST6Gal-1 and ST3Gal-4 are downregulated and ST3Gal-1 is altered in a stimulus dependent manner. 2) We subsequently analyzed the consequences of the modulation of cell surface sialic acids in DC functions. We observed that removing surface sialic acid by sialidase significantly decreased the capacity of moDCs to micropinocytose and receptormediated endocytose. In contrast, treatment with a sialidase significantly improved the capacity of moDCs to phagocytose Escherichia coli. The improved phagocytosis mechanism required E. coli sialic acids, indicating a mechanism of host–pathogen interaction dependent on sialic acid moieties. Sialidase-treated moDCs have increased expression of MHC and co-stimulatory molecules, suggesting a more mature phenotype. Experiments using mouse bone marrow-derived DCs (BMDCs) from ST3Gal-1-/- and ST6Gal-1-/- strains indicated that endocytosis and maturation are influenced by changes in either α2,3 or α2,6-sialylated glycans. The analysis of α2,6-sialylated, N-glycosylated proteins, strongly suggested the potential involvement of β2 integrins, underlying these mechanisms. 3) The effect of α2,6-sialylation in DC homing to lymph nodes was also analyzed. We observed that BMDCs deficient for ST6Gal-1 have an almost 50% reduction in DC homing, as assayed by in situ inflammation and adoptive transfer studies. A reduction in DC homing was also observed when wild type BMDCs were transferred into ST6Gal-1-/- recipient mice. Further investigations are necessary to identify the molecules involved in this process. 4) Finally, we also analyzed the impact of sialylation on DCs ability to prime T cells. Sialidase-treated moDCs show increased gene expression of IL-12, TNF-α, IL-6 and IL- 10 cytokines, and activation of the transcription factor nuclear factor-κB. Sialidase33 treated DCs induced a higher proliferative response of T cells with concomitant higher expression of interferon-γ, suggesting that the clearance of cell surface sialic acids contributes to the development of a T helper type 1 proinflammatory response. Together, our data strongly support sialic acid’s relevance in DC immune functions. Alterations of cell surface sialic acid content can alter the endocytosis/phagocytosis, maturation, migration/homing and the ability for T cell priming in human DCs. Moreover, sialic acid linkages created by ST6Gal-1 and ST3Gal-1 are functionally relevant. The engineering of cell surface sialylation, mediated by individual sialidases or sialyltransferases is a likely possibility to fine tune DC phagocytosis and immunological potency, with particular significance to DC-based therapies.

Avaliação farmacológica de princípios ativos presentes no chá de Erva-de-passarinho - Phoradendron latifolium (SW) Griseb

Nossos experimentos foram realizados com o intuito de avaliar informações populares que indicam que o chá de Erva-de-Passarinho é altamente vasoconstritor, assim como informações científicas referentes a outras espécies da mesma família que, segundo vários autores, apresentam efeitos hiper e hipotensores. O Phoradendron latifolium (SW) Griseb. por nós utilizado foi coletado em Maringá -PR, onde encontra-se parasitando a Figueira Branca entre outras árvores. Realizamos ensaios com o chá liofilizado de Erva-de-Passaronho sobre a motilidade do duodeno isolado de coelhos e sobre a pressão arterial de cães anestesiados com Nembutal. Observamos que o chá promoveu redução da motilidade duodenal até o máximo de 80% das contrações iniciais. Na Pressão Arterial o chá levou ao aparecimento de uma resposta bifásica, ocorrendo inicialmente uma hipertensão seguida de hipotenso que não foi bloqueada pela atropina ou propanolol. Na presença de cocaína foi suprimida a hipertensão. Podemos concluir que o efeito hipotensor não está relacionado com receptores muscarínicos ou adrenérgicos tipo β e que o efeito hipertensor seja provavelmente devido a uma substância do tipo da tiramina.

Efeitos da ação antrópica sobre a hidrogeoquímica do rio Negro na orla de Manaus/AM

O rio Negro, na orla de Manaus, recebe de seus tributários urbanos resíduos domésticos e industriais, cuja composição variada vem modificando as características naturais de suas águas. Com o intuito de avaliar o efeito da ação antrópica sobre o rio Negro foram coletadas amostras de água e analisadas as variáveis: pH, Eh, condutividade elétrica e alcalinidade (por potenciometria); oxigênio dissolvido (titrimetria); nitrogênio amoniacal e de nitritos (espectrofotometria); os cátions Ca, Mg, Na e K, e os metais Cd, Cu, Cr, Fe, Mn, Ni, Pb e Zn (por espectroscopia de absorção atômica - EAA). Os resultados obtidos para pH, condutividade, oxigênio dissolvido, nitrogênio amoniacal e nitritos mostram piora na qualidade da água do rio Negro, na foz dos igarapés São Raimundo (FISR) e Educandos (FIE) e a jusante destes (JIE), que são os dois maiores tributários urbanos e receptores de esgotos domésticos e efluentes industriais. Os metais predominaram na fase dissolvida e, a maior parte, está acima do limite máximo desejável, preconizado pelo ministério da saúde para águas destinadas ao abastecimento público, exceto cobre e zinco. O estudo mostrou que apesar da contribuição antrópica dos tributários urbanos, o rio Negro mantém, ainda, sua capacidade de diluir os poluentes, principalmente, no período de maior volume de água.

Obtenção e caracterização de carvão ativado de caroço de buriti (Mauritia flexuosa L. f.) para a avaliação do processo de adsorção de cobre (II)

Na região amazônica, algumas indústrias despejam cobre nos corpos receptores que, em elevadas concentrações, é tóxico para os seres vivos. A remoção de cobre de efluentes industriais é realizada por diversos processos como a adsorção. Neste trabalho mostrou-se o resultado da adsorção de cobre (II) em carvão ativado de caroço de buriti carbonizado a 400 °C e ativado a 900 °C. O carvão ativado foi caracterizado em termos de área específica, tamanho dos poros, densidades aparente e real, porosidade, microscopia eletrônica de varredura, conteúdo de cinzas, pH, umidade, carbono fixo e grupos funcionais de superfície. O estudo de equilíbrio de adsorção avaliou a influência do diâmetro das partículas do carvão, do tempo de contato adsorvente/adsorbato, do pH e da concentração inicial da solução de cobre (II) sobre a remoção de cobre (II). Com base nos resultados, concluiu-se que há uma maior eficiência de remoção de cobre (II) para diâmetro < 0,595 mm, tempo de contato de 300 minutos, pH 4,0 e concentrações iniciais de cobre (II) de 50 e 80 mg L-1. O modelo matemático de Langmuir foi o que melhor se ajustou aos dados de equilíbrio de adsorção. A partir do tempo de contato de 15 minutos todas as concentrações de equilíbrio ficaram abaixo do máximo permitido de 1,0 mg L-1 previsto pela legislação vigente para lançamento de efluentes em corpos receptores.

Acatisia associada à bromoprida em um paciente deprimido usando fluvoxamina

CONTEXTO: A acatisia é definida clinicamente como uma sensação de agitação associada à necessidade de produção de movimentos, comumente deflagrada por bloqueadores dopaminérgicos, como os neurolépticos, podendo ocorrer também durante o tratamento com inibidores seletivos de recaptação de serotonina. É possível que drogas não psiquiátricas que bloqueiem receptores dopaminérgicos, como a bromoprida, possam causar sintomas extrapiramidais. OBJETIVOS: Descrever um desfecho desfavorável caracterizado por acatisia em um paciente depressivo previamente estabilizado com fluvoxamina, após usar bromoprida. MÉTODOS: Descrição de um caso. RESULTADOS: Sr. J., paciente deprimido de 47 anos, estava estabilizado com fluvoxamina 200 mg por dia. Iniciou abruptamente com quadro de inquietação e necessidade de produzir movimentos voluntariamente a fim de aliviar esse desconforto. Há quatro dias havia iniciado o uso de bromoprida 30 mg por dia para tratamento de dispepsia. A suspensão da bromoprida promoveu alívio imediato dos sintomas. CONCLUSÃO: A bromoprida, um bloqueador dopaminérgico, pode ter deflagrado acatisia em um paciente em uso de fluvoxamina. Os mecanismos farmacológicos relacionados a esse desfecho são discutidos.

Da transparência

[Excerto] O ecrã assume a fronteira que separa a relação entre o artefacto verdadeiramente dito e o seu receptor. Cinema, Televisão ou Media Interactivos dependem da representação visual para existir contudo a relação que procuram com os seus receptores sejam eles passivos ou activos é de envolvência total. Nesse sentido e tendo em conta esta separação operada pelo ecrã que decorre do enquadramento que circunscreve o espaço ou da separação física que se efectua pelo vidro ou tela existe uma necessidade da parte do medium de se desfazer desse mesmo ecrã. É necessário proceder a mecanismos de transparência que criem a ilusão no espectador/participante de que ele está no mesmo plano do objecto e que nada os separa.

A radiodifusão no Brasil e em Portugal e a invasão dos brasucas: uma nova linguagem

Tese de Doutoramento em Ciências da Comunicação (área de especialização em Sociologia da Comunicação e da Informação).

Assistolia durante ecocardiograma de estresse com dobutamina

Caso de assistolia, durante a realização de ecocardiografia de estresse com dobutamina, em mulher de 59 anos, com queixa de dor precordial. A complicação não foi associada com isquemia miocárdica e deve ter sido causada pela estimulação dos receptores cárdio-inibidores cardíacos à ação da dobutamina. A assistolia cardíaca foi revertida após administração de atropina, sem seqüelas.

Effect of hormonal changes on corneal biomechanical properties and anterior segment ocular perameters

Dissertação de mestrado em Optometria Avançada

Synthetic biology approaches to shape bacteriophages towards Pseudomonas aeruginosa biofilm control

Dissertation for Ph.D. degree in Biomedical Engineering.

O bloqueio do sistema renina-angiotensina atenua a remodelação cardíaca de ratos submetidos a estenose aórtica

OBJETIVO: Avaliar o papel do bloqueador dos receptores AT1 e do inibidor da enzima conversora da angiotensina na remodelação cardíaca induzida por estenose aórtica em ratos. MÉTODOS: Ratos Wistar foram divididos em 4 grupos: controle (C, n=13), estenose aórtica (EAo, n=11), EAo com lisinopril, 20 mg/kg/dia (LIS, n=11) e EAo com losartan, 40 mg/kg/dia (LOS, n=9). Os tratamentos foram iniciados 3 dias antes da cirurgia. Após 6 semanas, os animais foram submetidos ao estudo ecocardiográfico, quantificação da concentração de hidroxiprolina e da área seccional (CSA) miocitária do ventrículo esquerdo (VE). RESULTADOS: A EAo induziu aumento da espessura da parede do VE. Os animais LIS e LOS não apresentaram diferença em relação aos animais controles. Os ratos EAo e LIS apresentaram maiores diâmetros do átrio esquerdo que os ratos controles, enquanto nos animais LOS não houve diferença. Os animais com EAo apresentaram maiores valores da porcentagem de encurtamento que os controle. Esse fato não foi modificado com LIS ou LOS. A CSA dos animais do grupo EAo foi maior que a dos controle. Entretanto, o tratamento com LOS e com LIS atenuou o aumento da área induzida pela EAo. A EAo resultou em aumento na concentração de HOP, enquanto o grupo LOS não apresentou diferença em relação ao grupo controle. CONCLUSÃO: O bloqueio do sistema renina-angiotensina, com bloqueador AT1 e com IECA, pode atenuar o desenvolvimento de hipertrofia cardíaca, porém só o bloqueio dos receptores AT1 atenua a fibrose intersticial do VE.

Farmacocinética das estatinas

As estatinas são agentes hipolipemiantes que exercem os seus efeitos através da inibição da HMG-CoA redutase, enzima fundamental na síntese do colesterol, levando a uma redução do colesterol tecidual e um conseqüente aumento na expressão dos receptores de LDL. Existem consideráveis diferenças entre as estatinas, no que tange às propriedades farmacocinéticas, bem como ao coeficiente de hidrofilicidade, via hepática de metabolização (especialmente, do citocromo P450 e isoenzimas), meia-vida plasmática e eficácia na redução lipídica. As estatinas também podem diferir na capacidade de interação com outras drogas que utilizam a mesma via de metabolização. Recentemente, muitos efeitos pleiotrópicos têm sido relatados com estas drogas, bem como propriedades antiinflamatórias, melhora na função endotelial e benefícios na hemostasia.

Farmacologia da niacina ou ácido nicotínico

Niacina ou ácido nicotínico é uma vitamina solúvel com propriedades hipolipemiantes. Niacina reduz triglicérides (20% - 50%), LDL (5% - 25%), e aumenta HDL (15% - 35%). O estudo Coronary Drug Project mostrou que o uso de niacina foi associado com redução de eventos coronários e mortalidade total, e mais recentemente, foi demonstrado que niacina combinada com outras drogas hipolipemiantes pode atenuar a progressão da aterosclerose coronária. A niacina parece reduzir a mobilização de ácidos graxos livres dos adipócitos, agindo em receptores específicos, diminuindo a formação de lipoproteínas ricas em triglicérides pelo fígado. Existem duas formas de niacina, uma de absorção rápida (cristalina), mais comumente associada com flushing, e outra de liberação extendida, recentemente referida como de melhor tolerabilidade. O uso de niacina pode associar-se com dispepsia, aumento dos níveis plasmáticos de enzimas hepáticas e também com modestas elevações na glicose e ácido úrico, ao menos na utilização de doses até 2g / dia da forma de liberação prolongada.

Resposta cronotrópica ao teste cardiopulmonar após o uso de cimetidina

OBJETIVO: Testar a hipótese, por meio de ensaio clínico randomizado, de que a administração de cimetidina altera a resposta cronotrópica ao exercício. MÉTODOS: Foram selecionados 24 indivíduos saudáveis, com idade entre 20 e 68 anos, não-atletas, os quais concordaram em ser submetidos a testes cardiopulmonares, após uso de placebo e de cimetidina, 400 mg, duas vezes ao dia, durante uma semana. Os testes foram realizados em esteira rolante, com protocolo de rampa com análises diretas dos gases expirados. Foi avaliada freqüência cardíaca máxima atingida, além da freqüência cardíaca de repouso e do limiar anaeróbico. RESULTADOS: Os indivíduos estudados foram igualmente distribuídos por sexo, com idade média (± desvio padrão) de 43 ±11 anos. Os exames com placebo e com cimetidina tiveram igual duração (578±90 seg vs 603±131 seg) e igual VO2 pico (35±8 ml/kg.min vs 35±8 ml/kg.min). A administração de cimetidina não apresentou efeito significativo na freqüência cardíaca de repouso (75±10 vs 74±8 bpm), no pico do esforço (176±12 vs 176±11 bpm) e, da mesma forma, também não houve diferença entre as variações das freqüências cardíacas (pico - repouso), nos dois estudos (101±14 vs 101±13 bpm). CONCLUSÃO: A administração de cimetidina por sete dias não altera a resposta cronotrópica ao exercício.

Estudio de las respuestas neurofisiológicas y conductuales integradas en el sistema límbico: participación de los neuropéptidos derivados de la pre pro MCH y Angiotensina II

Numerosos estudios indican que la amígdala, se encuentra estrechamente ligada a la generación y modulación de los procesos emocionales. Aunque el complejo de la amígdala generalmente se define por varios grupos distintos de células, los núcleos de la amígdala basolateral que se conectan con el núcleo central y el núcleo de la estría terminal son los que proyectan a las áreas del sistema nervioso central involucradas en el control de las respuestas autónomas, los procesos cognitivos y la respuesta emocional. Además de los ampliamente estudiados sistemas glutamatérgico, gabaérgico, endorfinérgico, CRH, CCK entre otros, en estas áreas de la amígdala se encuentran receptores AT1 del sistema renina-angiotensina cerebral y llegan fibras del sistema de la pre-pro-hormona MCH (ppMCH) de la que se derivan la hormona concentradora de melanina (MCH) y otros dos péptidos biológicamente activos: el neuropéptido glicina (G)-ácido glutámico (E) (NGE) y el neuropéptido glutamina (E)- isoleucina (I) (NEI). Entre las áreas a las que se proyectan los núcleos de la amígdala se destaca la inervación de núcleos dopaminérgicos a través del área tegmental ventral y su influencia sobre la función del eje hipotálamo-hipófiso-adrenal (HHA) por la modulación de la descarga de ACTH a través de la inervación del núcleo hipotalámico paraventricular. Este proyecto tiene como objetivo evaluar los efectos de los neuropéptidos derivados de la ppMCH y Angiotensina II en la amígdala basolateral, sobre: el estado de ansiedad, conducta de exploración, activación del eje HHA y la trasmisión dopaminérgica en las áreas de proyección de la amígdala. Se empleará un modelo de miedo potenciado en ratas, que provoca una mayor activación de la amígdala y el establecimiento de un estado de ansiedad por la exposición previa a una situación de estrés. En este modelo se desencadenan respuestas similares a las encontradas en pacientes que sufren desórdenes de ansiedad, lo que nos permite estudiar el rol de los neuromoduladores en su fisiopatogenia.