Análise do envolvimento do fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) na translocação de proteínas para o retículo endoplasmático em Saccharomyces cerevisiae

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Busca de parceiros físicos das proteínas ADAM23 e MX1, utilizando o sistema de duplo híbrido em Saccharomyces cerevisae

A metilação de ilhas CpG em regiões regulatórias de vários genes tem sido descrita como um processo importante no silenciamento de genes supressores de tumor e diretamente envolvida no processo de carcinogênese de uma série de tumores. O estudo desses genes afetados pela metilação em tumores visa identificar possíveis marcadores moleculares para o diagnóstico, prognóstico e tratamento de tumores, além de possibilitar a descoberta de fatores importantes no processo biológico do câncer. Os genes MX1 e ADAM23 foram identificados como diferencialmente metilados em linhagens celulares provenientes de carcinoma de cabeça e pescoço. Neste sentido, ao estudar o perfil diferencial de metilação de genes em carcinomas de células escamosas de cabeça e pescoço, o gene MX1 foi identificado como diferencialmente expresso. Dessa forma, para elucidar a função destes genes no controle da carcinogênese, o presente estudo buscou identificar ligantes celulares das proteínas MX1 e ADAM23 por meio de rastreamentos de duplo-híbrido, usando bibliotecas de cDNA de cérebro fetal humano. Os rastreamentos com a proteína ADAM23 não geraram resultados positivos por isso não são aqui discutidos. Foi realizado rastreamento com a proteína MX1, que resultou em aproximadamente 1,0x106 transformantes, dos quais 74 foram confirmados pelo ensaio de duplo-híbrido e codificam para 9 ligantes já conhecidos e 21novos ligantes prováveis de MX1. Entre esses novos ligantes prováveis estão proteínas que já haviam sido descritas como ligantes de MX1, incluindo a própria proteína MX1, o que valida os resultados obtidos com este rastreamento. Além disso, grande parte dos ligantes identificados são fatores envolvidos no processo de SUMOilação de proteínas, na formação de corpúsculos nucleares denominados PML-NB e uma série de proteínas relacionadas ao controle da transcrição e apoptose... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Ação da IL-18 sobre a expressão do receptor dectina-1 e produção de citocinas por monócitos humanos desafiados com diferentes cepas de Paracoccidioides brasiliensis

Estudos têm demonstrado que o reconhecimento inicial de microrganismos é mediado por receptores celulares expressos em células da imunidade inata denominados receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Assim, a interação entre moléculas de superfície dos patógenos e receptores homólogos presentes na membrana celular de monócitos, modula a fagocitose, a ativação da célula e conseqüentemente a produção de citocinas. Trabalhos têm demonstrado a importância da estimulação de receptores toll-like 2 e 4 (TLR2 e TLR4), receptores de manose (MR) e dectina-1 de monócitos, tanto em infecções bacterianas como fúngicas, culminando com indução de produção de várias citocinas. A IL-18 é uma citocina indutora de IFN-g e possui uma ação extremamente importante, por ser capaz de promover tanto uma resposta do tipo Th1 ou Th2, dependendo do contexto de estimulação e do microambiente de citocinas. Em trabalho recente demonstramos que a IL-18 possui uma ação importante sobre o aumento da expressão de MR em monócitos humanos, e o reconhecimento do Paracoccidioides brasiliensis via esse receptor causaria aumento do crescimento fúngico no interior da célula. Dessa forma, os objetivos do presente projeto foram: 1) Avaliar a ação da IL- 18 sobre a expressão do receptor dectina-1 por monócitos humanos desafiados in vitro com diferentes cepas do P. brasiliensis; b) Avaliar a participação da dectina-1 na indução da produção de IL-18, TNF-a e IL-10 por monócitos desafiados in vitro com diferentes cepas do P. brasiliensis. Assim, monócitos de indivíduos normais tratados in vitro com IL-18 foram desafiados com diferentes de cepas do P. brasiliensis, e a expressão do receptor dectina-1 foi avaliada pela técnica de citometria de fluxo. A dosagem de IL-18, TNF-a e IL-10 no sobrenadante de cultura de monócitos desafiados com P. brasiliensis foi realizada utilizando a técnica de ELISA . Os resultados mostraram que a ...

Efeito de Leucotrienos sobre a atividade fungicida de monócitos humanos contra o Paracoccidioides brasiliensis

Não disponível

Estudo das interações in vivo entre as proteínas teloméricas LaRPA-1 e LaRbp38 usando o sistema do duplo híbrido

A leishmaniose é um conjunto de doenças infecciosas causadas por parasitas do gênero Leishmania, que afligem milhões de pessoas no mundo, tendo a cada ano dois milhões de novos casos e 70 mil mortes. As drogas utilizadas no tratamento das diferentes formas clínicas da doença apresentam alta toxicidade e baixa eficácia, além de apresentarem muitos efeitos colaterais e colaborarem com o aparecimento de parasitas e vetores resistentes. Devido a estas adversidades, o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento desta parasitose é incentivada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) e um maior conhecimento sobre a biologia molecular destes protozoários poderá facilitar estas descobertas. Ultimamente, os telômeros, estruturas nucleoproteícas nos terminais dos cromossomos de eucariotos, têm sido alvo intenso de estudos, que visam utilizá-los como alvo terapêutico contra tumores malignos e microrganismos patogênicos. Os telômeros geralmente se apresentam como estruturas dinâmicas onde ocorrem interações entre o DNA e proteínas, resultando na formação do complexo telomérico, que é responsável pela proteção e manutenção dos cromossomos e estabilidade do genoma, caracterizando uma função imprescindível para viabilidade celular. Componentes do complexo telomérico de Leishmania amazonensis foram identificados por ensaios bioquímicos em extratos positivos para a atividade de telomerase. Entre estes componentes identificou-se as proteínas LaRPA-1 (L. amazonensis Replication Protein A-1) e a LaRbp38 (L. amazonensis RNA binding protein) as quais mostraram habilidade de interagir com o DNA telomérico in vitro e in vivo. Mais recentemente, utilizando-se ensaios de imunoprecipitação e de captura por “pull-down” foi demonstrado que estas proteínas fazem parte de um mesmo complexo nos telômeros do parasita. Este trabalho pretende confirmar estas possíveis interações entre as proteínas teloméricas LaRPA-1 e ...

Análise eletroforética de proteínas recombinantes obtidas de Pichia pastoris

A glicerol quinase é uma proteína tetramérica que cataliza a fosforilação do glicerol a glicerol-3-fosfato, composta por quatro subunidades - sua análise eletroforética fornecerá apenas uma banda se for constatada a sua pureza num gel não desnaturante - e sua reação com o glicerol é dependente de magnésio e de ATP. A eletroforese de proteínas utiliza como suporte um gel de poliacrilamida, que é formado pela polimerização de monômeros de acrilamida ao longo da sua cadeia e ligações cruzadas de cadeias pela inclusão de um co-monômero bifuncional apropriado, usualmente a N,N’ – metileno-bis-acrilamida ou apenas Bis . A eletroforese de proteínas mais comum é a que utiliza SDS para um gel de poliacrilamida desnaturante. O SDS é um sal chamado Dodecil Sulfato de Sódio que tem por característica se ligar a cadeia proteína nos resíduos de aminoácidos apolares, deixando com a carga negativa, sendo assim, toda proteína fica com carga total negativa, migrando para o anodo na eletroforese. As técnicas de purificação utilizadas foram ultrafiltração e precipitação com ácido tricloro acético, etanol gelado e sulfato de amônio. A dupla precipitação com etanol resultou na recuperação de maior quantidade de proteínas. A coloração do gel com prata foi mais sensível do que Comassie blue. O gel de eletroforese mostrou quatro bandas, correspondentes às quatro subunidades da glicerol quinase quando revelados com prata em gel de SDS-PAGE.

Efeito da opsonização de células leveduriformes de Paracoccidioides brasiliensis com soro humano sobre a atividade fungicida de monócitos

Monócitos e macrófagos são células da imunidade inata que desempenham importante papel na defesa contra infecções fúngicas, através do reconhecimento dos fungos, ativação e desenvolvimento de atividade fungicida. A função das células fagocitárias depende do seu estado de ativação, induzido principalmente pelo ambiente de citocinas, presentes durante a interação com o microrganismo. O presente projeto teve por objetivo avaliar o efeito da opsonização de células leveduriformes de Paracoccidioides brasiliensis com soro humano sobre a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e atividade fungicida de monócitos humanos, estimulados ou não com Interferon-gama (IFN-γ), contra P. brasiliensis. Monócitos de sangue periférico, obtidos de indivíduos saudáveis, foram cultivados na ausência ou presença de IFN-γ por 24h a 37oC. A seguir, essas células foram desafiadas com a amostra Pb18 de P. brasiliensis por 60 min para determinação da produção de H2O2 e por 4h para a avaliação da atividade fungicida nas proporções fungomonócito de 1:50. A suspensão fúngica foi previamente incubada por 30 min a 37oC na ausência de soro (SS) ou na presença de pool de soro humano normal, inativado (SI) por aquecimento a 56oC ou soro humano fresco (SF) não submetido à inativação do sistema complemento, nas concentrações de 5%, 10%, 20% e 30% em meio de cultura RPMI. A atividade fungicida de monócitos contra a amostra Pb18 foi avaliada por plaqueamento dessas co-culturas em meio de cultivo BHIágar e determinação da recuperação de fungos viáveis após 14 dias de incubação a 36oC. A produção de H2O2 por monócitos foi determinada através da técnica de redução do vermelho de fenol. Os resultados mostraram que a adição de SF ou SI em diferentes concentrações a culturas de P. brasiliensis não interfere com a viabilidade... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Estudos estruturais com a importina-α e Sequências de Localização Nuclear (NLS) de proteínas envolvidas no metabolismo de Neurospora crassa

Proteínas que apresentam atividades no núcleo e possuem sequência de localização nuclear (NLS) tem seu deslocamento dependente do heterodímero importina-α/β. A importina- (ImpA) é responsável pelo reconhecimento inicial do substrato a ser importado através da interação com os NLS. Os sinais são caracterizados por apresentar um ou mais grupos de aminoácidos básicos, denominados como sequências monopartidas e bipartidas. O fungo Neurospora crassa vem sendo utilizado há mais de 70 anos como organismo modelo em estudos de expressão gênica, desenvolvimento e diferenciação celular, ritmo circadiano, defesa do genoma, bem como outros aspectos da biologia de eucariotos. A presença de um grande número de genes no genoma de N. crassa ainda com funções desconhecidas aponta este organismo como um promissor modelo para o estudo de novos mecanismos genéticos e bioquímicos ainda não identificados. Considerando a importância do metabolismo do glicogênio para os organismos, o presente trabalho teve como objetivo o estudo estrutural de complexos de ImpA com peptídeos NLSs (NCM e NCB) de proteínas envolvidas no metabolismo de glicogênio do fungo N. crassa, utilizando técnicas de cristalografia de proteínas. Monocristais dos complexos ImpA-NCM e ImpA-NCB foram obtidos para a coleta dos dados de difração de raios-X, resultando em dois conjuntos de dados à 2,1Å e 2,45Å de resolução, respectivamente. Após elucidação da estrutura da ImpA, mapas de densidade eletrônica gerados revelaram uma densidade eletrônica no sítio principal de reconhecimento de NLS da ImpA de ambas estruturas, possibilitando modelagem dos peptídeos. Em uma comparação do mapa de densidade eletrônica obtido de ambos complexos com um mapa de uma estrutura nativa de ImpA (70-529) coletada à 2,0Å de resolução, a qual usualmente apresenta um peptídeo “contaminante” no sitio de ligação... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)

Associação entre expressão de receptores TLR2 e TLR4 e produção de TNF-alpha e IL-10 por monócitos de gestantes portadoras de pré-eclâmpsia

Preeclampsia (PE) is a pregnancy specific syndrome characterized by a systemic inflammatory response, with higher intensity than that observed in normal pregnancy. Cells of the immune system, such as monocytes and granulocytes are endogenously activated and secrete high levels of free radicals and inflammatory cytokines. The objective of this study was to assess the activation state of monocytes from pregnant women with preeclampsia by endogenous expression of TLR2 e TLR4 receptors and to correlate the expression of TLR2 and TLR4 on monocytes surface of pregnant women with PE with the production of tumor necrosis factor-alpha (TNF- and interleukin-10 (IL-10) by these cells stimulated or not with peptidoglycan (PG) and lipopolysaccharide (LPS), as agonists agents of TLR2 and TLR4, respectively. We evaluated 15 pregnant women with PE, 15 normotensive pregnant women (NT) and 15 non-pregnant (NP). Peripheral blood monocytes were incubates in the presence or absence of LPS or PG. The supernatant obtained after 18h of culture was aspirated and used for TNF- and IL-10 determination by enzyme immunoassay (ELISA). The endogenous expression of TLR2 and TLR4 receptors was evaluated by flow cytometry. Our results showed significant highly concentrations of TNF- and TLR4 expression in monocytes of preeclamptic women when compared with NT and NP. Normal pregnant women presented higher levels of IL-10 in comparison with PE and NP groups. TLR2 expression was similar in the three groups studied. Therefore, our study highlights the important role of TLR4 in PE and the consequent high production of TNF- by monocytes of these patients, as well as the potential mechanism involving low levels of IL-10 in the pathophysiology of the disease. These observations demonstrate the strong link between the pathology of PE and the immune system of these patients

Concentrações séricas e peritoneal de proteínas de fase aguda em equinos submetidos à endotoxemia experimental, tratados ou não com lidocaína

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Estudo da interação não-nativa no enovelamento de proteínas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Expressão, purificação e caracterização estrutural de proteínas codificadas por dois fitovírus

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Avaliação do envolvimento do receptor dectina-1 na atividade fungicida e na produção de metabólitos do oxigênio por neutrófilos e monócitos humanos desafiados com Paracoccidioides brasiliensis

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Análise funcional das proteínas desacopladas mitocondriais de plantas utilizando RNA-seq e mutantes de inserção

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Leishmaniose Visceral canina: Clonagem e expressão das proteínas Lc24 e Lc36 de L. chagasi com potencial aplicação no diagnóstico e desenvolvimento de vacina

Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAR