Rôle de l'activation de c-Jun N-terminal kinase (JNK) dans un modèle de glaucome chez le rat et neuroprotection par inhibition de la voie de JNK

RESUME : Dans ce travail effectué chez le rat adulte, l'excitotoxicité rétinienne est élicitée par injection intravitréenne de NMDA. Les lésions en résultant sont localisées dans la rétine interne. Elles prennent la forme de pycnoses dans la couche des cellules ganglionnaires (corps cellulaires des cellules ganglionnaires et amacrines déplacées) et dans la partie interne de la couche nucléaire interne (cellules amacrines). Cette localisation est liée à la présence de récepteurs au glutamate de type NMDA sur ces cellules. L'activation de ces récepteurs entraîne un influx calcique et l'activation de diverses enzymes (phospholipase A, calpaïnes, calmoduline, synthase d'oxyde nitrique). La signalisation se poursuit en aval en partie par les voies des Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) : ERK, p38, ]NK. Dans les expériences présentées, toutes trois sont activées après l'injection de NMDA. Dans les cascades de signalisation de JNK, trois kinases s'ancrent sur une protéine scaffold. Les MAPKKK phosphorylent MKK4 et MKK7, qui phosphorylent JNK. JNK a de nombreuses cibles nucléaires (dont le facteur de transcription c-Jun) et cytoplasmiques. La voie de JNK est bloquée par l'inhibiteur peptidique D-JNKI-1 en empêchant l'interaction de la kinase avec son substrat. L'inhibiteur est formé de 20 acides aminés du domaine de liaison JBD et de 10 acides aminés de la partie TAT du virus HIV. L'injection intravitréenne de D-JNKI-1 permet une diminution des taux de JNK et c-Jun phosphorylés dans les lysats de rétine. L'effet prépondérant est la restriction importante des altérations histologiques des couches internes de la rétine. L'évaluation par électrorétinogramme met en sus en évidence une sauvegarde de la fonction cellulaire. Ce travail a ainsi permis d'établir la protection morphologique et fonctionnelle des cellules de la rétine interne par inhibition spécifique de la voie de JNK lors d'excitotoxicité. SUMMARY Excitotoxicity in the retina associates with several pathologies like retinal ischemia, traumatic optic neuropathy and glaucoma. In this study, excitotoxicity is elicited by intravitreal NMDA injection in adult rats. Lesions localise in the inner retina. They present as pyknotic cells in the ganglion cell layer (ganglion cells and displaced amacrines) and the inner nuclear layer (amacrine cells). These cells express NMDA glutamate receptors. The receptor activation leads to a calcium flow into the cell and hence enzyme activation (phospholipase, calpains, calmodulin, nitric oxide synthase). The subsequent signaling pathways can involve the Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK): ERK, p38 end JNK. These were all activated in our experiments. The signaling cascade organises around several scaffold proteins. The various MAPKKK phosphorylate MKK4 and MKK7, which phosphorylate JNK. JNK targets are of nuclear (c-Jun transcription factor) or cytoplasmic localisation. The peptidic inhibitor D-JNKI-1, 20 amino acids from the JNK binding domain JBD coupled to 10 amino acids of the TAT transporter, disrupts the binding of JNK with its substrate. Intravitreal injection of the inhibitor lowers phosphorylated forms of JNK and c-Jun in retinal extracts. It protects strongly against histological lesions in the inner retina and allows functional rescue.

RNA-driven cyclin-dependent kinase regulation: when CDK9/cyclin T subunits of P-TEFb meet their ribonucleoprotein partners.

The positive transcription elongation factor (P-TEFb) consists of CDK9, a cyclin-dependent kinase and its cyclin T partner. It is required for transcription of most class II genes. Its activity is regulated by non-coding RNAs. The 7SK cellular RNA turns the HEXIM cellular protein into a P-TEFb inhibitor that binds its cyclin T subunit. Thus, P-TEFb activity responds to variations in global cellular transcriptional activity and to physiological conditions linked to cell differentiation, proliferation or cardiac hypertrophy. In contrast, the Tat activation region RNA plays an activating role. This feature at the 5' end of the human immunodeficiency (HIV) viral transcript associates with the viral protein Tat that in turn binds cyclin T1 and recruits active P-TEFb to the HIV promoter. This results in enhanced P-TEFb activity, which is critical for an efficient production of viral transcripts. Although discovered recently, the regulation of P-TEFb becomes a paradigm for non-coding RNAs that regulate transcription factors. It is also a unique example of RNA-driven regulation of a cyclindependent kinase.

Transcriptional activation of the utrophin promoter B by a constitutively active Ets-transcription factor.

Duchenne muscular dystrophy is an X-linked genetic disease caused by the absence of functional dystrophin. Pharmacological upregulation of utrophin, the autosomal homologue of dystrophin, offers a potential therapeutic approach to treat Duchenne patients. Full-length utrophin mRNA is transcribed from two alternative promoters, called A and B. In contrast to the utrophin promoter A, little is known about the factors regulating the activity of the utrophin promoter B. Computer analysis of this second promoter revealed the presence of several conserved binding motives for Ets-transcription factors. Using electrotransfer of cDNA into mouse muscles, we demonstrate that a genetically modified beta-subunit of the Ets-transcription factor GA-binding protein potently activates a utrophin promoter B reporter construct in innervated muscle fibers in vivo. These results make the GA-binding protein and the signaling cascade regulating its activity in muscle cells, potential targets for the pharmacological modulation of utrophin expression in Duchenne patients.

A role for the src family kinase Fyn in NK cell activation and the formation of the repertoire of Ly49 receptors.

NK cell function is regulated by a dual receptor system, which integrates signals from triggering receptors and MHC class I-specific inhibitory receptors. We show here that the src family kinase Fyn is required for efficient, NK cell-mediated lysis of target cells, which lack both self-MHC class I molecules and ligands for NKG2D, an activating NK cell receptor. In contrast, NK cell inhibition by the MHC class I-specific receptor Ly49A was independent of Fyn, suggesting that Fyn is specifically required for NK cell activation via non-MHC receptor(s). Compared to wild type, significantly fewer Fyn-deficient NK cells expressed the inhibitory Ly49A receptor. The presence of a transgenic Ly49A receptor together with its H-2(d) ligand strongly reduced the usage of endogenous Ly49 receptors in Fyn-deficient mice. These data suggest a model in which the repertoire of inhibitory Ly49 receptors is formed under the influenced of Fyn-dependent NK cell activation as well as the respective MHC class I environment. NK cells may acquire Ly49 receptors until they generate sufficient inhibitory signals to balance their activation levels. Such a process would ensure the induction of NK cell self-tolerance.

SOCS-1 protein prevents Janus Kinase/STAT-dependent inhibition of beta cell insulin gene transcription and secretion in response to interferon-gamma.

In the pathogenesis of type I diabetes mellitus, activated leukocytes infiltrate pancreatic islets and induce beta cell dysfunction and destruction. Interferon (IFN)-gamma, tumor necrosis factor-alpha and interleukin (IL)-1 beta play important, although not completely defined, roles in these mechanisms. Here, using the highly differentiated beta Tc-Tet insulin-secreting cell line, we showed that IFN-gamma dose- and time-dependently suppressed insulin synthesis and glucose-stimulated secretion. As described previously IFN-gamma, in combination with IL-1 beta, also induces inducible NO synthase expression and apoptosis (Dupraz, P., Cottet, S., Hamburger, F., Dolci, W., Felley-Bosco, E., and Thorens, B. (2000) J. Biol. Chem. 275, 37672--37678). To assess the role of the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription (STAT) pathway in IFN-gamma intracellular signaling, we stably overexpressed SOCS-1 (suppressor of cytokine signaling-1) in the beta cell line. We demonstrated that SOCS-1 suppressed cytokine-induced STAT-1 phosphorylation and increased cellular accumulation. This was accompanied by a suppression of the effect of IFN-gamma on: (i) reduction in insulin promoter-luciferase reporter gene transcription, (ii) decrease in insulin mRNA and peptide content, and (iii) suppression of glucose-stimulated insulin secretion. Furthermore, SOCS-1 also suppressed the cellular effects that require the combined presence of IL-1 beta and IFN-gamma: induction of nitric oxide production and apoptosis. Together our data demonstrate that IFN-gamma is responsible for the cytokine-induced defect in insulin gene expression and secretion and that this effect can be completely blocked by constitutive inhibition of the Janus kinase/STAT pathway.

CARMA1 is a critical lipid raft-associated regulator of TCR-induced NF-kappa B activation.

CARMA1 is a lymphocyte-specific member of the membrane-associated guanylate kinase (MAGUK) family of scaffolding proteins, which coordinate signaling pathways emanating from the plasma membrane. CARMA1 interacts with Bcl10 via its caspase-recruitment domain (CARD). Here we investigated the role of CARMA1 in T cell activation and found that T cell receptor (TCR) stimulation induced a physical association of CARMA1 with the TCR and Bcl10. We found that CARMA1 was constitutively associated with lipid rafts, whereas cytoplasmic Bcl10 translocated into lipid rafts upon TCR engagement. A CARMA1 mutant, defective for Bcl10 binding, had a dominant-negative (DN) effect on TCR-induced NF-kappa B activation and IL-2 production and on the c-Jun NH(2)-terminal kinase (Jnk) pathway when the TCR was coengaged with CD28. Together, our data show that CARMA1 is a critical lipid raft-associated regulator of TCR-induced NF-kappa B activation and CD28 costimulation-dependent Jnk activation.

GLUT4, AMP kinase, but not the insulin receptor, are required for hepatoportal glucose sensor-stimulated muscle glucose utilization.

Recent evidence suggests the existence of a hepatoportal vein glucose sensor, whose activation leads to enhanced glucose use in skeletal muscle, heart, and brown adipose tissue. The mechanism leading to this increase in whole body glucose clearance is not known, but previous data suggest that it is insulin independent. Here, we sought to further determine the portal sensor signaling pathway by selectively evaluating its dependence on muscle GLUT4, insulin receptor, and the evolutionarily conserved sensor of metabolic stress, AMP-activated protein kinase (AMPK). We demonstrate that the increase in muscle glucose use was suppressed in mice lacking the expression of GLUT4 in the organ muscle. In contrast, glucose use was stimulated normally in mice with muscle-specific inactivation of the insulin receptor gene, confirming independence from insulin-signaling pathways. Most importantly, the muscle glucose use in response to activation of the hepatoportal vein glucose sensor was completely dependent on the activity of AMPK, because enhanced hexose disposal was prevented by expression of a dominant negative AMPK in muscle. These data demonstrate that the portal sensor induces glucose use and development of hypoglycemia independently of insulin action, but by a mechanism that requires activation of the AMPK and the presence of GLUT4.

Expression, purification and biochemical characterization of recombinant Ca-dependent protein kinase 2 of the malaria parasite Plasmodium falciparum.

Calcium-dependent protein kinases (CDPKs) are serine/threonine kinases that react in response to calcium which functions as a trigger for several mechanisms in plants and invertebrates, but not in mammals. Recent structural studies have defined the role of calcium in the activation of CDPKs and have elucidated the important structural changes caused by calcium in order to allow the kinase domain of CDPK to bind and phosphorylate the substrate. However, the role of autophosphorylation in CDPKs is still not fully understood. In Plasmodium falciparum, seven CDPKs have been identified by sequence comparison, and four of them have been characterized and assigned to play a role in parasite motility, gametogenesis and egress from red blood cells. Although PfCDPK2 was already discovered in 1997, little is known about this enzyme and its metabolic role. In this work, we have expressed and purified PfCDPK2 at high purity in its unphosphorylated form and characterized its biochemical properties. Moreover, propositions about putative substrates in P. falciparum are made based on the analysis of the phosphorylation sites on the artificial substrate myelin basic protein (MBP).

Neuropeptide-inducible upregulation of proteasome activity precedes nuclear factor kappa B activation in androgen-independent prostate cancer cells.

ABSTRACT: BACKGROUND: Upregulation of nuclear factor kappa B (NFκB) activity and neuroendocrine differentiation are two mechanisms known to be involved in prostate cancer (PC) progression to castration resistance. We have observed that major components of these pathways, including NFκB, proteasome, neutral endopeptidase (NEP) and endothelin 1 (ET-1), exhibit an inverse and mirror image pattern in androgen-dependent (AD) and -independent (AI) states in vitro. METHODS: We have now investigated for evidence of a direct mechanistic connection between these pathways with the use of immunocytochemistry (ICC), western blot analysis, electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and proteasome activity assessment. RESULTS: Neuropeptide (NP) stimulation induced nuclear translocation of NFκB in a dose-dependent manner in AI cells, also evident as reduced total inhibitor κB (IκB) levels and increased DNA binding in EMSA. These effects were preceded by increased 20 S proteasome activity at lower doses and at earlier times and were at least partially reversed under conditions of NP deprivation induced by specific NP receptor inhibitors, as well as NFκB, IκB kinase (IKK) and proteasome inhibitors. AD cells showed no appreciable nuclear translocation upon NP stimulation, with less intense DNA binding signal on EMSA. CONCLUSIONS: Our results support evidence for a direct mechanistic connection between the NPs and NFκB/proteasome signaling pathways, with a distinct NP-induced profile in the more aggressive AI cancer state.

Targeting anticancer therapy : clinical and preclinical approaches

AbstractCancer treatment has shifted from cytotoxic and nonspecific chemotherapy to chronic treatment with targeted molecular therapies. These new classes of drugs directed against cancer-specific molecules and signaling pathways, act at a particular level of the tumor cell development. However, in both types of therapeutic approaches (standard cytotoxic chemotherapy and targeted signal transduction inhibitions), toxicity and side effects can occur. The aim of this thesis was to investigate various approaches to improve the activity and tolerability of cancer treatment, in a clinical setting, a) by molecular targeting through the use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs), whose dosage can be adapted to each patient according to plasma levels, and, b) in a preclinical model, by tissue targeting with locoregional administration of cytotoxic chemotherapy to increase drug exposure in the target tissue while reducing systemic toxicity of the treatment.A comprehensive program for the Therapeutic Drug Monitoring (TDM) of the new class of targeted anticancer drugs of TKIs in patient's blood has been therefore initiated comprising the setting up, validation and clinical application of a multiplex assay by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry of TKIs in plasma from cancer patients. Information on drugs exposure may be clinically useful for an optimal follow-up of patients' anticancer treatment, especially in case of less than optimal clinical response, occurrence of adverse drug reaction effects and the numerous risks of drug-drug interactions. In this context, better knowledge of the potential drug interactions between TKIs and widely prescribed co- medications is of critical importance for clinicians, to improve their daily care of cancer patients. For one of the first TKI imatinib, TDM interpretation is nowadays based on total plasma concentrations but, only the unbound (free) form is likely to enter cell to exert its pharmacological action. Pharmacokinetic analysis of the total and free plasma level of imatinib measured simultaneously in patients have allowed to refine and validate a population pharmacokinetic model integrating factors influencing in patients the exposure of pharmacological active species. The equation developed from this model may be used for extrapolating free imatinib plasma concentration based on the total plasma levels that are currently measured in TDM from patients. Finally, the specific influence of Pglycoprotein on the intracellular disposition of TKIs has been studies in cell systems using the siRNA silencing approach.Another approach to enhance the selectivity of anticancer treatment may be achieved by the loco-regional administration of a cytostatic agent to the target organ while sparing non- affected tissues. Isolated lung perfusion (ILP) was designed for the treatment of loco-regional malignancies of the lung but clinical results have been so far disappointing. It has been shown in a preclinical model in rats that ILP with the cytotoxic agent doxorubicin alone allows a high drug uptake in lung tissue, and a low systemic toxicity, but was characterized by a high spatial tissular heterogeneity in drug exposure and doxorubicin uptake in tumor was comparatively smaller than in normal lung tissue. Photodynamic therapy (PDT) is a new approach for the treatment of superficial tumors, and implies the application of a sensitizer activated by a laser light at a specific wavelength, that disrupts endothelial barrier of tumor vessels to increase locally the distribution of cytostatics into the tumor tissue. PDT pre-treatment before intravenous administration of liposomal doxorubicin was indeed shown to selectively increase drug uptake in tumors in a rat model of sarcoma tumors to the lung.RésuméLe traitement de certains cancers s'est progressivement transformé et est passé de la chimiothérapie, cytotoxique et non spécifique, au traitement chronique des patients avec des thérapies moléculaires ciblées. Ces médicaments ont une action ciblée en interférant à un niveau spécifique du développement de la cellule tumorale. Dans les deux types d'approches thérapeutiques (chimiothérapie cytotoxique et traitements ciblés), on est confronté à la présence de toxicité et aux effets secondaires du traitement anticancéreux. Le but de cette thèse a donc été d'étudier diverses approches visant à améliorer l'efficacité et la tolérabilité du traitement anticancéreux, a) dans le cadre d'une recherche clinique, par le ciblage moléculaire grâce aux inhibiteurs de tyrosines kinases (TKIs) dont la posologie est adaptée à chaque patient, et b) dans un modèle préclinique, par le ciblage tissulaire grâce à l'administration locorégionale de chimiothérapie cytotoxique, afin d'augmenter l'exposition dans le tissu cible et de réduire la toxicité systémique du traitement.Un programme de recherche sur le suivi thérapeutique (Therapeutic Drug Monitoring, TDM) des inhibiteurs de tyrosine kinases a été ainsi mis en place et a impliqué le développement, la validation et l'application clinique d'une méthode multiplex par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem des TKIs chez les patients souffrant de cancer. L'information fournie par le TDM sur l'exposition des patients aux traitements ciblés est cliniquement utile et est susceptible d'optimiser la dose administrée, notamment dans les cas où la réponse clinique au traitement des patients est sous-optimale, en présence d'effets secondaires du traitement ciblé, ou lorsque des risques d'interactions médicamenteuses sont suspectés. Dans ce contexte, l'étude des interactions entre les TKIs et les co-médications couramment associées est utile pour les cliniciens en charge d'améliorer au jour le jour la prise en charge du traitement anticancéreux. Pour le premier TKI imatinib, l'interprétation TDM est actuellement basée sur la mesure des concentrations plasmatiques totales alors que seule la fraction libre (médicament non lié aux protéines plasmatiques circulantes) est susceptible de pénétrer dans la cellule pour exercer son action pharmacologique. L'analyse pharmacocinétique des taux plasmatiques totaux et libres d'imatinib mesurés simultanément chez les patients a permis d'affiner et de valider un modèle de pharmacocinétique de population qui intègre les facteurs influençant l'exposition à la fraction de médicament pharmacologiquement active. L'équation développée à partir de ce modèle permet d'extrapoler les concentrations libres d'imatinib à partir des concentrations plasmatiques totales qui sont actuellement mesurées lors du TDM des patients. Finalement, l'influence de la P-glycoprotéine sur la disposition cellulaire des TKIs a été étudiée dans un modèle cellulaire utilisant l'approche par la technologie du siRNA permettant de bloquer sélectivement l'expression du gène de cette protéine d'efflux des médicaments.Une autre approche pour augmenter la sélectivité du traitement anticancéreux consiste en une administration loco-régionale d'un agent cytostatique directement au sein de l'organe cible tout en préservant les tissus sains. La perfusion isolée du poumon (ILP) a été conçue pour le traitement loco-régional des cancers affectant les tissus pulmonaires mais les résultats cliniques ont été jusqu'à ce jour décevants. Dans des modèles précliniques chez le rat, il a pu être démontré que l'ILP avec la doxorubicine, un agent cytotoxique, administré seul, permet une exposition élevée au niveau du tissu pulmonaire, et une faible toxicité systémique. Toutefois, cette technique est caractérisée par une importante variabilité de la distribution dans les tissus pulmonaires et une pénétration du médicament au sein de la tumeur comparativement plus faible que dans les tissus sains.La thérapie photodynamique (PDT) est une nouvelle approche pour le traitement des tumeurs superficielles, qui consiste en l'application d'un agent sensibilisateur activé par une lumière laser de longueur d'onde spécifique, qui perturbe l'intégrité physiologique de la barrière endothéliale des vaisseaux alimentant la tumeur et permet d'augmenter localement la pénétration des agents cytostatiques.Nos études ont montré qu'un pré-traitement par PDT permet d'augmenter sélectivement l'absorption de doxorubicine dans les tumeurs lors d'administration i.v. de doxorubicine liposomale dans un modèle de sarcome de poumons de rongeurs.Résumé large publicDepuis une dizaine d'année, le traitement de certains cancers s'est progressivement transformé et les patients qui devaient jusqu'alors subir des chimiothérapies, toxiques et non spécifiques, peuvent maintenant bénéficier de traitements chroniques avec des thérapies ciblées. Avec les deux types d'approches thérapeutiques, on reste cependant confronté à la toxicité et aux effets secondaires du traitement.Le but de cette thèse a été d'étudier chez les patients et dans des modèles précliniques les diverses approches visant à améliorer l'activité et la tolérance des traitements à travers un meilleur ciblage de la thérapie anticancéreuse. Cet effort de recherche nous a conduits à nous intéresser à l'optimisation du traitement par les inhibiteurs de tyrosines kinases (TKIs), une nouvelle génération d'agents anticancéreux ciblés agissant sélectivement sur les cellules tumorales, en particulier chez les patients souffrant de leucémie myéloïde chronique et de tumeurs stromales gastro-intestinales. L'activité clinique ainsi que la toxicité de ces TKIs paraissent dépendre non pas de la dose de médicament administrée, mais de la quantité de médicaments circulant dans le sang auxquelles les tumeurs cancéreuses sont exposées et qui varient beaucoup d'un patient à l'autre. A cet effet, nous avons développé une méthode par chromatographie couplée à la spectrométrie de masse pour mesurer chez les patients les taux de médicaments de la classe des TKIs dans la perspective de piloter le traitement par une approche de suivi thérapeutique (Therapeutic Drug Monitoring, TDM). Le TDM repose sur la mesure de la quantité de médicament dans le sang d'un patient dans le but d'adapter individuellement la posologie la plus appropriée: des quantités insuffisantes de médicament dans le sang peuvent conduire à un échec thérapeutique alors qu'un taux sanguin excessif peut entraîner des manifestations toxiques.Dans une seconde partie préclinique, nous nous sommes concentrés sur l'optimisation de la chimiothérapie loco-régionale dans un modèle de sarcome du poumon chez le rat, afin d'augmenter l'exposition dans la tumeur tout en réduisant la toxicité dans les tissus non affectés.La perfusion isolée du poumon (ILP) permet d'administrer un médicament anticancéreux cytotoxique comme la doxorubicine, sélectivement au niveau le tissu pulmonaire où sont généralement localisées les métastases de sarcome. L'administration par ILP de doxorubicine, toxique pour le coeur, a permis une forte accumulation des médicaments dans le poumon, tout en épargnant le coeur. Il a été malheureusement constaté que la doxorubicine ne pénètre que faiblement dans la tumeur sarcomateuse, témoignant des réponses cliniques décevantes observées avec cette approche en clinique. Nous avons ainsi étudié l'impact sur la pénétration tumorale de l'association d'une chimiothérapie cytotoxique avec la thérapie photodynamique (PDT) qui consiste en l'irradiation spécifique du tissu-cible cancéreux, après l'administration d'un agent photosensibilisateur. Dans ce modèle animal, nous avons observé qu'un traitement par PDT permet effectivement d'augmenter de façon sélective l'accumulation de doxorubicine dans les tumeurs lors d'administration intraveineuse de médicament.

Neural crest cell survival is dependent on Rho kinase and is required for development of the mid face in mouse embryos.

Neural crest cells (NCC) give rise to much of the tissue that forms the vertebrate head and face, including cartilage and bone, cranial ganglia and teeth. In this study we show that conditional expression of a dominant-negative (DN) form of Rho kinase (Rock) in mouse NCC results in severe hypoplasia of the frontonasal processes and first pharyngeal arch, ultimately resulting in reduction of the maxilla and nasal bones and severe craniofacial clefting affecting the nose, palate and lip. These defects resemble frontonasal dysplasia in humans. Disruption of the actin cytoskeleton, which leads to abnormalities in cell-matrix attachment, is seen in the RockDN;Wnt1-cre mutant embryos. This leads to elevated cell death, resulting in NCC deficiency and hypoplastic NCC-derived craniofacial structures. Rock is thus essential for survival of NCC that form the craniofacial region. We propose that reduced NCC numbers in the frontonasal processes and first pharyngeal arch, resulting from exacerbated cell death, may be the common mechanism underlying frontonasal dysplasia.

Antigen Receptor Signaling to NF-kappa B via CARMA1, BCL10, and MALT1

The signaling pathway controlling antigen receptor-induced regulation of the transcription factor NF-kappa B plays a key role in lymphocyte activation and development and the generation of lymphomas. Work of the past decade has led to dramatic progress in the identification and characterization of new players in the pathway. Moreover, novel enzymatic activities relevant for this pathway have been discovered, which represent interesting drug targets for immuno-suppression or lymphoma treatment. Here, we summarize these findings and give an outlook on interesting open issues that need to be addressed in the future.

Identification of CARDIAK, a RIP-like kinase that associates with caspase-1.

Members of the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily have an important role in the induction of cellular signals resulting in cell growth, differentiation and death. TNFR-1 recruits and assembles a signaling complex containing a number of death domain (DD)-containing proteins, including the adaptor protein TRADD and the serine/threonine kinase RIP, which mediates TNF-induced NF-kappa B activation. RIP also recruits caspase-2 to the TNFR-1 signaling complex via the adaptor protein RAIDD, which contains a DD and a caspase-recruiting domain (CARD). Here, we have identified a RIP-like kinase, termed CARDIAK (for CARD-containing interleukin (IL)-1 beta converting enzyme (ICE) associated kinase), which contains a serine/threonine kinase domain and a carboxy-terminal CARD. Overexpression of CARDIAK induced the activation of both NF-kappa B and Jun N-terminal kinase (JNK). CARDIAK interacted with the TNFR-associated factors TRAF-1 and TRAF-2, and a dominant-negative form of TRAF-2 inhibited CARDIAK-induced NF-kappa B activation. Interestingly, CARDIAK specifically interacted with the CARD of caspase-1 (previously known as ICE), and this interaction correlated with the processing of pro-caspase-1 and the formation of the active p20 subunit of caspase-1. Together, these data suggest that CARDIAK may be involved in NF-kappa B/JNK signaling and in the generation of the proinflammatory cytokine IL-1 beta through activation of caspase-1.

Roles of PPARβ and PPARγ in mouse placental development

RESUME Les gènes des PPARs jouent des rôles importants dans la régulation du métabolisme énergétique, lipidique et glucidique. Le présent travail, caractérise et analyse les défauts placentaires responsables de la mort embryonnaire des souris mutantes pour PPARβ et pour PPARγ, entre le jour E9.5 et E10.5. Les placentas issus d'embryons PPARP présentent un sévère retard de croissance, alors que les placentas mutants PPARγ montrent de graves défauts vasculaires. Nous montrons que les placentas issus d'embryons PPARβ-/-, au jour E9.5 présentent une réduction prononcée de la couche de cellules géantes, associée à une diminution des niveaux de protéines exprimées par les cellules géantes, tel que le placenta lactogène-I et la « proliferin ». Par ailleurs, nous montrons que le traitement d'un lignée trophoblastique par un ligand spécifique de PPARP augmente considérablement leur différentiation en cellules géantes. Cette différentiation dépendante de la voie de signalisation P13-kinase, s'accompagne d'une élévation de l'expression de l'ADRP, une protéine de structure associée aux vésicules lipidiques. Ainsi nous démontrons que PPAR5 est un régulateur majeur de la différentiation des cellules géantes, lesquelles sont primordiales aussi bien pour l'établissement de la structure placentaire, que pour la fonction endocrine. Par contre, les placentas PPARγ-/- présentent un défaut de vascularisation. Le niveau d'une protéine anti-angiogénique, la « proliferin-related protein », est très basse et ne peut pas contre-balancer l'élévation normale de la protéine pro-angiogénique « proliferin ». La formation des vaisseaux se trouve alors altérée. Ainsi, PPARγ constitue un régulateur majeur de l'activité anti-angiogénique. En conclusion, ce travail fournit de nouveaux éléments sur le rôle complémentaires de PPARβet PPARγ dans les événements complexes qui régissent le développement placentaire. SUMMARY Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) are nuclear hormone receptors involved in energy homeostasis and growth. Herein, we characterize the placental defects that cause embryonic lethality around E9.5/E10.5 in PPARβ- and in PPARγ-deficient mouse lines. Most but not all PPARβ-null mutants die around E9.5/E10.5 with severe growth retardation. The placentas from PPARβ-/- embryos at E9.5 exhibit a strongly reduced giant cell layer, associated with reduced levels of proteins expressed by giant cells such as Placental lactogen-I and Proliferin. Ectopic treatment of a rat trophoblast cell line with PPARβ ligand markedly accelerated PI3 kinase-dependent giant cell differentiation. In addition, we demonstrate that ADRP, a pen-related lipid droplet-bound protein, is up-regulated by PPARβ in differentiated Rcho-1 cells. These results indicate that PPARβ is a crucial regulator of the differentiation secondary giant cells, which play a major role in the establishment of the placental structure as well as an important endocrine function. In contrast, the main alteration of the PPARγ-null placentas concerns the vasculogenesis. We show that in these placentas, the level of the anti-angiogenic proliferin-related protein is very low, and cannot balance the normal elevation of the pro-angiogenic proliferin expression, leading to the defective placental vessel formation. Consistently, the dramatic increase of PPARγ expression in late stage of gestation in wild-type mice is likely a major regulator of the anti-angiogenic activity, particularly important at the end of the pregnancy. This work emphasizes the important and complementary roles of PPARβ and PPARγ in mouse placental development and provides new tools for understanding the complex regulatory events that governs placental development and function. Understanding the function of PPARβ and PPARγ are of crucial interest with respect to human placental development and associated pathologies.

Analyse fonctionnelle et moléculaire d'un nouveau gène (VIT32) impliqué dans le mécanisme d'action de la vasopressine

Résumé Les mécanismes de régulation de la réabsorption fine du sodium dans la partie distale (tube distal et tube collecteur) du néphron ont un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie de la composition ionique et du volume des fluides extracellulaires. Ces mécanismes permettent le maintien de la pression sanguine. Dans la cellule principale du tube collecteur cortical (CCD), le taux de réabsorption de sodium dépend essentiellement de l'activité du canal épithélial à sodium (ENaC) à la membrane apicale et de la pompe sodium-potassium-adénosine-triphosphatase (Na+-K±ATPase) à la membrane basolatérale. L'activité de ces deux molécules de transport est en partie régulée par des hormones dont l'aldostérone, la vasopressine et l'insuline. Dans les cellules principales de CCD, la vasopressine régule le transport de sodium en deux étapes : une étape précoce dite « non-génomique » et une étape tardive dite « génotnique ». Durant l'étape précoce, la vasopressine régule l'expression de gènes, dont certains peuvent être impliqués dans le transport de sodium, comme ENaC et la Na+ -K+ATP ase. Le but de mon travail a été d'étudier l'implication d'une protéine appelée VIP32 (vasopressin induced protein : VIP) dans le transport de sodium. L'expression de VIP32 est augmentée par la vasopressine dans les cellules principales de CCD. Dans l'ovocyte de Xenopus laevis utilisé comme système d'expression hétérologue, nous avons montré que l'expression de VIP32 provoque la maturation méiotique de l'ovocyte par l'activation de la voie des MAPK (mitogen-activated protein kinase : MAPK) et du facteur de promotion méiotique (MPF). La co-expression d'ENaC et de VIP32 diminue l'activité d'ENaC de façon sélective, par l'activation de la voie des MAPK, sans affecter l'expression du canal à la surface membranaire. Nous avons également montré que la régulation de l'activité d'ENaC par la voie des MAPK est dépendante du mécanisme de régulation d'ENaC lié à un motif du canal appelé PY. Ce motif est impliqué dans le contrôle de la probabilité d'ouverture ainsi que l'expression à la surface membranaire d'ENaC. Dans les cellules principales, VIP32 par l'activation de la voie des MAPK peut être impliqué dans la régulation négative du transport transépithélial qui a lieu après plusieurs heures de traitement à la vasopressine. Le tube collecteur de reins normaux présente un taux basal significatif d'activité de la voie MAPK MEK1/2-ERK1/2. Dans la lignée mpkCCDc14 de cellules principales de CCD de souris, que nous avons utilisé pour cette partie du travail, nous avons montré la présence d'un taux basal d'activité d'ERK1/2 (pERK1/2). L'aldostérone et la vasopressine, connus pour stimuler le courant sodique transépithélial dans le CCD, ne changeaient pas le taux basal de pERK1/2. Le transport de sodium transépithélial basal, ou stimulé par l'aldostérone ou la vasopressine est diminué par l'effet de PD98059, un inhibiteur de MEK1/2 qui diminue parallèlement le taux de pERK1/2. Nous avons également montré dans des cellules non stimulées, ou stimulées par de l'aldostérone ou de la vasopressine, que l'activité de la Na+-K+ ATPase, mais pas celle d'ENaC est inhibée par des traitements avec différents inhibiteurs de MEK1/2. Par un marquage de la Na±-K+ATPase à la surface membranaire nous avons montré que la voie d'ERK1/2 contrôle l'activité intrinsèque de la Na+-K+ ATPase, plutôt que son expression à la surface membranaire. Ces données ont montré que l'activité de la Na+-K+ATPase et le transport transépithélial de sodium sont contrôlés par l'activité basal et constitutive de la voie d'ERK1/2. Summary The regulation of sodium reabsorption in the distal nephron (distal tubule and cortical collecting duct) in the kidney plays an essential role in the control of extracellular fluids composition and volume, and thereby blood pressure. In the principal cell of the collecting duct (CCD), the level of sodium reabsorption mainlly depends on the activity of both epithlial sodium channel (ENaC) and sodium-potassium-adenosine-triphosphatase (Na+-K+ATPase). The activity of these two transporters is regulated by hormones especially aldosterone, vasopressin and insuline.In the principal cell of the CCD, vasopressin regulates sodium transport via a short-term effect and a late genomic effect. During the genomic effect vasopressin activates a complex network of vasopressin-dependent genes involved in the regulation of sodium transport as ENaC and Na+-K+ATPase. We were interested in the role of a recently identified vasopressin induced protein (VIP32) and its implication in the regulation of sodium transport in principal cell of the CCD. The Xenopus oocyte expression system revealed two functions : expressed alone VIP32 rapidly induces oocyte meiotic maturation through the activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and the meiotic promoting factor and when co-expressed with ENaC, V1P32 selectively dowrn-egulates channel activity, but not channel cell surface expression. We have shown that the ENaC downregulation mediated by the activation of the MAPK pathway is related to the PY motif of ENaC. This motif is implicated in ENaC cell surface expression and open probability regulation. In the kidney principal cell, VIP32 through the activation of MAPK pathway may be involved in the downregulation of transepithelial sodium transport observed within a few hours after vasopressin treatment. The collecting duct of normal kidney exhibits significant activity of the MEK1/2-ERK1/2 MAPK pathway. Using in vitro cultured mpkCCDc14 principal cells we have shown a significant basal level of ERK1/2 activity (pERK1/2). Aldosterone and vasopressin, known to upregulate sodium reabsorption in CCDs, did not change ERK1/2 activity. Basal and aldosterone- or vasopressin-stimulated sodium transport were downregulated by the MEK1/2 inhibitor PD98059 in parallel with a decrease in pERK1/2 in vitro. The activity of Na+-K+ATPase but not that of ENaC was inhibited by MEK1/2 inhibitors in both, unstimulated and aldosterone- or vasopressin-stimulated CCDs in vitro. Cell surface labelling showed that intrinsic activity rather than cell surface expression of Na+-K+ATPase was controlled by pERK1/2. Our data demonstrate that basal constitutive activity of ERK1/2 pathway controls Na+-K+ATPase activity and transepithelial sodium transport in the principal cell. Résumé tout public Les mécanismes de régulation de la réabsorption fine du sodium dans la partie distale du néphron (l'unité fonctionnelle du rein) ont un rôle essentiel dans le maintien de l'homéostasie de la composition et du volume des fluides extracellulaires. Ces mécanismes permettent de maintenir une pression sanguine effective. Dans les cellules principales du tube collecteur, une région spécifique du néphron distal, le transport de sodium dépend essentiellement de l'activité de deux transporteurs de sodium : le canal épithélial à sodium (ENaC) et la pompe sodium-potassium-adénosine-triphosphatase (Na+-K+ATPase). Afin de répondre aux besoins de l'organisme, l'activité de ces deux molécules de transport est en partie régulée par des hormones dont l'aldostérone, la vasopressine et l'insuline. Dans les cellules principales du tube collecteur, la vasopressine régule le transport de sodium en deux étapes : une étape rapide et une étape lente dite « génomique ». Durant l'étape lente, la vasopressine régule l'expression de gènes pouvant être impliqués dans le transport de sodium, dont notamment ceux d'ENaC et de la Na+-K+ATPase. Parmi les gènes dont l'expression est augmentée par la vasopressine, celui de VIP32 (vasopressin induced protein : VIP) fait l'objet de cette étude. Le but de mon travail a été d'étudier, dans un système d'expression hétérologue (l'ovocyte de Xenopus leavis), l'implication de VIP32 dans le transport de sodium. Nous avons montré que VIP32 est capable d'activer un mécanisme moléculaire en cascade appelé MAPK (mitogen-activated protein kinase : MAPK) et est aussi capable de diminuer l'activité d'ENaC. Parallèlement, dans une lignée de cellules principales de tube collecteur les mpkCCDc14, nous avons montré que le taux basal d'activité de la cascade MAPK est capable de réguler l'activité de la Na+-K+ATPase, tandis qu'il n'influence pas l'activité d'ENaC.