Characterization of the Sterile20 kinase Slik : A regulator of growth in Drosophila

La prolifération cellulaire et la croissance tissulaire sont étroitement contrôlées au cours du développement. Chez la Drosophila melanogaster, ces processus sont régulés en partie par la kinase stérile-20 Slik (SLK et LOK chez les mammifères) et le suppresseur de tumeur Hippo (Hpo, MST1/2 chez les mammifères) dans les cellules épithéliales. La surexpression de la kinase Slik augmente la taille des tissus chez les mouches adultes. Cependant, les mutants slik-/- meurent avant d'avoir terminé leur développement. Lorsqu’elle est surexprimée dans les cellules épithéliales des ailes en voie de développement, cette protéine favorise la prolifération cellulaire. En outre, l'expression de Slik dans une population de cellules conduit à une surprolifération des cellules voisines, même quand elles sont physiquement séparées. Ceci est probablement dû à la sécrétion de facteurs de croissance qui stimulent la prolifération de manière paracrine. En utilisant des méthodes génétiques et transcriptomiques, nous essayons de déterminer les molécules et les mécanismes impliqués. Contrairement à ce qui a été publié, nous avons constaté que Slik ne transmet pas de signal prolifératif en inhibant le suppresseur de tumeur Merlin (Mer, NF2 chez les mammifères), un composant en amont de la voie Hippo. Plutôt, elle favorise la prolifération non-autonome et la croissance des tissus en signalisation par la kinase dRaf (la seule kinase de la famille Raf chez la drosophile). Nous prouvons que dRaf est nécessaire chez les cellules voisines pour conduire la prolifération chez ces cellules. De plus, nous avons utilisé le séquençage du transcriptome pour identifier de nouveaux effecteurs en aval de Slik. Ce qui permettra de mieux comprendre les effets de SLK et LOK chez les humains.

Genomic architecture of sickle cell disease clinical variation in children from West Africa : a case-control study design

Contexte : L’anémie falciforme ou drépanocytose est un problème de santé important, particulièrement pour les patients d’origine africaine. La variation phénotypique de l’anémie falciforme est problématique pour le suivi et le traitement des patients. L’architecture génomique responsable de cette variabilité est peu connue. Principe : Mieux saisir la contribution génétique de la variation clinique de cette maladie facilitera l’identification des patients à risque de développer des phénotypes sévères, ainsi que l’adaptation des soins. Objectifs : L’objectif général de cette thèse est de combler les lacunes relatives aux connaissances sur l’épidémiologie génomique de l’anémie falciforme à l’aide d’une cohorte issue au Bénin. Les objectifs spécifiques sont les suivants : 1) caractériser les profils d’expressions génomiques associés à la sévérité de l’anémie falciforme ; 2) identifier des biomarqueurs de la sévérité de l’anémie falciforme ; 3) identifier la régulation génétique des variations transcriptionelles ; 4) identifier des interactions statistiques entre le génotype et le niveau de sévérité associé à l’expression ; 5) identifier des cibles de médicaments pour améliorer l’état des patients atteints d’anémie falciforme. Méthode : Une étude cas-témoins de 250 patients et 61 frères et soeurs non-atteints a été menée au Centre de Prise en charge Médical Intégré du Nourrisson et de la Femme Enceinte atteints de Drépanocytose, au Bénin entre février et décembre 2010. Résultats : Notre analyse a montré que des profils d’expressions sont associés avec la sévérité de l’anémie falciforme. Ces profils sont enrichis de génes des voies biologiques qui contribuent à la progression de la maladie : l’activation plaquettaire, les lymphocytes B, le stress, l’inflammation et la prolifération cellulaire. Des biomarqueurs transcriptionnels ont permis de distinguer les patients ayant des niveaux de sévérité clinique différents. La régulation génétique de la variation de l’expression des gènes a été démontrée et des interactions ont été identifiées. Sur la base de ces résultats génétiques, des cibles de médicaments sont proposées. Conclusion: Ce travail de thèse permet de mieux comprendre l’impact de la génomique sur la sévérité de l’anémie falciforme et ouvre des perspectives de développement de traitements ciblés pour améliorer les soins offerts aux patients.

Les protéines Staufen et leurs rôles dans la régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes, la réponse aux dommages à l’ADN et le cycle cellulaire

Les différents mécanismes de régulation posttranscriptionnelle de l’expression des gènes sont de plus en plus reconnus comme des processus essentiels dans divers phénomènes physiologiques importants, comme la prolifération cellulaire et la réponse aux dommages à l’ADN. Deux des protéines impliquées dans ce type de régulation sont Staufen1 (Stau1) et Staufen2 (Stau2). Elles sont des protéines de liaison à l’ARN double brin qui contribuent au transport de l’ARN messager (ARNm), au contrôle de la traduction, à l’épissage alternatif et sont responsables de la dégradation de certains ARNm spécifiques. Les protéines Staufen peuvent en effet s’associer à des ARNm bien précis, d’autant plus que, majoritairement, Stau1 et Stau2 ne se retrouvent pas en complexe avec les mêmes cibles. De nombreuses évidences récentes montrent l’implication de divers mécanismes de régulation posttranscriptionnelle dans la réponse aux dommages à l’ADN, plusieurs protéines de liaison à l’ARN y participant d’ailleurs. De façon importante, cette réponse dicte un ou plusieurs destin(s) à la cellule qui doit réagir à la suite de dommages à l’intégrité de son ADN: réparation de l’ADN, arrêt de la prolifération cellulaire, apoptose. Nous avons donc fait l’hypothèse que l’expression de Stau1 et/ou de Stau2 pourrait être affectée en réponse à un stress génotoxique, ce qui pourrait avoir comme conséquence de moduler l’expression et/ou la stabilité de leurs ARNm cibles. De même, notre laboratoire a récemment observé que l’expression de Stau1 varie pendant le cycle cellulaire, celle-ci étant plus élevée jusqu’au début de la mitose (prométaphase), puis elle diminue alors que les cellules complètent leur division. Par conséquent, nous avons fait l’hypothèse que Stau1 pourrait lier des ARNm de façon différentielle dans des cellules bloquées en prométaphase et dans des cellules asynchrones. D’un côté, en employant la camptothécine (CPT), une drogue causant des dommages à l’ADN, pour traiter des cellules de la lignée de cancer colorectal HCT116, nous avons observé que seule l’expression de Stau2 est réduite de façon considérable, tant au niveau de la protéine que de l’ARNm. L’utilisation d’autres agents cytotoxiques a permis de confirmer cette observation initiale. De plus, nous avons constaté que l’expression de Stau2 est touchée même dans des conditions n’engendrant pas une réponse apoptotique, ce qui suggère que cette déplétion de Stau2 est possiblement importante pour la mise en place d’une réponse appropriée aux dommages à l’ADN. D’ailleurs, la surexpression de Stau2 conjointement avec le traitement à la CPT entraîne un retard dans l’induction de l’apoptose dans les cellules HCT116. Nous avons aussi montré que la diminution de l’expression de Stau2 est due à une régulation de sa transcription en réponse au stress génotoxique, ce pourquoi une région minimale du promoteur putatif de Stau2 est nécessaire. Également, nous avons identifié que le facteur de transcription E2F1, couramment impliqué dans la réponse aux dommages à l’ADN, peut contrôler l’expression de Stau2. Ainsi, E2F1 permet une augmentation de l’expression de Stau2 dans des cellules non traitées, mais cette hausse est abolie dans des cellules traitées à la CPT, ce qui suggère que la CPT pourrait agir en inhibant l’activation transcriptionnelle de Stau2 par E2F1. Enfin, nous avons observé que certains ARNm associés à Stau2, et codant pour des protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l’ADN et l’apoptose, sont exprimés différemment dans des cellules traitées à la CPT et des cellules non traitées. D’un autre côté, nous avons identifié les ARNm associés à Stau1 lors de la prométaphase, alors que l’expression de Stau1 est à son niveau le plus élevé pendant le cycle cellulaire, grâce à une étude à grande échelle de micropuces d’ADN dans des cellules HEK293T. Nous avons par la suite confirmé l’association entre Stau1 et certains ARNm d’intérêts, donc codant pour des protéines impliquées dans la régulation de la prolifération cellulaire et/ou le déroulement de la mitose. Une comparaison de la liaison de ces ARNm à Stau1 dans des cellules bloquées en prométaphase par rapport à des cellules asynchrones nous a permis de constater une association préférentielle dans les cellules en prométaphase. Ceci suggère une augmentation potentielle de la régulation de ces ARNm par Stau1 à ce moment du cycle cellulaire. Les données présentées dans cette thèse indiquent vraisemblablement que la régulation posttranscriptionnelle de l’expression génique contrôlée par les protéines Staufen se fait en partie grâce à la modulation de l’expression de Stau1 et de Stau2 en fonction des conditions cellulaires. Nous envisageons alors que cette variation de l’expression des protéines Staufen ait des conséquences sur des sous-ensembles d’ARNm auxquels elles sont liées et que de cette façon, elles jouent un rôle pour réguler des processus physiologiques essentiels comme la réponse aux dommages à l’ADN et la progression dans le cycle cellulaire.

Investigation of the structure and dynamics of the centromeric epigenetic mark

Le centromère est le site chromosomal où le kinetochore se forme, afin d’assurer une ségrégation fidèles des chromosomes et ainsi maintenir la ploïdie appropriée lors de la mitose. L’identité du centromere est héritée par un mécanisme épigénétique impliquant une variante de l’histone H3 nommée centromere protein-A (CENP-A), qui remplace l’histone H3 au niveau de la chromatine du centromère. Des erreurs de propagation de la chromatine du centromère peuvent mener à des problèmes de ségrégation des chromosomes, pouvant entraîner l’aneuploïdie, un phénomène fréquemment observé dans le cancer. De plus, une expression non-régulée de CENP-A a aussi été rapportée dans différentes tumeurs humaines. Ainsi, plusieurs études ont cherchées à élucider la structure et le rôle de la chromatine contenant CENP-A dans des cellules en prolifération. Toutefois, la nature moléculaire de CENP-A en tant que marqueur épigénétique ainsi que ces dynamiques à l'extérieur du cycle cellulaire demeurent des sujets débat. Dans cette thèse, une nouvelle méthode de comptage de molécules uniques à l'aide de la microscopie à réflexion totale interne de la fluorescence (TIRF) sera décrite, puis exploitée afin d'élucider la composition moléculaire des nucléosomes contenant CENP-A, extraits de cellules en prolifération. Nous démontrons que les nucléosomes contenant CENP-A marquent les centromères humains de façon épigénétique à travers le cycle cellulaire. De plus, nos données démontrent que la forme prénucléosomale de CENP-A, en association avec la protéine chaperon HJURP existe sous forme de monomère et de dimère, ce qui reflète une étape intermédiaire de l'assemblage de nucléosomes contenant CENP-A. Ensuite, des analyses quantitatives de centromères lors de différenciation myogénique, et dans différents tissus adultes révèlent des changements globaux qui maintiennent la marque épigénétique dans une forme inactive suite à la différentiation terminale. Ces changements incluent une réduction du nombre de points focaux de CENP-A, un réarrangement des points dans le noyau, ainsi qu'une réduction importante de la quantité de CENP-A. De plus, nous démontrons que lorsqu'une dédifférenciation cellulaire est induite puis le cycle cellulaire ré-entamé, le phénotype "différencié" décrit ci-haut est récupéré, et les centromères reprennent leur phénotype "prolifératif". En somme, cet oeuvre décrit la composition structurale sous-jacente à l'identité épigénétique des centromères de cellules humaines lors du cycle cellulaire, et met en lumière le rôle de CENP-A à l'extérieur du cycle cellulaire.

Fonctions antitumorales de la voie ERK/MAPK et développement rationnel de nouvelles stratégies thérapeutiques

Les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) régulent une multitude de processus cellulaires, incluant la prolifération, la survie et la différenciation. Ces kinases représentent l’élément terminal de la voie ERK/MAPK, laquelle est activée dans près de 30% de tous les cancers humains et donc généralement perçue comme étant un effecteur critique de la progression tumorale. Cependant, une accumulation d’observations suggèrent que les kinases ERK pourraient également induire la suppression tumorale. Le but premier de cette thèse est de démontrer comment la signalisation par ERK peut contribuer à la suppression tumorale et de concilier les mécanismes impliqués avec son rôle dans la progression du cancer. Puisque nos travaux ont une incidence sur les bénéfices attendus de certaines thérapies actuellement en développement, le deuxième objectif de la thèse est de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre le cancer. Nous avons démontré qu’une hyperactivation des kinases ERK induit la sénescence cellulaire. Le mécanisme implique la dégradation sélective et dépendante du protéasome de nombreuses protéines, ce que nous avons nommé le SAPD (Senescence-Associated Protein Degradation). Ce processus cible des protéines requises pour différentes fonctions cellulaires, incluant la progression du cycle cellulaire, les fonctions mitochondriales et la biogenèse des ribosomes. Ensuite, nos résultats montrent qu’en plus d’inhiber l’établissement de la sénescence, une diminution de la signalisation par les kinases ERK favorise la reprogrammation cellulaire, laquelle permet aux cellules précancéreuses de développer leur tumorigénicité et aux cellules cancéreuses d’acquérir des propriétés attribuables aux cellules souches. Ces observations suggèrent que les mécanismes qui inhibent la voie ERK/MAPK pourraient favoriser l’initiation du cancer, la formation de métastases et la résistance à diverses thérapies. Enfin, nous avons démontré que la metformine, utilisée pour le traitement du diabète, inhibe le facteur de transcription NF-kB. Ce dernier joue un rôle central dans la reprogrammation cellulaire et dans la production de cytokines pro-inflammatoires nocives par les cellules sénescentes. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que la metformine pourrait être utilisée en combinaison avec certaines thérapies afin d’éviter les effets secondaires tant d’une inhibition des kinases ERK que d’une hyperactivation. Globalement, les résultats présentés démontrent que l’effet de la voie ERK/MAPK dépend de la force de son activation. Alors qu’une activation modérée peut contribuer à la prolifération de la plupart des cellules, une forte activation induit la sénescence tandis qu’au contraire, une faible activation favorise la reprogrammation des cellules cancéreuses et donc une augmentation de l’agressivité de la tumeur. Cette polyvalence de la voie suggère une certaine prudence face à l’usage des inhibiteurs de la voie ERK/MAPK. Cependant, elle nous motive à travailler au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, lesquelles pourraient inclure la metformine.

Le devoir syndical de représentation sous l'angle de la Charte des droits et libertés de la personne: le cas des clauses" orphelin"

En raison des présentes transformations du marché du travail, le mouvement syndical est à la recherche d’un nouvel équilibre. Dans ce contexte plutôt changeant, réorganisations et flexibilité se négocient en échange d’une protection accrue pour ceux qui demeurent en emploi. Si d’une part, ceci mène à une prolifération de nouvelles formes d’emploi atypiques et de disparités de traitement, d’autre part la constitutionnalisation du droit du travail change le rapport quant à l’universalisme syndical. Nous nous sommes alors interrogée sur les impacts que cela peut avoir sur le devoir syndical de représentation. Prenant cela en considération, nous avons voulu au cours de notre recherche faire la lumière tant sur certains impacts de la négociation de clauses de disparité de traitement dans les milieux de travail syndiqués que sur les défis contemporains du droit du travail et de l’emploi. Cette thèse propre au champ d’études que sont les relations industrielles se distingue des autres recherches dans le même domaine en se concentrant sur l’effet empirique de la mise en œuvre d’une norme, par l’étude de deux cas suggestifs. Plus précisément, notre thèse avait comme principal objectif de répondre à la question suivante : Quels sont les effets sur l’acteur (action) syndical du recours à la norme d’égalité, à la suite la négociation de clauses « orphelin »? Pour y parvenir, nous avons dû reconstituer comment les acteurs syndicaux s’étaient approprié l’espace ouvert par la constitutionnalisation du droit du travail. Nous avons utilisé une méthode qualitative, impliquant une revue de la littérature sociohistorique, théorique et juridique, une analyse de la jurisprudence existant à ce sujet et l’étude de deux cas portant sur la négociation d’une clause « orphelin » le tout représentant soixante entrevues semi-dirigées dans plusieurs casernes et palais de justice. Les connaissances acquises permettent au plan empirique une meilleure compréhension des interactions possibles entre acteurs, institutions et stratégies lors de la mise en œuvre de la norme d’égalité ainsi que des déterminants de l’action (ou de l’inaction) syndicale. Sur le plan pratique, nous espérons que notre thèse puisse guider toute personne ou tout groupe de personnes désirant mettre en œuvre des mesures égalitaires, tant pour éviter certains écueils reliés à ces actions ou réactions suscitées par la mise en œuvre du droit à l’égalité, que pour mesurer l’efficacité des actions entreprises. De surcroît, sur le plan théorique, nous croyons que de mettre à l’épreuve un modèle théorique recoupant stratégies et institutions permettra d’aborder les problèmes à la fois au niveau de l’acteur et au niveau structurel. Les résultats obtenus aident à comprendre en quoi et comment peut se construire l’action syndicale dans certains (2) cas de mise en œuvre de la norme d’égalité. Le choix de différentes stratégies ne peut pas être dissocié des différents contextes économiques, sociaux et juridiques, ni des capacités stratégiques des différents acteurs en cause. Les principales contraintes identifiées ont pu être imputées tant aux structures de l’association syndicale qu’aux différents univers normatifs mobilisés. Les sources de tensions vécues dans les milieux à l’étude ont été rattachées notamment aux perceptions d’injustice et à la méconnaissance des différentes normes juridiques. En conséquence, il faut conclure que pour les associations syndicales (sans se restreindre à celles à l’étude), la question d’iniquité pourrait avoir de graves conséquences et non seulement sur le devoir de représentation. Nous avons spécialement souligné la fragilisation de leurs assises, dans leurs deux pôles d’actions : d’acteur économique (faille dans la capacité d’action traditionnelle) et d’acteur politique (climat hostile au syndicalisme). Nous souhaitons que l’acteur syndical puisse mobiliser, à la lumière des résultats de notre recherche, des arguments concourant à repenser l’action syndicale, que nous croyons être plus pertinente que jamais. Nous croyons également que les différents acteurs du monde du travail pourraient s’approprier certaines de nos recommandations afin de favoriser une citoyenneté au travail plus inclusive.

Evaluating DNA damage response (DDR) activation in human prostate cancer

Introduction: Au Canada, le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les hommes et le plus mortel après les cancers du poumon et du côlon. Il y a place à optimiser le traitement du cancer de la prostate de manière à mettre en œuvre une médecine personnalisée qui s’adapte aux caractéristiques de la maladie de chaque patient de façon individuelle. Dans ce mémoire, nous avons évalué la réponse aux dommages de l’ADN (RDA) comme biomarqueur potentiel du cancer de la prostate. Les lésions potentiellement oncogènes de l'ADN déclenche une cascade de signalisation favorisant la réparation de l'ADN et l’activation des points de contrôle du cycle cellulaire pour préserver l’intégrité du génome. La RDA est un mécanisme central de suppression tumorale chez l’homme. La RDA joue un rôle important dans l’arrêt de la prolifération des cellules dont les génomes sont compromis, et donc, prévient la progression du cancer en agissant comme une barrière. Cette réponse cellulaire détermine également comment les cellules normales et cancéreuses réagissent aux agents utilisés pour endommager l'ADN lors du traitement du cancer comme la radiothérapie ou la chimiothérapie, en plus la présence d,un certain niveau de RDA dans les cellules du cancer de la prostate peuvent également influer sur l'issue de ces traitements. L’activation des signaux de la RDA peut agir comme un frein au cancer dans plusieurs lésions pré-néoplasiques de l'homme, y compris le cancer de la prostate. Il a été démontré que la RDA est augmentée dans les cellules de néoplasie intra- épithéliale (PIN) comparativement aux cellules prostatiques normales. Toutefois, le devient de la RDA entre le PIN et l’adénocarcinome est encore mal documenté et aucune corrélation n'a été réalisée avec les données cliniques des patients. Notre hypothèse est que les niveaux d’activation de la RDA seront variables selon les différents grades et agressivité du cancer de la prostate. Ces niveaux pourront être corrélés et possiblement prédire les réponses cliniques aux traitements des patients et aider à définir une stratégie plus efficace et de nouveaux biomarqueurs pour prédire les résultats du traitement et personnaliser les traitements en conséquence. Nos objectifs sont de caractériser l'activation de la RDA dans le carcinome de la prostate et corréler ses données avec les résultats cliniques. Méthodes : Nous avons utilisé des micro-étalages de tissus (tissue microarrays- TMAs) de 300 patients ayant subi une prostatectomie radicale pour un cancer de la prostate et déterminé le niveau d’expression de protéines de RDA dans le compartiment stromal et épithélial des tissus normaux et cancéreux. Les niveaux d’expression de 53BP1, p-H2AX, p65 et p-CHK2 ont été quantifiés par immunofluorescence (IF) et par un logiciel automatisé. Ces marqueurs de RDA ont d’abord été validés sur des TMAs-cellule constitués de cellules de fibroblastes normales ou irradiées (pour induire une activation du RDA). Les données ont été quantifiées à l'aide de couches binaires couramment utilisées pour classer les pixels d'une image pour que l’analyse se fasse de manière indépendante permettant la détection de plusieurs régions morphologiques tels que le noyau, l'épithélium et le stroma. Des opérations arithmétiques ont ensuite été réalisées pour obtenir des valeurs correspondant à l'activation de la RDA qui ont ensuite été corrélées à la récidive biochimique et l'apparition de métastases osseuses. Résultats : De faibles niveaux d'expression de la protéine p65 dans le compartiment nucléaire épithélial du tissu normal de la prostate sont associés à un faible risque de récidive biochimique. Par ailleurs, nous avons aussi observé que de faibles niveaux d'expression de la protéine 53BP1 dans le compartiment nucléaire épithéliale du tissu prostatique normal et cancéreux ont été associés à une plus faible incidence de métastases osseuses. Conclusion: Ces résultats confirment que p65 a une valeur pronostique chez les patients présentant un adénocarcinome de la prostate. Ces résultats suggèrent également que le marqueur 53BP1 peut aussi avoir une valeur pronostique chez les patients avec le cancer de la prostate. La validation d'autres marqueurs de RDA pourront également être corrélés aux résultats cliniques. De plus, avec un suivi des patients plus long, il se peut que ces résultats se traduisent par une corrélation avec la survie. Les niveaux d'activité de la RDA pourront éventuellement être utilisés en clinique dans le cadre du profil du patient comme le sont actuellement l’antigène prostatique spécifique (APS) ou le Gleason afin de personnaliser le traitement.

Étude des mécanismes moléculaires impliquant l'homéoprotéine MEIS1 dans le développement de leucémies myéloïdes aigües

Les leucémies myéloïdes aigües résultent d’un dérèglement du processus de l’hématopoïèse et regroupent des maladies hétérogènes qui présentent des profils cliniques et génétiques variés. La compréhension des processus cellulaires responsables de l’initiation et du maintien de ces cancers permettrait de développer des outils thérapeutiques efficaces et ciblés. Au cours des dernières années, une quantité croissante d’anomalies génétiques reliées au développement de leucémies ont été corrélées à une expression anormale des gènes HOX et de leurs cofacteurs MEIS et PBX. Des modèles expérimentaux murins ont confirmé le rôle direct joué par ces protéines dans le développement de leucémies. En effet, la protéine MEIS1 collabore avec HOXA9 dans la leucémogenèse et requiert pour ce faire trois domaines distincts. Deux de ces domaines sont conservés chez PREP1, un membre de la même classe d’homéoprotéine que MEIS1. En utilisant une approche de gain-de-fonction, j’ai confirmé l’importance du rôle joué par le domaine C-terminal de MEIS1 dans l’accélération des leucémies induites par HOXA9. J’ai également montré que l’activité de ce domaine était corrélée avec une signature transcriptionnelle associée à la prolifération cellulaire. J’ai ensuite réalisé un criblage à haut débit afin d’identifier des antagonistes de l’interaction MEIS-PBX, également essentielle à l’accélération des leucémies HOX. À cette fin, j’ai développé un essai de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) permettant de détecter la dimérisation MEIS-PBX dans les cellules vivantes. Plus de 115 000 composés chimiques ont été testés et suite à une confirmation par un essai orthogonal, une vingtaine de molécules ont été identifiées comme inhibiteurs potentiels. Ces composés pourront être rapidement testés sur la prolifération de cellules leucémiques primaires dans un contexte d’étude préclinique. Finalement, deux approches protéomiques complémentaires ont permis d’identifier des partenaires potentiels de MEIS1 et PREP1. La catégorisation fonctionnelle de ces candidats suggère un nouveau rôle pour ces homéoprotéines dans l’épissage de l’ARN et dans la reconnaissance de l’ADN méthylé.

Cell lines and animal model in the analysis of pharmacogenomics markers in childhood acute lymphoblastic leukemia

La leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) est le cancer pédiatrique le plus fréquent. Elle est la cause principale de mortalité liée au cancer chez les enfants due à un groupe de patient ne répondant pas au traitement. Les patients peuvent aussi souffrir de plusieurs toxicités associées à un traitement intensif de chimiothérapie. Les études en pharmacogénétique de notre groupe ont montré une corrélation tant individuelle que combinée entre les variants génétiques particuliers d’enzymes dépendantes du folate, particulièrement la dihydrofolate réductase (DHFR) ainsi que la thymidylate synthase (TS), principales cibles du méthotrexate (MTX) et le risque élevé de rechute chez les patients atteints de la LAL. En outre, des variations dans le gène ATF5 impliqué dans la régulation de l’asparagine synthetase (ASNS) sont associées à un risque plus élevé de rechute ou à une toxicité ASNase dépendante chez les patients ayant reçu de l’asparaginase d’E.coli (ASNase). Le but principal de mon projet de thèse est de comprendre davantage d’un point de vue fonctionnel, le rôle de variations génétiques dans la réponse thérapeutique chez les patients atteints de la LAL, en se concentrant sur deux composants majeurs du traitement de la LAL soit le MTX ainsi que l’ASNase. Mon objectif spécifique était d’analyser une association trouvée dans des paramètres cliniques par le biais d’essais de prolifération cellulaire de lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCLs, n=93) et d’un modèle murin de xénogreffe de la LAL. Une variation génétique dans le polymorphisme TS (homozygosité de l’allèle de la répétition triple 3R) ainsi que l’haplotype *1b de DHFR (défini par une combinaison particulière d’allèle dérivé de six sites polymorphiques dans le promoteur majeur et mineur de DHFR) et de leurs effets sur la sensibilité au MTX ont été évalués par le biais d’essais de prolifération cellulaire. Des essais in vitro similaires sur la réponse à l’ASNase de E. Coli ont permis d’évaluer l’effet de la variation T1562C de la région 5’UTR de ATF5 ainsi que des haplotypes particuliers du gène ASNS (définis par deux variations génétiques et arbitrairement appelés haplotype *1). Le modèle murin de xénogreffe ont été utilisé pour évaluer l’effet du génotype 3R3R du gène TS. L’analyse de polymorphismes additionnels dans le gène ASNS a révélé une diversification de l’haplotype *1 en 5 sous-types définis par deux polymorphismes (rs10486009 et rs6971012,) et corrélé avec la sensibilité in vitro à l’ASNase et l’un d’eux (rs10486009) semble particulièrement important dans la réduction de la sensibilité in vitro à l’ASNase, pouvant expliquer une sensibilité réduite de l’haplotype *1 dans des paramètres cliniques. Aucune association entre ATF5 T1562C et des essais de prolifération cellulaire en réponse à ASNase de E.Coli n’a été détectée. Nous n’avons pas détecté une association liée au génotype lors d’analyse in vitro de sensibilité au MTX. Par contre, des résultats in vivo issus de modèle murin de xénogreffe ont montré une relation entre le génotype TS 3R/3R et la résistance de manière dose-dépendante au traitement par MTX. Les résultats obtenus ont permis de fournir une explication concernant un haut risque significatif de rechute rencontré chez les patients au génotype TS 3R/3R et suggèrent que ces patients pourraient recevoir une augmentation de leur dose de MTX. À travers ces expériences, nous avons aussi démontré que les modèles murins de xénogreffe peuvent servir comme outil préclinique afin d’explorer l’option d’un traitement individualisé. En conclusion, la connaissance acquise à travers mon projet de thèse a permis de confirmer et/ou d’identifier quelques variants dans la voix d’action du MTX et de l’ASNase qui pourraient faciliter la mise en place de stratégies d’individualisation de la dose, permettant la sélection d’un traitement optimum ou moduler la thérapie basé sur la génétique individuelle.

Découverte de cellules souches potentielles de l’épithélium thymique

Le thymus subit un vieillissement précoce, appelé involution thymique, qui cause une perte de fonction du thymus avec l’âge. À ce jour, les mécanismes de renouvellement des cellules épithéliales thymiques (TECs) sont encore mal compris, c’est pourquoi nous avons voulu identifier les cellules souches de l’épithélium thymique. Comme les cellules souches sont quiescentes dans plusieurs tissus, les objectifs de notre étude étaient de déterminer si l’épithélium thymique contenait des cellules quiescentes et d’étudier la cinétique de prolifération des TECs chez les souris jeunes et adultes. Pour ce faire, nous avons utilisé une souris transgénique (H2B-GFP Tet-On) nous permettant d’identifier les cellules ne se divisant pas sur une longue période de temps (LRC, label-retaining cells¬). Nous avons d’abord montré que les TECs proliféraient plus rapidement chez les femelles que les mâles. De plus, nous avons trouvé plusieurs différences entre l’épithélium thymique post-natal et adulte : (1) les TECs corticales (cTECs) et médullaires (mTECs) ont un taux de prolifération similaire chez les jeunes souris, mais chez l’adulte, les cTECs prolifèrent plus lentement que les mTECs; (2) les TECs prolifèrent plus rapidement chez les souris jeunes que adultes; (3) des LRC sont détectées chez l’adulte, mais pas chez les jeunes souris. Les LRC, retrouvées dans le compartiment cTEC, sous-expriment des gènes associés à la sénescence et surexpriment des gènes importants pour le développement et le renouvellement des TECs. Ces résultats montrent que ces cellules sont quiescentes et suggèrent qu’elles pourraient bel et bien être les progéniteurs thymiques responsables du renouvellement des TECs adultes.

Early growth response protein 1 (Egr-1) expression by Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) involves MAPKs and PKB pathways

Un remodelage vasculaire anormal est à la base de la pathogenèse des maladies cardio-vasculaires (MCV) telles que l’athérosclérose et l’hypertension. Des dysfonctionnements au niveau de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires qui jouent un rôle primordial dans le remodelage vasculaire. L’insulin-like growth factor 1 (IGF-1), puissant facteur mitogène, contribue au développement des MCV, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, composantes clés impliquées dans les voies de croissance cellulaire. Ces molécules sont également impliquées dans la modulation de l’expression de nombreux facteurs de transcription, incluant le facteur Egr-1. Egr-1 est régulé à la hausse dans différents types de maladies vasculaires impliquant les voies de signalisation de croissance et de stress oxydant qui par ailleurs peuvent être déclenchées par l’IGF-1. Cependant, la question d’une possible modulation de l’expression d’Egr-1 dans les CMLV demeure inabordée; plus spécifiquement, la caractérisation de la voie de signalisation reliant l’action d’IGF-1 à l’expression d’Egr-1 reste à établir. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’implication de MAPK, PKB et des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO) dans l’expression d’Egr-1 induite par l’IGF-1 dans les CMLV. L’IGF-1 a induit une augmentation marquée du niveau protéique de l’Egr-1 en fonction du temps et de la concentration utilisés. Cette augmentation a été inhibée en fonction des doses d’agents pharmacologiques qui ciblent les voies de signalisation de MAPK, PKB et DRO. De plus, l’expression du facteur de transcription, Egr-1, en réponse de l’IGF-1, a été atténuée suite à un blocage pharmacologique des processus cellulaires responsables de la synthèse d’ARN et de synthèse protéique. Pour conclure, on a démontré que l’IGF-1 stimule l’expression d’Egr-1 via les voies de signalisation, impliquant ERK1/2/JNK, PI3K/PKB. On a également proposé que les DRO jouent un rôle important dans ce processus. Dans l’ensemble, nous avons suggéré un nouveau mécanisme par lequel l’IGF-1 promeut la prolifération et l’hypertrophie cellulaire, processus à la base des anomalies vasculaires.

Régulation du métabolisme des ARNm par les voies de signalisation MAPK et mTOR

Il est à ce jour bien établi que la régulation de l’expression génique dépend en grande partie des évènements post-transcriptionnels et que la traduction des ARNm tient un rôle de premier plan dans ces processus. Elle est particulièrement importante pour définir le protéome, maintenir l’homéostasie et contrôler la croissance et la prolifération cellulaire. De nombreuses pathologies humaines telles que le cancer découlent de dérèglements de la synthèse protéique. Ceci souligne l’importance d’une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires contribuant au contrôle de la traduction des ARNm. Le facteur d’initiation eIF4E est essentiel à la traduction et son activité est régulée par ses partenaires protéiques dont font partie les protéines 4E-BP et 4E-T. Les voies de signalisation PI3K/mTOR et MAPK qui sont fortement impliquées dans l’étiologie du cancer, contrôlent la traduction en modulant l’activité d’eIF4E via l’inhibition des protéines 4E-BP et la localisation de 4E-T. Afin d’améliorer notre compréhension des mécanismes régulant la traduction des ARNm, nous avons utilisé plusieurs approches. Tout d’abord, nous avons caractérisé les mécanismes par lesquels le complexe mTORC1 est activé en réponse aux facteurs de croissance et avons déterminé que la kinase RSK, en aval de la voie Ras/ERK, contrôle directement l’activité de mTORC1 en phosphorylant Raptor, la sous-unité régulatrice du complexe mTORC1. Par ailleurs, nous nous sommes intéressés au rôle joué par mTORC1 dans l’initiation de la traduction. Pour cela, nous avons réalisé un criblage protéomique dans le but d’identifier de nouveaux facteurs sous le contrôle de mTORC1 qui participent activement à la traduction. Ces travaux ont ainsi permis l’identification de la protéine de liaison à l’ARN LARP1 comme effecteur majeur de la traduction des ARNm et de la croissance cellulaire en aval de mTORC1. Finalement, notre étude de l’effet du stress oxydant dans la répression de la traduction nous a permis de montrer que la kinase JNK contrôle la localisation du répresseur 4E-T au sein des P-bodies, qui sont des granules cytoplasmiques concentrant des ARNm non traduits et des facteurs de la dégradation des ARNm. Nos travaux ont donc abouti à la découverte de mécanismes moléculaires cruciaux impliqués dans la régulation de la traduction des ARNm et de la synthèse protéique. Ces derniers étant largement impliqués dans la prolifération cellulaire et la croissance tumorale, nos recherches ouvrent sur un champ d’investigation plus large pour le développement de nouvelles molécules anti-cancéreuses.

Study of nuclear receptor dynamics by BRET

Les récepteurs nucléaires (RN) sont des facteurs de transcription ligand dépendants qui contrôlent une grande variété de processus biologiques de la physiologie humaine, ce qui a fait d'eux des cibles pharmacologiques privilégiées pour de nombreuses maladies. L'un de ces récepteurs, le récepteur de l’œstrogène alpha (ERα), peut activer la prolifération cellulaire dans certaines sections de l'épithélium mammaire tandis qu’un autre, le récepteur de l'acide rétinoïque alpha (RARα), peut provoquer un arrêt de la croissance et la différenciation cellulaire. La signalisation de ces deux récepteurs peut être altérée dans le cancer du sein, contribuant à la tumorigénèse mammaire. L’activité d’ERα peut être bloquée par les anti-oestrogènes (AE) pour inhiber la prolifération des cellules tumorales mammaires. Par contre, l’activation des voies de RARα avec des rétinoïdes dans un contexte clinique a rencontré peu de succès. Ceci pourrait résulter du manque de spécificité des ligands testés pour RARα et/ou de leur activité seulement dans certains sous-types de tumeurs mammaires. Puisque les récepteurs nucléaires forment des homo- et hétéro-dimères, nous avons cherché à développer de nouveaux essais pharmacologiques pour étudier l'activité de complexes dimériques spécifiques, leur dynamique d’association et la structure quaternaire des récepteurs des œstrogènes. Nous décrivons ici une nouvelle technique FRET, surnommée BRET avec renforcement de fluorescence par transferts combinés (BRETFect), qui permet de détecter la formation de complexes de récepteurs nucléaires ternaires. Le BRETFect peut suivre l'activation des hétérodimères ERα-ERβ et met en évidence un mécanisme allostérique d'activation que chaque récepteur exerce sur son partenaire de dimérisation. L'utilisation de BRETFect en combinaison avec le PCA nous a permis d'observer la formation de multimères d’ERα fonctionnels dans des cellules vivantes pour la première fois. La formation de multimères est favorisée par les AE induisant la dégradation du récepteur des oestrogènes, ce qui pourrait contribuer à leurs propriétés spécifiques. Ces essais de BRET apportent une nette amélioration par rapport aux tests de vecteurs rapporteur luciférase classique, en fournissant des informations spécifiques aux récepteurs en temps réel sans aucune interférence par d'autres processus tels que la transcription et de la traduction. L'utilisation de ces tests nous a permis de caractériser les propriétés de modulation de l’activité des récepteurs nucléaires d’une nouvelle classe de molécules hybrides qui peuvent à la fois lier ERa ou RAR et inhiber les HDACs, conduisant au développement de nouvelles molécules prometteuses bifonctionnelles telles que la molécule hybride RAR-agoniste/HDACi TTNN-HA.

Patrons saisonniers de transformation du carbone et efficacité métabolique des communautés bactériennes du golfe d’Amundsen, Arctique canadien

Les réchauffements climatiques associés aux activités anthropiques ont soumis les écosystèmes arctiques à des changements rapides qui menacent leur stabilité à court terme. La diminution dramatique de la banquise arctique est une des conséquences les plus concrètes de ce réchauffement. Dans ce contexte, comprendre et prédire comment les systèmes arctiques évolueront est crucial, surtout en considérant comment les flux de carbone (C) de ces écosystèmes - soit des puits nets, soit des sources nettes de CO2 pour l'atmosphère - pourraient avoir des répercussions importantes sur le climat. Le but de cette thèse est de dresser un portrait saisonnier de l’activité bactérienne afin de déterminer l’importance de sa contribution aux flux de carbone en Arctique. Plus spécifiquement, nous caractérisons pour la première fois la respiration et le recours à la photohétérotrophie chez les microorganismes du golfe d’Amundsen. Ces deux composantes du cycle du carbone demeurent peu décrites et souvent omises des modèles actuels, malgré leur rôle déterminant dans les flux de C non seulement de l’Arctique, mais des milieux marins en général. Dans un premier temps, nous caractérisons la respiration des communautés microbiennes (RC) des glaces de mer. La connaissance des taux de respiration est essentielle à l’estimation des flux de C, mais encore limitée pour les milieux polaires. En effet, les études précédentes dans le golfe d’Amundsen n’ont pas mesuré la RC. Par la mesure de la respiration dans les glaces, nos résultats montrent des taux élevés de respiration dans la glace, de 2 à 3 fois supérieurs à la colonne d'eau, et une production bactérienne jusqu’à 25 fois plus importante. Ces résultats démontrent que la respiration microbienne peut consommer une proportion significative de la production primaire (PP) des glaces et pourrait jouer un rôle important dans les flux biogéniques de CO2 entre les glaces de mer et l’atmosphère (Nguyen et Maranger, 2011). Dans un second temps, nous mesurons la respiration des communautés microbiennes pélagiques du golfe d’Amundsen pendant une période de 8 mois consécutif, incluant le couvert de glace hivernal. En mesurant directement la consommation d'O2, nous montrons une RC importante, mesurable tout au long de l’année et dépassant largement les apports en C de la production primaire. Globalement, la forte consommation de C par les communautés microbiennes suggère une forte dépendance sur recyclage interne de la PP locale. Ces observations ont des conséquences importantes sur notre compréhension du potentiel de séquestration de CO2 par les eaux de l’Océan Arctique (Nguyen et al. 2012). Dans un dernier temps, nous déterminons la dynamique saisonnière de présence (ADN) et d’expression (ARN) du gène de la protéorhodopsine (PR), impliqué dans la photohétérotrophie chez les communautés bactérienne. Le gène de la PR, en conjonction avec le chromophore rétinal, permet à certaines bactéries de capturer l’énergie lumineuse à des fins énergétiques ou sensorielles. Cet apport supplémentaire d’énergie pourrait contribuer à la survie et prolifération des communautés qui possèdent la protéorhodopsine. Bien que détectée dans plusieurs océans, notre étude est une des rares à dresser un portrait saisonnier de la distribution et de l’expression du gène en milieu marin. Nous montrons que le gène de la PR est présent toute l’année et distribué dans des communautés diversifiées. Étonnamment, l’expression du gène se poursuit en hiver, en absence de lumière, suggérant soit qu’elle ne dépend pas de la lumière, ou que des sources de photons très localisées justifie l’expression du gène à des fins sensorielles et de détection (Nguyen et al., soumis au journal ISME). Cette thèse contribue à la compréhension du cycle du C en Arctique et innove par la caractérisation de la respiration et de l’efficacité de croissance des communautés microbiennes pélagiques et des glaces de mer. De plus, nous montrons pour la première fois une expression soutenue de la protéorhodopsine en Arctique, qui pourrait moduler la consommation de C par la respiration et justifier son inclusion éventuelle dans les modélisations du cycle du C. Dans le contexte des changements climatiques, il est clair que l'importance de l’activité bactérienne a été sous-estimée et aura un impact important dans le bilan de C de l'Arctique.

Modulation de l'expression de Sirt-1 induite par l'endothéline-1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires

Au cours des maladies cardiovasculaires (MCV), il peut se produire divers problèmes de santé, telle que l’insuffisance cardiaque ou encore l’HTA. Ces phénomènes se caractérisent, entre autres, par une augmentation de synthèse d’endotheline-1 (ET-1), un neuropeptide synthétisé par les cellules endothéliales ayant un effet vasoconstricteur sur les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Ainsi, la surexpression de ce vasopeptide, mène à terme, au maintien de l’HTA aggravée des sujets, précédée ou concomitante à l’athérosclérose ou à la resténose, cliniquement illustrées par une prolifération et une migration anormale des CMLV de la media vers l’intima des vaisseaux sanguins. Parallèlement, il a été observé que la protéine sirtuine-1 (Sirt-1), membre de la famille des protéines histones déacétylases (HDAC), présente des propriétés anti-athérosclérotiques par sa capacité d’atténuer la prolifération et la migration des CMLV. Des travaux récents ont aussi montré qu’au cours de l’HTA la protéine Sirt-1 est faiblement exprimée dans les CMLV. Son implication dans le développement des pathologies vasculaires semble apparente, mais des études demeurent nécessaires pour décrire son rôle exact dans la pathogenèse des MCV. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’observer la variation d’expression de Sirt-1 dans les CMLV, isolées de l’aorte ascendante de rat, en réponse à l’ET-1. On a remarqué qu’une heure de stimulation des CMLV avec l’ET-1 induit une diminution de l’expression de Sirt-1 via l’activation des récepteurs ETA. Ces résultats suggèrent que la capacité d’ET-1 à atténuer l’expression de Sirt-1 serait un éventuel mécanisme d’action avec des effets favorisant les MCV.