Complement expression in retinal pigment epithelial cells is modulated by activated macrophages

Complement activation is involved in a variety of retinal diseases. We have shown previously that a number of complement components and regulators can be produced locally in the eye, and that retinal pigment epithelial (RPE) cells are the major source of complement expression at the retina-choroidal interface. The expression of complement components by RPE cells is regulated by inflammatory cytokines. Under aging or inflammatory conditions, microglia and macrophages accumulate in the subretinal space, where they are in close contact with RPE cells. In this study, we investigated the effect of activated macrophages on complement expression by RPE cells. Mouse RPE cells were treated with the supernatants from un-activated bone marrow-derived macrophages (BM-DMs), the classically activated BM-DMs (M1) and different types of the alternatively activated BM-DMs (M2a by IL-4, M2b by immune complex and lipopolysaccharide (LPS), M2c by IL-10). The expression of inflammatory cytokines and complement genes by RPE cells were determined by real-time RT-PCR. The protein expression of CFB, C3, C1INH, and C1r was examined by Western blot. Our results show that un-stimulated RPE cells express a variety of complement-related genes, and that the expression levels of complement regulators, including C1r, factor H (CFH), DAF1, CD59, C1INH, Crry, and C4BP genes are significantly higher than those of complement component genes (C2, C4, CFB, C3, and C5). Macrophage supernatants increased inflammatory cytokine (IL-1ß, IL-6, iNOS), chemokine (CCL2) and complement expression in RPE cells. The supernatants from M0, M2a and M2c macrophages mildly up-regulated (2~3.5-fold) CFB, CFH and C3 gene expression in RPE cells, whereas the supernatants from M1 and M2b macrophages massively increased (10~30-fold) CFB and C3 gene expression in RPE cells. The expression of other genes, including C1r, C2, C4, CFH, Masp1, C1INH, and C4BP in RPE cells was also increased by the supernatants of M1 and M2b macrophages; however, the increment levels were significantly lower than CFB and C3 genes. M1 and M2b macrophage supernatants enhanced CFB (Bb fragment) protein expression and C3 secretion by RPE cells. M1 macrophages may affect complement expression in RPE cells through the STAT1 pathway. Our results suggest that under inflammatory conditions, activated macrophages could promote the alternative pathway of complement activation in the retina via induction of RPE cell CFB and C3 expression.

Killer immunoglobulin-like Receptors (KIR) haplogroups A and B track with Natural Killer Cells and Cytokine Profile in Aged Subjects: Observations from Octo/Nonagenarians in the Belfast Elderly Longitudinal Free-living Aging STudy (BELFAST)

Background: Natural Killer Cells (NK) play an important role in detection and elimination of virus-infected, damaged or cancer cells. NK cell function is guided by expression of Killer Immunoglobulin-like Receptors (KIRs) and contributed to by the cytokine milieu. KIR molecules are grouped on NK cells into stimulatory and inhibitory KIR haplotypes A and B, through which NKs sense and tolerate HLA self-antigens or up-regulate the NK-cytotoxic response to cells with altered HLA self-antigens, damaged by viruses or tumours. We have previously described increased numbers of NK and NK-related subsets in association with sIL-2R cytokine serum levels in BELFAST octo/nonagenarians. We hypothesised that changes in KIR A and B haplotype gene frequencies could explain the increased cytokine profiles and NK compartments previously described in Belfast Elderly Longitudinal Free-living Aging STudy (BELFAST) octo/nonagenarians, who show evidence of ageing well.

Results: In the BELFAST study, 24% of octo/nonagenarians carried the KIR A haplotype and 76% KIR B haplotype with no differences for KIR A haplogroup frequency between male or female subjects (23% v 24%; p=0.88) or for KIR B haplogroup (77% v 76%; p=0.99). Octo/nonagenarian KIR A haplotype carriers showed increased NK numbers and percentage compared to Group B KIR subjects (p=0.003; p=0.016 respectively). There were no KIR A/ B haplogroup-associated changes for related CD57+CD8 (high or low) subsets. Using logistic regression, KIR B carriers were predicted to have higher IL-12 cytokine levels compared to KIR A carriers by about 3% (OR 1.03, confidence limits CI 0.99–1.09; p=0.027) and 14% higher levels for TGF-ß (active), a cytokine with an anti-inflammatory role, (OR 1.14, confidence limits CI 0.99–1.09; p=0.002).

Conclusion: In this observational study, BELFAST octo/nonagenarians carrying KIR A haplotype showed higher NK cell numbers and percentage compared to KIR B carriers. Conversely, KIR B haplotype carriers, with genes encoding for activating KIRs, showed a tendency for higher serum pro-inflammatory cytokines compared to KIR A carriers. While the findings in this study should be considered exploratory they may serve to stimulate debate about the immune signatures of those who appear to age slowly and who represent a model for good quality survivor-hood.© 2013 Rea et al.; licensee BioMed Central Ltd.

Pellino3 targets the IRF7 pathway and facilitates autoregulation of TLR3-and viral-induced expression of type i interferons

Toll-like receptors (TLRs) sense pathogen-associated molecules and respond by inducing cytokines and type I interferon. Here we show that genetic ablation of the E3 ubiquitin ligase Pellino3 augmented the expression of type I interferon but not of proinflammatory cytokines in response to TLR3 activation. Pellino3-deficient mice had greater resistance against the pathogenic and lethal effects of encephalomyocarditis virus (EMCV). TLR3 signaling induced Pellino3, which in turn interacted with and ubiquitinated TRAF6. This modification suppressed the ability of TRAF6 to interact with and activate IRF7, resulting in downregulation of type I interferon expression. Our findings highlight a new physiological role for Pellino3 and define a new autoregulatory network for controlling type I interferon expression. © 2012 Nature America, Inc. All rights reserved.

Antimicrobial peptides and proinflammatory cytokines in periprosthetic joint infection

Background: Differentiation between septic and aseptic loosening of joint replacements is essential for successful revision surgery, but reliable markers for the diagnosis of low-grade infection are lacking. The present study was performed to assess intra-articular and systemic levels of antimicrobial peptides and proinflammatory cytokines as diagnostic markers for periprosthetic joint infection. Methods: Fifteen consecutive patients with staphylococcal periprosthetic joint infections and twenty control patients with aseptic loosening of total hip and knee replacements were included in this prospective, single-center, controlled clinical trial. Expression of the antimicrobial peptides human β-defensin-2 (HBD-2), human β-defensin-3 (HBD-3), and cathelicidin LL-37 (LL-37) was determined by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) in serum and joint aspirates. Proinflammatory cytokines were assessed in serum and joint aspirates with use of cytometric bead arrays. C-reactive protein in serum, microbiology, and histopathology of periprosthetic tissue served as the “gold standard” for the diagnosis of infection. Results: The antimicrobial peptides HBD-3 and LL-37 were significantly elevated in joint aspirates from patients with periprosthetic joint infection compared with patients with aseptic loosening, and the area under the curve (AUC) in a receiver operating characteristic curve analysis was equal to 0.745 and 0.875, respectively. Additionally, significant local increases in the proinflammatory cytokines interleukin (IL)-1β, IL-4, IL-6, IL-17A, interferon (IFN)-γ, and tumor necrosis factor (TNF)-α were observed to be associated with infection. Logistic regression analysis indicated that the combination of an antimicrobial peptide with another synovial fluid biomarker improved diagnostic accuracy; the AUC value was 0.916 for LL-37 and IL-4, 0.895 for LL-37 and IL-6, 0.972 for HBD-3 and IL-4, and 0.849 for HBD-3 and IL-6. In contrast, the only antimicrobial peptides and cytokines in serum that showed a significant systemic increase in association with infection were HBD-2, IL-4, and IL-6 (all of which had an AUC value of <0.75). Conclusions: The present study showed promising results for the use of antimicrobial peptides and other biomarkers in synovial fluid for the diagnosis of periprosthetic joint infection, and analysis of the levels in synovial fluid was more accurate than analysis of serum.

Impact of vitamin D3 on cutaneous immunity and antimicrobial peptide expression

Antimicrobial peptides (AMPs) are effectors of cutaneous innate immunity and protect primarily against microbial infections. An array of AMPs can be found in and on the skin. Those include peptides that were first discovered for their antimicrobial properties but also proteins with antimicrobial activity first characterized for their activity as chemokines, enzymes, enzyme inhibitors and neuropeptides. Cathelicidins were among the first families of AMPs discovered in skin. They are now known to exert a dual role in innate immune defense: they have direct antimicrobial activity and will also initiate a host cellular response resulting in cytokine release, inflammation and angiogenesis. Altered cathelicidin expression and function was observed in several common inflammatory skin diseases such as atopic dermatitis, rosacea and psoriasis. Until recently the molecular mechanisms underlying cathelicidin regulation were not known. Lately, vitamin D3 was identified as the major regulator of cathelicidin expression and entered the spotlight as an immune modulator with impact on both, innate and adaptive immunity. Therapies targeting vitamin D3 signalling may provide novel approaches for the treatment of infectious and inflammatory skin diseases by affecting both innate and adaptive immune functions through AMP regulation.

Endothelial NADPH oxidase-2 promotes interstitial cardiac fibrosis and diastolic dysfunction through proinflammatory effects and endothelial-mesenchymal transition

Objectives: This study sought to investigate the effect of endothelial dysfunction on the development of cardiac hypertrophy and fibrosis.
Background: Endothelial dysfunction accompanies cardiac hypertrophy and fibrosis, but its contribution to these conditions is unclear. Increased nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-2 (NOX2) activation causes endothelial dysfunction.
Methods: Transgenic mice with endothelial-specific NOX2 overexpression (TG mice) and wild-type littermates received long-term angiotensin II (AngII) infusion (1.1 mg/kg/day, 2 weeks) to induce hypertrophy and fibrosis.
Results: TG mice had systolic hypertension and hypertrophy similar to those seen in wild-type mice but developed greater cardiac fibrosis and evidence of isolated left ventricular diastolic dysfunction (p < 0.05). TG myocardium had more inflammatory cells and VCAM-1-positive vessels than did wild-type myocardium after AngII treatment (both p < 0.05). TG microvascular endothelial cells (ECs) treated with AngII recruited 2-fold more leukocytes than did wild-type ECs in an in vitro adhesion assay (p < 0.05). However, inflammatory cell NOX2 per se was not essential for the profibrotic effects of AngII. TG showed a higher level of endothelial-mesenchymal transition (EMT) than did wild-type mice after AngII infusion. In cultured ECs treated with AngII, NOX2 enhanced EMT as assessed by the relative expression of fibroblast versus endothelial-specific markers.
Conclusions: AngII-induced endothelial NOX2 activation has profound profibrotic effects in the heart in vivo that lead to a diastolic dysfunction phenotype. Endothelial NOX2 enhances EMT and has proinflammatory effects. This may be an important mechanism underlying cardiac fibrosis and diastolic dysfunction during increased renin-angiotensin activation.

Cytokine and C-reactive protein profiles induced by porcine circovirus type 2 experimental infection in 3-week-old piglets

The purpose of this study was to determine serum profiles of cytokines at a protein level and Creactive protein (CRP) during the development of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) in experimentally inoculated pigs. Levels of serum IFN-alpha, IL-6, IL-10, and CRP were examined for a 35-day period in 10 piglets experimentally infected with PCV2 at 3 weeks of age. Four of the infected piglets developed severe PMWS at 14 to 21 days post-infection (d.p.i.) and died prior to termination of the experiment. The remaining six PCV2-infected piglets experienced transient fever, but did not display overt clinical signs of PMWS and were considered as subclinically infected. A bioassay was used to detect IL-6 and ELISAs were used to detect IFN-alpha, IL-10, and CRP. There were no significant differences in cytokine or CRP expression from 0 to 7 d.p.i. between the PMWS-affected and the subclinically infected piglets. Levels of IL-10 and CRP were elevated from 10 and 14 d.p.i. respectively in the PMWS-affected piglets compared to the subclinically infected piglets. There were no significant differences in IFN-alpha and IL-6 expression between the PMWS-affected piglets and the subclinically infected piglets. The present study shows that elevated levels of serum CRP and IL-10 were associated with PCV2-infected piglets that subsequently developed severe PMWS. This may help to provide further insight into the immunoaetiogenesis of this syndrome.

Characterization of protein C receptor expression in monocytes

Many sequelae associated with endotoxaemic-induced shock result from excessive production of the cytokine mediators, tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha), interleukin 1 (IL-1) and IL-6 from lipopolysaccharide (LPS)-activated monocytes. Protein C (PC)/activated protein C (APC) has potent cytokine-modifying properties and is protective in animal models and human clinical trials of sepsis. The precise mechanism by which this anti-inflammatory response is achieved remains unknown; however, the recently described endothelial protein C receptor (EPCR) appears to be essential for this function. The pivotal role that monocytes play in the pathophysiology of septic shock led us to investigate the possible expression of a protein C receptor on the monocyte membrane. We used similarity algorithms to screen human sequence databases for paralogues of the EPCR but found none. However, using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), we detected an mRNA transcribed in primary human monocytes and THP1 cells that was identical to human EPCR mRNA. We also used immunocytochemical analysis to demonstrate the expression of a protein C receptor on the surface of monocytes encoded by the same gene as EPCR. These results confirm a new member of the protein C pathway involving primary monocytes. Further characterization will be necessary to compare and contrast its biological properties with those of EPCR.

Interferon-γ stimulates CD14, TLR2 and TLR4 mRNA expression in gingival fibroblasts increasing responsiveness to bacterial challenge

Objective: To investigate the potential effects of IFN-y on the responsiveness of human gingival fibroblasts to bacterial challenge.
Design :mRNA and protein expression of CD14, TLR2 and TLR4 in human gingival fibroblasts was detected by quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR) and flow cytometry. The effect of preincubation with IFN-y on subsequent bacterial LPS-induced expression of IL-6 and IL-8 by gingival fibroblasts was determined by ELISA. Bacterial LPS-induced IκBα degradation in human gingival fibroblasts was investigated by western blot.
Results: Human gingival fibroblasts express CD14, TLR2 and TLR4 mRNAs. IFN-y, but not IL-1B, induced mRNA expression of all three receptors and the expression of membrane bound CD14 protein. Pre-incubation of fibroblasts with IFN-y and subsequent stimulation with Escherichia coli LPS or Porphyromonas gingivalis LPS led to increased production of IL-6 and IL-8. LPS-induced pro-inflammatory cytokine production was abrogated by a blocking antibody to CD14. Both E. coli LPS and P. gingivalis LPS induced IκBα degradation in human gingival fibroblasts.
Conclusion: Our data indicate that IFN-y primes human gingival fibroblasts, through the upregulation of CD14 expression, which results in increased responsiveness to bacterial LPS challenge, as determined by pro-inflammatory cytokine production.

Clinical Outcomes and Genetic Expression Profile in Human Liver Graft Dysfunction During Ischemia/Reperfusion Injury

Introduction. This study aims to compare the molecular gene expression during ischemia reperfusion injury. Several surgical times were considered: in the beginning of the harvesting (T0), at the end of the cold ischemia period (T1), and after reperfusion (T2) and compared with graft dysfunction after liver transplant (OLT). Methods. We studied 54 patients undergoing OLT. Clinical, laboratory data, and histologic data (Suzuki classification) as well as the Survival Outcomes Following Liver Transplantation (SOFT) score were used and compared with the molecular gene expression of the following genes: Interleukin (IL)-1b, IL-6, tumor necrosis factor-a, perforin, E-selectin (SELE), Fas-ligand, granzyme B, heme oxygenase-1, and nitric oxide synthetase. Results. Fifteen patients presented with graft dysfunction according to SOFT criteria. No relevant data were obtained by comparing the variables graft dysfunction and histologic variables. We observed a statistically significant relation between SELE at T0 (P ¼ .013) and IL-1b at T0 (P ¼ .028) and early graft dysfunction. Conclusions. We conclude that several genetically determined proinflammatory expressions may play a critical role in the development of graft dysfunction after OLT.

CD14 expression on monocytes and TNF alpha production in patients with septic shock, cardiogenic shock or bacterial pneumonia.

OBJECTIVES: In patients with septic shock, circulating monocytes become refractory to stimulation with microbial products. Whether this hyporesponsive state is induced by infection or is related to shock is unknown. To address this question, we measured TNF alpha production by monocytes or by whole blood obtained from healthy volunteers (controls), from patients with septic shock, from patients with severe infection (bacterial pneumonia) without shock, and from patients with cardiogenic shock without infection. MEASUREMENTS: The numbers of circulating monocytes, of CD14+ monocytes, and the expression of monocyte CD14 and the LPS receptor, were assessed by flow cytometry. Monocytes or whole blood were stimulated with lipopolysaccharide endotoxin (LPS), heat-killed Escherichia coli or Staphylococcus aureus, and TNF alpha production was measured by bioassay. RESULTS: The number of circulating monocytes, of CD14+ monocytes, and the monocyte CD14 expression were significantly lower in patients with septic shock than in controls, in patients with bacterial pneumonia or in those with cardiogenic shock (p < 0.001). Monocytes or whole blood of patients with septic shock exhibited a profound deficiency of TNF alpha production in response to all stimuli (p < 0.05 compared to controls). Whole blood of patients with cardiogenic shock also exhibited this defect (p < 0.05 compared to controls), although to a lesser extent, despite normal monocyte counts and normal CD14 expression. CONCLUSIONS: Unlike patients with bacterial pneumonia, patients with septic or cardiogenic shock display profoundly defective TNF alpha production in response to a broad range of infectious stimuli. Thus, down-regulation of cytokine production appears to occur in patients with systemic, but not localised, albeit severe, infections and also in patients with non-infectious circulatory failure. Whilst depletion of monocytes and reduced monocyte CD14 expression are likely to be critical components of the hyporesponsiveness observed in patients with septic shock, other as yet unidentified factors are at work in this group and in patients with cardiogenic shock.

Expression des SOCS-1 et SOCS-3 par les lymphocytes T humains en réponse à des cytokines immuno-modulatrices

Les cytokines jouent un rôle fondamental dans la régulation des processus biologiques via la cascade de signalisation JAK-STAT. Les « Suppressors of Cytokine Signalling » (SOCS), protéines intracellulaires, inhibent la voie JAK-STAT. Plusieurs études supportent leur implication dans des maladies immunitaires, mais peu d’informations sont disponibles sur leur expression par les lymphocytes T humains. Nous postulons que les cytokines Interféron-β(IFN-β) et Interleukine-27 (IL-27), dotées d’un potentiel immuno-régulateur, ont des rôles bénéfiques via l’induction des SOCS. L’impact de l’IFN-β et l’IL-27 sur l’expression des SOCS-1 et SOCS-3 par des cellules T CD8 et CD4 humaines a été étudié en utilisant des cellules sanguines de donneurs sains. L’expression de ces régulateurs a été évaluée aux niveaux de l’ARNm par qRT-PCR et protéique par immunocytochimie. Les SOCS-1 et SOCS-3 ont été rapidement induits en ARNm dans les deux types cellulaires en réponse à l’IFN-β ou l’IL-27 et une augmentation de l’expression a été confirmée au niveau protéique. Afin de mimer les thérapies à base d’IFN-β, les cellules T ont été exposées chroniquement à l’IFN-β. Après chaque ajout de cytokine les cellules T ont augmenté l’expression du SOCS-1, sans moduler le SOCS-3. L’IL-27 a induit les SOCS-1 et SOCS-3 préférentiellement dans les cellules T CD8 ; ceci corrèle avec des résultats du laboratoire démontrant une plus petite expression des récepteurs à l’IL-27 par les lymphocytes T CD4 que les CD8. Notre projet a permis d’élucider l’expression des SOCS dans deux populations de cellules T et de clarifier les mécanismes d’actions de l’IFN-β et l’IL-27.

L’étude de l’impact des protéines non structurales NS1 et NS2 du virus respiratoire syncitial sur la réponse immunitaire innée

Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un virus à ARN de polarité négative. Les études démontrent que toute la population sera infectée par ce virus au moins deux fois avant l’âge de 3 ans. Le RSV peut provoquer plusieurs pathologies respiratoires telles que la bronchiolite aiguë et la pneumonie. Les infections sévères corrèlent avec le développement de l’asthme. Lors d’une infection virale, les particules du RSV sont détectées par le senseur RIG-I qui induit l’activation des facteurs de transcription NF-κB et IRF-3. Respectivement, les facteurs de transcription activeront les réponses inflammatoire et antivirale. Au coeur des pathologies induites par le RSV se trouve une réponse immunitaire mal adaptée. Plus précisément, par l’entremise de NF-κB, le RSV provoque une production exagérée de cytokines et chimiokines qui induisent une réponse inflammatoire démesurée provoquant du dommage tissulaire. Paradoxalement, le RSV est capable d’échapper à la réponse antivirale. Ces deux phénomènes sont contrôlés par l’entremise des protéines non structurales NS1 et NS2. Le mécanisme délimitant le mode d’action de NS1 et NS2 sur la réponse antivirale reste à être déterminé. Avec pour objectif d’élucider comment NS1 et NS2 inhibent la réponse antivirale, nous avons investigué le mécanisme de reconnaissance de l’hôte vis-à-vis de RSV. Nous démontrerons, pour la première fois, que le senseur cytosolique MDA5 est impliqué dans la réponse antivirale contre le RSV. Nous présenterons des résultats préliminaires qui suggèrent que le rôle de MDA5 est non redondant à RIG-I. À l’aide d’ARN interférant dirigé contre RIG-I et de transfection de MDA5, nous démontrerons que MDA5 ne contribue pas à la phosphorylation d’IRF-3, mais plutôt qu’elle régit la stabilité du facteur de transcription. Nous démontrerons aussi que, contrairement à l’hypothèse actuelle sur le fonctionnement de NS1 et NS2, l’inhibition de ces derniers ne provoque pas une augmentation de la cytokine antivirale IFN−β. Cependant, l’expression ectopique de NS1 et NS2 réduit l’activité du promoteur de l’IFN-β et de la protéine cytoplasmic antivirale ISG56 lorsqu’elle est mesurée par essai luciférase.

The role of interleukin-1beta on the expression of nestin in cardiac neural stem cells following myocardial infarction

Le mécanisme biologique responsable pour l’augmentation de l’expression de la protéine nestin dans les cellules souches neurales (CSN) du cœur après un infarctus du myocarde (IM) demeure inconnu. Des études antérieures ont démontré que le traitement au dexamethasone, un glucocorticoïde aux propriétés anti-inflammatoires, abolit la régulation positive de nestin après un IM. Ceci suggère un lien avec la réponse inflammatoire. Nous avons vérifié dans cette étude l’hypothèse que la cytokine inflammatoire interleukin-1beta (IL-1beta) peut modifier le phénotype de cellules souches neurales. Le deuxième objectif de l’étude fut d’établir l’impact, suivant un IM, de l’inhibition de la signalisation de IL-1beta sur la fonction et la guérison cardiaque. Suite à une ligature complète de l’artère coronaire du rat mâle, le dysfonctionnement contractile du ventricule gauche fut associé à une régulation positive de la protéine nestin dans le myocarde non-infarci. Le traitement avec Xoma 052 (1 mg/kg), un anticorps anti-IL-1beta, 24h, 7 et 14 jours après un évènement ischémique, eu aucun effet sur la taille de l’infarctus ou la contractilité du ventricule gauche. De plus, le traitement avec Xoma 052 après un IM n’a pu supprimer l’augmentation de l’expression de nestin et Bcl-2 malgré une réduction modeste du niveau de la protéine Bax. Pour déterminer directement le rôle de la réponse inflammatoire en l’absence d’ischémie, nous avons injecté des rats mâles avec du LPS (10mg/kg, 18hrs). Dans le coeur du rat-LPS, nous avons noté une augmentation significative du niveau d’ARNm de IL-1beta et de l’expression de la protéine nestin. Le prétraitement avec 10mg/kg de Xoma 052 a aboli l’augmentation de l’expression de nestin dans le coeur des rats-LPS. Ces observations indiquent que les cellules souches neurales pourraient représenter une cible potentielle de l’IL-1beta.

Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.