牙鲆群体遗传多样性及鲽形目鱼类分子系统学初步研究

本文以山东近海野生和养殖牙鲆Paralichthys olivaceus(T．& S.)为研究对象，采用同工酶电泳和随机扩增多态性DNA(RAPD)两种方法，进行了群体遗传学研究；另外，用PCR扩增了牙鲆、桂皮斑鲆Pseudorhombus cinnamomeus(T．& S.)、石鲽Kareius bicoloratus，Basilewsky和大菱鲆Psetta maxima 4种鲽形目鱼类mtDNA 16s rRNA基因区的部分片段，采用生物信息、学方法构建了鲽形目分子系统树。主要结果如下：1．首先建立了适于牙鲆同工酶分析的水平淀粉凝胶和垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳系统；对获得的牙鲆15种同工酶基本酶谱进行了生化遗传分析，进而对自然和养殖群体的生化遗传结构进行了分析，共记录了29个基因座位，发现了9个多态座位。2．野生群体的生化遗传参数多态基因座位比例(31．O％)、等位基因平均数(1．38)和群体平均杂合度(0．0802)都明显高于养殖群体(24．1％，1．28，O．0788)；在野生群体中有9个多态基因座位，而养殖群体仅7个多态基因座位；其中，除了Cat和Idhp-1(仅养殖群体)(P < 0．05)有显著差异、Ldh-C(P < O．01)完全偏离Hardy-Weinberg定律外，其余多态座位基因频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律。野生和养殖群体的遗传相似性系数(I)为0．9877，它们的遗传距离(D)是0．0124；两群体间的遗传分化系数G_(st)为0．0681，D_m为0．01，表明总变异中的6．8％的遗传变异产生于群体间的基因差异。3．采用11个随机引物对20个野生个体和24个养殖个体进行了RAPD群体遗传多样性分析，分别扩增出88条和86条DNA带，片段大小在200-2500bp之间，平均每个引物扩增的带数是7．8-8．0。两个群体的多态座位比例分别是43．2％和34．9％，平均杂合度是0．2739和0．2255，而Shannon遗传多样性指数表明两群体的遗传变异中有88．12％的遗传变异来自种群内，只有11．88％的变异来自群体间。遗传分化指数G_(st)的结果也验证了Shannon遗传多样性指数的结果：总群体的遗传变异中约有12％是由两群体间的基因差异产生的。4．本文对牙鲆两个群体的同一批样品分别采用经典的同工酶方法和RAPD方法进行了较系统的比较分析。发现，RAPD所显示的多态性要比同工酶的高得多，因为大部分RAPD的变异是源于非编码区和重复DNA，可以遍布整个基因组，而同工酶仅是功能基因的产物，只表现编码区的变异。因此，自然选择在同工酶编码区的作用要多于RAPD标记。在遗传相似性系数(I)和遗传距离(D)上，RAPD的分析结果与同工酶的分析结果也是有差异的，用同工酶分析两个群体遗传距离只有0．0124，而用RAPD研究可达0．0508。遗传分化指数的差异也很大，同工酶为0．0681，RAPD为0．1237。5．RAPD和同工酶的分析结果是类似的，即自然群体的多态座位比例和平均杂合度要比养殖群体高，降低幅度在同工酶中界于1．7～22．3％之间，在RAPD中则界于15．9～19．2％之间。这充分证明了养殖群体的遗传多样性水平已有明显的丧失，值得我们注意。6．构建了鲽形目鱼类mtDNA 16S rRNA基因的分子系统树。通过分子克隆法将牙鲆、桂皮斑鲆、大菱鲆和石鲽mtDNA 16S rRNA目的基因片段连接到质粒载体上，经MegaBACE测序仪测序，分别获得了590、595、582和590bp序列，通过生物信息学方法对其进行了序列分析和核酸变异比较，结合NCBI上6种鲽形目鱼类的同源序列探讨了这4种鱼类在鲽形目中的遗传分化和分子系统进化，构建了系统树，其中，桂皮斑鲆的16S rRNA基因在系统树中的位置与物种形态资料的系统演化不相符，而其它三种很好地呈现了它们在鲽形目中的系统位置。同时，可以看出mtDNA 16S rRNA基因片段可以构建一个相对准确的树，特别是NJ树和ML树比较接近，更为客观一些。由比对序列获得的物种之间的遗传距离也基本可以反映种、属、科间的不同变异水平。

牙鲆和大黄鱼经济性状候选基因的DNA分子标记研究

本文利用不同的分子标记方法，分别对牙鲆及大黄鱼不同养殖群体的生长、抗病等经济性状的候选基因进行了序列多态性研究，检测到了几个SNP位点和微卫星的多态性位点，并分析了它们与经济性状之间的相关性；同时，利用微卫星的多态性位点对牙鲆2个养殖群体的遗传变异进行了分析，这些均为海水鱼类遗传育种及标记辅助选育工作提供了基础数据。 在牙鲆胶南养殖群体中，以100个个体为实验材料，根据其生长激素（GH）基因的6个外显子序列设计引物，通过SSCP分析技术显示该群体GH基因的第4外显子存在多态性，检测到2种基因型，AA型和AB型。DNA测序结果表明，AB型在第1763位发生碱基突变，c→t，与AA型同源性达到99%。连锁分析结果表明：这2种基因型的个体在体重和头长上表现出显著的差异，AB型个体的体重和头长都明显大于AA型个体(P<0.05)，由此推测等位基因B是一个对牙鲆体重和头长都有利的等位基因；这2种基因型个体之间在其体型性状上也存在显著差异（P<0.05）；同时，该多态位点的Hardy-Weinberg平衡性检验结果表明，该群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。在牙鲆GH基因第1外显子区域还发现了一个微卫星位点，对该位点进行多态性分析，检测到5种基因型、3种等位基因，one-way ANOVA统计结果显示，基因型AC个体的体重、头长和体高明显大于其它基因型个体（P<0.05），C是一个对体重、头长和体高有利的等位基因。 对2个大黄鱼养殖群体的GH基因进行SSCP分析后发现，浙江群体大黄鱼GH基因在第196位存在1个SNP（g→a）位点，检测到2种基因型，AA和AB。t检验结果表明，AA型个体的体高比AB型个体的高(P≤0.05)，但AB型个体在体长/体高上占优势(P≤0.05)，提示该突变位点可以作为大黄鱼体型性状的候选标记。福建群体大黄鱼GH基因在第692位有1个SNP位点(t→c)，共检测到2种基因型，CC型和CD型，其中，CD基因型个体的体重和全长显著大于CC基因型个体(P≤0.01)，提示该位点可以作为大黄鱼体重和头长性状的候选标记。 在牙鲆胶南和日照2个养殖群体中，采用牙鲆GHR基因5’端Promoter区的一个微卫星标记，进行了群体遗传变异的研究，并探索了该基因多态性位点与牙鲆生长性状之间的相关性。结果表明，2个群体在该位点检测到的等位基因数为12和9个，有效等位基因数为6.26和5.04个。两个群体该位点的Hardy-Weinberg遗传偏离指数均为正值，并没有显示出杂合子缺失，但各基因型分布频率都在一定程度上偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。连锁分析发现，在胶南群体中，IM基因型对应的个体在全重、全长、体长、头长、体高和眼径形态学数据中均是最大的，但仅在体重上极其显著的大于全部其它基因型个体；在日照群体中，BC基因型对应的个体在全重、全长、体高、尾柄高、尾柄长和眼径数据中均是最大的；而CJ基因型对应的个体在体长和头长这两组数据中是最大的。由此认为，该位点IM基因型可以作为牙鲆体重性状的潜在标记。 在进行牙鲆抗病性状标记的筛选时，利用迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）LSE40对牙鲆鱼进行攻毒感染实验，得到死亡群体和未死亡群体。选择Toll样受体基因中的TLR2、TLR3和TLR9基因作为候选基因，分别对这3个基因中的部分序列共设计7对引物进行扩增，同时对扩增产物进行RFLP多态性分析，目前只在TLR3基因内检测到一个EcoRI的酶切多态性位点，测序后发现，这是由于在TLR3基因第3806位的EcoRI酶切位点在某些个体中缺失所致。酶切产物共呈现出3种基因型，分别定义为AA，AB和BB。χ2检验证明该多态性位点与牙鲆抗迟缓爱德华氏菌LSE40的能力有一定关系。利用多因素非条件Logistic回归分析对死亡组和存活组牙鲆的各种形态学数据以及不同基因型之间进行了分析，发现体长、头长和体高均具有显著的相关性（P<0.05），而这几个因素与体重的相关性不显著（P>0.05）。多因素非条件Logistic分析后发现：AA基因型对死亡率具有显著的影响（P<0.05），是主要的危险因素，而AB基因型的作用不显著（P>0.05）；头长是主要的保护因素（P<0.05），体重对死亡率的影响很小。χ2检验证明，等位基因A是对死亡的主要危险等位基因，B是对存活有利的主要等位基因。推测该位点可以作为牙鲆抗迟缓爱德华氏菌的潜在标记。

栉孔扇贝抗鳗弧菌感染性状候选基因的多态性研究

栉孔扇贝（Chlamys farreri）是我国北方地区主要的养殖贝类之一，曾为沿海各省带来巨大的经济效益。但自1997年以来，陆续爆发的病害问题给扇贝养殖业造成了巨大的经济损失，严重影响了该产业的健康发展。目前认为培育抗病性强的扇贝优良品种是解决病害问题的根本途径。由于传统的育种方法费时费力，无法满足对良种的迫切需求，因此有必要通过分子手段加快抗病品种的培育步伐。标记辅助育种（marker assisted selection，MAS）是成功应用于动物育种中的分子手段之一，但由于缺乏与抗病性状相关的标记，MAS目前还无法在软体动物中得到应用。因此，寻找与抗病性状相关的分子标记是在软体动物中发展MAS的关键。 本研究利用鳗弧菌（Listonella anguillarum）对栉孔扇贝进行攻毒感染实验，初步得到敏感群体和抗病群体后采用PCR、PCR-RFLP、Bi-PASA PCR等方法研究了CfLysG、CfC1qDC和CfLITAF基因多态性及其与栉孔扇贝对鳗弧菌抗性的关系。 研究发现，栉孔扇贝CfLysG的基因序列中共有104个单核苷酸多态性（SNP）位点和29个插入/缺失（I/D）多态性位点。有17个多态性位点位于启动子区域，选择其中的-753 I/D、-391A/G和-284I/D多态性进行检测，发现这三个位点的基因型在敏感群体和抗病群体中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。其中-753 ID基因型和-284 ID基因在抗病群体中的频率高于在敏感群体中的频率，但两者之间无显著性差异（P>0.05）。-391 AG基因型在抗病群体中的频率显著高于敏感群体（P=0.007），表明-391 AG基因型与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性显著相关。为验证这一相关性，对-391位点不同基因型的扇贝进行攻毒感染实验。统计发现，具有-391 AA基因型的扇贝累计死亡率显著高于具有-391 AG基因型的扇贝（P=0.001），进一步证实了CfLysG基因-391 AG基因型与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性显著相关。CfLysG基因的外显子共有3处SNP，其中仅第三外显子上的+3473 A/C为非同义突变。统计分析表明，+3473位点不同基因型在敏感群体中的分布频率符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05），而在抗病群体中则偏离Hardy-Weinberg平衡（P<0.01）。+3473 AA基因型在抗病群体中的频率显著高于在敏感群体中的频率（P=0.022），表明+3473 AA基因型与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性显著相关。CfLysG基因第1内含子存在+96 I/D和+487 I/D两处大片段的I/D多态性。统计发现，这两个位点的基因型在敏感群体和抗病群体中的分布频率均符合Hardy-Weinberg 平衡（P>0.05）。其中+96 DD基因型和+487 ID基因型在抗病群体中的频率均略高于在敏感群体中的频率，但两者之间无显著性差异（P>0.05）。表明这两个位点的多态性与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性无显著相关性。对CfLysG基因各多态性位点的统计分析表明，各位点之间存在不同程度的连锁不平衡，提示有单体型的存在。对19种频率>1%的单体型在敏感群体及抗病群体中的频率进行分析，发现-753 I/-391 G/-284 I/+96 I/+487 D/+3473 A单体型在抗病群体中的频率显著高于敏感群体（P=0.044），表明该单体型与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性显著相关。 在栉孔扇贝CfC1qDC基因cDNA序列上共发现14处SNP。对+423 T/C多态性与栉孔扇贝对鳗弧菌抗性的关系进行了分析。统计发现，+423位点各基因型在敏感群体和抗病群体中的分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.05）。+423 TT基因型在抗病群体中的频率显著高于在敏感群体中的频率（P=0.005），表明+423 TT基因型与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性显著相关。 在栉孔扇贝CfLITAF基因cDNA序列中共发现3处SNP及1处I/D多态性。对+145 I/D多态性进行研究，发现所有敏感个体及抗病个体中均同时存在+145 位点所有等位基因，表明+145位点多态性与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性不相关。 以上研究表明，栉孔扇贝CfLysG基因-391 AG基因型、+3473 AA基因型、-753 I/-391 G/-284 I/+96 I/+487 D/+3473 A单体型以及CfC1qDC基因+423 TT基因型与栉孔扇贝对鳗弧菌的抗性显著相关，提示它们可作为与栉孔扇贝抗病相关的候选分子标记应用于贝类抗病育种中，为贝类的标记辅助育种提供参考。此外，抗病相关分子标记的发现还有利于加深对扇贝发病机理的理解，并有助于发掘预防及治疗贝类疾病的新方法。

中国近海栉孔扇贝群体遗传结构及遗传变异与生长的关系

本文以凝胶电泳方法，以等位基因酶和可溶性蛋白为探针研究了中国近海栉孔扇贝(Chlamys farreri)5个不同自然分布群体的遗传结构及遗传变异与生长的关系。在所研究的23个位点中，只有Mdh-1在5个群体中为纯合状态，其余位点都不同程度地处于多态或杂合态。大多数位点的等位基因及基因型分布频率都处在不平衡状态。对各位点的D值检验表明，大多数位点都杂合子缺失。杂合子过剩或处于Hardy-Weinberg平衡的位点为19.64-22.32%。杂合度以海洋岛和长岛群体最高，都是0.304，荣成和大连群体次之，分别为0.290和0.287，青岛群体为0.219。位点有效等位基因数及密码子差数在群体间的变化与杂合度基本一致。用这三个参数构建的遗传变异综合评价指数在这5个群体从北至南依次为0.726，0.542，0.658，0.547和0.133。多态位点比例在P ≤ 0.99水平下，海洋、大连、长岛及荣成4个群体都在0.800以上，仅青岛群体为0.565。在Est7个位点从高纬度向低纬度在等位基因数目上存在梯度递减渐变性。在某些等位基因的分布频率或从高纬度或从低纬度向相对方向递变。除了单向渐变外，也存在双向渐变现象。栉孔扇贝这5个群体在遗传相似性方面基本上是群体间的差异（I > 0.900）。相比之下，大连、长岛两群体间的相似性最大。由于辽东沿岸流和黄海冷水团的作用，海洋岛群体与邻近群体的基因交流较差，使之在遗传上相对较为独立。从遗传变异不平、杂合子缺失特征及等位基因的渐变性也证明，该群体已具相当程度的分化，这主要是由于环境隔离所造成的“孤岛效应”的结果。通过对5个群体形态数量性状生与群体遗传变异的比较表明，遗传变异不平较高的群体，其生长速度也较快，二者基本呈平行关系，唯海洋岛与长岛的结果相悖，其原因可能与两海区间初级生产力水平有关。从个体杂合度与第一年生长壳高关系的研究可以发现，海洋、大连和青岛群体在杂合度与生长间基本呈正相关关系，而在长岛与荣成群体内存在杂合度与生长具不同相关性的子群体，并证明个体杂合度超过0.300以上，其与生长的关系基本上处于不定向状态。在环境和遗传双重压力下，青岛群体的变异水平较低。

Yellow perch strain evaluation I: Genetic variance of six broodstock populations

As a prelude to strain selection for domestication and future marker assisted selection, genetic variation revealed by microsatellite DNA was evaluated in yellow perch, Perca flavescens, from four wild North American populations collected in 2003-2004 (Maine, New York, North Carolina, and Pennsylvania,), and two captive populations (Michigan and Ohio). For the loci examined, levels of heterozygosity ranged from H-e=0.04 to 0.88, genetic differentiation was highly significant among all population pairs, and effective migration ranged from low (N(e)m=0.3) to high (N(e)m=4.5). Deviation from Hardy-Weinberg equilibrium was regularly observed indicating significant departures from random mating. Instantaneous measures of inbreeding within these populations ranged from near zero to moderate (median F=0.16) and overall inbreeding levels averaged F-IS=0.18. Estimates of genetic diversity, Phi(ST), and genetic distance were highest between Michigan and all other broodstock groups and lowest between New York and Ohio. Genetic differentiation among groups did not correlate with geographic distance. Overall, the patterns of variation exhibited by the captive (Michigan and Ohio) populations were similar to patterns exhibited by the other wild populations, indicating that spawning and management practices to date have not significantly reduced levels of genetic variation. (C) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Comparação da taxas de crescimento populacional em artrópodes utilizando testes permutacionais.

Taxas de crescimento populacional são importantes indicadores em estudos sobre a eficiência de espécies de artrópodes como agentes de controle biológico e aspectos de biossegurança relacionados ao possível impacto de agentes biológicos sobre artrópodes não alvo (MAIA et al., 2000). Nesses estudos, dados de oviposição e sobrevivência de cada um dos tratamentos avaliados são condensados em tabelas de vida e fertilidade (TBVF), para posterior estimação dos parâmetros populacionais: taxa líquida de reprodução (Ro), taxas intrínsecas de crescimento (Rm), tempo de duplicação (Dt), intervalo entre geraçãoes (T) e razão finita de crescimento (Lambda). Os testes estatísticos para comparação de grupos com relação a esses parâmetros requerem a quantificação das incertezas (variância, erro padrão, intervalos de confiança) associada às suas respectivas estimativas, em cada grupo. As estimativas dessas incertezas são tradicionalmente obtidas utilizando o método jackknife. Como alternativa aos testes que utilizam estimativas jackknife da variância, propomos o uso de testes permutacionais (MANLY, 1991). Os testes permutacionais (TP) utilizam distribuições empíricas, geradas via alocações aleatórias das unidades experimentais aos tratamentos (grupos). Tais distribuições empíricas são utilizadas testar hipóteses sobre os parâmetros de interesse.

The effect of the product cost factor on error handling in industrial robots

N.W. Hardy and M.H. Lee. The effect of the product cost factor on error handling in industrial robots. In Maria Gini, editor, Detecting and Resolving Errors in Manufacturing Systems. Papers from the 1994 AAAI Spring Symposium Series, pages 59-64, Menlo Park, CA, March 1994. The AAAI Press. Technical Report SS-94-04, ISBN 0-929280-60-1.

An application of a multiple agent system for flexible assemble tasks

C.H. Orgill, N.W. Hardy, M.H. Lee, and K.A.I. Sharpe. An application of a multiple agent system for flexible assemble tasks. In Knowledge based envirnments for industrial applications including cooperating expert systems in control. IEE London, 1989.

Automatic diagnosis of task faults in flexible manufacturing systems

Hardy, N. W., Barnes, D. P., Lee, L. H. (1989). Automatic diagnosis of task faults in flexible manufacturing systems. Robotica, 7 (1):25-35

A software development package for intelligent supervisory systems

Barnes, D. P., Hardy, N. W., Lee, M. H., Orgill, C. H., Sharpe, K. A. I. A software development package for intelligent supervisory systems. In Proc. ACME Res. Conf., Nottingham, September 1988, pp. 4

Experiences with a knowledge engineering toolkit: an assessment in industrial robotics

V. Robinson, N. W. Hardy, D. P. Barnes, C. J. Price, M. H. Lee. Experiences with a knowledge engineering toolkit: an assessment in industrial robotics. Knowledge Engineering Review, 2 (1):43-54, 1987.

Declarative sensor knowledge in a robot monitoring system

Hardy, N. W., Barnes, D. P., Lee, M. (1987). Declarative sensor knowledge in a robot monitoring system. In: Languages for Sensor-Based Control in Robotics, Ulrich Rembold and Klaus H?rmann (eds), Springer-Verlag, p. 169-188.

Research into error recovery for sensory robots

Lee, M., Barnes, D. P., Hardy, N. (1985). Research into error recovery for sensory robots. Sensor Review, 5 (4), 194-197.

Research into automatic error recovery

Lee, M., Hardy, N., & Barnes, D. P. (1984). Research into automatic error recovery. 65-69. Paper presented at 4th International Conference on Robot Vision and Sensory Controls, London, London, United Kingdom.

Knowledge engineering in robot control

N. W. Hardy, M. H. Lee, and D. P. Barnes. Knowledge engineering in robot control. In Proceedings of Expert Systems '83, pages 70-77, Cambridge, 1983.