MMP-9/CD44 : un nouveau complexe ligand/récepteur impliqué dans la régulation de la fonction des cellules musculaires lisses bronchiques humaines

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Rôle du tissu adipeux dans l’effet cardioprotecteur du EP 80317, un ligand sélectif du récepteur CD36

Le récepteur CD36 est impliqué dans le transport des acides gras libres non estérifiés (AGNE) au niveau des tissus cardiaque et périphériques. Les dommages tissulaires et la dysfonction cardiaque observés après une ischémie-reperfusion (I/R) du myocarde sont en partie liés à l’internalisation et au métabolisme oxydatif accrus des AGNE dont la concentration sanguine augmente transitoirement après un infarctus du myocarde, contrairement à ce qui est observé chez des souris déficientes en CD36. Nous avons émis l’hypothèse selon laquelle le EP 80317, un ligand synthétique du récepteur CD36, exercerait un effet cardioprotecteur contre les dommages induits par une ischémie transitoire du myocarde. Nos objectifs étaient 1) de vérifier l’effet cardioprotecteur du EP 80317 et 2) de définir son mécanisme, plus précisément de documenter l’effet du traitement sur le métabolisme lipidique. À cette fin, des souris de type sauvage ont été traitées par le EP 80317 (289 nmol/kg) par voie sous-cutanée pendant 14 jours avant d’être soumises à 30 minutes d’ischémie suivant la ligature de l’artère coronaire gauche descendante et de sa reperfusion pendant une période de 6 ou 48 heures. Le cœur et les tissus périphériques (foie, muscle squelettique et dépôts adipeux) ont été prélevés pour déterminer le profil de certains gènes impliqués dans la régulation du métabolisme lipidique. Nos travaux ont montré que l’effet cardioprotecteur d’un traitement préventif par le EP 80317 est associé à une augmentation transitoire du stockage des triglycérides et d’une réduction des AGNE circulants.

Les récepteurs 5-HT4b adoptent différentes conformations ligand-spécifique ayant des propriétés de signalisation et de régulation distinctes

Les antidépresseurs actuels sont très similaires au niveau de leur mécanisme d’action et sont plus ou moins efficaces. Un des problèmes majeurs est leur long temps de latence à fournir une action thérapeutique dû aux adaptations des sites pré et post synaptiques. Dans un modèle animal, nous avons récemment découvert que l’agoniste RS67333 des récepteurs 5-HT4 était en mesure de produire en trois jours les mêmes effets antidépresseurs qui normalement prennent de deux à trois semaines à apparaître avec les antidépresseurs actuellement disponibles. De plus, nous avons constaté que les effets antidépresseurs de cet agoniste possédaient une résistance à la tolérance. Il y a d’autres agonistes du même récepteur, tel que le prucalopride qui ne produit pas d’effets antidépresseurs comme RS67333. Étant donné que l’efficacité du Prucalopride à stimuler les 5-HT4Rs est similaire sinon plus grande que celle de RS67333, nous avons énoncé l’hypothèse que le récepteur 5-HT4 pourrait adopter différentes conformations actives suite à son activation par différents agonistes. Nous avons ainsi décidé d’explorer les principales réponses fonctionnelles des récepteurs 5-HT4B en observant leurs propriétés de régulation et de signalisation. Nous avons montré que l’isoforme B du récepteur 5-HT4, étant hautement exprimé dans le système limbique, détient une signalisation et une régulation différentes dépendant du ligand activateur. Nos résultats indiquent que chacun des agonistes testés (5-HT, RS67333, ML10302, Zacopride, Prucalopride) modulent distinctivement la production d’AMPc et l’internalisation du récepteur. Les résultats nous ont clairement permis de déterminer que les agonistes possèdent une efficacité et ou puissance différentes les uns par rapport aux autres. De plus, l’ordre d’efficacité des agonistes à moduler la voie de l’AMPc était (Prucalopride > Zacopride = ML10302 = 5-HT > RS67333) et est différente de leur ordre d’efficacité à induire la régulation du récepteur par internalisation (5-HT > Zacopride > Prucalopride > ML10302 = RS67333). Ainsi, nous avons montré que les 5-HT4Rs adoptent des conformations qui sont ligand-spécifiques. Cela implique que la sélectivité fonctionnelle serait un facteur important à considérer dans les mécanismes d’action antidépresseur des agonistes de ce récepteur.

Use of cellular impedance to characterize ligand functional selectivity at G protein-coupled receptors

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) représentent la plus grande famille de cibles thérapeutiques pour le traitement d’une panoplie de pathologies humaines. Bien que plusieurs décennies de recherche aient permis de façonner nos connaissances sur ces protéines membranaires, notre compréhension des déterminants moléculaires de leur activité signalétique reste encore limitée. De ces domaines de recherche, une avancée récente a mis à jour un nouveau phénomène, appelé sélectivité fonctionnelle des ligands, qui a bouleversé les paradigmes décrivant leu fonctionnement de ces récepteurs. Ce concept émane d’observations montrant que l’activité pharmacologique de certains ligands n’est pas nécessairement conservée sur tout le répertoire signalétiques connu du récepteur et peu se restreindre à l'activation sélective d’un sous-groupe de voies de signalisation.Ce nouveau modèle pharmacologique de l'activation des RCPG ouvre de nouvelles possibilités pour la découverte de médicaments plus efficace et sûr, ciblant les RCPGs. En effet, il permet la conception de molécules modulant spécifiquement les voies signalétiques d’intérêt thérapeutique, sans engager les autres voies qui pourraient mener à des effets secondaires indésirables ou de la tolérance. Cette thèse décrit l'utilisation d'une nouvelle approche sans marquage, basée sur la mesure du changement l'impédance cellulaire. Par la mesure des changements cellulaires, comme la morphologie, l’adhésion et/ou la redistribution des macromolécules, cette approche permet de mesurer de façon simultanée l'activité de plusieurs voies de signalisation impliqués dans ces réponses. Utilisant le récepteur β2-adrénergique (β2AR) comme modèle, nous avons démontré que les variations dans l’impédance cellulaire étaient directement liées à l’activation de multiples voies de signalisation suite à la stimulation du récepteur par son ligand. L’agoniste type du β2AR, l’isoprotérénol, s’est avéré induire une réponse d’impédance dose-dépendante constituée, dans le temps, de plusieurs caractéristiques distinctes pouvant être bloquées de façon compétitive par l’antagoniste ICI118,551 Par l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs, nous avons été en mesure de déterminer la contribution de plusieurs voies signalétiques canoniques, comme les voies dépendantes de Gs et Gi, la production d’AMPc et l’activation de ERK1/2, sur ces changements. De plus, la dissection de la réponse d’impédance a permis d’identifier une nouvelle voie de mobilisation du Ca2+ contribuant à la réponse globale des changements initiés par la stimulation du β2AR. Dans une autre étude, nous avons rapporté que la réponse calcique induite par le β2AR serait attribuable à une transactivation Gs-dépendant du récepteur purinergique P2Y11, lui-même couplé à la protéine Gq. La mesure d’impédance permettant de distinguer et de décrire une pléiade d’activités signalétiques, nous avons émis l’hypothèse que des ligands arborant des profils signalétiques différents généreraient des réponses d’impédance distinctes. Le criblage d’une librairie de ligands spécifiques au β2AR a révélé une grande variété de signatures d’impédance. Grâce au développement d’une approche computationnelle innovatrice, nous avons été en mesure de regrouper ces signatures en cinq classes de composés, un regroupement qui s’est avéré hautement corrélé avec le profil signalétique des différents ligands. Nous avons ensuite combiné le criblage de composés par impédance avec l’utilisation d’inhibiteurs sélectifs de voies signalétiques afin d’augmenter la résolution du regroupement. En évaluant l’impact d’une voie signalétique donnée sur la signature d’impédance, nous avons été en mesure de révéler une plus grande variété de textures parmi les ligands. De plus, cette méthode s’est avérée efficace pour prédire le profil signalétique d’une librairie de composés non caractérisés, ciblant le β2AR. Ces travaux ont mené à l’élaboration d’une méthode permettant d’exprimer visuellement la sélectivité fonctionnelle de ligands et ont révélé de nouvelles classes de composés pour ce récepteur. Ces nouvelles classes de composés ont ensuite été testées sur des cardiomyocytes humains, confirmant que les composés regroupés dans différentes classes produisent des effets distincts sur la contractilité de ces cellules. Globalement, ces travaux démontrent la pertinence de l’utilisation de l’impédance cellulaire pour une évaluation précise des différences fonctionnelles parmi les composés ciblant les RCPGs. En fournissant une représentation pluridimensionnelle de la signalisation émanant des RCPGs à l’aide d’un seul essai ne requérant pas de marquage, les signatures d’impédance représentent une stratégie simple et innovante pour l’évaluation de la fonctionnalité sélective des ligands. Cette méthode pourrait être d’une grande utilité dans le processus de découverte de nouveaux médicaments.

Design, synthèse et application en catalyse verte d’un ligand alkyl imidazolium β-cyclodextrine

Le 21e siècle est le berceau d’une conscientisation grandissante sur les impacts environnementaux des processus utilisés pour synthétiser des molécules cibles. Parmi les avancées qui ont marqué ces dernières décennies, il est également question de réduction de déchets, de conservation de l’énergie et de durabilité des innovations. Ces aspects constituent les lignes directrices de la chimie verte. De ce fait, il est impératif de développer des stratégies de synthèse dont les impacts environnementaux sont bénins. Dans ce mémoire nous présentons la synthèse, la caractérisation et l’étude des propriétés catalytiques en milieu aqueux d’un ligand composé d’une unité -cyclodextrine native, d’une unité imidazolium et d’une chaine alkyle à 12 carbones. Ce ligand hybride s’auto-assemble dans l’eau sous forme de micelles, permettant ainsi d’effectuer en sa présence des couplages de Suzuki-Miyaura dans l’eau, avec de bons rendements. La fonctionnalisation de la face primaire de la -cyclodextrine par un noyau alkyl-imidazolium, précurseur de ligand de type carbène N-hétérocyclique, a permis le développement d’un système catalytique vert et hautement recyclable. Dans un deuxième temps, nous présentons l’utilisation du même ligand hybride dans des couplages de Heck dans l’eau, démontrant ainsi la versatilité du ligand.

Étude de la régulation de l'activité du ligand Delta dans le cadre de la signalisation Notch

La voie de signalisation Notch est conservée au cours de l'évolution. Elle joue un rôle clé dans le développement, et elle est impliquée dans de nombreuses décisions de destin cellulaire, dans le maintien des cellules souches, et dans le contrôle de la prolifération et de la différenciation cellulaires. Une dérégulation de la signalisation Notch est impliquée dans diverses maladies et cancers, y compris les tumeurs solides, comme les cancers du sein et du col de l'utérus, et les leucémies, comme la Leucémie Aiguë Lymphoblastique des cellules T (LAL-T). Notch est un récepteur transmembranaire activé par des ligands transmembranaires de la famille DSL (Delta/Serrate/Lag-2). Bien que plusieurs mutations oncogéniques ont été identifiées au niveau du récepteur Notch, de nombreux cancers modulés par Notch demeurent ligand-dépendants. Étonnamment, les mécanismes moléculaires régulant l'activation du ligand sont encore relativement peu caractérisés par rapport à ceux qui régissent le récepteur Notch lui-même. Utilisant un essai de co-culture avec un rapporteur luciférase de Notch, nous avons effectué le premier crible d'ARNi pan-génomique visant spécifiquement à identifier des régulateurs des ligands de Notch dans la cellule émettrice du signal. Nous avons ainsi pu découvrir de nouvelles classes de régulateurs communs pour les ligands Delta-like1 et 4. Ces régulateurs comprennent des inhibiteurs de protéases, des facteurs de transcription, et des gènes divers à fonction inconnue, tels que Tmem128 « Transmembrane protein 128 », ou à fonction préalablement caractérisée tels que la co-chaperonne moléculaire Cdc37 « Cell division cycle 37 homolog ». Par la suite, nous avons développé des cribles secondaires fonctionnels où nous avons démontré l'importance de ces régulateurs pour des événements Notch-dépendants, comme la différenciation des cellules T normales, et la survie des cellules souches pré-leucémiques isolées à partir d'un modèle murin de LAL-T. En outre, nous avons prouvé que les régulateurs les plus forts du crible de survie sont également nécessaires pour l'activité d'auto-renouvellement des cellules souches pré-leucémiques. Finalement, nous avons entamé une caractérisation moléculaire préliminaire de deux régulateurs nouvellement identifiés; Tmem128 et Cdc37 afin d'étudier leur mécanisme d'action sur les ligands. En conclusion, cette étude nous a permis d'identifier de nouveaux régulateurs de la voie Notch qui pourraient servir de cibles thérapeutiques potentielles dans les cancers; tel qu'illustré par le modèle LAL-T. La compréhension des détails moléculaires sous-jacents aux fonctions de ces régulateurs sera essentielle afin de développer des inhibiteurs pharmacologiques pour bloquer leur action et entraver la signalisation Notch dans le cancer.

Macrocyclic molecular square complex of zinc(II) self-assembled with a carbohydrazone ligand

A novel N4O coordination mode offers carbohydrazone ligands as a building block for interesting frameworks through self-assembly. Bridging mode of oxygen of bis(2-benzoylpyridine ketone) carbohydrazone (H2L) with metal centers facilitates the formation of the macrocyclic molecular square [Zn(HL)]4(BF4)4 · 10H2O, offers wide range of applications for carbohydrazones.

Crystal Structures and Spectral Investigation of Aroylhydrazones and their Mixed Ligand Metal Chelates

Supra molecular architectures of coordination complexes of liydrazones through non covalent interactions have been explored. Molecular self—assernbly driven by weak interactions such as hydrogen— bonding, K '”T[, C-1-I‘ "TE, van der Waals interactions, and so forth are currently of tremendous research interest in the fields of molecule based materials. The directional properties of the hydrogembonding interaction associate discrete molecules into aggregate structures that are sufficiently stable to be considered as independent chemical species. Chemistry can borrow nature’s strategy to utilize hydrogen-bonding as Well as other noncovalent interactions as found in secondary and tertiary structures of proteins such as the double helix folding of DNA, hydrophobic selflorganization of phospholipids in cell membrane etc. In supramolecular chemistry hydrogen bonding plays an important role in forming a variety of architectures. Thus, the wise modulation and tuning of the complementary sites responsible for hydrogen—bond formation have led to its application in supramolecular electronics, host-guest chemistry, self-assembly of molecular capsules, nanotubes etc. The work presented in this thesis describes the synthesis and characterization of metal complexes derived from some substituted aroylhydrazones. The thesis is divided into seven chapters.

The role of dynamical polarization of the ligand-to-metal charge transfer excitations in the ab initio determination of effective exchange parameters

The role of the bridging ligand on the effective Heisenberg coupling parameters is analyzed in detail. This analysis strongly suggests that the ligand-to-metal charge transfer excitations are responsible for a large part of the final value of the magnetic coupling constant. This permits us to suggest a variant of the difference dedicated configuration interaction (DDCI) method, presently one of the most accurate and reliable for the evaluation of magnetic effective interactions. This method treats the bridging ligand orbitals mediating the interaction at the same level than the magnetic orbitals and preserves the high quality of the DDCI results while being much less computationally demanding. The numerical accuracy of the new approach is illustrated on various systems with one or two magnetic electrons per magnetic center. The fact that accurate results can be obtained using a rather reduced configuration interaction space opens the possibility to study more complex systems with many magnetic centers and/or many electrons per center.

Crystal Structures and Spectral Aspects of Mixed Ligand Transition Metal Chelates Derived from Aldehyde based ONS Donor Thiosemicarbazones

Thiosemicarbazones have emerged as an important class of ligands over a period of time, for a variety of reasons, such as variable donor properties, structural diversity and biological applications. Interesting as the coordination chemistry may be, the driving force for the study of these ligands has undoubtedly been their biological properties and the majority of the 3000 or so publications on thiosemicarbazones since 2000 have alluded to this feature. Thiosemicarbazones with potential donor atoms in their structural skeleton fascinate coordination chemists with their versatile chelating behavior. The thiosemicarbazones of aromatic aldehydes and ketones form stable chelates with transition metal cations by utilizing both their sulfur and azomethine nitrogen as donor atoms. They have been shown to possess a diverse range of biological activities including anticancer, antitumor, antibacterial, antiviral, antimalarial and antifungal properties owing to their ability to diffuse through the semipermeable membrane of the cell lines. The enhanced effect may be attributed to the increased lipophilicity of the metal complexes compared to the ligand alone.

Synthesis, characterization and physiochemical information, along with antimicrobial studies of some metal complexes derived from an ON donor semicarbazone ligand

Eight new transition metal complexes of benzaldehyde-N(4)–phenylsemicarbazone have been synthesized and characterized by elemental analyses, molar conductance, electronic and infrared spectral studies. In all the complexes, the semicarbazone is coordinated as neutral bidentate ligand. 1H NMR spectrum of [Zn(HL)2(OAc)2] shows that there is no enolisation of the ligand in the complex. The magnetic susceptibility measurements indicate that Cr(III), Mn(II), Fe(III), Co(II) and Cu(II) complexes are paramagnetic and Ni(II) is diamagnetic. The EPR spectrum of [Mn(HL)2(OAc)2] in DMF solution at 77K shows hyperfine sextet with low intensity forbidden lines lying between each of the two main hyperfine lines. The g values calculated for the [Cu(HL)2SO4] complex in frozen DMF, indicate the presence of unpaired electron in the dx2−y2 orbital. The metal ligand bonding parameters evaluated showed strong in-plane bonding and in-plane bonding. The ligand and complexes were screened for their possible antimicrobial activities.

Synthesis and spectral investigations of vanadium(IV/V) complexes derived from an ONS donor thiosemicarbazone ligand

Four oxovanadium and one dioxovanadium complex with 2-hydroxyacetophenone N(4)- phenylthiosemicarbazone (H2L) which are represented as [VOLphen]·2H2O (1), [VOLbipy] (2), [VOLdmbipy] (3), [VOL]2 (4) and [VO2HL]·CH3OH (5) have been synthesized and characterized by elemental analyses, electronic, infrared and EPR spectral techniques. In all the complexes 1–4 the ligand coordinates through phenolic oxygen, azomethine nitrogen and thiolate sulfur. But in complex [VO2HL]·CH3OH, coordination takes place in thione form instead of thiolate sulfur. All the complexes except [VO2HL]·CH3OH are EPR active due to the presence of an unpaired electron. In frozen DMF at 77 K, all the oxovanadium(IV) complexes show axial anisotropy with two sets of eight line patterns

Versatile binding properties of a di-2-pyridyl ketone nicotinoylhydrazone ligand: Crystal structure of a Cu(II) complex

Six new copper complexes of di-2-pyridyl ketone nicotinoylhydrazone (HDKN) have been synthesized. The complexes have been characterized by a variety of spectroscopic techniques and the structure of [Cu(DKN)2]·H2O has been determined by single crystal X-ray diffraction. The compound [Cu(DKN)2]·H2O crystallized in the monoclinic space group P21 and has a distorted octahedral geometry. The IR spectra revealed the presence of variable modes of chelation for the investigated ligand. The EPR spectra of compounds [Cu2(DKN)2( -N3)2] and [Cu2(DKN)2( -NCS)2] in polycrystalline state suggest a dimeric structure as they exhibited a half field signal, which indicate the presence of a weak interaction between two Cu(II) ions in these complexes

Analyse von Protein-Ligand Interaktionen zur Charakterisierung zyklonukleotidbindender Proteine

Hyperpolarisations-aktivierte zyklonukleotid-gesteuerte (HCN) Kanäle übernehmen wichtige Funktionen in der Regulation der Herz- und Neuronalaktivität und können über einen dualen Mechanismus aus Membranhyperpolarisation und der Bindung von zyklischen Nukleotiden aktiviert werden. Ein großes Ziel der aktuellen Forschung ist die Entwicklung neuartiger Inhibitoren, die einer Fehlregulation der Kanäle entgegenwirken. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation von HCN Kanälen durch zyklische Nukleotide im Detail analysiert, indem erstmals ein umfassender Screen mit 48 unterschiedlichen Zyklonukleotid-Analoga am C-terminalen Bereich (bestehend aus C-Linker und Zyklonukleotid-Bindedomäne) der drei Isoformen HCN1, HCN2 und HCN4 durchgeführt wurde. Mit Hilfe eines Fluoreszenzpolarisations-Assays wurde der Einfluss von Modifikationen in der Base, der Ribose und dem zyklischen Phosphat auf die Bindungsaffinitäten innerhalb der Zyklonukleotid-Bindedomäne untersucht. Zyklonukleotid-Analoga mit Modifikationen an der Position 7 und 8 der Base verschoben die apparenten Affinitäten im Vergleich zu den beiden natürlich vorkommenden Zyklonukleotiden cAMP und cGMP vom mikromolaren in den nanomolaren Bereich. Selektiv für die HCN4 Isoform erwiesen sich Zyklonukleotid-Analoga mit Modifikationen an der Position 6 der Base, während Modifikationen an der Position 8 der Base zu einer höheren Affinität für die HCN2 Isoform führten. Im Gegensatz zu HCN2 und HCN4 zeigte die HCN1 Isoform besonders hohe Affinitäten für Zyklonukleotid-Analoga mit Modifikationen an der Position 8 von cGMP. Eine Substitution der 2’-Hydroxylgruppe erlaubte keine Bindung an die HCN Kanäle. Mit 7-CH-cAMP konnte ein hochaffines Bindemolekül für HCN Kanäle identifiziert werden, denn der Austausch eines Stickstoffs gegen eine CH-Einheit an Position 7 der Base führte zu einer 100-fachen Steigerung der Affinität im Vergleich zu cAMP. In Übereinstimmung mit der hochaffinen Bindung konnte in kinetischen Analysen eine langsamere Dissoziationsrate für 7-CH-cAMP gemessen werden. Anhand thermodynamischer Messungen konnte ein entropisch favorisierter Bindungsmodus für 7-CH-cAMP im Vergleich zu cAMP identifiziert werden. Basierend auf einer Kristallstruktur des HCN4 CNBD:7-CH-cAMP Komplexes (2,5 Å) lässt sich erklären, dass 7-CH-cAMP durch seine höhere Lipohilie im Vergleich zu cAMP eine stärkere Präferenz für das hydrophobe Netzwerk zwischen Protein und Base besitzt. In detaillierten, vergleichenden Analysen mit den zyklonukleotidbindenden Proteinen PKA Typ I und II, hPKGIβ und Epac 1 und 2 konnte gezeigt werden, dass 7-CH-cAMP die höchsten Affinitäten für die drei Isoformen der HCN Kanäle aufwies. Somit könnte sich 7-CH-cAMP als vielversprechender Kandidat für die selektive Regulation von HCN Kanälen in vitro und in lebenden Zellen eignen und möglicherweise einen wichtigen Beitrag als krankheitsrelevanter Effektor leisten.

SCAPA (Spacially Addressable Protein Array) – a Novel Protein Array for the Differential Profiling of Ligand-receptor Induced Signalling

While protein microarray technology has been successful in demonstrating its usefulness for large scale high-throughput proteome profiling, performance of antibody/antigen microarrays has been only moderately productive. Immobilization of either the capture antibodies or the protein samples on solid supports has severe drawbacks. Denaturation of the immobilized proteins as well as inconsistent orientation of antibodies/ligands on the arrays can lead to erroneous results. This has prompted a number of studies to address these challenges by immobilizing proteins on biocompatible surfaces, which has met with limited success. Our strategy relates to a multiplexed, sensitive and high-throughput method for the screening quantification of intracellular signalling proteins from a complex mixture of proteins. Each signalling protein to be monitored has its capture moiety linked to a specific oligo ‘tag’. The array involves the oligonucleotide hybridization-directed localization and identification of different signalling proteins simultaneously, in a rapid and easy manner. Antibodies have been used as the capture moieties for specific identification of each signaling protein. The method involves covalently partnering each antibody/protein molecule with a unique DNA or DNA derivatives oligonucleotide tag that directs the antibody to a unique site on the microarray due to specific hybridization with a complementary tag-probe on the array. Particular surface modifications and optimal conditions allowed high signal to noise ratio which is essential to the success of this approach.