哺乳动物生长激素/泌乳刺激素基因超家族的分子进化研究

生长激素（Growthhormone，GH）和泌乳刺激素（Prolactin，PRL）基因具有相似的结构和功能，它们和其他一些相关基因组成了GH/PRL基因超家族。在大部分哺乳动物基因组中，GH和PRL都是单拷贝基因。但在灵长目动物中，PRL是单拷贝基因，GH基因却发生了串联重复事件，形成一个基因家族。而在啮齿目中则相反，GH是单拷贝的，PRL却发生了串联重复事件形成一个基因家族。用PCR、克隆、测序的方法，我们从7种灵长目动物中得到了35条GH－类似基因。系统发育分析的结果显示所有旧大陆猴／人猿超科（OWM/H）的GH一类似基因和所有新大陆猴（NWM）的GH-类似基因分别形成两个单系，提示新大陆猴的GH基因家族和旧大陆猴／人猿超科GH基因家族起源于独立的基因重复事件。我们的分析结果还提示在。H基因家族的进化历程中发生了多次基因重复和基因转换事件。此外，不同GH基因家族成员的进化速率和所受到的选择压力存在显著差异。GHN基因在人猿超科和旧大陆猴中进化速率都比较慢，且受到了很强的纯化选择的作用；而CSH基因在两个世系中进化速率都比较快而且可能受到近中性选择的作用；GHV的进化速率和选择压力在旧大陆猴和人猿超科之间存在显著差异。对于新大陆猴GH基因家族，我们发现3个主要的功能基因簇，有趣的是这3个基因簇分别受到了纯化选择、近中性选择和正选择3种不同类型的选择压力。进一步分析的结果显示GH基因家族的进化符合所谓"生一和一灭（Birth-and-death）"的进化模式，该模式以频繁的基因重复和假基因化为主要特征。啮齿目泌乳刺激素基因家族由多个结构相似、在染色体上串联排列的基因组成，创门主要在生殖过程中协调作用。我们利用生物信息学手段在大鼠中得到了两个新的家族成员。结合系统发育、基因转换分析及染色体相对位置的比较，我们认为啮齿目PRL基因家族中的PL-I和PL-II基因亚家族是在大、小鼠分歧之后由物种特异的基因重复事件形成的。此外，啮齿目PRL基因家族的进化历程较复杂，因为除了通常的5-外显子结构的基因外，该家族还包含6-外显子结构的基因，后者在前者的第2和第3外显子之间获得了一个额外的外显子。本研究中我们意外地发现这个外显子在两个基因簇中的起源方式并不相同。在groupA中，它来源于一段外源DNA的插入，而在groupB中则来源于原先的非编码序列。对同义替换和异义替换速率比较的结果显示，在这些获得额外外显子的基－因中纯化选择压力得到了放松。激素蛋白必须与其受体结合经过信号传导才能发挥其生物学功能，因此，研究激素和受体的协同进化就显得尤为重要。我们对哺乳动物泌乳刺激素基因和其受体（PRLR）基因进行了协同进化分析，结果发现哺乳动物PRLR的膜外区和膜内区显示出和PRL一致的"插曲"式的进化模式。皮耳森相关系数计算的结果说明PRLR的膜外区和PRL基因发生了协同进化，同时PRLR的两个功能区域：膜外区和膜内区之间也发生了协同进化。此外，我们还发现灵长目PRL基因也发生了和GH基因类似的"插曲"式的进化，而且快速进化可能是选择压力放松的结果。

Identification of an Atlantic salmon IFN multigene cluster encoding three IFN subtypes with very different expression properties

A cluster of 11 interferon (IFN) genes were identified in the Atlantic salmon genome linked to the growth hormone I gene. The genes encode three different IFN subtypes; IFNa (two genes), IFNb (four genes) and IFNc (five genes), which show 22-32% amino acid sequence identity. Expression of the fish IFNs were studied in head kidney, leukocytes or To cells after stimulation with the dsRNA poly I:C or the imidazoquinoline S-27609. In mammals, poly I:C induces IFN-beta through the RIG-I/MDA5 or the TLR3 pathway, both of which are dependent on NF-kappa B. In contrast, S-27609 induces mammalian IFN-alpha in plasmacytoid dendritic cells through the TLR7 pathway independent of NF-kappa B. The presence of an NF-kappa B site in their promoters and their strong up-regulation by poly I:C, suggest that salmon IFNa1/IFNa2 are induced through similar pathways as IFN-beta. In contrast, the apparent lack of NF-kappa B motif in the promoter and the strong upregulation by S-27609 in head kidney and leukocytes, suggest that IFNb genes are induced through a pathway similar to mammalian IFN-alpha. IFNc genes showed expression patterns different from both IFNa and IFNb. Taken together, salmon IFNa and IFNb are not orthologs of mammalian IFN-beta and IFN-alpha, respectively, but appear to utilize similar induction pathways. (C) 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Identifying novel molecular mechanisms of ghrelin receptor signalling underlying neural control of food intake: interaction with stress and impulsivity

The gut-hormone, ghrelin, activates the centrally expressed growth hormone secretagogue 1a (GHS-R1a) receptor, or ghrelin receptor. The ghrelin receptor is a G-protein coupled receptor (GPCR) expressed in several brain regions, including the arcuate nucleus (Arc), lateral hypothalamus (LH), ventral tegmental area (VTA), nucleus accumbens (NAcc) and amygdala. Activation of the GHS-R1a mediates a multitude of biological activities, including release of growth hormone and food intake. The ghrelin signalling system also plays a key role in the hedonic aspects of food intake and activates the dopaminergic mesolimbic circuit involved in reward signalling. Recently, ghrelin has been shown to be involved in mediating a stress response and to mediate stress-induced food reward behaviour via its interaction with the HPA-axis at the level of the anterior pituitary. Here, we focus on the role of the GHS-R1a receptor in reward behaviour, including the motivation to eat, its anxiogenic effects, and its role in impulsive behaviour. We investigate the functional selectivity and pharmacology of GHS-R1a receptor ligands as well as crosstalk of the GHS-R1a receptor with the serotonin 2C (5-HT2C) receptor, which represent another major target in the regulation of eating behaviour, stress-sensitivity and impulse control disorders. We demonstrate, to our knowledge for the first time, the direct impact of GHS-R1a signalling on impulsive responding in a 2-choice serial reaction time task (2CSRTT) and show a role for the 5-HT2C receptor in modulating amphetamine-associated impulsive action. Finally, we investigate differential gene expression patterns in the mesocorticolimbic pathway, specifically in the NAcc and PFC, between innate low- and high-impulsive rats. Together, these findings are poised to have important implications in the development of novel treatment strategies to combat eating disorders, including obesity and binge eating disorders as well as impulse control disorders, including, substance abuse and addiction, attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) and mood disorders.

A dose-finding study of lanreotide (a somatostatin analog) in patients with colorectal carcinoma

BACKGROUND. Laboratory data suggest that insulin-like growth factor-1 (IGE-1) may stimulate the growth of different human tumors. At least in acromegalic patients, somatostatin (SMS) analogs, such as lanreotide, suppress the serum levels of growth hormone (GH) and IGE-1. METHODS. To evaluate the tolerability and biologic activity of different doses of lanreotide in patients with advanced colorectal carcinoma, consecutive groups of 3 patients each were subcutaneous treated with lanreotide at doses of 1, 2, 3, 4, 5, or 6 mg three times a day for 2 months. In the event of Grade 3 side effects, 3 additional patients were treated with the same dose before the next dose escalation. Serum samples were obtained on Days 0, 15, 30, and 60 for serum GH, IGF-1, and lanreotide assessment. RESULTS. Twenty-four patients were enrolled and all were evaluable. Except for the 3 and 6 mg doses, for which the observation of a Grade 3 side effect required that an additional three patients be treated, it was sufficient to treat 3 patients at each dose. The overall incidence of side effects was as follows: changes in bowel habits, 83%; abdominal cramps, 79%; diarrhea, 17%; vomiting, 17%; nausea, 21%; steatorrhea, 78%; hyperglycemia, 35%; laboratory hypothyroidism, 39%; gallstones, 13%; and weight loss, 17%. No evidence of an increase in the incidence, intensity, or duration of side effects was observed with dose escalation. Serum IGF-1 levels were as follows: Day 13: 63%, 60%, and 67% of the baseline values for the low (12 mg), intermediate (3-4 mg), and high (5- 6 mg) dose groups, respectively; Day 30: 63%, 59%, and 51%, respectively; and Day 60: 73%, 69%, and 47%, respectively. Serum lanreotide levels declined during treatment in all of the dose groups (90 ng/mL on Day 15, and 35 ng/mL on Day 60 for the 5-6 mg group; 10 ng/mL on Day 15, and 1.5 ng/mL on Day 60 for the 1-2 mg group). No antitumor activity or tumor marker reduction was observed. CONCLUSIONS. No increase in toxicity was observed when subcutaneous lanreotide doses were escalated to 6 mg three times a day for 2 months. The highest doses seemed to maintain reduced serum IGF-1 levels; with the lowest doses, a 'rebound' in serum IGF-1 levels was observed during treatment. Nevertheless, intermittent subcutaneous injections do not ensure constant serum drug concentrations over time.

Medicalization, markets and consumers.

This paper examines the impact of changes in the medical marketplace on medicalization in U.S. society. Using four cases (Viagra, Paxil, human growth hormone and in vitro fertilization), we focus on two aspects of the changing medical marketplace: the role of direct-to-consumer advertising of prescription drugs and the emergence of private medical markets. We demonstrate how consumers and pharmaceutical corporations contribute to medicalization, with physicians, insurance coverage, and changes in regulatory practices playing facilitating roles. In some cases, insurers attempt to counteract medicalization by restricting access. We distinguish mediated and private medical markets, each characterized by differing relationships with corporations, insurers, consumers, and physicians. In the changing medical environment, with medical markets as intervening factors, corporations and insurers are becoming more significant determinants in the medicalization process.

Anti-angiogenic factors and pre-eclampsia in type 1 diabetic women

Aims/hypothesis: Elevated anti-angiogenic factors such as soluble fms-like tyrosine kinase 1 (sFlt1), a soluble form of vascular endothelial growth factor receptor, and endoglin, a co-receptor for TGFß1, confer high risk of pre-eclampsia in healthy pregnant women. In this multicentre prospective study, we determined levels of these and related factors in pregnant women with type 1 diabetes, a condition associated with a fourfold increase in pre-eclampsia.
Methods: Maternal serum sFlt1, endoglin, placental growth factor (PlGF) and pigment epithelial derived factor were measured in 151 type 1 diabetic and 24 healthy non-diabetic women at each trimester and at term.
Results: Approximately 22% of the diabetic women developed pre-eclampsia, primarily after their third trimester visit. In women with pre-eclampsia (diabetic pre-eclampsia, n?=?26) vs those without hypertensive complications (diabetic normotensive, n?=?95), significant changes in angiogenic factors were observed, predominantly in the early third trimester and prior to clinical manifestation of pre-eclampsia. Serum sFlt1 levels were increased approximately twofold in type 1 diabetic pre-eclampsia vs type 1 diabetic normotensive women at the third trimester visit (p?<?0.05) and the normal rise of PlGF during pregnancy was blunted (p?<?0.05). Among type 1 diabetic women, third trimester sFlt1 and PlGF were inversely related (r2?=?42%, p?<?0.0001). Endoglin levels were increased significantly in the diabetic group as a whole vs the non-diabetic group (p?<?0.0001).
Conclusions/interpretation: Higher sFlt1 levels, a blunted PlGF rise and an elevated sFlt1/PlGF ratio are predictive of pre-eclampsia in pregnant women with type 1 diabetes. Elevated endoglin levels in women with type 1 diabetes may confer a predisposition to pre-eclampsia and may contribute to the high incidence of pre-eclampsia in this patient group.

Do princípio da boa fé nos contratos de seguro

O objetivo deste estudo foi analisar os seguintes tópicos: a possibilidade de interpretação literal do artigo 798 do Código Civil brasileiro, a aplicação das súmulas 61 e 105 do STF, o cabimento de indenização à família do suicida, os entendimentos da neurociência sobre possibilidades que podem interferir na ideação suicida, a visão e, finalmente, posicionamentos do Superior Tribunal de Justiça (STJ) e do Supremo Tribunal Federal do Brasil e quanto ao pagamento da indenização estabelecido no contrato de seguro de vida em caso de suicídio do contratante antes dos dois anos da assinatura do contrato. Buscou-se, também, comparar a doutrina e jurisprudência do Brasil e de Portugal. Na estrutura, iniciou-se por considerações sobre a interpretação jurídica e, em seguida, foram desenvolvidos os capítulos acerca de negócio jurídico, dos contratos, dos contratos de seguro de vida e da boa fé presente e necessária. Como o foco principal eram os contratos de seguro de vida e baseando-se na doutrina e na jurisprudência, de modo geral, mesmo a legislação dos dois países diferindo em pequenos aspectos, concluiu-se que: (1) o seguro é a cobertura de evento futuro e incerto que poderá gerar o dever de indenizar por parte do segurador; (2) a boa-fé - que é presumida - constitui elemento intrínseco do seguro, e é caracterizada pela lealdade nas informações prestadas pelo segurado ao garantidor do risco pactuado; (3) o legislador procurou evitar fraudes contra as seguradoras na hipótese de contratação de seguro de vida por pessoas que já tinham a idéia de suicídio quando firmaram o instrumento contratual; (4) uma coisa é a contratação causada pela premeditação ao suicídio, que pode excluir a indenização. Outra, diferente, é a premeditação para o próprio ato suicida;(5) é possível a interpretação entre os enunciados das Súmulas 105 do STF e 61 da Corte Superior na vigência do Código Civil de 2002; e (6) as regras relativas aos contratos de seguro devem ser interpretadas sempre com base nos princípios da boa fé e da lealdade contratual. Essa premissa é extremamente importante para a hipótese de indenização securitária decorrente de suicídio, pois dela extraise que a presunção de boa fé deverá também prevalecer sobre a exegese literal do art. 798 do Código Civil 2002. O período de 02 anos contido na norma não deve ser examinado isoladamente, mas em conformidade com as demais circunstâncias que envolveram sua elaboração, pois seu objetivo certamente não foi substituir a prova da premeditação do suicídio pelo mero transcurso de um lapso temporal. Há de se distinguir a premeditação que diz respeito ao ato do suicídio daquela que se refere ao ato de contratar o seguro com afinalidade única de favorecer o beneficiário que receberá o capital segurado. Somente a última hipótese permite a exclusão da cobertura contratada, pois configura a má-fé contratual. Em Portugal, salvo em raras exceções, apenas o critério temporal tem sido considerado. Continuando com o objetivo deste estudo, pretendeu-se refletir sobre as pesquisas neurocientíficas acerca do suicídio e, nelas, constam aspectos efetivamente que merecem ser considerados pela ciência jurídica. Suicídio é tema complexo e digno de reflexões por parte de profissionais de várias áreas de atuação. Suas causas ainda são motivo de curiosidade e de investigação. A idéia de uma associação entre disfunção serotoninérgica e suicídio é antiga e bastante consistente, surgindo ainda nos anos 1970 com as primeiras pesquisas. Defende-se que a boa fé necessária nos contratos de seguro, especialmente nos de seguro de vida, prevalece mesmo nos casos em que o contratante se esquece ou deixa de informar algum detalhe que, mais tarde, possa vir a comprometer o recebimento do prêmio por seus beneficiários. Há fortes evidências de que determinantes neurobiológicos, independentes das doenças psiquiátricas, implicam em comportamento suicida, estudados especialmente nos últimos 20 anos. Assim, noções básicas sobre a neurobiologia do suicídio podem finalmente produzir ferramentas clínicas para tratar comportamento suicida e evitar mortes, além de poder nortear seguradoras na análise de propostas de seguros de vida. Textos legais não têm sido elaborados com fundamento na sedimentação existente nos repositórios da psicopatologia forense, psiquiatria, psicanálise e sociologia sobre o suicídio, disponíveis há décadas e de forma reiteradamente confirmados. Na mesma linha, os textos deixaram de lado incontáveis pesquisas sobre o tema, notadamente a respeito de sua etiologia, causas primárias, efeitos, e correlação com outras ciências, como neurociência, psiquiatria e psicanálise. Não buscaram informações sobre o comportamento singular do suicida, nem reconheceram o estado sui generis de desequilíbrio mental em que o ato final foi praticado. Sabe-se que os transtornos psiquiátricos são fundamentais para o entendimento do comportamento suicida, mas também já está comprovada a realidade de problemas comuns, como distúrbios do sono, e sono insuficiente é um problema da sociedade moderna. Dentre os neurotransmissores, a serotonina é considerada como a maior candidata a um vínculo etiológico entre distúrbios do sono e suicídio, pois suas alterações promovem estados de vigília e de início do sono. Como somente 14% de pessoas que tentaram suicídio tiveram pensamentos suicidaprévios à tentativa de suicídio de forma potencialmente impulsiva ou reativa, a insônia foi o fator importante visualizado antes de tentativas de suicídio graves e letais em relação a planosespecíficos de suicídio. Nas pesquisas neurocientíficas revisadas, constatou-se que: (1) a frequência de pesadelos está diretamente associada a maior risco de suicídios na população em geral; (2) sono de má qualidade está associado a suicídios na maturidade e velhice na população em geral; (3) sono curto (menos de cinco horas) está associado a maiores probabilidades de ideação suicida e tentativa de suicídio; (4) pesadelos frequentes são preditores de tentativas de suicídio; e (5) a presença de qualquer problema de sono está associada com maior risco de suicídio na população em geral. A associação entre redução da resposta de hormônio de crescimento e comportamento suicida nos pacientes com depressão só é encontrada quando há simultaneamente uma alteração serotoninérgica. Geneticamente analisados, determinantes neurobiológicos são independentes de transtorno psiquiátrico com o qual estão associados, pois muitos suicídios ocorrem de maneira inesperada. Além disso, quando se considera a depressão como único fator, percebe-se que muitas pessoas depressivas nunca se tornam suicidas e muitos suicídios são cometidos por pessoas consideradas normais.Quanto à colesterolemia, na maior categoria de concentração de colesterol total no soro, o risco relativo ajustado de suicídio violento é mais do que o dobro em comparação com a categoria mais baixa. Nas avaliações eletroencefalográficas em adolescentes suicidas pode-se dizer existir uma hipótese de ativação reduzida esquerda posterior, que não está relacionada à depressão, mas ao comportamento agressivo ou suicida. Essas abordagens da Neurociência servem, portanto, para indicar que um contratante de seguro de vida, mesmo saudável, pode estar vivenciando problemas da vida contemporânea e, mesmo sem jamais ter tido qualquer pensamento ou ideação suicida, vir a cometer esse ato extremo por alterações independentes de sua vontade. Entende-se que, neste foco, a ciência jurídica deve refletir para fazer inserir de maneira obrigatória nos pré-requisitos da apólice, informações sobre exames molecu-lares e sobre algum eventual distúrbio do sono, já que existem achados evidenciados sobre alguns fenômenos não antes considerados. Como abordado neste estudo, já existe uma seguradora portuguesa que solicitam exames moleculares, mas nenhuma no Brasil. Assim, isto indica já ser um início de mudança.

Liver fat in adults with GH deficiency: comparison to matched controls and the effect of GH replacement

CONTEXT: Existing data regarding the association between growth hormone deficiency (GHD) and liver fat content are conflicting. OBJECTIVE: We aimed i) to assess intrahepatocellular lipid (IHCL) content in hypopituitary adults with GHD compared to matched controls and ii) to evaluate the effect of growth hormone (GH) replacement on IHCL content. DESIGN: Cross-sectional comparison and controlled intervention study. PATIENTS, PARTICIPANTS: Cross-sectional comparison: 22 hypopituitary adults with GHD and 44 healthy controls matched for age, BMI, gender and ethnicity. Intervention study: 9 GHD patients starting GH replacement (GH Rx group), 9 GHD patients not starting replacement therapy (non-GH Rx group). INTERVENTION: Intervention study:GH replacement for 6 months in the GH Rx group, dosage was titrated to achieve normal IGF-1 levels. MAIN OUTCOME MEASURES: IHCL content determined by proton magnetic resonance spectroscopy (1 H MRS). RESULTS: Cross-sectional comparison: There was no difference in IHCL content between GHD patients and healthy controls (1.89% (0.30, 4.03) vs. 1.14% (0.22, 2.32); p=0.2), the prevalence of patients with hepatic steatosis (IHCL of ≥ 5.56%) was similar in the two groups (22.7% vs. 15.9%; chi square probability = 0.4). Intervention study: The change in IHCL content over 6 months did not differ between the GH Rx group and the non-GH Rx group (-0.63 ± 4.53% vs. +0.11 ± 1.46%; p=0.6). CONCLUSIONS: In our study liver fat content and the prevalence of hepatic steatosis did not differ between hypopituitary adults with GHD and matched controls. In GHD patients GH replacement had no effect on liver fat content.

Anti-doping testing at the 2008 European football championship.

Big sports events like the 2008 European Football Championship are a challenge for anti-doping activities, particularly when the sports event is hosted by two different countries and there are two laboratories accredited by the World Anti-Doping Agency. This challenges the logistics of sample collection as well as the chemical analyses, which must be carried out timeously. The following paper discusses the handling of whereabouts information for each athlete and the therapeutic use exemption system, experiences in sample collection and transportation of blood and urine samples, and the results of the chemical analysis in two different accredited laboratories. An overview of the analytical results of blood profiling and growth hormone testing in comparison with the distribution of the normal population is also presented.

Régulation de l'activité transcriptionnelle de PPARgamma via l'activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a : potentiel anti-athérosclérotique

Les sécrétines peptidiques de l’hormone de croissance (GHRPs) constituent une classe de peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance (GH). Cette activité est médiée par leur liaison à un récepteur couplé aux protéines G : le récepteur des sécrétines de l’hormone de croissance (GHS-R1a), identifié subséquemment comme le récepteur de la ghréline. La ghréline est un peptide de 28 acides aminés sécrété principalement par les cellules de la muqueuse de l’estomac, qui exerce de nombreux effets périphériques indépendamment de la sécrétion de l’hormone de croissance. Les effets indépendants de la sécrétion de GH incluent, entre autres, des actions sur le contrôle de la prise de nourriture, le métabolisme énergétique, la fonction cardiaque, le système immunitaire et la prolifération cellulaire. L’étude de la distribution périphérique des sites de liaison des GHRPs nous a permis d’identifier un second site, le CD36, un récepteur scavenger exprimé dans plusieurs tissus dont le myocarde, l’endothélium de la microvasculature et les monocytes/macrophages. Le CD36 exprimé à la surface du macrophage joue un rôle clé dans l’initiation du développement de l’athérosclérose par la liaison et l’internalisation des lipoprotéines de faible densité oxydées (LDLox) dans l’espace sous-endothélial de l’artère. L’hexaréline, un analogue GHRP, a été développé comme agent thérapeutique pour stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance par l’hypophyse. Sa propriété de liaison aux récepteurs GHS-R1a et CD36 situés en périphérie et particulièrement sa capacité d’interférer avec la liaison des LDLox par le CD36 nous ont incité à évaluer la capacité de l’hexaréline à moduler le métabolisme lipidique du macrophage. L’objectif principal de ce projet a été de déterminer les effets de l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a, par l’hexaréline et la ghréline, le ligand endogène du GHS-R1a, sur la physiologie du macrophage et de déterminer son potentiel anti-athérosclérotique. Les résultats montrent premièrement que l’hexaréline et la ghréline augmentent l’expression des transporteurs ABCA1 et ABCG1, impliqués dans le transport inverse du cholestérol, via un mécanisme contrôlé par le récepteur nucléaire PPARγ. La régulation de l’activité transcriptionnelle de PPARγ par l’activation des récepteurs CD36 et GHS-R1a se fait indépendamment de la présence du domaine de liaison du ligand (LBD) de PPARγ et est conséquente de changements dans l’état de phosphorylation de PPARγ. Une étude plus approfondie de la signalisation résultant de la liaison de la ghréline sur le GHS-R1a révèle que PPARγ est activé par un mécanisme de concertation entre les voies de signalisation Gαq/PI3-K/Akt et Fyn/Dok-1/ERK au niveau du macrophage. Le rôle de PPARγ dans la régulation du métabolisme lipidique par l’hexaréline a été démontré par l’utilisation de macrophages de souris hétérozygotes pour le gène de Ppar gamma, qui présentent une forte diminution de l’activation des gènes de la cascade métabolique PPARγ-LXRα-transporteurs ABC en réponse à l’hexaréline. L’injection quotidienne d’hexaréline à un modèle de souris prédisposées au développement de l’athérosclérose, les souris déficientes en apoE sous une diète riche en cholestérol et en lipides, se traduit également en une diminution significative de la présence de lésions athérosclérotiques correspondant à une augmentation de l’expression des gènes cibles de PPARγ et LXRα dans les macrophages péritonéaux provenant des animaux traités à l’hexaréline. L’ensemble des résultats obtenus dans cette thèse identifie certains nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de PPARγ et du métabolisme du cholestérol dans le macrophage via les récepteurs CD36 et GHS-R1a. Ils pourraient servir de cibles thérapeutiques dans une perspective de traitement des maladies cardiovasculaires.

Contrôle de l'expression de la protéine PHEX et rôle de PHEX et FGF23 dans la minéralisation par les cellules MC3T3

PHEX est une protéine importante dans le processus de minéralisation osseuse. Des mutations ou la délétion d’une partie de ce gène causent l’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractérisée par une hypophosphatémie, accompagnée de défauts de minéralisation, de rachitisme et de lésions ostéomalaciques. Avec l’hypophosphatémie, les taux circulants de vitamine D devraient être augmentés, ce qui n’est pas le cas d’où une régulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgré le fait que cette protéine soit une peptidase, aucun substrat physiologique n’a encore été répertorié pour PHEX. PHEX est une protéine membranaire de type II de la famille M13 des métalloendopeptidases à zinc possédant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire d’environ 20 acides aminés et une large portion C-terminale extracellulaire où se trouve le site actif de l’enzyme. PHEX est exprimée de façon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparaît à l’initiation de la minéralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modèle animal de la maladie humaine, montrent des quantités importantes de la protéine FGF23. De plus, FGF23 est impliqué dans une autre maladie reliée au métabolisme du phosphate, l’hypophosphatémie rachitique autosomale dominante (ADHR) où des mutations de FGF23 causent sensiblement les mêmes symptômes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostéoblastes et les ostéocytes. FGF23 cause une hypophosphatémie par la diminution de l’expression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la réabsorption du phosphate rénal. L’hypothèse proposée dans la littérature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minéralisation osseuse. Plus spécifiquement, l’activation ou l’inactivation de ces peptides aurait pour rôle de réguler les quantités de FGF23. Selon l’hypothèse mentionnée précédemment, la régulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minéralisation. Une quantité croissante de données sur la régulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue l’expression de PHEX tandis que les glucocorticoïdes et l’hormone de croissance augmentent son expression. Dans une première étude, nous avons voulu déterminer si un peptide relié à la minéralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait réguler l’expression de PHEX. Nous avons déterminé que le PTHrP1-34 peut réguler de façon négative l’expression de PHEX dans les cellules UMR-106, une lignée cellulaire ostéoblastique. Cette régulation passe par la voie de l’AMPc/protéine kinase A. De plus, cette diminution d’expression est également observée au jour 7 dans des cultures primaires d’ostéoblastes de rat en minéralisation. Par la suite, nous avons étudié un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouvé chez un patient souffrant de XLH, où la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation n’interfère pas avec le site catalytique de l’enzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthétique que la protéine sauvage. Il a été déterminé que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons démontré que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX à COPII, responsable de la formation de vésicules de sécrétion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, à l’incorporation de PHEX dans des vésicules de calcification, lesdites vésicules étant importantes dans le processus de minéralisation. Finalement, des essais de compétitions ont démontré que la minéralisation pouvait être perturbée lorsque l’on surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement à la queue mutée. Ceci suggère possiblement que l’interaction avec COPII menant à l’incorporation de PHEX dans les vésicules de calcification ou d’autres protéines comprenant de tels motifs pourrait être importante pour la minéralisation. Finalement, la dernière étude porte sur la protéine FGF23. Nous avons démontré, par la surexpression de FGF23 dans la lignée MC3T3 d’ostéoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la sénescence de ces cellules. En effet, des essais de sénescence ont montré l’augmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprimé. Par contre, la prolifération n’est pas altérée. De plus, il semblerait que la différenciation soit plus rapide, tel qu’observé par une minéralisation survenant plus tôt, mais n’étant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostéoblastes se différencient plus rapidement et passent donc à un état de sénescence prématuré comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littérature où KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinité sur son récepteur, lorsqu’inactivé démontre un phénotype similaire au vieillissement incluant un phénotype de sénescence.

Le récepteur CD36 : implication dans le développement de l'athérosclérose et dans le recrutement des leucocytes aux sites inflammatoires

Le CD36 est un récepteur éboueur de classe B exprimé par plusieurs types cellulaires dont les macrophages et les cellules endothéliales de la microvasculature. Le CD36 présente une haute affinité de liaison pour les ligands lipidiques tels que les lipoprotéines oxydées de basse densité (LDLox). De part sa capacité à internaliser les LDLox au niveau des macrophages et de son implication dans la formation des cellules spumeuses, le CD36 joue un rôle critique dans le développement des lésions athérosclérotiques. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le EP 80317, un ligand synthétique sélectif du CD36, exerce des effets anti-athérosclérotiques chez les souris déficientes en apolipoprotéine E. Un traitement prolongé (12 semaines) avec le EP 80317 réduit fortement (de 51%) la surface des lésions athérosclérotiques par comparaison aux souris témoins. L'effet anti-athérosclérotique est associé à une diminution des taux de cholestérol plasmatique, à une réduction de l’internalisation des LDLox au niveau des macrophages et à une augmentation de l’expression des protéines impliquées dans le transport inverse du cholestérol. De plus, un traitement par le EP 80317 est également associé une diminution de l’expression aortique et plasmatique de protéines pro-inflammatoires. Nos études ont aussi montré un rôle pour le CD36 dans le recrutement des phagocytes mononucléés au niveau des lésions athérosclérotiques, tel que démontré par une réduction de l’accumulation des phagocytes mononucléés radiomarqués CD36–/– par rapport aux cellules CD36+/+. À l’échelle moléculaire, nous avons montré que les phospholipides oxydés induisent la phosphorylation de la kinase Pyk2 des podosomes des monocytes/macrophages de manière dépendante de l’expression du CD36 et de Src. Cette phosphorylation est atténuée par un traitement par le EP80317. Nos résultats appuient le rôle important du CD36 dans l’athérosclérose et suggèrent que les ligands synthétiques qui modulent la fonction du CD36 représentent potentiellement une nouvelle classe d'agents anti-athérosclérotiques. Le CD36 exprimé par les cellules endothéliales de la microvasculature est un récepteur de l’hétérodimère protéique S100A8/A9. Ces protéines s’associent à l’acide arachidonique intracellulaire (AA) des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) et le complexe S100A8/A9/AA peut être sécrété par les PMN activés au contact de l’endothélium. Nous avons vérifié l’hypothèse selon laquelle le CD36 exprimé par la microvasculature est impliqué dans le métabolisme transcellulaire de l’AA par la liaison du complexe S100A8/A9/AA et la réponse inflammatoire. Chez deux modèles murins d'inflammation aiguë (ischémie/reperfusion des membres inférieurs et poche d’air dorsale), nous avons observé que la réponse inflammatoire, notamment l’accumulation des PMN au niveau des sites inflammatoires, est diminuée en moyenne de 63% chez les souris CD36-/-. De même, un traitement par le EP 80317 ou par les anticorps anti-S100A8/A9 diminue chacun de 60% en moyenne l’extravasation des PMN vers les tissus inflammatoires. L’administration simultanée des deux traitements n’a aucun effet supplémentaire, et ces traitements n’exercent aucun effet chez les souris CD36-/-. Nos résultats appuient le rôle du récepteur CD36 de la microvasculature dans la régulation de la réponse inflammatoire. L’utilisation des ligands synthétiques du CD36 pourrait représenter une nouvelle avenue thérapeutique dans le traitement des réponses inflammatoires aiguës.

Regulation of lipid metabolism in adipocytes and hepatocytes by hexarelin through scavenger receptor CD36

Les sécrétines de l’hormone de croissance (GHRPs) sont de petits peptides synthétiques capables de stimuler la sécrétion de l’hormone de croissance à partir de l’hypophyse via leur liaison au récepteur de la ghréline GHS-R1a. Le GHRP hexaréline a été utilisé afin d’étudier la distribution tissulaire de GHS-R1a et son effet GH-indépendant. Ainsi, par cette approche, il a été déterminé que l’hexaréline était capable de se lier à un deuxième récepteur identifié comme étant le récepteur scavenger CD36. Ce récepteur possède une multitude de ligands dont les particules oxLDL et les acides gras à longue chaîne. CD36 est généralement reconnu pour son rôle dans l’athérogénèse et sa contribution à la formation de cellules spumeuses suite à l’internalisation des oxLDL dans les macrophages/monocytes. Auparavant, nous avions démontré que le traitement des macrophages avec l’hexaréline menait à l’activation de PPARƔ via sa liaison à GHS-R1a, mais aussi à CD36. De plus, une cascade d’activation impliquant LXRα et les transporteurs ABC provoquait également une augmentation de l’efflux du cholestérol. Une stimulation de la voie du transport inverse du cholestérol vers les particules HDL entraînait donc une diminution de l’engorgement des macrophages de lipides et la formation de cellules spumeuses. Puisque CD36 est exprimé dans de multiples tissus et qu’il est également responsable du captage des acides gras à longue chaîne, nous avons voulu étudier l’impact de l’hexaréline uniquement à travers sa liaison à CD36. Dans le but d’approfondir nos connaissances sur la régulation du métabolisme des lipides par CD36, nous avons choisi des types cellulaires jouant un rôle important dans l’homéostasie lipidique n’exprimant pas GHS-R1a, soient les adipocytes et les hépatocytes. L’ensemble de mes travaux démontre qu’en réponse à son interaction avec l’hexaréline, CD36 a le potentiel de réduire le contenu lipidique des adipocytes et des hépatocytes. Dans les cellules adipeuses, l'hexaréline augmente l’expression de plusieurs gènes impliqués dans la mobilisation et l’oxydation des acides gras, et induit également l’expression des marqueurs thermogéniques PGC-1α et UCP-1. De même, hexaréline augmente l’expression des gènes impliqués dans la biogenèse mitochondriale, un effet accompagné de changements morphologiques des mitochondries; des caractéristiques observées dans les types cellulaires ayant une grande capacité oxydative. Ces résultats démontrent que les adipocytes blancs traités avec hexaréline ont la capacité de se transformer en un phénotype similaire aux adipocytes bruns ayant l’habileté de brûler les acides gras plutôt que de les emmagasiner. Cet effet est également observé dans les tissus adipeux de souris et est dépendant de la présence de CD36. Dans les hépatocytes, nous avons démontré le potentiel de CD36 à moduler le métabolisme du cholestérol. En réponse au traitement des cellules avec hexaréline, une phosphorylation rapide de LKB1 et de l’AMPK est suivie d’une phosphorylation inhibitrice de l’HMG-CoA réductase (HMGR), l’enzyme clé dans la synthèse du cholestérol. De plus, la liaison d'hexaréline à CD36 provoque le recrutement d’insig-2 à HMGR, l’étape d’engagement dans sa dégradation. La dégradation de HMGR par hexaréline semble être dépendante de l’activité de PPARƔ et de l’AMPK. Dans le but d’élucider le mécanisme d’activation par hexaréline, nous avons démontré d’une part que sa liaison à CD36 provoque une déphosphorylation de Erk soulevant ainsi l’inhibition que celui-ci exerce sur PPARƔ et d’autre part, un recrutement de l’AMPK à PGC-1α expliquant ainsi une partie du mécanisme d’activation de PPARƔ par hexaréline. Les résultats générés dans cette thèse ont permis d’élucider de nouveaux mécanismes d’action de CD36 et d'approfondir nos connaissances de son influence dans la régulation du métabolisme des lipides.

Étude des mécanismes associés aux effets bénéfiques de la restriction calorique sur la fonction somatotrope du rat vieillissant.

Dans les cellules somatotropes, la liaison du facteur de libération de l’hormone de croissance (GHRH) à son récepteur (GHRH-R) stimule la synthèse et la sécrétion de l’hormone de croissance (GH) ainsi que la prolifération cellulaire. Chez les mammifères, le vieillissement est caractérisé par une diminution de la sécrétion de GH, liée à une perte de sensibilité des somatotropes au GHRH. Chez le rat âgé, des modifications de niveaux d'ARNm du GHRH-R et une diminution d'affinité et de capacité de liaison du GHRH sont rapportés. Au cours du vieillissement, une augmentation des niveaux de glucose et d’acides gras libres sérique suggère qu’une gluco- ou lipotoxicité puisse contribuer au dysfonctionnement de la fonction somatotrope. À ce jour, la restriction calorique modérée de longue durée (RCMLD) constitue l’intervention la plus efficace pour prévenir ou retarder les détériorations liées à l’âge. Des études ont montré des effets bénéfiques de la RCMLD sur l’axe somatotrope au cours du vieillissement via un maintien des paramètres de liaison du GHRH-R. Compte tenu de l’importance de cet axe, la compréhension des mécanismes menant à la somatopause ainsi que ceux associés aux effets bénéfiques de la RCMLD s’avère importante. Les objectifs principaux de la présente thèse étaient : 1) de déterminer les effets de la RCMLD chez le rat, sur le GHRH-R hypophysaire et la sensibilité des somatotropes au GHRH, 2) d’identifier les mécanismes associés à la somatopause et aux effets bénéfiques de la RCMLD, et 3) de préciser les effets d’une gluco-ou lipotoxicité sur l’axe somatotrope de rats et leur implication dans la somatopause. Des rats de 8 mois ont été soumis à une restriction calorique de 40% jusqu’à l’âge de 18-20 mois et ont été comparés à des rats jeunes et âgés nourris ad libitum. Cette étude a permis de mettre en évidence des effets bénéfiques de la RCMLD sur la régulation et la fonctionnalité du GHRH-R et de proposer que le glucose et les acides gras libres (AGL) circulants soient impliqués dans le vieillissement de la somatotrope. Une étude de micro-puce à ADN à permis d’identifier des gènes associés à des mécanismes de protection et de réparation des dommages cellulaires mis en place dans l’hypophyse antérieure au cours du vieillissement et par la RCMLD. Finalement, les effets d’un stress gluco- ou lipotoxique sur la fonction somatotrope ont été étudiés chez des rats de 2 et 6 mois, infusés 72 h avec une solution de glucose ou d’Intralipides, mimant les niveaux circulants de glucose et d’AGL retrouvés chez le rat âgé. Les résultats obtenus montrent que la glucotoxicité affecte la régulation de certains gènes de la somatotrope, dont le GHRH-R, et suggèrent que la capacité de réponse à ce type de stress est altérée. Les mécanismes par lesquels la glucotoxicité exerce ces effets pourraient inclure la génération de stress oxydant. L’ensemble de ces résultats proposent de nouvelles pistes mécanistiques qui pourraient contribuer au retardement de la somatopause et, ultimement, à l’élaboration de nouvelles stratégies d’intervention nutritionnelles ou pharmacologiques ciblant les mêmes voies que la RCMLD, avec une efficacité similaire ou supérieure.

Application du SPR dans le criblage des ligands synthétiques du CD36 et sa validation

Le CD36 est un récepteur de type éboueur de classe B exprimé à la surface de nombreux types cellulaires dont les macrophages, les cellules endothéliales de la microvasculature et les plaquettes. Ce récepteur multiligand est impliqué dans plusieurs processus pathologiques notamment l’athérosclérose, l’angiogénèse et la malaria via la liaison spécifique de ligands comme les lipoprotéines oxydées de basse densité, la thrombospondine-1 et la protéine PfEMP-1, respectivement. Les peptides de la relâche de l’hormone de croissance (GHRP) ont été identifiés comme les premiers ligands synthétiques du CD36. Afin de développer de nouveaux ligands synthétiques du CD36, l’établissement d’une méthode de criblage est essentiel pour découvrir des composés avec une liaison de haute affinité pour ce récepteur. Pour y parvenir, nous avons surexprimé le domaine extracellulaire du CD36 humain dans les cellules d’insectes Sf9. La protéine soluble purifiée par chromatographie d’affinité fut immobilisée à la surface d’une plaque de résonance de plasmons de surface (SPR) pour les études de liaison. La méthodologie développée a permis de caractériser les ligands du CD36 en déterminant leurs constantes de dissociation (KD), et d’établir une relation structure-activité des ligands de la famille des azapeptides, des composés dérivés du GHRP-6. Afin de valider la méthode par spectroscopie SPR, une corrélation a été établie entre les valeurs de KD obtenues en SPR et les valeurs d’CI50 de courbes d’inhibition de la phosphorylation des MAP kinases JNK1/2 induite par un phospholipide oxydé, le POVPC, en présence de concentrations croissantes de ligands du CD36 dans les macrophages RAW 264.7.