Técnicas de análise laboratorial para solos, matéria vegetal e corretivos orgãnicos

Dissertação de mestrado em Técnicas de Caracterização e Análise Química

Aspectos bioquímicos y celulares de la reproducción de los vectores de la enfermedad de Chagas: regulación e importancia fisiológica. Biochemical and cellular aspects of the reproduction of Chagas’ disease vectors: regulation and physiologycal impact

En la hipótesis de trabajo del presente proyecto se considera la importancia del metabolismo de lípidos y proteínas en los insectos hematófagos, en particular en los vectores de la enfermedad de Chagas, para afrontar exitosamente la demanda energética de la reproducción. Las hembras de estas especies pueden ingerir una comida de sangre abundante en lípidos y proteínas, los que son modificados en el intestino para su utilización y posterior almacenamiento en estructuras organizadas en el tejido ovárico, sustentando así el rápido crecimiento de los ovocitos. Estos aspectos resultan críticos para el ciclo de vida del insecto y para el mantenimiento de la cadena epidemiológica de la enfermedad. En estas especies, recientemente hemos caracterizado a nivel bioquímico y celular la interacción entre lipoproteínas y tejidos [Fruttero y col., Insect Biochem. Mol. Biol. 39: 322-331 (2009); Fruttero y col. Biocel 33 (3): 260 (2009)] y las fases del ciclo reproductivo [Aguirre y col., J. Insect Physiol. 54: 393-402 (2008)]. No obstante, los factores que participan en su regulación son aún escasamente conocidos. En este contexto, el estudio propone emplear dos especies de triatominos con el objeto de: (1) caracterizar los factores involucrados en la formación y regulación de reservas nutricionales en los ovocitos; (2) analizar los eventos que participan en la regresión del tejido ovárico: atresia folicular y mecanismos de muerte celular. (3) evaluar el impacto de productos naturales (ureasas vegetales y péptidos derivados) en el desarrollo del tejido ovárico. Para la ejecución de los objetivos se llevarán a cabo ensayos in vivo e in vitro con trazadores fluorescentes, fraccionamiento subcelular, estudios de expresión de proteínas (mRNA y proteína), estudios histo-morfológicos, ultraestructurales e inmunocitoquímicos, microscopía láser confocalizada, ensayos de actividad enzimática, ELISA, western-blot, electroforesis bidimensional, espectrometria de masas en tándem, etc. También se evaluarán los mecanismos de muerte celular (apoptosis/autofagia) mediante microscopía electrónica, detección de apoptosis in situ (TUNEL), inmunofluorescencia, etc. Los resultados obtenidos permitirán un mejor conocimiento sobre la fisiología y bioquímica de estos vectores, los que resultan indispensables en el diseño de nuevas estrategias para su control. Debido a la carencia de un tratamiento específico para la enfermedad y a la falta de métodos preventivos (vacuna), el control del vector es una de las vías más importantes para reducir la incidencia de la enfermedad. Actualmente, la situación socio-económica que sufren amplios núcleos de nuestra población propicia condiciones de vida que facilitan la reproducción de los vectores y la transmisión vectorial del parásito. El estudio permitirá además explorar aspectos bioquímicos y celulares básicos, generando conocimientos que podrían ser extensivos a otros insectos de importancia económica en la ganadería y/o agricultura. The aim of this project is to analyze the biochemical and cellular events involved in the lipid and protein metabolism in Chagas' disease vectors, and to evaluate their impact on the physiology of reproduction, particularly in the formation of nutritional resources in developing oocytes. At present, little is known about these critical aspects for the life cycle of the insect and for the epidemiology of the disease. The experimental approaches, which will be carried out using two species of triatomines, were designed: (1) to characterize factors involved in the formation and regulation of nutritional resources in developing oocytes; (2) to analyze the biochemical and cellular events that play a role during the regression of ovarian tissue, including the processes of oocyte resorption and programmed cell death. (3) to evaluate the impact of natural products (ureases from jackbean and related peptides) in the development of ovarian tissue. Methods and techniques involved in the project are: in vivo and in vitro assays with fluorescent tracers, ELISA, chemical assays, enzyme activities, western-blot; protein expression (mRNA), histological techniques, immunohistochemical and ultrastructural studies. Cell death will be analyzed by detection of apoptosis in situ (TUNEL), immunofluorescence (for autophagy), among others. The results obtained from the study will offer the opportunity to explore important aspects in the biology and physiology of Chagas' disease vectors that could be of potential utility in designing alternative strategies for the control of the insect.

Homocisteína e polimorfismos dos genes MTHFR e VEGF: impacto na doença arterial coronariana

FUNDAMENTO: Polimorfismos em genes relacionados ao desenvolvimento da aterosclerose, angiogênese e metabolismo da homocisteína (Hcy) podem ser fatores de risco para a doença arterial coronariana (DAC). OBJETIVO: Avaliar o efeito dos polimorfismos VEGF C-2578A e MTHFR C677T na DAC e a associação desses polimorfismos com a gravidade e a extensão das lesões ateroscleróticas e concentrações de Hcy. MÉTODOS: 244 indivíduos foram avaliados através de angiografia coronariana e incluídos no estudo (145 com DAC e 99 indivíduos-controle). Os polimorfismos VEGF C-2578A e MTHFR C677T foram investigados através das técnicas de PCR-SSCP e PCR-RFLP, respectivamente. Os níveis de homocisteína plasmática foram mensurados através de cromatografia líquida/espectrometria de massa seqüencial (CL/EMS). RESULTADOS: Não houve diferença significante em relação à distribuição de alelos e genótipos entre os grupos, para ambos os polimorfismos. A análise univariada mostrou uma freqüência maior do genótipo VEGF -2578AA no grupo com doença em três vasos (p=0,044). Além disso, o genótipo VEGF -2578CA foi observado mais freqüentemente entre indivíduos com <95% de estenose (p=0,010). Após ajuste para outros fatores de risco para DAC em um modelo multivariado, observou-se que o polimorfismo VEGF C-2578A não era um correlato independente da DAC (p=0,688). O polimorfismo MTHFR não mostrou qualquer relação com a extensão e/ou gravidade da DAC. O polimorfismo MTHFR C677T não mostrou uma associação direta com hiperhomocisteinemia ou aumento das concentrações médias de Hcy no plasma. CONCLUSÃO: Embora haja uma aparente associação entre o polimorfismo VEGF C-2578A e o desenvolvimento de aterosclerose coronariana, essa associação não é independente dos fatores de risco cardiovasculares convencionais.

Um estudo sobre as águas subterrâneas da região de Piracicaba

Uma opção para abastecimento de água às indústrias e populações tem sido a utilização das águas subterrâneas. Na região de Piracicaba, onde os mananciais de superfície apresentam os maiores teores de poluição do Brasil, tem-se procurado a utilização dos recursos hídricos subterrâneos. Com uma contribuição às medidas de ordem prática no estabelecimento de baterias de poços artesianos, iniciamos um estudo sistemático dessas águas visando sua utilização para o abastecimento da população, indústria e agricultura. Neste estudo foram analisadas amostras de águas subterrâneas da região de Piracicaba, colhidas em 23 poços artezianos, 3 artezianos jorrantes, 4 freáticos e 3 mananciais. Por meio da espectrometria de massa foram feitas determinações das concentrações dos isótopos D e (18)0 e estudou-se a correlação destes dados com as concentrações de D e (18)0, previamente determinadas por SALATI et alii (1972) para as águas de precipitação da mesma região e para o rio Piracicaba. Algumas análises químicas também foram efetuadas. De um exame preliminar pode deduzir-se que: a) as águas subterrâneas de vários poços de região podem ser representativas de um único aquífero, em virtude das pequenas variações apresentadas por suas concentrações isotópicas; b) a concordência entre as concentrações de D e (18)0 das águas de precipitação e subterrâneas sugere que as zonas de recarga são muito permeáveis; c) as concentrações isotópicas mais elevadas das águas do rio Piracicaba, em comparação com as das águas subterrâeas indicam ser este rio um efluente dos aquíferos da região em foco; d) de maneira geral, as águas subterrâneas, apresentam-se de qualidade imprópria para o consumo humano; e) evidenciou-se também a pequena vazão oferecida pela maioria dos poços profundos. Por ultimo, este estudo proporcionou outras informações que permitirão melhor orientação nas futuras investigações hidrogeológicas.

Akt fosforila FoxG1 en cèl·lules de glioma

En un treball recent s’ha descrit l’amplificació del gen del factor de transcripció FoxG1, homòleg de l'oncogen víric aviar Qin, en mostres de meduloblastoma, un tipus de tumor cerebral que representa el 20% dels tumors cerebrals infantils malignes (Adesina et al.¸2007). El tumor cerebral més freqüent i agressiu en l’adult és el glioma, especialment la seva forma més maligna: el glioblastoma multiforme (glioma de grau IV segons la classificació de l'OMS). En aquest treball hem estudiat l'expressió proteica del factor de transcripció FoxG1, homòleg de l'oncogen víric aviar Qin, en mostres de glioma. Vam analitzar 15 mostres de glioma, detectant FoxG1 en 9 d’elles, i amb diferents nivells d’expressió. Intentant aprofundir en el coneixement de la funció i la regulació de FoxG1, vam estudiar si FoxG1 podia ser fosforilat. Vam detectar, tant per assaig cinasa com per espectrometria de masses, que FoxG1 és un substracte directe de la cinasa Akt, el principal efector de la via de PI3K (phosphoinositide 3-kinase). En la línia cel•lular de glioblastoma U373MG, vam observar que Akt endogen fosforila FoxG1 en un pèptid situat a l’extrem C-terminal del domini forkhead. Aquesta fosforilació és contrarestada per un inhibidor farmacològic de PI3K. Al contrari del que passa en FoxO on la fosforilació per Akt inhibeix l’activitat de FoxO promovent la seva exportació del nucli, la fosforilació de FoxG1 per Akt no promou cap canvi en la seva localització subcel•lular, i FoxG1 es manté nuclear. Actualment estem estudiant els efectes biològics de la fosforilació de FoxG1 per Akt.

Exposició Materno Fetal a l’Alcohol

Estudi transversal de mares i mostres de meconi en neonats per determinar i quantificar la presència dels metabòlits directes de l’etanol (Etil Glucorònid i Etil Sulfat). Mitjançant les entrevistes clíniques a les mares i l’anàlisi del meconi utilitzant la tècnica de Cromatografia Líquida i Espectrometria de Masses es pretén establir la prevalença del consum d’alcohol durant la gestació i per tant l’exposició fetal a l’etanol. Mitjançant aquest treball també es pretén valorar la conveniència d’estandaritzar un marcador analític utilitzat com a prova d’screening neonatal per la detecció precoç de les alteracions derivades del consum d’alcohol durant l’embaràs.

Drogues d’abús en detinguts al jutjat de guàrdia: repercusió a l’àmbit de l’execució penal i l’Administració de justícia

L’estudi de la saliva com a matriu d’anàlisis de drogues d’abús en conductors es fa des dels anys 80. Els investigadors trobaven dificultats però el major inconvenient va ser l’existència de tècniques analítiques no prou sensibles per a la detecció de les drogues. A finals de les anys 90 la saliva es va considerar un fluid molt adequat i es van anar publicant treballs que investigaven aquesta temàtica. No obstant això encara no n ’hi ha molts treballs, especialment al nostre país. A Catalunya no s’han fet estudis encara que s’ha contribuït en alguns projectes realitats fora de la nostra comunitat. Objectius: Obtenir dades del consum de drogues d’abús en una mostra de conductors de vehicles a motor. Obtenir dades dels tòxics més freqüents trobats en les mostres analitzades. Relacionar el consum de tòxics amb alteracions en la conducta o conduccions temeràries en la població que es sotmet a l’estudi. Metodologia: Estudi d’una mostra de subjectes que són aturats per la Guàrdia Urbana de Barcelona, Girona ,Tarragona i policia local de el Prat de Llobregat conduint vehicles a motor. Obtenció d’una mostra de saliva als subjectes que es consideren que poden trobar-se sota la influència de les drogues. Anàlisis de les mostres per immunoassaig mitjançant el kit Cozart DDS com a test de camp i confirmació dels resultats per cromatografia de gasos i espectrometria de masses. Resultats: Es descriuen en els resultats obtinguts, les freqüències de consum, les principals drogues d’abús trobades i es valoren els símptomes clínics que presentaven els subjectes. Conclusions: Les drogues d’abús estan presents en conductors de vehicles a motor. El kit utilitzat per la determinació de drogues a peu de carretera és una bona eina atès que es confirmen els resultats especialment per a la cocaïna i opiacis.

Identificación y uso de biomarcadores pronósticos en el ictus isquémico

II. Es van analitzar mostres de microdiàlisi cerebral in vivo de pacients d’ictus isquèmic pel descobriment de biomarcadors associats a la malaltia cerebrovascular. Es van obtenir microdialitzats (MDs) de la zona infartada, de la zona del periinfart i de la zona contralateral no afectada. Els MDs es van comparar, qualitativament i quantitativament, mitjançant tècniques de proteómica basades en marcatge isobàric i espectrometria de masses. Complementàriament, alguns candidats es van estudiar mitjançant immunotransferència en mostres de teixit de necròpsies cerebrals de pacients morts a causa d’un ictus isquèmic. Finalment, hem començat a realitzar ELISAs per la determinació d’aquests candidats en mostres de sang.

Efecto de las Estatinas sobre el Peptidoma Plasmático y Urinario de Pacientes Trasplantados Renales

Estudiem l’efecte de l’atorvastatina sobre perfil lipídic, funció renal, marcadors d’inflamació, peptidoma plasmàtic i urinari de 54 pacients trasplantats renals. L’estudi proteòmic es basa en tecnologia d’esferes magnètiques combinada amb espectrometria de masses MALDI-TOF. L’atorvastatina va millorar el perfil lipídic dels pacients i va provocar canvis significatius al peptidoma plasmàtic. Es va observar la disminució en plasma de pèptids derivats de fragments del quininogen i de C4. Atès que bradiquinina i C4a, que s’alliberen de quininogen i C4, son potents mediadors de la inflamació, els nostres resultats poden aclarir els efectes antiinflamatoris atribuïts a les estatines.

Avaluació de vitamines i antioxidants en aliments vegetals mitjançant tècniques HPLC-DAD i UPLC-MS/MS

El programa experimental s’ha portat a terme dins el marc de les activitats del projecte TRUEFOOD, finançat per la UE per als anys 2007-2010. L’objectiu principal d’aquesta activitat ha estat l’avaluació dels continguts en àcid ascòrbic (vitamina C), polifenols totals, àcids fenòlics i flavonoides en mostres de tomàquet i enciam, produïts sota diferents condicions de camp (producció ecològica i convencional). Per aconseguir els resultats s’han utilitzat mètodes analítics basats en tècniques de cromatografia líquida d’alta eficàcia (HPLC) i d’ultra-alta eficàcia (UHPLC) acoblades a sistemes de detecció de diode array (DAD) i espectrometria de masses (MSn). Per a l’àcid ascòrbic, s’ha desenvolupat un mètode ràpid que ha permès la determinació d’aquest compost en diferents matrius vegetals amb el mínim pretractament de les mostres, utilitzant una fase estacionària HILIC (Fluorinated Stationary Phase). Els mètodes desenvolupats d’anàlisi de compostos fenòlics han permès realitzar les anàlisi de forma ràpida, a fi de processar el màxim nombre de mostres per a obtenir resultats representatius. S’ha realitzat una completa caracterització dels extractes de tomàquet i enciam, ampliant el coneixement descrit en la bibliografia sobre la seva composició fenòlica. En el cas de l’enciam, s’ha identificat quatre compostos fenòlics que mai abans han estat descrits i quantificats en aquesta hortalissa. La definició, amb precisió, dels continguts en vitamina C i compostos fenòlics en les mostres analitzades ha permès comparar els efectes de diferents tècniques de cultiu sobre les característiques nutricionals dels vegetals objecte de l’estudi. Els mètodes d’anàlisi desenvolupats i els resultats derivats del projecte seran publicats properament en revistes científiques de reconegut prestigi.

The implementation of liquid chromatography tandem mass spectrometry for the official control of lipophilic toxins in seafood: Single-laboratory validation under four chromatographic conditions

We performed a comprehensive study to assess the fit for purpose of four chromatographic conditions for the determination of six groups of marine lipophilic toxins (okadaic acid and dinophysistoxins, pectenotoxins, azaspiracids, yessotoxins, gymnodimine and spirolides) by LC-MS/MS to select the most suitable conditions as stated by the European Union Reference Laboratory for Marine Biotoxins (EURLMB). For every case, the elution gradient has been optimized to achieve a total run-time cycle of 12 min. We performed a single-laboratory validation for the analysis of three relevant matrices for the seafood aquaculture industry (mussels, pacific oysters and clams), and for sea urchins for which no data about lipophilic toxins have been reported before. Moreover, we have compared the method performance under alkaline conditions using two quantification strategies: the external standard calibration (EXS) and the matrix-matched standard calibration (MMS). Alkaline conditions were the only scenario that allowed detection windows with polarity switching in a 3200 QTrap mass spectrometer, thus the analysis of all toxins can be accomplished in a single run, increasing sample throughput. The limits of quantification under alkaline conditions met the validation requirements established by the EURLMB for all toxins and matrices, while the remaining conditions failed in some cases. The accuracy of the method and the matrix effects where generally dependent on the mobile phases and the seafood species. The MMS had a moderate positive impact on method accuracy for crude extracts, but it showed poor trueness for seafood species other than mussels when analyzing hydrolyzed extracts. Alkaline conditions with EXS and recovery correction for OA were selected as the most proper conditions in the context of our laboratory. This comparative study can help other laboratories to choose the best conditions for the implementation of LC-MS/MS according to their own necessities.

Protein phosphatase inhibition assays for okadaic acid detection in shellfish: matrix effects, applicability and comparison with LC-MS/MS analysis

The applicability of the protein phosphatase inhibition assay (PPIA) to the determination of okadaic acid (OA) and its acyl derivatives in shellfish samples has been investigated, using a recombinant PP2A and a commercial one. Mediterranean mussel, wedge clam, Pacific oyster and flat oyster have been chosen as model species. Shellfish matrix loading limits for the PPIA have been established, according to the shellfish species and the enzyme source. A synergistic inhibitory effect has been observed in the presence of OA and shellfish matrix, which has been overcome by the application of a correction factor (0.48). Finally, Mediterranean mussel samples obtained from Rı´a de Arousa during a DSP closure associated to Dinophysis acuminata, determined as positive by the mouse bioassay, have been analysed with the PPIAs. The OA equivalent contents provided by the PPIAs correlate satisfactorily with those obtained by liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC–MS/MS).

Anàlisi tèrmica de l'obtenció d'òxids de ceri a partir de precursors moleculars

El projecte consisteix en l’anàlisi tèrmica de l’obtenció d’òxids de ceri a partirde precursors moleculars com són el propionat de ceri (III), el propionat de ceri (III)dopat amb gadolini i el propionat de ceri (III) dopat amb zirconi. Els òxids resultantssón materials superconductors que ofereixen una resistència nul•la al pas del correnten determinades condicions. Per realitzar l’estudi hem fet servir quatre tècniques diferents: termogravimetria, calorimetria diferencial, espectrometria de masses i difracció de raigs-x

Improving gene annotation using peptide mass spectrometry

Annotation of protein-coding genes is a key goal of genome sequencing projects. In spite of tremendous recent advances in computational gene finding, comprehensive annotation remains a challenge. Peptide mass spectrometry is a powerful tool for researching the dynamic proteome and suggests an attractive approach to discover and validate protein-coding genes. We present algorithms to construct and efficiently search spectra against a genomic database, with no prior knowledge of encoded proteins. By searching a corpus of 18.5 million tandem mass spectra (MS/MS) from human proteomic samples, we validate 39,000 exons and 11,000 introns at the level of translation. We present translation-level evidence for novel or extended exons in 16 genes, confirm translation of 224 hypothetical proteins, and discover or confirm over 40 alternative splicing events. Polymorphisms are efficiently encoded in our database, allowing us to observe variant alleles for 308 coding SNPs. Finally, we demonstrate the use of mass spectrometry to improve automated gene prediction, adding 800 correct exons to our predictions using a simple rescoring strategy. Our results demonstrate that proteomic profiling should play a role in any genome sequencing project.