Qualidade fisiológica de sementes de milho, feijão, soja e alface na presença de extrato de tiririca

A espécie Cyperus rotundus (tiririca) é perene e de difícil controle. Os órgãos subterrâneos dessa ciperácea produzem inibidores capazes de interferir na germinação e no crescimento de plântulas e de plantas de várias espécies, fenômeno chamado de alelopatia. A inibição na germinação de sementes pode estar associada à interferência de substâncias alelopáticas na atividade de enzimas chaves no processo de germinação. Nesse trabalho foi avaliada a qualidade fisiológica assim como a atividade de enzimas envolvidas no processo de germinação em sementes de milho, feijão, soja e alface submetidas ao extrato de bulbos de tiririca. As sementes foram germinadas em substrato contendo extrato de bulbos de tiririca, nas concentrações de 10 g L-1 e 100 g L-1 e água destilada. A avaliação da qualidade fisiológica foi feita por meio de testes de germinação e vigor. Avaliou-se a atividade das enzimas superóxido-dismutase e esterase para todas as espécies, catalase para as sementes de milho e feijão, peroxidase e endo-b-mananase para as de alface, glutamato-oxalacetato-transaminase e a-amilase para as de milho e glicose-6-fosfato-desidrogenase para as de soja. Observou-se uma diminuição da germinação das sementes de alface com o aumento da concentração do extrato, inibição da germinação das sementes de milho e de feijão quando submetidas ao extrato na concentração de 10 g L-1 e um estímulo da germinação de sementes de soja na presença do extrato na concentração de 10 g L-1 e uma inibição em extrato na concentração de 100 g L-1. Foi observada redução da atividade das enzimas superóxido-dismutase, endo-b-mananase, peroxidase e a-amilase com o aumento da concentração do extrato. Para glutamato-oxalacetato-transaminase e glicose-6-fosfato-desidrogenase observou-se aumento da atividade da enzima com o aumento da concentração do extrato, indicando a perda da qualidade das sementes. Para esterase foi verificada menor atividade da enzima nas sementes de alface submetidas à germinação em substrato contendo 100 g L-1 e em soja menor atividade dessa enzima foi observada nas concentrações de 0 e 100 g L-1. Para catalase, observou-se padrões diferenciados de bandas sob concentrações de 10 e 100 g L-1 para o milho. O extrato de bulbos de tiririca interfere na qualidade fisiológica na atividade das enzimas envolvidas no processo de germinação de sementes de milho, feijão, soja e alface.

Identificação de cultivares de milho, feijão, algodão e soja por meio de enzimas e proteínas resistentes ao calor

Nesta pesquisa foram avaliados o polimorfismo e a estabilidade de isoenzimas e de proteínas resistentes ao calor em sementes de cultivares de milho, feijão, algodão e soja, com diferentes níveis de qualidade fisiológica. As isoenzimas ,álcool desidrogenase, catalase, esterase e superóxido dismutase analisadas conjuntamente, foram eficientes na separação de oito cultivares de milho. Para as cultivares de feijão, pela enzima peroxidase foi possível diferenciar a cultivar Carioca, no entanto, este padrão mostrou-se variável em sementes com baixa germinação. Não foi possível diferenciar as cultivares de algodão pelas enzimas esterase, superóxido dismutase, diaforase e malato desidrogenase. A cultivar Conquista, de soja, foi diferenciada pelos sistemas enzimáticos esterase e superóxido dismutase e a 'BRS-154' pela esterase. Proteínas resistentes ao calor são polimórficas e estáveis para a identificação de cultivares de milho.

Alterações fisiológicas e bioquímicas durante a embebição de sementes de sucupira-preta (Bowdichia virgilioides Kunth.)

Nessa pesquisa foi avaliado o comportamento das sementes de sucupira-preta durante a embebição, bem como as modificações em algumas proteínas durante esse processo. As sementes foram embebidas em rolo de papel umedecido, a 30°C e pesadas a cada 6 horas até a protrusão radicular de 50% das sementes, após o que as sementes foram submetidas a análises protéicas pela técnica da eletroforese. A curva de embebição dessa espécie segue um modelo trifásico. Na avaliação dos sistemas enzimáticos, foi observado um comportamento constante para as enzimas superóxido dismutase e malato desidrogenase. Para a enzima álcool desidrogenase, catalase e α-amilase, a intensidade das bandas variou em função do lote utilizado. Para as proteínas resistentes ao calor, foi observada a presença de bandas durante toda a germinação, com alterações na intensidade no decorrer do processo.

Condicionamento osmótico e giberelina na qualidade fisiológica de sementes de pimentão colhidas em diferentes estádios de maturação

Considerando que o condicionamento osmótico e a aplicação do ácido giberélico são capazes de beneficiar a germinação e o vigor das sementes, objetivou-se com essa pesquisa verificar o efeito da associação do condicionamento osmótico com giberelina na qualidade das sementes de pimentão colhidas em diferentes estádios de maturação. Os frutos foram produzidos em ambiente protegido, utilizando-se os híbridos Magnata Super e Konan R, que foram colhidos em quatro estádios de maturação, com base na coloração dos frutos: completamente verdes (estádio 1), com 20 a 30% de coloração avermelhada (estádio 2), com 40 a 50% de coloração avermelhada (estádio 3) e completamente vermelhos (estádio 4). As sementes foram condicionadas em solução de KNO3 contendo giberelina nas seguintes concentrações: 0, 50, 100, 200 e 400μM. Foram feitas as seguintes determinações em laboratório: germinação, emergência, índice de velocidade de emergência, condutividade elétrica, análise das enzimas malato desidrogenase, álcool desidrogenase, catalase e proteínas resistentes ao calor. O condicionamento osmótico e o uso da giberelina não proporcionaram aumentos significativos na germinação de sementes de pimentão dos dois híbridos. Entretanto favoreceu a velocidade de emergência, principalmente em sementes colhidas nos estádios 3 e 4. Verificou-se também efeito negativo do condicionamento osmótico em sementes colhidas no estádio 1 para ambos os híbridos. Concluiu-se que a associação dos tratamentos afeta positivamente o vigor das sementes de pimentão, com os melhores resultados verificados em sementes colhidas de frutos no início do amadurecimento, com 20 a 50% de coloração avermelhada.

Estudo enzimático da deterioração de sementes de Melanoxylon brauna submetidas ao envelhecimento natural e acelerado

Não há conhecimento específico para sementes florestais quanto aos processos metabólicos envolvidos durante o armazenamento, o que dificulta o estabelecimento de técnicas para sua conservação adequada. Assim, o objetivo do presente trabalho foi estudar a participação de enzimas do estresse oxidativo e metabolismo de lipídios durante o armazenamento ou envelhecimento acelerado. Sementes de brauna (Melanoxylon brauna - Leguminosae-Caesalpinoideae) foram envelhecidas naturalmente durante o armazenamento por 0, 3, 6, 9 e 12 meses em câmara fria e artificialmente (envelhecimento acelerado) durante 0, 24, 48, 72 e 96 horas, com objetivo de avaliar alterações na atividade das enzimas superóxido dismutase e catalase e nos teores de lipídios. Para isso, foram realizados testes de germinação, avaliadas a atividade enzimática e quantificados os teores de lipídios no eixo embrionário e nos cotilédones. O envelhecimento natural e acelerado afetou de forma semelhante o comportamento das sementes de brauna, promovendo redução do vigor. Embora os efeitos dos dois tipos de envelhecimento afetassem igualmente a germinação, o envelhecimento artificial a 45 ºC por 72 horas simula adequadamente o comportamento enzimático manifestado pelas sementes armazenadas por 12 meses em câmara fria. Houve semelhante redução gradativa das reservas de lipídios em ambos os sistemas de envelhecimento, mas sem correlação entre o armazenamento natural e o envelhecimento acelerado.

Desempenho durante o armazenamento de sementes de pepino submetidas a diferentes métodos de secagem

A secagem de sementes de pepino é etapa obrigatória no seu beneficiamento, bem como o armazenamento para conquistar mercados competitivos e melhores oportunidades de preços. Portanto, o objetivo com este trabalho foi o de avaliar o desempenho fisiológico e bioquímico durante a secagem e armazenamento de sementes de pepino. A cultivar utilizada foi o híbrido de pepino Ômega comercializado pela Agristar Ltda. As sementes foram lavadas e secadas em temperatura ambiente de 25 ºC, 35 ºC e 45 ºC até atingir grau de umidade de 7%. As sementes foram embaladas em sacos de papel multifoliado e armazenadas em condições de ambiente não controlado. As avaliações da qualidade foram realizadas aos 0, 3, 6, 9 e 12 meses pelos testes de germinação, primeira contagem, condutividade elétrica e emergência de plântulas em bandeja. Avaliaram também as atividades enzimáticas de superóxido dismutase, catalase, esterase, lipoxigenase, isocitrato liase e proteína LEA, e por fim o teste de sanidade. A secagem de sementes de pepino, em temperatura ambiente, e a 35 ºC resulta em sementes de melhor qualidade. Ocorre redução da qualidade fisiológica das sementes e da atividade da proteína LEA a partir de seis meses de armazenamento, independente da temperatura de secagem.

Desempenho fisiológico e bioquímico de sementes de pepino nos diferentes estádios de maturação

O trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar o desempenho fisiológico e bioquímico durante a maturação de sementes de pepino. Foi utilizado o híbrido de pepino "Ômega". Os frutos foram colhidos aos 30, 35, 40, 45, 50 e 55 dias após a antese e as sementes foram avaliadas após o processamento e secagem a sombra. Avaliou-se a massa de frutos, o teor de água e massa seca das sementes, massa de mil sementes e a análise de imagens por meio de raios-X. A qualidade fisiológica foi avaliada pelos testes de germinação, primeira contagem, condutividade elétrica e índice de velocidade de emergência. Foi realizada a eletroforese das enzimas superóxido dismutase, catalase, esterase, lipoxigenase, isocitrato liase e proteínas LEA. A análise enzimática e os testes de raios-x e fisiológicos indicam que a melhor qualidade fisiológica em sementes de pepino híbrido Ômega é obtida aos 45 e 50 dias após a antese quando os frutos apresentam coloração verde esbranquiçada.

Viabilidade e atividade antioxidante de sementes de genótipos de feijão-miúdo submetidos ao estresse salino

O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de diferentes concentrações salinas na germinação, produção inicial de biomassa e estresse oxidativo de quatro genótipos de feijão-miúdo de uso comum na região de São José do Norte-RS. As sementes dos genótipos Amendoim, Mosqueado, Baio e Preto foram semeadas em rolos de papel "germitest" embebido em solução de cloreto de sódio nas concentrações de zero, 50, 100, 150 e 200 mM e colocados para germinar a temperatura constante de 25 ºC. Os parâmetros avaliados foram: germinação, primeira contagem de germinação, comprimento e massa seca da parte aérea e de raízes das plântulas, peroxidação de lipídios e atividade específica das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, ascorbato peroxidase e catalase. O aumento da concentração de sal causou efeito negativo à germinação e primeira contagem das sementes dos quatro genótipos de feijão-miúdo a partir do tratamento com 100 mM de sal. Quanto aos parâmetros de crescimento, a análise conjunta das curvas de regressão, mostrou haver igual tendência para os quatro genótipos, com redução expressiva no crescimento concomitante ao aumento do estresse salino. Os efeitos desse estresse também foram evidenciados pelo aumento na peroxidação de lipídios no tratamento com 200 mM de sal, seguido pela menor capacidade antioxidante das enzimas, uma vez que, nas concentrações intermediárias de sal, as enzimas antioxidantes atuaram de forma eficiente na eliminação das espécies reativas de oxigênio (EROs), evitando o estresse oxidativo. Estes resultados permitem concluir que, nas doses intermediárias de sal, houve um bom desenvolvimento inicial para os quatro genótipos de feijão-miúdo, sendo a melhor resposta obtida no genótipo Amendoim.

Physiological quality of coffee seeds produced under different levels of solar radiation and maturation stages

In Brazil, although the coffee plantations are predominantly grown under full sunlight, the use of agroforestry systems can lead to socioeconomic advantages, thus providing a favorable environment to the crop by promoting its sustainability as well as environmental preservation. However, there is a lack of information on physiological quality of the coffee seeds produced under different levels of solar radiation. Within this context, the objective of this study was to evaluate the influence of different levels of solar radiation and maturation stages on the physiological quality of coffee (Coffea arabica L.) seeds, cv. Acaiá Cerrado MG-1474. Three levels of solar radiation (plants grown under full sunlight; under plastic screens of 35% shading; and under plastic screens of 50% shading) and three maturation stages (cherry, greenish-yellow and green) were assessed. Physiological quality of seeds was assessed by using germination test, first count of germination, abnormal seedlings, dead seeds, and seedlings with open cotyledonary leaves. Electrophoretic analysis of isoenzymes catalase, esterase, superoxide dismutase and peroxidase was also performed. With the evolution of development the coffee seeds presents increases on physiological quality, and at its beginning the seeds show improvements on quality with the reduction of solar radiation.

Physiological maturity of eggplant seeds

Determination of seed physiological maturity and ideal moment for harvesting fruits to extract their seeds are important aspects to produce seeds with high quality. To identify the best period for harvesting eggplant fruits, associated with ideal resting period of the fruit for extracting seeds, an eggplant production field was installed in municipality of Ijaci, in the State of Minas Gerais, Southwestern Brazil. The fruits were harvested at periods of 49, 56, 63, 70, and 77 days after pollination (DAP). The seeds of fruits harvested in each period were manually extracted immediately after harvest or after a post-harvest resting period of seven days, under a shed. The physiological quality of seeds was assessed by tests of: germination percentage; germination and emergence speed indexes; and electrical conductivity; which were carried out in the Central Seed Laboratory, Federal University of Lavras. Electrophoretic analyses of isoenzymes: catalase (CAT); esterase (EST); superoxide dismutase (SOD); and peroxidase (PO), were also therein performed. Results of germination and vigor of seeds have showed that the best period for harvesting the fruit is around 70 DAP; and that seeds should be extracted immediately after harvest. Electrophoretic analysis of enzymes has showed immaturity for eggplant seeds, harvested after 49 DAP.

A comparative study of protoheme and heme d catalases : role of the heme and the heme pocket in catalysis and ligand binding

Catalase dismutes H20 2 to O2 and H20. In successive twoelectron reactions H20 2 induces both oxidation and reduction at the heme group. In the first step the protoheme prosthetic group of beef liver catalase forms compound I, in which the heme has been oxidized from Fe3+ to Fe4+=0 and a porphyrin radical has been created. Compound II is formed by the oneelectron reduction of comp I. It retains Fe4+=0 but lacks the porphyrin radical and is catalytically inert. Molecular structures are available for Escherichia coli Hydroperoxidase II, Micrococcus Iysodeiktus, Penicillium vitale and beef liver enzymes, which contain different hemes and heme pockets. In the present work, the pockets and substrate access channels of protoheme (beef liver & Micrococcus) and heme d (HPII of E. coli and Penicillium) catalases have been analysed using Quanta™ and CharmMTM molecular modeling packages on the Silicon Graphics Iris Indigo 2 computer. Experimental studies have been carried out with two catalases, HPII (and its mutants) and beef liver. Fluoride and formate' are inhibitors of both enzymes, and their binding is modulated by the heme and by distal residues N201 & H128. Both HPII and beef liver enzymes form compound I with H202 or peracetate. The reduction of beef liver enzyme compound I to II and the decay of compound II are accelerated by fluoride. The decay of compound II is also accelerated by formate, and this reagent acts as a 2-electron donor towards compound I of both enzymes. It is concluded that heme d enzymes (Penicillium and HPII of E. coli) are formed by autocatalytic transformation of protoheme in a modified pocket which contains a characteristic serine residue as well as a partially occluded heme channel. They are less active than protoheme enzymes but also do not form the inactive compound II species. Binding of peroxide as well as fluoride and formate is prevented by mutation of H128 and modulated by mutation of N201.

Aspects of the hemes and modulation of hydrogen donors in catalases from bovine liver, yeast, and escherichia coli

Catalase is the enzyme which decomposes hydrogen peroxide to water and oxygen. Escherichia coli contains two catalases. Hydroperoxidase I (HPI) is a bifunctional catalase-peroxidase. Hydroperoxidase II (HPII) is only catalytically active toward H202. Expression of the genes encoding these proteins is controlled by different regimes. HPJI is thought to be a hexamer, having one heme d cis group per enzymatic subunit. HPII wild type protein and heme containing mutant proteins were obtained from the laboratory of P. Loewen (Univ. of Manitoba). Mutants constructed by oligonucleotidedirected mutagenesis were targeted for replacement of either the His128 residue or the Asn201 residue in the vicinity of the HPII heme crevice. His128 is the residue thought to be analogous to the His74 distal axial ligand of the heme in the bovine liver enzyme, and Asn201 is believed to be a residue critical to the function of the enzyme because of its role in orienting and interacting with the substrate molecule. Investigation of the nature of the hemes via absorption spectroscopy of the unmodified catalase proteins and their derived pyridine hemochromes showed that while the bovine and Saccharomyces cerevisiae catalase enzymes are protoheme-containing, the HPII wild type protein contains heme d, and the mutant proteins contain either solely protoheme, or heme d-protoheme mixtures. Cyanide binding studies supported this, as ligand binding was monophasic for the bovine, Saccharomyces cerevisiae, and wild type HPII enzymes, but biphasic for several of the HPII mutant proteins. Several mammalian catalases, and at least two prokaryotic catalases, are known to be NADPH binding. The function of this cofactor appears to be the prevention of inactivation of the enzyme, which occurs via formation of the inactive secondary catalase peroxide compound (compound II). No physiologically plausible scheme has yet been proposed for the NADPH mediation of catalase activity. This study has shown, via fluorescence and affinity chromatography techniques, that NADPH binds to the T (Typical) and A (Atypical) catalases of Saccharomyces cerevisiae, and that wild type HPII apparently does not bind NADPH. This study has also shown that NADPH is unlike any other hydrogen donor to catalase, and addresses its features as a unique donor by proposing a mechanism whereby NADPH is oxidized and catalase is protected from inactivation via the formation of protein radical species. Migration of this radical to a position close to the NADPH is also proposed as an adjunct hypothesis, based on similar electron migrations that are known to occur within metmyoglobin and cytochrome c peroxidase when reacted with H202. Validation of these hypotheses may be obtained in appropriate future experiments.

Activités antidiabétiques et neuroprotectrices du jus de bleuet biostransformé

Le bleuet démontre un potentiel thérapeutique dans le traitement du cancer et des maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Ces effets bénéfiques sont attribuables aux composés phénoliques abondants dans le bleuet, tels que les anthocyanines et les flavonoïdes. La biotransformation du jus de bleuet avec les bactéries Serratia vaccinii augmente sa teneur en composés phénoliques et son activité anti-oxydante, et modifie ses activités physiologiques. L’objectif de la présente étude est d’évaluer l’activité neuroprotectrice et le potentiel antidiabétique du jus de bleuet biostranformé (BJ). Le BJ est étudié dans différents tests dont : 1) La protection des neurones (N2a) contre le stress oxydatif (SO) induit par le peroxyde d’hydrogène; 2) La stimulation de la prise de glucose par les cellules musculaires (C2C12) et adipeuses (3T3-L1); 3) L’activité anti-hyperglycémique chez les souris obèses diabétiques KKAy. En effet, tandis que le jus de bleuet normal n’a aucun effet, le BJ augmente l’activité des enzymes anti-oxydantes, comme la catalase et la SOD (Superoxide Dimutase) et protège les neurones contre les changements de la signalisation des MAPKs et contre la toxicité induite par le peroxyde d’hydrogène. Le BJ augmente aussi la prise de glucose de 48% dans les cellules C2C12 et de 142% dans les cellules 3T3-L1. Cette augmentation n’est pas expliquée par une augmentation du calcium cytosolique mais plutôt par une stimulation de la phosphorylation de l’AMPK. De plus, le BJ inhibe l’adipogenèse chez les 3T3-L1. Le BJ diminue également l’hyperglycémie chez les souris obèses diabétiques KKAy et protège les jeunes souris pré-diabétiques contre le développement de l’obésité et du diabète. L’activité anti-hyperglycémique du BJ pourrait impliquer les adipokines puisque le BJ augmente le niveau d’adiponectine chez les souris diabétiques. Le BJ représente ainsi une approche prometteuse pour le traitement du diabète et les maladies neurodégénératives et une source de nouveaux agents thérapeutiques contre ces maladies.

Modulation de la voie de signalisation de Gαq par l’hyperglycémie : mécanisme moléculaire

Les complications vasculaires telles que l’augmentation de la contractilité et la prolifération cellulaire sont les complications les plus communes observées dans le diabète et l’hyperglycémie chronique est un facteur important dans ces processus. La voie de signalisation de Gαq joue un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire et l’altération de celle-ci peut contribuer aux complications vasculaires observées dans les cas de diabète et d’hyperglycémie. Il a été observé que les taux et l’activité des protéines kinase C (PKC) et du diacylglycérol (DAG) sont augmentés dans ces conditions. Cependant, aucune étude n’a démontré l’implication de Gαq/11 et des PLCβ, molécules de signalisation en amont de PKC/DAG. Plusieurs études révèlent que l’augmentation des taux et de l’activité des PKC et du DAG induite par l’hyperglycémie dans des cellules du muscle lisse vasculaire (CMLV) est attribuée à l’augmentation du stress oxydatif. De plus, les niveaux de certains peptides vasoactifs, tels que l’angiotensine II et l’endothéline-1, augmentés dans les conditions de diabète/d’hyperglycémie, peuvent contribuer à l’augmentation du stress oxydatif observée. Le travail présenté dans cette thèse avait pour but d’examiner les effets de l’hyperglycémie sur les niveaux d’expression protéique de Gαq/11 et de ses molécules associées, ainsi que d’étudier le mécanisme moléculaire par lequel l’hyperglycémie module la voie de signalisation de Gαq dans les CMLV. Dans la première étude, nous avons examiné si l’hyperglycémie pouvait moduler l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ1 et PLCβ2. Le prétraitement des CMLV A10 avec 26 mM de glucose durant 72 heures augmente l’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 en comparaison avec les CMLV témoins. Le traitement avec des antagonistes aux récepteurs AT1 de l’Ang II, et ETA/ETB de l’ET-1, atténue la hausse de Gαq, de Gα11, de PLCβ1 et de PLCβ2 induite par l’hyperglycémie. De plus, la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 était plus élevée dans les CMLV exposée à 26 mM de glucose. Le traitement des CMLV A10 avec l’Ang II et l’ET-1 augmente également les niveaux d’expression des protéines Gα q/11 et PLCβ. Cette augmentation de l’expression est restaurée au niveau des CMLV témoins par les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ dans les CMLV induite par l’hyperglycémie est attribuée à l’activation des récepteurs AT1, ETA et ETB. Dans la seconde étude, nous avons examiné l’implication du stress oxydatif dans l’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. Nous avons également déterminé le mécanisme responsable de l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie. L’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et PLCβ des CMLV A10 exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec l’antioxydant diphenyleneiodonium (DPI), et la catalase, un chélateur du peroxyde d’hydrogène, mais pas par le 111Mn-tetralis(benzoic acid porphyrin) (MnTBAP) ni par l’acide urique, des chélateurs du peroxynitrite. De plus, l’augmentation de la formation d’IP3 stimulée par l’ET-1 dans les CMLV exposées à 26 mM de glucose est revenue au niveau basal après un traitement avec le DPI et la catalase. Ces résultats suggèrent que l’augmentation du stress oxydatif induite par l’hyperglycémie contribue à l’augmentation de l’expression des protéines Gαq/11 et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq. De plus, l’augmentation de la production d’anion superoxyde (O2-), de l’activité de la NADPH oxydase et de l’expression des protéines p22(phox) et p47(phox) induite par l’hyperglycémie est revenue à un niveau basal après un traitement avec les antagonistes des récepteurs AT1, ETA et ETB. Ces résultats suggèrent que l’hyperglycémie augmente les niveaux endogènes de l’Ang II et de l’ET-1, ce qui augmente le stress oxydatif par la formation d’O2- et de H2O2 et peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gq/11α et de leurs molécules de signalisation. Puisqu’il a été observé que l’hyperglycémie transactive les récepteurs aux facteurs de croissance tels que le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGF-R) et le récepteur au facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-R), nous avons entrepris d’examiner, dans la troisième étude, l’implication d’EGF-R et de PDGF-R dans l’augmentation des niveaux de Gαq/11, de PLCβ et de leur signalisation induite par l’hyperglycémie. L’augmentation des niveaux d’expression des protéines Gαq, Gα11, PLCβ-1 et PLCβ-2 induite par l’hyperglycémie est revenue au niveau basal après un traitement avec les inhibiteurs d’EGF-R (AG1478) et de PDGF-R (AG1295) et par l’inhibiteur de c-Src, PP2. L’augmentation de la phosphorylation d’EGF-R et de PDGF-R induite par l’hyperglycémie a été abolie par AG1478, AG1295 et PP2. De plus, l’augmentation des niveaux de Gαq/11, et de PLCβ induite par l’hyperglycémie est atténuée par l’inhibiteur des MAPK, le PD98059, et par l’inhibiteur d’AKT, le wortmannin. L’augmentation de la phosphorylation d’ERK et d’AKT était également atténuée par AG1478 et AG1295. Ces résultats suggèrent que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par c-Src peut contribuer à l’augmentation des niveaux de Gα q/11/PLC et de leur signalisation par la voie des MAPK/PI3K. En conclusion, les études présentées dans cette thèse indiquent que l’hyperglycémie augmente les niveaux de Gαq/11 et de PLCβ. Nous avons émis des évidences qui démontrent que l’augmentation endogène de l’Ang II et de l’ET-1 par l’hyperglycémie peut contribuer à l’augmentation de la production d’O2- et de H2O2 résultant ainsi en une augmentation du stress oxydatif qui pourrait être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et de leur signalisation dans les conditions d’hyperglycémie. Finalement, nous avons démontré que la transactivation des récepteurs aux facteurs de croissance induite par l’hyperglycémie peut être responsable de l’augmentation de Gαq/11/PLC et les molécules associées à la voie de signalisation de Gq dans les cas de diabète et d’hyperglycémie.

Le diabète maternel influence la morphogenèse rénale et la programmation périnatale

Le diabète maternel est un facteur de risque majeur pour le développement de malformations congénitales. Dans le syndrome de l’embryopathie diabétique, l’exposition prolongée du fœtus à de hautes concentrations ambientes de glucose induit des dommages qui peuvent affecter plusieurs organes, dont les reins. Les malformations rénales sont la cause de près de 40 pourcent des cas d’insuffisance rénale infantile. L’hyperglycémie constitue un environnement utérin adverse qui nuit à la néphrogenèse et peut causer l’agenèse, la dysplasie (aplasie) ou l’hypoplasie rénale. Les mécanismes moléculaires par lesquels les hautes concentrations ambientes de glucose mènent à la dysmorphogenèse et aux malformations demeurent toutefois mal définis. Le diabète maternel prédispose aussi la progéniture au développement d’autres problèmes à l’âge adulte, tels l’hypertension, l’obésité et le diabète de type 2. Ce phénomène appelé ‘programmation périnatale’ a suscité l’intérêt au cours des dernières décennies, mais les mécanismes responsables demeurent mal compris. Mes études doctorales visaient à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le diabète maternel ou un environnement in utero hyperglycémique affecte la néphrogenèse et programme par la suite la progéniture a développer de l’hypertension par des observations in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons utilisé les cellules MK4, des cellules embryonnaires du mésenchyme métanéphrique de souris, pour nos études in vitro et deux lignées de souris transgéniques (Tg) pour nos études ex vivo et in vivo, soient les souris HoxB7-GFP-Tg et Nephrin-CFP-Tg. Les souris HoxB7-GFP-Tg expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans le bourgeon urétérique (UB), sous le contrôle du promoteur HoxB7. Les souris Nephrin-CFP expriment la protéine fluorescente cyan (CFP) dans les glomérules, sous le contrôle du promoteur nephrin spécifique aux podocytes. Nos études in vitro visaient à déterminer si les hautes concentrations de glucose modulent l’expression du gène Pax2 dans les cellules MK4. Les cellules MK4 ont été traitées pendant 24h avec du milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants ou inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK, PKC et NF-kB. Nos résultats ont démontré que le D-glucose élevé (25mM) augmente la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules MK4 et induit spécifiquement l’expression du gène Pax2. Des analogues du glucose tels le D-mannitol, L-glucose ou le 2-Deoxy-D-glucose n’induisent pas cette augmentation dans les cellules MK4. La stimulation de l’expression du gène Pax2 par le D-glucose dans les cellules MK4 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de NF-kB, mais pas par des inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK ou PKC. Ces résultats indiquent que la stimulation de l’expression du gène Pax2 par les concentrations élevées de glucose est due, au moins en partie, à la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation NF-kB, et non pas via les voies PKC, p38 MAPK et p44/42 MAPK. Nos études ex vivo s’intéressaient aux effets d’un milieu hyperglycémique sur la morphogenèse de la ramification du bourgeon urétérique (UB). Des explants de reins embryonnaires (E12 à E18) ont été prélevés par micro-dissection de femelles HoxB7-GFP gestantes. Les explants ont ensuite été cultivés dans un milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants, catalase ou inhibiteur de PI3K/AKT pour diverses durées. Nos résultats ont démontré que le D-glucose stimule la ramification du UB de manière spécifique, et ce via l’expression du gène Pax2. Cette augmentation de la ramification et de l’expression du gène Pax2 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de PI3K/AKT. Ces études ont démontré que les hautes concentrations de glucose altèrent la morphogenèse de la ramification du UB via l’expression de Pax2. L’effet stimulant du glucose semble s’effectuer via la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation Akt. Nos études in vivo visaient à déterminer le rôle fondamental du diabète maternel sur les défauts de morphogenèse rénale chez la progéniture. Dans notre modèle animal, le diabète maternel est induit par le streptozotocin (STZ) chez des femelles HoxB7-GFP gestantes (E13). Les souriceaux ont été étudiés à différents âges (naissants et âgés de une, deux ou trois semaines). Nous avons examiné leurs morphologie rénale, nombre de néphrons, expression génique et les événements apoptotiques lors de cette étude à court terme. La progéniture des mères diabétiques avait un plus faible poids, taille et poids des reins, et possédait des glomérules plus petits et moins de néphrons par rapport à la progéniture des mères contrôles. La dysmorphogenèse rénale observée est peut-être causée par l’augmentation de l’apoptose des cellules dans la région du glomérule. Nos résultats ont montré que les souriceaux nés de mères diabétiques possèdent plus de podocytes apoptotiques et plus de marquage contre la caspase-3 active dans leurs tubules rénaux que la progéniture des mères contrôles. Les souriceaux des mères diabétiques montrent une augmentation de l’expression des composants du système rénine angiotensine (RAS) intrarénal comme l’angiotensinogène et la rénine, ainsi qu’une augmentation des isoformes p50 et p65 de NF-kB. Ces résultats indiquent que le diabète maternel active le RAS intrarénal et induit l’apoptose des glomérules, menant à une altération de la morphogenèse rénale de la progéniture. En conclusion, nos études ont permis de démontrer que le glucose élevé ou l’environnement in utero diabétique altère la morphogenèse du UB, qui résulte en un retard dans la néphrogenèse et produit des reins plus petits. Cet effet est dû, au moins en partie, à la génération des ROS, à l’activation du RAS intrarénal et à la voie NF-kB. Nos études futures se concentreront sur les mécanismes par lesquels le diabète maternel induit la programmation périnatale de l’hypertension chez la progéniture adulte. Cette étude à long terme porte sur trois types de progénitures : adultes nés de mères contrôles, diabétiques ou diabétiques traitées avec insuline pendant la gestation. Nous observerons la pression systolique, la morphologie rénale et l’expression de divers gènes et protéines. Nous voulons de plus déterminer si la présence d’un système antioxydant (catalase) peut protéger la progéniture des effets néfastes des ROS causés par l’environnement in utero hyperglycémique. Les souris Catalase-Tg expriment la catalase spécifiquement dans les tubules proximaux et nous permettrons d’explorer notre hypothèse sur le rôle des ROS dans notre modèle expérimental de diabète maternel.