Die Rolle von IL-17 in Patienten und im Mausmodell für Lungen-Adenokarzinom

Die Funktion der Th 17-Zelllinie im Lungenkarzinom wurde noch nicht vollständig verstanden. In dieser Studie wurde darüber berichtet, dass die Expression der Th17-Zellmarker (RORA, RORC2, IL-17A) in den Lungen der Patienten mit Adenokarzinom erhöht ist, und diese mit dem Transkriptionsfaktor der regulatorischen T-Zellen FOXP 3 positiv korrelieren, was auf eine Beziehung dieser Zelltypen deutet. Außerdem hat man auch herausgefunden, dass IL-17A mit T-bet Trankriptionsfaktor in den Patienten entgegengesetzt korreliert. Die Blockade in einem Mausmodell für Lungen-Adenokarzinom resultierte die Reduktion von Tumorbefall in der Lunge, lokale Expansion der IFNg produzierenden CD4+ T-Effektorzellen und Reduktion der CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T-Zellen. Untersuchungen in T-bet(-/-) Mäusen zeigten, dass die antikarzinogenen Wirkungen der antiIL-17A-Behandlung T-bet Transkriptionsfaktor benötigen, um sowohl die FOXP3 regulatorischen T-Zellen als auch die Th17-Zellen in vivo zu supprimieren. Dementsprechend hat man herausgefunden, dass der Th17-Pfad beim Fehlen des T-bet Transkriptionsfaktors durch Hochregulierung des IL-23 Rezeptors in CD4+ T-Zellen stimuliert wurde. Bemerkenswert, dass der IL-17 Rezeptor hauptsächlich auf den CD4+CD62Lhigh naiven T-Zellen exprimiert wird und sowohl auf den CD4+T-bet+ Th1- als auch auf den CD4+CD25+FOXP3+ Treg -Zellen im Tumor fehlt. Dieses resultiert den Verlust der Kontrolle der IL-17 auf Th1 und Treg-Zellentwicklung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Blockade des IL-17A eine mögliche klinische Behandlung darstellt, weil sie die IFNg produzierenden Th1 Zellen unterstützt und die CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T Zellen in Lungen Karzinom reduziert.

Evaluation von Effektivität und Sicherheit der niederfrequenten, transkraniellen Ultraschalltherapie beim Schlaganfall

In den westlichen Ländern nimmt die Zahl der Schlaganfall-Patienten stetig zu und zählt mittlerweilernzu einer der häufigsten Todesursachen. Derzeit ist die Rekanalisationstherapie mit demrnFibrinolytikum rt-PA die einzig zugelassene Therapie. Die Rekanalisationsrate ist oftmals inkomplettrnund aufgrund von möglichen Blutungskomplikationen die Therapie nicht bei allen Patientenrnmöglich. Daher ist es wichtig, Alternativtherapieansätze (z.B. Ultraschallthrombolyse) zurnentwickeln. Blutgerinnsel können mit Hilfe von Ultraschall in Schwingung gebracht und sornlysiert oder die Wirkung von rt-PA verstärkt werden. Die vorliegende Arbeit hatte die Evaluationrnvon Bioeffekten von 60 kHz Ultraschall an gesundem und ischämischem Hirngewebe zum Ziel.rnNeben tierexperimentellen Methoden kamen auch molekular-biologische Techniken zur Anwendung.rnDie erste Studie beschäftigte sich mit der Wirkung von 60 kHz (Intensität: 0,2 W/cm2 undrnDuty Cycle 50%) auf ischämisches Hirngewebe (permanent ischämisch und nach Reperfusion).rnLediglich nach Reperfusion und Ultraschallbehandlung war das Läsionsvolumen signifikantrnerhöht, so dass von einer besonderen Vulnerabilität des Hirngewebes nach Reperfusionrnauszugehen ist (Penumbraschädigung). In der neurologischen Beurteilung der Tiere zeigte sichrnbei allen Tieren mit permanenter Okklusion und etwa einem Drittel der Tiere nach Reperfusionrnund Ultraschallbehandlung eine Hörminderung. In der anschließenden Studie wurde diernUltraschallintensität erniedrigt und der Duty Cycle variiert. In einer publizierten in vitro Studiernkonnte die zunehmende Lyserate mit steigendem Duty Cycle nachgewiesen werden. DiernAuswertung ergab eine Abhängigkeit des Läsionsvolumens von der Länge des Duty Cycles. Derrndritte Teil der Arbeit befasst sich mit der Wirkung von Ultraschall auf die Genexpression. Hierzurnwurden gesunde Ratten mit Ultraschall verschiedener Frequenzen (60 kHz, 488 kHz und 3 MHz)rntranskraniell behandelt und 4 h bzw. 24 h nach der Behandlung getötet. Proben von ischämischenrnTieren dienten als positive Kontrollen. Aufgrund von Literaturrecherchen wurden mehrerernKandidatengene ermittelt. Die Messung der Ischämieproben ergab eine weitgehende Übereinstimmungrnmit der Literatur. Die Messungen an den mit 60 kHz behandelten Proben ergabenrnkaum Anzeichen für eine differenzielle Genregulation. Die Frequenz von 488 kHz zeigte diernmeisten Regulationen, gefolgt von der Behandlung mit 3 MHz. Dieses Ergebnis lässt vermuten,rndass es sich bei den detektierten Veränderungen um protektive Mechanismen handelt, da diesernFrequenzen bislang im Tierversuch als nebenwirkungsarm beschrieben wurden. Die Auswertungrnvon 60 kHz-Proben mit Affymetrix Arrays ergab lediglich einige wenige differentiell regulierternGene. Die Array-Experimente konnten nicht durch qPCR-Messungen bestätigt werden.

Flut und Hitze: Auswirkungen extremer Klimaereignisse auf die epigäische Arthropodenfauna (Araneae – Spinnen) ufernaher Lebensräume (Auen, Polder) des Inselrheins bei Mainz

Die vorliegende Arbeit ist ein Teil des Projektes Flut und Hitze des Kompetenzzentrums Überflutung an der Universität Mainz. Die Ziele dieser Untersuchung waren: Die Artzusammensetzung und Phänologien der Spinnengemeinschaften von Uferhabitaten bei Mainz (Rheinland-Pfalz, Deutschland) zu ermitteln, anhand des Artenspektrums die Folgen langjähriger Trockenheit und die Auswirkungen des Extremsommers 2003 zu beschreiben, Einflüsse von Überflutungen festzustellen und die Submersionstoleranzen ausgewählter Arten zu bestimmen. Insgesamt wurden 27783 Spinnen aus 179 Arten und 24 Familien bearbeitet. Die Untersuchung umfasste einen Hartholzauwald bei Ingelheim am Rhein, den Hochwasserschutzpolder Ingelheim, sowie Tiermaterial von vier weiteren Uferstandorten und drei Inselstandorten des Rheins bei Mainz. Die Beprobung der Hartholzaue mit Barberfallen und Stammeklektoren erfolgte von Mai 2005 bis Mai 2008. Im Polder wurden von Oktober 2006 bis Mai 2008 mit Barberfallen und einem Vakuumsauger gefangen. Die Proben der weiteren Standorte stammten aus Barberfallenfängen der Jahre 2000 bis einschließlich 2005. In der seit Winter 2002/2003 nicht mehr überfluteten und im Sommer stark austrocknenden Hartholzaue wurde eine als xerotolerant zu bezeichnende Spinnenfauna vorgefunden. Dies galt insbesondere für die sehr artenreiche Stammregion. Zu den dominierenden Spezies zählten: Diplostyla concolor (Boden), Clubiona pallidula und Textrix denticulata (beide Stamm). Der Polder Ingelheim wurde überwiegend von euryöken Freilandbewohnern besiedelt, dominant kamen Oedothorax apicatus und Pardosa agrestis vor. Das Tiermaterial der Ufer- und Inselstandorte wies deutliche Unterschiede in der Artenzusammensetzung im Bezug auf die Flutungsintensität auf. Nach dem Ausbleiben von Hochwässern und dem starken Austrocknen der Standorte im Sommer 2003 wurden hygrobionte Arten wie Allomengea vidua kaum mehr vorgefunden, während sich xerotolerante Spezies ausbreiteten. Darüber hinaus wurden die Submersionstoleranzen ausgewählter Spinnenarten im Labor ermittelt. Die gewonnenen Daten lassen Vermuten, dass die getesteten Spinnenspezies durchaus in der Lage sind, bei niedrigen Wassertemperaturen eine kurze Flut submers zu überstehen. Unter hohen Temperaturen besteht dagegen keine Submersionstoleranz.

Das wasserlösliche Chlorophyll-Protein (WSCP): biochemische Charakterisierung und Untersuchungen zur biologischen Funktion

Das WSCP (water-soluble chlorophyll protein) der Brassicaceen ist das einzig bekannte Chlorophyll-bindende Protein, welches keine Carotinoide bindet. Es ist ein wasserlösliches, ca. 80 kDa großes Homotetramer mit 1-4 gebundenen Chlorophyllen. Das Protein ist äußerst stabil und vermag die gebundenen Chlorophylle vor Photooxidation zu schützen. Seine Funktion in der Pflanze ist bis heute ein Rätsel und sollte in dieser Arbeit zusammen mit seinen biochemischen Eigenschaften weiter aufgeklärt werden. Es wurden Versuche durchgeführt mit nativem und rekombinantem WSCP aus Blumenkohl (BoWSCP bzw. BoWSCPhis) und aus Arabidopsis thaliana (AtWSCP bzw. AtWSCPhis). Die Expressionsausbeute von BoWSCPhis konnte verbessert werden und zusätzlich wurde die Rekonstitutionsmethode für das rekombinante WSCP optimiert, sodass das pigmentierte Protein mit hoher Ausbeute und großer Reinheit gewonnen werden konnte. Zudem wurde ein neuer WSCP-Klon hergestellt, mBoWSCPhis, der in seiner Sequenz dem maturen nativen BoWSCP entspricht und weitaus weniger Aggregationsprobleme zeigte als BoWSCPhis. Weiterführende Versuche zur Stabilität und dem Oligomerisierungsgrad von WSCP haben die neue Erkenntnis erbracht, dass die Phytolschwänze der von WSCP gebundenen Chlorophylle zwar essentiell sind für die Stabilität von WSCP-Oligomeren, nicht aber für die Oligomerisierung selbst, wie es in der Literatur bislang postuliert wurde. Zusätzlich zu ihrer außerordentlichen Hitzestabilität erwiesen sich die Chl-WSCP-Komplexe als stabil in einem breiten pH-Spektrum. AtWSCPhis besaß eine vergleichbare Stabilität, und auch das Oligomerisierungsverhalten zeigte Ähnlichkeiten zu BoWSCPhis. Im Rahmen einer Forschungskooperation mit dem Institut für Optik und Atomare Physik der TU Berlin wurden zeitaufgelöste Absorptionsspektren sowie Tieftemperatur-Fluoreszenzspektren an Chl-WSCP-Komplexen gemessen. Die Ergebnisse zeigten deutlich, dass die WSCP-gebundenen Chlorophylle excitonisch gekoppelt sind und wiesen zudem auf unterschiedliche Chl-Bindungsmodi hin. Aufgrund seines einfachen Aufbaus und seines geringen Chlorophyllgehalts hat sich WSCP bei diesen Versuchen als sehr geeignetes Modellsystem erwiesen, um Messungen zur Chlorophyllbindung mit Vorhersagen aus theoretischen Modellen zu vergleichen. Bei den Experimenten zur biologischen Funktion wurden einerseits Arabidopsis thaliana WSCP-„knock-out“-Pflanzen unter verschiedenen Bedingungen charakterisiert, andererseits wurden Experimente mit rekombinantem WSCP durchgeführt, um eine mögliche Interaktion mit anderen Proteinen zu detektieren. Die vegetativen Stadien der Mutante zeigten keinen Phänotyp; das native Arabidopsis-WSCP konnte später bei der Wildtyp-Pflanze ausschließlich in jungen Schoten lokalisiert werden, was eine Erklärung hierfür lieferte. Rekombinantes WSCP konnte Chlorophylle aus nativem LHCII entfernen, eine Interaktion mit Chlorophyllase konnte jedoch nicht nachgewiesen werden; daher konnte auch die Hypothese, WSCP sei ein Chl-Carrier beim Chl-Abbau, nicht untermauert werden. Bei den durchgeführten Enzym-Assays wurde eine geringfügige Inhibition der Cysteinprotease Papain beobachtet, aber keine Inhibition der Serinprotease Trypsin, obwohl Blumenkohl-WSCP N-proximal das Motiv der Künitz-Proteaseinhibitoren besitzt. Die Frage nach der biologischen Funktion von WSCP bleibt also weiterhin offen.

Bioinformatische Identifizierung und Charakterisierung von Zyklin-abhängigen Kinasen und Zyklinen des Parasiten Eimeria tenella und deren Nutzung im rationalen Wirkstoffdesign

Parasiten der Apicomplexa umfassen sowohl humanpathogene, als auch tierpathogene Protozoen. Beispiele für wichtige Vertreter human- und tierpathogener Parasiten sind Plasmodium falciparum und Eimeria tenella. E. tenella verursacht die Kokzidiose des Hühnchens, eine Darmerkrankung die weltweit für Verluste in einer geschätzten Höhe von bis zu 3 Milliarden US$ verantwortlich zeichnet. Eine prophylaktische Vakzinierung gegen diese Krankheit ist ökonomisch meist ineffizient, und eine Behandlung mit Kokzidiostatika wird durch häufige Resistenzbildung gegen bekannte Wirkstoffe erschwert. Diese Situation erfordert die Entwicklung neuer kostengünstiger Alternativen. Geeignete Zielproteine für die Entwicklung neuartiger Arzneistoffe zur Behandlung der Kokzidiose sind die Zyklin-abhängigen Kinasen (CDKs), zu denen auch die CDK-related Kinase 2 (EtCRK2) aus E. tenella gehört. Diese Proteine sind maßgeblich an der Regulation des Zellzyklus beteiligt. Durch chemische Validierung mit dem CDK Inhibitor Flavopiridol konnte nachgewiesen werden, dass ein Funktionsverlust von CDKs in E. tenella die Vermehrung des Parasiten in Zellkultur inhibiert. E. tenella CDKs sind daher als Zielproteine für die Entwicklung einer Chemotherapie der Kokzidiose geeignet. Mittels bioinformatischer Tiefenanalysen sollten CDK Proteine im Parasiten E. tenella identifiziert werden. Das Genom von E. tenella liegt in Rohfassung vor [ftp://ftp.sanger.ac.uk]. Jedoch waren zum Zeitpunkt dieser Arbeiten viele Sequenzen des Genoms noch nicht annotiert. Homologe CDK Proteine von E. tenella konnten durch den Vergleich von Sequenzinformationen mit anderen Organismen der Apicomplexa identifiziert und analysiert werden. Durch diese Analysen konnten neben der bereits bekannten EtCRK2, drei weitere, bislang nicht annotierte CDKs in E. tenella identifiziert werden (EtCRK1, EtCRK3 sowie EtMRK). Darüber hinaus wurde eine Analyse der entsprechenden Zykline – der Aktivatoren der CDKs – bezüglich Funktion und Struktur, sowie eine Datenbanksuche nach bisher nicht beschriebenen Zyklinen in E. tenella durchgeführt. Diese Suchen ergaben vier neue potentielle Zykline für E. tenella, wovon EtCYC3a als Aktivator der EtCRK2 von María L. Suárez Fernández (Intervet Innovation GmbH, Schwabenheim) bestätigt werden konnte. Sequenzvergleiche lassen vermuten, dass auch EtCYC1 und EtCYC3b in der Lage sind, EtCRK2 zu aktivieren. Außerdem ist anzunehmen, dass EtCYC4 als Aktivator der EtCRK1 fungiert. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit war die Suche und Optimierung nach neuen Inhibitoren von CDKs aus E. tenella. In vorangegangenen Arbeiten konnten bereits Inhibitoren der EtCRK2 gefunden werden [BEYER, 2007]. Mittels Substruktur- und Ähnlichkeitssuchen konnten im Rahmen dieser Arbeit weitere Inhibitoren der EtCRK2 identifiziert werden. Vier dieser Strukturklassen erfüllen die Kriterien einer Leitstruktur. Eine dieser Leitstrukturen gehört zur Strukturklasse der Benzimidazol-Carbonitrile und ist bislang nicht als Inhibitor anderer Kinasen beschrieben. Diese neu identifizierte Leitstruktur konnte in silico weiter optimiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Bindungsenergien von Vertretern dieser Strukturklasse berechnet, um einen wahrscheinlichen Bindemodus vorherzusagen. Für die weiterführende in silico Optimierung wurde eine virtuelle kombinatorische Substanzbibliothek dieser Klasse erstellt. Die Auswahl geeigneter Verbindungen für eine chemische Synthese erfolgte durch molekulares Docking unter Nutzung von Homologiemodellen der EtCRK2. Darüber hinaus wurde ein in silico Screening nach potentiellen Inhibitoren der PfMRK und EtMRK durchgeführt. Dabei konnten weitere interessante virtuelle Hit-Strukturen aus einer Substanzdatenbank kommerziell erhältlicher Verbindungen gefunden werden. Durch dieses virtuelle Screening konnten jeweils sieben Verbindungen als virtuelle Hits der PfMRK sowie der EtMRK identifiziert werden. Die Häufung von Strukturklassen mit bekannter CDK Aktivität deutet darauf hin, dass während des virtuellen Screenings eine Anreicherung von CDK Inhibitoren stattgefunden hat. Diese Ergebnisse lassen auf eine Weiterentwicklung neuer Wirkstoffe gegen Kokzidiose und Malaria hoffen.

Die Rolle von GABA- und Glyzinrezeptoren während der radialen Migration kortikaler Neurone in der pränatalen Maus

Für die Entwicklung des zerebralen Kortex ist die radiale Migration von Neuronen von elementarer Bedeutung. Für diese radiale Migration sind extrazelluläre Signale, die mit den Neuronen interagieren und eine Umgestaltung des Zytoskeletts vermitteln, notwendig. Zu den extrazellulären Signalen gehört auch der Neurotransmitter GABA, der über Depolarisation der Neurone einen Ca2+-Einstrom vermittelt und dadurch die Modulation der Migration über Ca2+-abhängige Signalwege ermöglicht. Auch von Taurin ist bekannt, dass es die neuronale Migration beeinflusst. Frühere Studien zeigten, dass die Depolarisation von GABAA-Rezeptoren durch GABA zu einem Migrationsstop führt, wohingegen Picrotoxin-sensitive Rezeptoren die Migration von der Ventrikulären Zone in die Intermediäre Zone des pränatalen Kortex vermitteln. Obwohl zu den Picrotoxin-sensitiven Rezeptoren GABAA-, GABAC- und bestimmte Glyzinrezeptoren gehören, wurde die Rolle von GABAC- und Glyzinrezeptoren während der radialen Migration nie überprüft. Ziel dieser Dissertation war deshalb, den Einfluss von GABAC- und Glyzinrezeptoren auf die radiale Migration zu untersuchen. Unter Verwendung von Migrationsanalysen, Fluoreszenzmessungen, molekularbiologischen und histologischen Methoden wurde gezeigt, dass GABAC-Rezeptoren im unteren Bereiche des präfrontalen Kortex exprimiert werden, ihre Aktivierung durch GABA in der Intermediären Zone zu einer Depolarisation führt, dass GABAC-Rezeptoren die Migration fördern und dieser Effekt über den migrationsstoppenden Effekt der GABAA-Rezeptoren dominiert. Durch Aktivierung der Glyzinrezeptoren fördert Taurin die Migration.

Pflanzlicher Lichtsammler (LHCII) in Hybridkomplexen mit organischen Farbstoffen und anorganischen Halbleiter-Nanokristallen (Quantum dots)

Der Lichtsammelkomplex II (LHCII) höherer Pflanzen ist eines der häufigsten Membranproteine der Welt. Er bindet 14 Chlorophylle und 4 Carotinoide nicht kovalent und fungiert in vivo als Lichtantenne des Photosystems II. Eine optimale Absorption von Licht ist auch bei Solarzellen entscheidend und es liegt nahe hier dasselbe Prinzip zu verwenden. Dafür bietet sich der Einsatz biologischer Komponenten wie des LHCII an. Dieser wurde evolutionär für eine effektive Absorption und Weiterleitung von Sonnenenergie optimiert. Zusätzlich lässt er sich in vitro in rekombinanter Form rekonstituieren. Für eine eventuelle Nutzung des LHCII in technologischen Anwendungen bedarf es der Interaktion mit anderen, vorzugsweise synthetischen Komponenten. Daher wurde die Bindung und der Energietransfer zwischen dem LHCII und organischen Fluoreszenzfarbstoffen sowie anorganischen „Quantum dots“ (QDs) untersucht. rnMit Donorfarbstoffen wurde die Grünlücke des LHCII funktionell geschlossen. Dafür wurden bis zu vier Fluoreszenzfarbstoffe kovalent an den LHCII gebunden. Diese Interaktion erfolgte sowohl mit Maleimiden an Cysteinen als auch mit N-Hydroxysuccinimidylestern an Lysinen. Die Assemblierung, Struktur und Funktion des Pigment-Protein-Komplexes wurde durch die Fluoreszenzfarbstoffe nicht gestört.rnAuf der Suche nach einem Farbstoff, der als Akzeptor die vom LHCII aufgenommene Energie übernimmt und durch Elektronenabgabe in elektrische Energie umwandelt, wurden drei Rylenfarbstoffe, ein Quaterrylen und zwei Terrylene, untersucht. Der LHCII konnte mit allen Farbstoffen erfolgreich markiert werden. Für die Nutzung der Hybridkomplexe ergaben sich allerdings Probleme. Das Quaterrylen beeinträchtigte aufgrund seiner Hydrophobizität die Rekonstitution des Proteins, während bei beiden Terrylenen der Energietransfer ineffizient war.rn Zusätzlich zu den Standard-Verknüpfungen zwischen Farbstoffen und Proteinen wurde in dieser Arbeit die „native chemische Ligation“ etabliert. Hierfür wurde eine LHCII-Mutante mit N-terminalem Cystein hergestellt, markiert und rekonstituiert. Messdaten an diesem Hybridkomplex ließen auf einen Energietransfer zwischen Farbstoff und Protein schließen. rnIn Hybridkomplexen sollen langfristig zur Ladungstrennung fähige Typ II-QDs Anwendung finden, wobei der LHCII als Lichtantenne dienen soll. Bis diese QDs verwendet werden können, wurden grundlegende Fragen der Interaktion beider Materialen an Typ I-QDs mit Energietransfer zum LHCII untersucht. Dabei zeigte sich, dass QDs in wässriger Lösung schnell aggregieren und entsprechende Kontrollen wichtig sind. Weiterführend konnte anhand der Trennung von ungebundenem und QD-gebundenem LHCII die Bindung von LHCII an QDs bestätigt werden. Dabei wurden Unterschiede in der Bindungseffizienz in Abhängigkeit der verwendeten LHCII und QDs festgestellt. Durch Herstellung von Fusionsproteinen aus LHCII und Affinitätspeptiden konnte die Bindung optimiert werden. Ein Energietransfer von QDs zu LHCII war nicht sicher nachzuweisen, da in den Hybridkomplexen zwar die QD- (Donor-) Fluoreszenz gelöscht, aber die LHCII- (Akzeptor-) Fluoreszenz nicht entsprechend stimuliert wurde.rnZusammenfassend wurden in dieser Arbeit einige Hybridkomplexe hergestellt, die in weiterführenden Ansätzen Verwendung finden können. Auf die hier gewonnenen Erkenntnisse über Interaktionen zwischen LHCII und synthetischen Materialien kann jetzt weiter aufgebaut werden.

Inhibierung des IL-17A vermittelten Blut-Hirnschrankenversagens in experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) und Mikrogliaaktivierung durch IL-17A

Experimentelle Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) ist das Tiermodell für Multiple Sklerose (MS). Es ist bekannt, dass das proinflammatorische Zytokin IL-17A eine wichtige Rolle in MS und EAE spielt. Dieses wird hauptsächlich von einer Subpopulation der T-Helferzellen (Th17 Zellen) exprimiert. Es war bekannt, dass diese am Zusammenbruch der Blut-Hirnschranke (BHS) beteiligt sind. Der Integritätsverlust der BHS ist ein wichtiger und früher Aspekt in der Pathogenese von EAE und MS. Daraufhin können Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS) eindringen. Spezifische T-Zellen greifen das Myelin an und führen so zu einer Entzündungsreaktion, Demyelinisierung und axonalem Schaden. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass durch Hemmung des kontraktilen endothelialen Apparates das BHS Versagen vermindert werden kann und es dadurch zu einem milderen Verlauf der EAE Pathogenese kommt. Wird der Inhibitor der Myosinleichtkettenkinase ML-7 C57/bl6 Mäusen, bei denen EAE induziert wurde, intraperitoneal verabreicht, kommt es zu einem geringeren Phosphorylierungsgrad der leichten Kette des Myosins in Endothelzellen und folglich zu einem verringerten Schrankenversagen. Außerdem konnte ich zeigen, dass weniger reaktive Sauerstoffspezies (ROS) gebildet werden. Folglich kommt es zu einer geringeren Infiltration von Immunzellen aus der Peripherie in das ZNS. Somit werden weniger Zytokine und auch Matrixmetalloproteinasen (MMP) ausgeschüttet, wodurch die Entzündungsreaktion weniger stark ausgeprägt ist. Außerdem werden weniger Mikrogliazellen aktiviert. Ich habe den Zusammenhang zwischen Mikrogliazellaktivierung und IL-17A näher untersucht. Dieses proinflammatorische Zytokin aktiviert Mikrogliazellen auch in vitro. Durch IL-17A Stimulation kommt es zur vermehrten ROS Bildung. Folglich kommt es zu einer vermehrten Proliferation und Migration, sowie einer erhöhten Zytokinproduktion. Außerdem konnte ich zeigen, dass der N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptor an der Mikrogliaaktivierung beteiligt ist. Abhängig von IL-17A Stimulation kommt es zu einem Kalziumeinstrom über den NMDA-Rezeptor. Werden Inhibitoren des NMDA-Rezeptors eingesetzt, können IL-17A vermittelte Proliferation, Migration, Zytokin-und ROS-Produktion verhindert werden. Der NMDA-Rezeptor ist sehr gut in Neuronen erforscht, wohingegen bisher sehr wenig über seine Funktion in Gliazellen bekannt war. In dieser Arbeit ist es mir gelungen einen Zusammenhang zwischen IL-17A vermittelter Mikrogliaaktivierung und Kalziumeinstrom über den NMDA-Rezeptor herzustellen.

Muster und Prozesse in einer Microcebus-Hybridzone in Südostmadagaskar

Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde in zwei Schwerpunktanalysen mit eine Teil- und Gesamtdatensatz die Untersuchung der Hybridisierung zwischen den beiden Microcebus-Arten M. murinus und M. griseorufus im Ökoton Südostmadagaskars umfangreich und vertieft untersucht. Für die genetischen Analysen wurden die maternal vererbte mitochondriale Hypervariable Region I (HVR 1) und neun nukleäre biparental vererbte Mikrosatellitenmarker eingesetzt. Als weiterer Datensatz wurden morphometrische Daten verwendet. Für die erste Schwerpunktanalyse wurde ein bereits vorhandener Teildatensatz (Hapke 2005 & Gligor 2006) mit Daten von insgesamt 162 Individuen aus neun Populationen der Dornbuschzone, der Übergangswaldzone und des Küstenwaldgebietes eingesetzt. In der zweiten Schwerpunktanalyse wurde eine umfangreiche Untersuchung der Microcebus griseoruus-M. murinus- Hybridzone vorgenommen. Für diese detaillierte Charakterisierung der Hybridzone wurde eine ausgedehnte und fein auflösende Probennahme in einem als Kernzone definierten Bereich, der die gesamte Übergangswaldzone und die dazu benachbarten Dornbuschgebiete umfasste, durchgeführt. Die morphometrischen und genetischen Daten der neu beprobten Individuen dieser Kernzone wurden mit den Daten des Teildatensatzes und weiteren Daten aus Küstenwaldpopulationen (Hapke 2005) zu einem Gesamtdatensatz zusammengefasst. Die Integration des Teildatensatzes in den Gesamtdatensatz erforderte umfassende und zeitintensive Labor- und Analysearbeiten, die im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführt wurden. Der Gesamtdatensatz umfasste insgesamt 569 Individuen der Gattung Microcebus aus 29 Untersuchungsstandorten. Die mit beiden Datensätzen durchgeführte Analyse morphometrischer Daten zeigte deutlich, dass die Mehrzahl der Individuen aus der Übergangswaldzone einen intermediären Morphotyp aufweist. Durch die mit den Daten des Teildatensatzes durchgeführten Bayes’schen Clusteranalysen und Assignment-Tests, das vornehmlich in den Populationen der Übergangszone beobachtete signifikante Kopplungsungleichgewicht und Heterozygotendefizit, die festgestellte Verteilung der mitochondrialen Haplotypen und das kontrastierende Muster zwischen nukleären Mikrosatellitengenotypen und mitochondrialen Haplotypen in den Übergangswaldpopulationen konnte erstmals das Vorkommen einer Hybridzone zwischen Microcebus-Arten wissenschaftlich fundiert festgestellt werden. Die Ergebnisse dieser Schwerpunktanalyse wurden in der Fachzeitschrift Molecular Ecology publiziert (Gligor et al. 2009). Die in der ersten Schwerpunktanalyse festgestellte Hybridzone konnte durch die zweite Schwerpunktanalyse mit den genetischen und morphometrischen Daten des Gesamtdatensatzes nicht nur bestätigt werden, sondern auch auf die gesamte Übergangswaldzone erweitert werden. Ferner wurden starke Hinweise auf eine Hybridisierung beider Microcebus-Arten an einigen Dornbuschstandorten der Kernzone gefunden. Durch die große Datenmenge des Gesamtdatensatzes, vor allem aus der Kernzone des Untersuchungsgebietes, war es möglich eine fundierte Charakterisierung der Microcebus griseoruus-M. murinus- Hybridzone durchzuführen. Die Übereinstimmung der Hybridzone mit dem beobachteten Vegetationsmosaik zusammen mit den Ergebnissen der PCA, der PCoA und der Bayes’schen Clusteranalyse sprechen für das Modell der „Mosaik Hybridzone“, während die Einzelbetrachtung der mosaikartig verteilten intermediären Übergangswälder eine hohe Abundanz der Hybride aufzeigte und somit eher das „Bounded Hybrid Superiority model“ unterstützt. Der gewählte geographische Beprobungsmaßstab könnte somit einen Einfluss auf die beobachtete Struktur einer Hybridzone haben. Eines der markantesten Muster in der Hybridzone ist das stark kontrastierende cyto-nukleäre Muster. Der seit ca. 3000 Jahren fortschreitende Klimawandel in Südmadagaskar und die damit verbundene Expansion des Verbreitungsgebietes der Art Microcebus griseorufus nach Osten, das in dieser Arbeit festgestellte „male-biased dispersal“ bei M. griseorufus und der Einfluss exogener Selektion sprechen stark für eine massive asymmetrische nukleäre Genintrogression von M. griseorufus-Allelen in M. murinus-Populationen, verbunden mit einer potentiellen Verdrängung der Art M. murinus aus der Übergangswaldzone. In den jeweiligen Kerngebieten Dornbusch und Küstenwald bleibt jedoch die Diskretheit beider Arten gewahrt.

Die Rolle des anti-apoptotischen Proteins Mcl-1 für die Leber und das hepatozelluläre Karzinom

Myeloid cell leukemia-1 (Mcl-1) ist ein anti-apoptotisches Mitglied der Bcl-2-Proteinfamilie. Als solches ist es in der Lage, die mitochondriale Aktivierung während der Apoptose zu hemmen. Dadurch schützt es Zellen bei zellulärem Stress (wie z.B. Differenzierung, Proliferation oder Virusinfektion) vor Apoptoseinduktion. Aufgrund dieser Eigenschaft ist es unabkömmlich während der Embryogenese und in verschiedenen hämatopoetischen Zellpopulationen. Des Weiteren ist Mcl-1 als Protoonkogen in verschiedenen humanen Tumorentitäten verstärkt exprimiert und kann so zu einer verminderten Apoptosesensitivität von Tumorzellen beitragen. Auch primäre humane Hepatozyten können nach Mcl-1-Induktion durch Wachstumsfaktorbehandlung gegenüber CD95-vermittelter Apoptose geschützt werden. Daher sollte untersucht werden, welche Bedeutung Mcl-1 im hepatozellulären Karzinom (HCC) und in der gesunden Leber einnimmt. Hierzu wurde zunächst humanes HCC-Gewebe hinsichtlich der Expression von Mcl-1 untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Mcl-1 sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene in HCC-Gewebe verstärkt exprimiert ist im Vergleich zu benachbartem Normalgewebe. Auch in verschiedenen HCC-Zelllinien konnte eine starke Mcl-1-Expression nachgewiesen werden. Diese war vor allem über den PI3K/Akt-Signalweg reguliert. Eine Hemmung dieses Signalwegs führte zu einer Reduktion der Mcl-1-Expression und so zu einer Sensitivierung der Zellen gegenüber verschiedenen Chemotherapeutika und zielgerichteten Therapien. Des Weiteren wurde die Mcl-1-Expression spezifisch durch RNA-Interferenz gehemmt. Auch hier konnte gezeigt werden, dass Zellen mit unterdrückter Mcl-1-Expression deutlich sensitiver gegenüber verschiedenen Apoptose-induzierenden Substanzen reagierten. Eine kombinierte Hemmung der Mcl-1-Expression und der PI3-Kinase führte schließlich zu einer nochmals verstärkten Sensitivierung. Im Gegensatz dazu führte eine Überexpression von Mcl-1 zu einer Hemmung der Apoptoseinduktion. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine Mauslinie etabliert, welche spezifisch in Hepatozyten kein Mcl-1 exprimiert, um so die Bedeutung von Mcl-1 für die Leber in vivo zu untersuchen. Es zeigte sich, dass Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäuse bereits im Alter von acht Wochen eine verminderte Lebergröße aufweisen. Dies wurde verursacht durch spontane Apoptoseinduktion in den Mcl-1 negativen Hepatozyten. Hierdurch kam es zu einer Leberschädigung, ersichtlich durch erhöhte Transaminasenwerte, erhöhte Caspase-3-Aktivierung, und Schädigung der Gewebsstruktur. Zudem war als kompensatorischer Effekt die Zellproliferation erhöht, ohne dass sich jedoch das Lebergewicht an das von Kontrolltieren anglich. Interessanterweise kam es in Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäusen als Folge der chronischen Leberschädigung zur Entwicklung einer Leberfibrose, ersichtlich durch eine verstärkte Collageneinlagerung. Weiterhin reagierten Mcl-1flox/flox-AlbCre-Mäuse wesentlich empfindlicher gegenüber Todesrezeptor-vermittelter Apoptose. Diese Daten zeigen zum einen, dass Mcl-1 zur Apoptoseresistenz von HCC-Zellen beitragen kann. Zielgerichtete Therapien, welche die Expression von Mcl-1 hemmen, könnten folglich für die Therapie des HCCs von Interesse sein. Des Weiteren konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Mcl-1 ein zentraler anti-apoptotischer Faktor für Hepatozyten in vivo ist.

Identifizierung und Überexpression immunregulatorischer Moleküle in dendritischen Zellen zur gezielten Modulation ihrer T-Zell-stimulierenden Eigenschaften

Die Modifizierung von dendritischen Zellen (DCs) in vitro erfolgt meist durch eine Behandlung mit Mediatoren, die den Aktivierungszustand sowie die T-Zell-polarisierenden DC-Eigenschaften verändern. In dieser Doktorarbeit sollten zunächst mediatorinduzierte tolerogene Schlüsselmoleküle identifiziert werden. Als Modell wurden murine Knochenmarkszellen unter DC-differenzierenden Bedingungen mit dem Glucocorticoid Dexamethason (DEX) behandelt. Die generierten DEX-APCs (antigenpräsentierende Zellen) zeigten einen protolerogenen, weitgehend maturierungsresistenten Phänotyp und eine gesteigerte Expression toleranzassoziierter Moleküle. DEX-APCs induzierten in vitro aus CD25+ depletierten allogenen T-Zellen de novo CD4+ und CD8+ regulatorische T-Zellen (Tregs). Basierend auf diesen Ergebnissen und Literaturstudien wurden protolerogene Moleküle für eine Überexpression in DCs selektiert. Da DCs non-viral kaum transfizierbar sind, wurde die lentivirale Transduktion von DCs optimiert, wodurch Effizienzen bis zu 95% erreicht werden konnten. Der mit der Transduktion assoziierte physikalische Stress resultierte in einer partiellen DC-Aktivierung. Trotzdessen zeigten DCs, die die Zytokine IL-10 oder IL-21 überexprimierten, einen protolerogenen Phänotyp und induzierten in vitro Tregs. Beide DC-Populationen reduzierten im therapeutischen Ansatz im murinen Krankheitsmodell der Kontaktallergie haptenspezifisch die Ohrschwellungsreaktion. Auch DCs, die andere Zytokine, intrazelluläre Proteine oder Oberflächenrezeptoren mit protolerogenen Eigenschaften überexprimierten, wiesen eine jeweils spezifische Genexpressionssignatur auf. Diese DC-Populationen waren zumeist durch eine verminderte allogene T-Zell-Aktivierungskapazität gekennzeichnet und veränderten die Th1-/Th2-Zytokinmuster in kokultivierten T-Zellen.

Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-Out

Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-OutrnrnBei Dmxl1 handelt es sich um ein neuartiges Gen aus Mus musculus. Das ebenfalls in der vorliegenden Arbeit bioinformatisch untersuchte Gen DMXL1 ist das zu Dmxl1 homologe Gen des Menschen. Beide Gene bestehen aus 43 Exons, das murine Dmxl1 codiert für eine mRNA von 10992 bp bzw. 12210 bp, das humane DMXL1 kodiert für eine cDNA von 11082 bp, der offene Leserahmen umfasst bei der Maus 9042 bp. In der Maus konnte ein mögliches alternatives Polyadenylierungssignal identifiziert werden. Zwischen beiden Spezies sind die Exonpositionen und ihre Längen hoch konserviert. Dmxl1 liegt auf dem Crick-Strang von Chromosom 18 Bande C, der translatierte Bereich erstreckt sich auf genomischer Ebene über 129558 bp und die Orientierung verläuft in Richtung Centromer. Dmxl1 und DMXL1 gehören damit zu den größten bekannten Genen in Maus und Mensch. Bei beiden Spezies liegen die DmX-Homologen genomisch innerhalb eines Bereichs der Isochoren-Klasse L1 in einer Gen-armen Region. Die Anzahl der repetitiven Elemente innerhalb der Genregion von Dmxl1 liegt 6% unter dem erwarteten Wert eines L1 Isochors, die Anzahl beim Menschen liegt 4% über dem erwarteten Wert. Um die mögliche Promotorstruktur von Dmxl1 darzustellen, wurden umfangreiche in silico-Analysen der Region um den putativen Transkriptionsstart vorgenommen. Mit Hilfe der gewonnenen Daten konnte ein Transkriptionstartpunkt identifiziert werden. Zudem wurde eine Promotorstruktur erarbeitet, bei der angenommen werden kann, dass sie eine gute Näherung an die tatsächlich vorhandenen Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren darstellt. Die mit bioinformatischen Werkzeugen erzeugte virtuelle Promotor- und Enhancerstruktur zeigt das Potenzial, Dmxl1 basal und ubiquitär zu exprimieren. Gleichzeitig zeigen diese Daten, dass Dmxl1 vermutlich in einigen Geweben der Keimbahn, im Fettgewebe, dem blutbildenen System und während der Embryogenese hochkomplex reguliert werden kann. Eine regulierte Expression zur Steuerung des Energiestoffwechsels ist ebenfalls wahrscheinlich. Diese Ergebnisse passen sehr gut zu den experimentell ermittelten Daten und den beobachteten Phänotypen Dmxl1-chimärer Mäuse.rnDie abgeleitete Aminosäuresequenz umfasst in der Maus 3013 AS, im Menschen 3027 AS, der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigt eine Identität von 89,3 % und eine Similarität von 94,7 % zwischen beiden Spezies. Im Dmxl1/DMXL1-Protein von Maus und Mensch konnten mindestens 24 und maximal 36 WD-Wiederholungseinheiten identifiziert werden, zudem wurden eine Reihe weiterer konservierter Proteinmotive gefunden. Die in silico-Strukturanalysen beider abgeleiteter Aminosäuresequenzen lässt vermuten, dass sich C- und N-terminal WD-Propellerstrukturen befinden. In dieser Arbeit gelang eine C-terminale Rekonstruktion einer 10-blättrigen Propellerstruktur, denkbar ist jedoch auch eine Struktur mit mindestens drei WD-Propellern, wenn eine prädominante Struktur mit Propellern aus jeweils sieben Propellerblättern angenommen wird.rnDas primäre Ziel dieser Arbeit, die Etablierung einer stabilen Mauslinie mit diruptiertem Dmxl1-Gen konnte aufgrund einer beobachteten Haploinsuffizienz nicht erreicht werden. Trotz zahlreicher Transformationen von Maus-Stammzelllinien konnte letztlich nur eine stabil transformierte Linie mit einem Dmxl1-Null-Allel identifiziert werden, was auch zu den theoretischen Daten und den angenommenen Aufgaben von Dmxl1 als komplex und diffizil reguliertes Multifunktions-Protein passt. Aus der transformierten Mauszelllinie konnten chimäre Mäuse entwickelt werden, die in Abhängigkeit von dem Ausmaß des Chimärismus phänotypisch massive Schädigungen aufwiesen. Neben einer Teilsterilität wurden massive Fettleibigkeit und ein ausgeprägter Hypogonadismus beobachtet. Keines der Tiere war in der Lage das Dmxl1-Null-Allel zu transduzieren. Die Tiere waren nur sehr eingeschränkt fertil, die wenigen Nachkommen entsprachen genotypisch und phänotypisch ausschließlich den verwendeten Blastocysten.rn

Untersuchungen zur Expression und Lokalisation der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Ngb) und Cytoglobin (Cygb) in Säugern

Die vorliegende Dissertation beinhaltet Untersuchungen zur Expression und Funktion der respiratorischen Proteine Neuroglobin (Nbg) und Cytoglobin (Cygb) in Vertebraten. rnrnUm die Expression der Globine während der Entwicklung des Säugerhirns zu untersuchen, wurden die Hirne von Maus-Embryonen ab dem Fötalstadium MF10 bis zum Tag eins nach der Geburt (T1) mit Adulttieren verglichen. Quantifiziert wurde sowohl die mRNA- als auch die Protein-Expression. Beide Globine zeigten im Verlauf der Entwicklung einen stetigen Anstieg der mRNA-Expression, wobei Ngb zu Beginn in zehnfach höherer Konzentration vorlag und im zeitlichen Verlauf einen 130-fachen Anstieg zeigte. Cygb zeigte lediglich einen 16-fachen Anstieg bis zum Adultstadium. Auf Proteinebene konnte die Expressionszunahme beider Globine im Laufe der Entwicklung bestätigt werden. Weder in den hypoxieresistenten Frühembryonalstadien noch während der mit Sauerstoff-Stress verbundenen Geburt zeigte sich ein Expressionsmaximum. Dies spricht gegen eine Globin-Funktion in der Oxidanz-Abwehr. Eher ist zumindest Ngb mit der Reifung der Neurone und dem damit einhergehenden, gesteigerten oxidativen Stoffwechsel assoziiert.rnrnDes Weiteren sollte die zelluläre und intrazelluläre Lokalisation beider Globine anhand einer primären Zellkultur aus dem Hippocampus pränataler Ratten und in immortalen Zelllinien untersucht werden. Neuroglobin wurde dabei nur in Neuronen, nicht jedoch in Gliazellen nachgewiesen. Das Färbemuster war in allen Ngb-exprimierenden Zellen zytoplasmatisch. Cytoglobin wurde in der Primärkultur in den Neuronen jedoch ebenso in den mit anti-GFAP markierten Gliazellen beobachtet. In beiden Zellpopulationen war auch der Kern durch das CyGB-Antiserum markiert. rnEine genauere Untersuchung der intrazellulären Lokalisation sollte durch die Transfektion von Globin-pEGFP-Fusionsproteinen erfolgen. Nach Transfektion der Fusionskonstrukte wurde die GFP-Färbung bei beiden Globinen sowohl im Zytoplasma als auch im Kern beobachtet. Eine rein nukleäre Lokalisation, die insbesondere für Cygb von anderen Autoren postuliert wurde, konnte somit ausgeschlossen werden. rnrnIn primären Zellkulturen aus Cerebellum und Kortex, die mit Hilfe von Paraquat oxidativem Stress ausgesetzt wurden, wurde der Verlauf der Globin-mRNA-Expression mit dem unregulierten 18s rRNA-Referenzgen und mit den Antioxidanz-Enzymen Cu-Zn-SOD und Gpx verglichen. Neuroglobin zeigte einen Expressionsverlauf ähnlich dem der beiden Antioxidanz-Enzyme, jedoch liegt seine mRNA im Hirngewebe in hundertfach niedrigerer Menge als Cu-Zn-SOD und Gpx vor. Cytoglobin zeigte keine Veränderung der Expression. Eine Funktion der Globine im Sinne einer ROS-Abwehr kann aus den Befunden nicht abgeleitet werden. rnrnUntersuchungen von Tumor und Normalgewebe mittels eines cDNA-Cancer-Arrays zeigten, dass NGB in Tumoren verschiedenen Ursprungs nicht exprimiert wird, CyGB dagegen keine Änderung seiner Expression in Tumor versus Normalgewebe erfährt. Eine Induktion der beiden Globine z.B. durch Hypoxie in soliden Tumoren kann daher ausgeschlossen werden.rn

Analyse immunologischer und proteomischer Aspekte im Rahmen der Glaukompathogenese

Das Glaukom stellt eine heterogene Gruppe von okularen Erkrankungen dar, deren Pathogenese sich durch einen langsamen, progradienten Untergang von retinalen Ganglienzellen und ihren Axonen auszeichnet. rnIn den letzten Jahren wurde im Kontext der Glaukompathogenese verstärkt die Beteiligung autoreaktiver Antikörper diskutiert. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit bestand in dem Vergleich solcher Autoantikörper-Reaktionen in den Serum- und Kammerwasserproben einzelner Glaukompatienten. Hierdurch sollte geklärt werden, inwieweit die Immunreaktivitäten dieser beiden Körperflüssigkeiten miteinander übereinstimmen und ob sich Hinweise auf eine lokale Antikörperproduktion im immunprivilegierten Auge finden lassen. Mittels eines etablierten Protein-Microarray-Verfahrens wurden die Immunreaktionen gegen 40 verschiedene Antigene, wie z.B. Hitzeschock-Proteine oder neuronale Strukturproteine, untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die detektierten Autoantikörper-Reaktionen gegen mehr als 80% der untersuchten Antigene in beiden Körperflüssigkeiten miteinander übereinstimmen. Verdeutlicht wird hierdurch, dass die Antikörper-basierenden immunologischen Vorgänge im Auge bzw. Kammerwasser, trotz dessen Abschottung vom Blutkreislauf durch die Blut-Retina-Schranke, denen des Serums stark ähneln. Nur vereinzelt lassen sich Hinweise auf eine lokale Antikörperproduktion im Auge finden, wodurch die Bedeutung der detektierten Serumantikörper-Reaktionen für die Glaukomerkrankung belegt wird. rnEin weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Detektion möglicher veränderter Proteinexpressionen in den Retinae und Serumproben von Glaukompatienten, die potentiell zu den neurodegenerativen Prozessen der Glaukompathogenese beitragen. Um die Analyse spezifischer Proteinexpressionen zu ermöglichen, wurde das Verfahren des Antikörper-Microarrays etabliert und auf die Fragestellung angewendet. Untersucht wurden hierbei vor allem die Abundanzen von Komplementproteinen, Zytokinen und Hitzeschock-Proteinen, aber auch die von verschiedenen neuronalen Strukturproteinen. Als Probenmaterial dienten Serum- und Retinaproben von Glaukompatienten, die vergleichend denen von gesunden Probanden gegenübergestellt wurden. Die Analyse erbrachte die Erkenntnis, dass neben der verstärkten Expression von Komplementproteinen in der Retina (z.B. C3, C6) auch im Serum der Glaukompatienten eine erhöhte Konzentration dieser Proteine vorliegt, die im Rahmen der Glaukomerkrankung möglicherweise ebenfalls eine Rolle spielen. Ähnliches konnte für verschiedene Zytokine, wie z.B. TNF-α, IFN-γ oder IL1-β beobachtet werden, die in den untersuchten Retinae von Glaukomprobanden, teilweise auch in den Serumproben der Patienten, in verstärktem Maße detektiert werden konnten. Die erhöhte Produktion von Zytokinen in der Retina ist wahrscheinlich auf die Aktivierung von Gliazellen zurückzuführen, ein Ereignis für das in dieser Arbeit zahlreiche Hinweise gefunden werden konnten. Die Gliaaktivierung wird vermutlich durch apoptotische Prozesse in der Retina ausgelöst, eventuell aber auch durch eine erfolgte Komplementaktivierung. Darüber hinaus konnten mittels eines massenspektrometrischen Verfahrens weitere Expressionsunterschiede verschiedener retinaler Proteine bei Glaukompatienten festgestellt werden. Diese Veränderungen, wie z.B. geminderte Mengen von ROS-eliminierenden Proteinen, wie der Superoxid Dismutase und Peroxiredoxin-2, begünstigen bzw. verstärken sehr wahrscheinlich die neurodegenerativen Prozesse in der Retina von GlaukompatientenrnInwieweit die untersuchten Faktoren kausativ an den neurodegenerativen Prozessen beteiligt sind, bleibt ungeklärt, jedoch untermauert deren Vielzahl die Notwendigkeit, die Ursache der Glaukomerkrankung als komplexe Interaktion und Wechselwirkung verschiedener Komponenten zu betrachten und nicht als einen einzelnen fehlgesteuerten Mechanismus.rn

Einzelmolekül-Untersuchungen zu Faltung und Zusammenbau des Lichtsammelkomplexes LHCII

Zusammenfassungrn Der Faltungsprozess des Hauptlichtsammelkomplexes des Photosystems II aus höheren Pflanzen (light harvesting complex II, LHCII) wurde bereits mehrfach untersucht, die Experimente hierzu fanden stets im Ensemble statt. Anhand der bislang veröffentlichten Faltungskinetiken des LHCII aus höheren Pflanzen lassen sich aber keine eindeutigen Aussagen bezüglich der Diversität der Faltungswege treffen. Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit Faltungskinetiken einzelner LHCII-Moleküle während der Komplexbildung aufgenommen werden, um weitergehende Informationen zum Faltungsmechanismus zu erhalten und zur Frage, ob hier mehrere unterschiedliche Wege eingeschlagen werden.rnHierfür war zunächst die Etablierung einer Oberflächenimmobilisierung mit Glas als Trägermaterial notwendig. Nachdem Versuche, diese Immobilisierung über einen His6-tag oder über einen heterobifunktionellen Linker zu bewerkstelligen, nicht zum Erfolg geführt haben, konnte eine Immobilisierung des Biotin-markierten Proteins an Oberflächen-gebundenes Avidin erreicht werden. Die Qualität dieser Immobilisierung wurde hierbei sowohl über Bindungsversuche mit fluoreszenzfarbstoffmarkiertem Protein als auch über eine direkte Kontrolle der Oberflächenbeschaffenheit mittels Rasterkraftmikroskopie überprüft. Die für die folgenden Versuche optimale Belegungsdichte wurde im konfokalen Fluoreszenzmikroskop ermittelt. Zudem wurde sichergestellt, dass die Proteine vereinzelt auf der Oberfläche immobilisiert vorliegen.rnAuf dieser Basis wurden LHCII-Komplexe, die zuvor in vitro rekonstituiert wurden, immobilisiert und Versuche zur kontrollierten Denaturierung unternommen, um Zerfalls-kinetiken im Verfahren der internen Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (total internal reflection fluorescence, TIRF) aufnehmen zu können. Hierbei traten Schwierigkeiten bezüglich der Lebensdauer der Komplexe unter Laser-Belichtung auf, da sich die Löschung der Fluoreszenz durch Zerstrahlung der Pigmente einerseits oder Dissoziation der LHCII andererseits nicht unterscheiden ließen. Auch durch verschiedene Maßnahmen zur Erhöhung der Lebensdauer konnte diese nicht in dem Maße gesteigert werden, wie es experimentell notwendig gewesen wäre.rnFür das eigentliche Hauptziel dieser Arbeit – die Aufzeichnung von Einzelmolekül-Faltungskinetiken – war die Entwicklung einer Methode zur Rekonstitution oberflächen-immobilisierter LHCII-Apoproteine notwendig. Dieses Ziel wurde mithilfe einer Detergenzmisch-Rekonstitution erreicht. Der Erfolg der Rekonstitution konnte experimentell sowohl im Fluorimeter anhand des komplexinternen Energietransfers auf einen kovalent an das Protein gebundenen Infrarot-Fluorophor als auch im TIRF-Verfahren direkt beobachtet werden. Auch hier konnte nach ca. 80 Sekunden ein Ausbleichen der Komplexe während der Belichtung durch den Anregungs-Laser beobachtet werden.rnIn Versuchen zur Beobachtung des Komplexbildungsvorganges zeigte sich, dass die Rekonstitution offenbar durch die Belichtung massiv gestört wird. Ein weiteres Problem war eine sehr starke Hintergrundfluoreszenz, ausgelöst durch die zur Rekonstitution notwendige Pigmentlösung, die trotz der TIRF-Anregung von ausschließlich oberflächengebundenem Material die Fluoreszenz der Komplexe überlagerte. Somit konnte die Rekonstitution oberflächenimmobilisierter LHCII-Proteine zwar in Vorher-Nachher-Aufnahmen gezeigt werden, der Faltungsprozess an sich konnte dagegen im Rahmen dieser Arbeit nicht aufgezeichnet werden.