Control of hair follicle cell fate by underlying mesenchyme through a CSL-Wnt5a-FoxN1 regulatory axis.

Epithelial-mesenchymal interactions are key to skin morphogenesis and homeostasis. We report that maintenance of the hair follicle keratinocyte cell fate is defective in mice with mesenchymal deletion of the CSL/RBP-Jkappa gene, the effector of "canonical" Notch signaling. Hair follicle reconstitution assays demonstrate that this can be attributed to an intrinsic defect of dermal papilla cells. Similar consequences on hair follicle differentiation result from deletion of Wnt5a, a specific dermal papilla signature gene that we found to be under direct Notch/CSL control in these cells. Functional rescue experiments establish Wnt5a as an essential downstream mediator of Notch-CSL signaling, impinging on expression in the keratinocyte compartment of FoxN1, a gene with a key hair follicle regulatory function. Thus, Notch/CSL signaling plays a unique function in control of hair follicle differentiation by the underlying mesenchyme, with Wnt5a signaling and FoxN1 as mediators.

Controlling cytokinesis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe : the role of dma1; and ubc8

ABSTRACT The fission yeast Schizosaccharomyces pombe is a single celled eukaryote that has proved to be an excellent model system for the study of cell cycle control. S. pombe cells are rod shaped and grow mainly by elongation at their tips. They divide by formation of medially-placed cell wall, or septum, which cleaves the cell in two. Once the cell commits itself to mitosis the site of division is determined by formation of an acto-myosin based contractile ring at the cell cortex. The ring is assembled in stages throughout mitosis and contracts at the end of anaphase, coincident with spindle disassembly. The contraction, but not the assembly, of the ring requires the signal transduction network called the septation initiation network or SIN. The core components of the SIN are three protein kinases (cdc7p, sidl p and sid2p) and their regulatory subunits (spg1 p, cdcl4p and moblp, respectively). Signalling is dependent upon the nucleotide status of the GTPase spgl p, which is regulated by a two-component GAP protein, cdc16p-byr4p. Signalling is thought to emanate from the spindle pole body, where core SIN components are anchored to a scaffold comprised of sid4p and cdc11p. Activation of the SIN requires the protein kinase plolp, which also has additional roles in mitosis. SIN signalling is tightly regulated to assure the proper co-ordination of mitosis and cytokinesis. Ectopic activation of the SIN in interphase can uncouple septum formation from mitosis, while deregulated SIN signalling leads to formation of cells with multiple septa that do not cleave. Regulators of SIN activity are therefore of considerable interest. This study has concentrated upon two of these, dma1 and ubc8. I have demonstrated that dmal becomes essential when SIN signalling is activated. This leads me to propose a tripartite model for regulation of the SIN during the mitotic cell cycle. Increased expression of dma1 inhibits SIN signalling and prevents cell division. To identify potential targets and mediators of this, multicopy suppressors of dma1 toxicity were identified. One of these, ubc8, is the subject of this thesis. Genetic and molecular analyses are consistent with the view that ubc8p acts as an inhibitor of the SIN Localisation of ubc8p indicates that it is a nuclear protein. The ubc8 gene is not essential, but in its absence cells are unable to prevent septum formation if progression through mitosis is impaired. These data suggest that it may be an effector of the spindle assembly checkpoint. Together, these data shed new light upon the mechanisms by which cytokinesis is regulated in S. pombe. RESUME La levure Schizosaccharomyces pombe est un eucaryote unicellulaire qui est un bon système d'étude du cycle cellulaire. Les cellules de S. pombe sont en forme de bâtonnets et poussent par allongement aux deux bouts. Elles se divisent en formant une paroi au milieu de la cellule, qui s'appelle un septum et qui sépare la cellule en deux. Une fois que la cellule est engagée dans la mitose, le site de clivage est déterminé par la formation d'un anneau contractile d'acto-myosine au niveau du cortex cellulaire. Cet anneau est séquentiellement assemblé au cours de la mitose et se contacte à la fin de l'anaphase, au moment où le fuseau mitotique et désassemblé. La contraction, mais non pas l'assemblage, de l'anneau dépend d'un réseau de signalisation appelé septation initiation netvvork' ou SIN. Les composants centraux du SIN sont trois kinases (cdc7, sidi et sid2) ainsi que leurs sous-unités régulatrices (spgl, cdc14 et mob1, respectivement). La signalisation dépend du nucléotide rattaché à la GTPase spgl qui est régulée par une GAP comprenant deux sous-unités cdc16 et byr4. La signalisation est présumée provenir du pôle du fuseau où les composants centraux du SIN sont ancrés grâce à un échafaudage comprenant sid4 et cdcl 1. La signalisation est étroitement régulée pour assurer une bonne coordination entre mitose et cytokinèse. Une activation ectopique du SIN en interphase peut découpler la formation du septum de la mitose, engendrant des cellules à multiples septa qui ne sont pas clivés. C'est pourquoi les régulateurs du SIN sont d'un intérêt considérable. Cette étude se concentre autour de deux ces régulateurs, dma1 et ubc8. J'ai montré que dma1 devient essentiel quand la signalisation du SIN est activée. Ceci m'amène à proposer un modèle en trois parties pour la régulation du SIN durant la mitose. Une expression élevée de dma1 inhibe la signalisation du SIN et empêche la division cellulaire. Afin d'identifier des substrats ou médiateurs potentiels de la toxicité de dma1, des supresseurs en copies multiples ont été identifiés. Un de ces supresseurs, ubc8, constitue le deuxième sujet de cette thèse. Les études génétiques et moléculaires suggèrent un rôle inhibiteur du SIN par ubc8. Ubc8p est une protéine nucléaire, non essentielle, mais en son absence les cellules ne peuvent pas restreindre la fomation du septum, lorsque la progression de la mitose est perturbée. Les données suggèrent que ubc8 pourrait être un effecteur de point de contrôle de l'assemblage du fuseau mitotique. Prises dans leur ensemble, ces données apportent un nouvel éclairage sur les mécanismes de régulation de la cytokinèse dans S. pombe.

Role of c-Myc in homeostasis of memory CD8 T cells

RESUME La mémoire immunologique est essentielle durant la vie et permet aux lymphocytes de répondre plus rapidement et efficacement lors d'une deuxième rencontre avec un antigène connu. Les facteurs contrôlant l'homéostasie des cellules T CD8 mémoires in vivo ne sont pas encore bien définis. Cependant, la prolifération homéostatique de ces cellules dans un hôte déplété en cellules hématopoietiques nécessite l'intéraction du TCR avec les molecules du MHC de class I du soi. De plus, le rôle de cytokines, telles que 1'IL-15 et l'IL-7, est essentiel dans ce mécanisme, aussi bien que dans la maintenance des cellules T CD8 mémoires. Puisque la protéine c-Myc - impliquée dans des mécanismes tells que la division, la prolifération, l'apoptose et la differentiation - a été définie comme étant impliquée dans la réponse à différentes cytokines, nous nous sommes intéressés à l'analyse de l'homéostasie des lymphocytes T CD8 mémoires dans des souris déficientes en c-Myc (c_rnycΔORF/+), qui expriment un niveau réduit de cette protéine. Bien que le développement des cellules T dans le thymus soit normal dans les souris c_rnycΔORF/+, nous avons observé une réduction de 2 à 3 fois dans la population des cellules T CD8 de phenotype mémoire (CD44+) dans les organes lymphoïdes de la périphérie de ces souris. Cette différence ne correspond pas à une réduction de prolifération ou d'expression de protéines de survie telles que Bel-2. Cependant, la prolifération homéostatique de cellules T CD8 c_rnycΔORF/+, mais pas T CD4 c_rnycΔORF/+, est reduite de manière dramatique lorsqu'elles sont transférées dans un hôte irradié. De plus, le transfert adoptif de lymphocytes T dans des souris irradiées déficientes en l'IL-15 nous a permis de montrer que la prolifération homéostatique dépendante de l'IL-15 des cellules T CD8 nécessite l'expression de c-Myc. De plus, contrairement aux cellules T CD8 CD44+ de type sauvage, nous avons observé que l'expansion induite par l'IL-15 des cellules T CD8 CD44+ c_rnycΔORF/+ est altérée aussi bien in vivo (en réponse à une injection de polyI:C) et in vitro. Par conséquent, nos résultats identifient c-Myc comme une nouvelle protéine régulatrice de la signalisation par l'IL-15 impliquée dans l'homéostasie des cellules T CD8 CD44+. SUMMARY Immunological memory is essential throughout life and allows memory lymphocytes to respond faster and more efficiently upon re-encounter of a known antigen. Factors controlling homeostasis of memory CD8 T cells under steady-state conditions in vivo are currently not well defined. However, the homeostatic proliferation of memory CD8 T cells in lymphopenic hosts requires the interaction of the TCR with self MHC class I molecules. In addition, cytokines, such as IL-15 and to a lesser extent IL-7, are essential for both homeostatic proliferation and maintenance of memory CD8 T cells. Since c-Myc, a proto-oncogene involved in cell division, proliferation, apoptosis and differentiation, has been widely implicated in responsiveness to cytokines, we were interested in analyzing homeostasis of memory CD8 T cells in c-myc hypomorph (c_rnycΔORF/+) mice, which express reduced levels of c-Myc. Although T cell development in the thymus was normal in c_rnycΔORF/+ mice, we found a selective 2- to 3-fold reduction in the memory-phenotype CD44high CD8 T cell population in the periphery. Reduced numbers of CD44high CD8 T cells did not correlate with decreased steady-state turnover rate or low expression of survival factors such as Bcl- 2. However, homeostatic proliferation of c_rnycΔORF/+ CD8 T cells, but not c_rnycΔORF/+ CD4 T cells, was dramatically reduced upon transfer into sublethally irradiated wild-type recipients. In addition, upon transfer of c_rnycΔORF/+ and c-myc WT cells into IL-15-/- mice, we observed that IL-15-induced homeostatic proliferation of CD8 T cells requires c-Myc. Moreover, in contrast to c-myc WT CD44high CD8 T cells, IL-15-induced expansion of c_rnycΔORF/+ CD44high CD8 T cells was strongly impaired both in vivo (in response to polyI:C injection) and in vitro. Collectively, our data identify c-Myc as a novel downstream regulator of IL-15 signaling involved in homeostasis of memory CD8 T cells.

Study of drug tolerance mechanisms and of the calcineurin pathway in the opportunistic pathogen "Candida albicans"

ABSTRACT :Azole antifungal drugs possess fungistatic activity in Candida albicans making this human pathogen tolerant to these agents. The conversion of azoles into fungicidal agents is of interest since their fungistatic properties increase the ability of C. albicans to develop drug resistance. In C. albicans, the phosphatase calcineurin (calcineurin) is essential for antifungal drug tolerance. Up to now, the only known target of calcineurin is Crzl, which is a transcription factor (TF) involved in responses to ionic stress. Thus, most of the components of the calcineurin signaling remain to be identified in C. albicans.In this work, the calcineurin pathway was investigated in order to i) characterize the role of calcineurin in the biology of C. albicans, ii) identify putative targets of calcineurin and iii) characterize the phenomenon of tolerance to antifungal drugs. Towards these aims, four different approaches were used.First, using C. albicans microarrays, an attempt was made to identify a set of calcineurindependent genes (CDGs). Since CDGs were highly dependent upon the external stimulus used to activate calcineurin (Ca2+ or terbinafine), this stimulus bias was bypassed by the construction of strains expressing a truncated autoactive form of calcineurin (Cmp1tr) in a doxycyclinedependent manner. The characterization of Cmpltr was undertaken and results showed that it mimicked awild-type activated calcineurin for all tested phenotypes (i.e. Cnbl-dependence, inhibition by FK506, phosphatase 2B activity, ability to dephosphorylate Crzl and to regulate Crz1-and calcineurin-dependent genes, role in antifungal drug tolerance and susceptibility, role in colony formation on Spider agar). Cmp1tr was therefore considered as a valid tool to study the calcineurin signaling pathway. In silico analysis of CDGs allowed the identification of i) a significant overlap between CDGs and genes regulated by the Cyrl signalíng pathway, ii) putative interactions between calcineurin activation and cell wall reorganization and phospholipid transport, iii) a putative interactión between calcineurin and the regulation of translation and iv) a putative relation between calcineurin and proteasome regulation. Further in silico analyses of the promoters of Crz1-independent CDGs were performed to identify TFs (other than Crz1) that were likely to regulate CDGs and therefore to be a direct target of calcineurin. The analyses revealed that Rpn4 and Mnl1 were TFs likely to be regulated by calcineurin.Second, in order to better characterize azole tolerance, an attempt was made to i) confirm the role of Hsp90 in fluconazole tolerance with a doxycycline-dependent Hsp90 expression system and ii) assess its calcineurin-dependence. Hsp90 was found to be significantly involved in fluconazole tolerance. However, results were not in agreement with the hypothesis that Hsp90 mediates fluconazole tolerance by the only downstream effector calcineurin. Rather Hsp90 is interacting with numerous components for fluconazole tolerance.Third, a collection of C. albicans TFs mutants were screened for loss of tolerance to terbinafine and fluconazole in order to identify TFs involved in antifungal drug tolerance. Out of the 265 TFs mutants screened, only the upc2Δ/Δ mutant showed a loss of fluconazole and terbinafine tolerance. Interestingly, no relation between Upc2 and calcineurin activity was found. These results suggested that the tolerance to antifungal drugs must not be only considered as a calcineurin-dependent phenomenon in C. albicans.Fourth, using FRCS analyses, an attempt was made to identify putative signs of programmed cell death (PCD) in calcineurin mutant cells upon loss of tolerance to terbinafine. A high proportion of cells died from both RO5-dependent (which is a sign of PCD) and ROS-independent (which is a sign of loss of homeostasis) processes in the calcineurin mutant. While these results suggest that calcineurin represses both loss of homeostasis and PCD, the role of calcineurin in PCD is still an open question.In conclusion, this work allowed i) the identification of several putative calcineurin targets, ii) the discovery of several links between calcineurin and signaling pathways and important biological processes and iii) the identification of novel components of calcineurin-independent mechanisms that participate in tolerance to antifungal drugs in C. albicans.RÉSUME :Les azoles sont des antifongiques qui présentent une activité fongistatique contre Candida albicans et rendent cette levure tolérante à ces agents. La conversion des azoles en agents fongicides est d'intérêts car leurs propriétés fongistatiques favorisent le développement de résistance aux drogues chez C. albicans. La calcineurine (calcineurin) est une phosphatase essentielle pour la tolérance aux antifongiques chez C. albicans. La seule cible connue de la calcineurin est Crz1, un facteur de transcription (FT) impliqué dans la réponse aux stress ionique. Ainsi, la plupart des constituants de la voie de signalisation de la calcineurin restent encore à être identifiés chez C. albicans.Dans ce travail de thèse, la voie de signalisation de la calcineurin a été étudiée de sorte à i) caractériser le rôle de la calcineurin dans la biologie de C. albicans, ii) identifier de nouvelles cibles de la calcineurin et iii) caractériser le phénomène de tolérance aux antifongiques. A ce propos, quatre approches ont été entreprises.Premièrement, des puces à ADN de C. albicans ont été utilisées afin d'identifier les gènes dépendants de la calcineurin (GDCs). Les GDCs étant étroitement dépendants du stimulus utilisé pour activer la calcineurin, le biais «stimulus» a été évité via la construction d'une souche exprimant une forme tronquée et autoactive de la calcineurin (Cmp1tr), en présence de doxycycline. La caractérisation de Cmp1tr a été entreprise et les résultats ont montré qu'elle mimait une calcineurin sauvage et activée pour la plupart des phénotypes testés (i.e. dépendance à Cnb1, inhibition par le FK506, activité phosphatase 2B, déphosphorylation de Crz1 et régulation de gènes dépendant de la calcineurin, rôle dans la tolérance et la susceptibilité aux antifongiques, rôle dans la formation des colonies sur milieu Spider). Cmp1tr a donc été considéré comme un outil pertinent pour l'étude de la voie de signalisation de la calcineurin. Les analyses in silico des GDCs ont permis l'identification i) d'un chevauchement entre les GDCs èt les gènes régulés par la voie de signalisation de Cyrl, ii) d'une interaction entre la calcineurin et la réorganisation de la paroi cellulaire ainsi que le transport des phospholipides, iii) d'une interaction entre calcineurin et la régulation de la traduction et iv) une relation entre la calcineurin et la régulation du protéasome. De plus, une analyse in silico des promoteurs des GDCs avec une régulation indépendante de Crz1 a permis d'identifier deux FTs qui pourraient être des cibles directes de la calcineurin, Rpn4 et Mnll.Deuxièmement, afin de caractériser la tolérance aux azoles, il a été entrepris i) de confirmer le rôle de Hsp90 dans la tolérance au fluconazole en utilisant un système d'expression dépendant de la doxycycline et ii) de caractériser sa dépendance à la calcineurin. Hsp90 a été montré impliqué dans la tolérance aux azoles. Cependant, les résultats n'ont pas corroboré une hypothèse expliquant le rôle d'Hsp90 dans la tolérance aux antifongiques par son unique. interaction avec la calcineurin. Il a été proposé que le rôle d'Hsp90 dans la tolérance aux antifongiques soit dû à ces multiples interactions avec le protéome de C. albicans plutôt que par son interaction avec un partenaire unique.Troisièmement, une collection de mutant pour des FTs de C. albicans a été criblée pour une perte de tolérance au fluconazole ou à la terbinafine, de sorte à identifier les FTs impliqués dans la tolérance aux antifongiques. Sur les 265 FTs passés au crible, seul le mutant upc2Δ/Δ a montré une perte de tolérance au fluconazole et à la terbinafine. Aucune relation n'a été trouvée entre la calcineurin et l'activité d'Upc2. Ces résultats suggèrent que la perte de tolérance aux antifongiques ne doit pas être considérée comme un phénomène exclusivement lié à la voie de signalisation de la calcineurin.Quatrièmement, en utilisant la cytométrie de flux, la présence de signes de mort cellulaire programmée (MCP) a été recherchée lors de la perte de tolérance du mutant calcineurin incubé avec de la terbinafine. Une grande proportion de cellules mortes incluant ou non une production de ROS (un signe de MCP) a été détectée dans le mutant calcineurin. Ces résultats préliminaires suggèrent que la calcineurin réprime autant la perte d'homéostasie qu'elle régule l'entrée en MCP. Cependant d'autres analyses sont nécessaires pour démontrer clairement le rôle de la calcineurin dans la régulation de la MCP.En conclusion, ce travail de thèse a permis i) l'identification de plusieurs cibles possibles de la calcineurine, ii) la découverte de plusieurs interactions entre la calcineurine et d'autres voies de signalisation et processus biologiques importants et iii) de démontrer la présence de voies indépendantes de la calcineurine impliquées dans la tolérance aux antifongiques chez C. albicans.

Remodelage des canaux potassiques dépendants de l'ATP lors de l'hypertrophie et de l'insuffisance cardiaque

RESUME :Introduction. Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité dans les pays développés et l'insuffisance cardiaque (IC) est la plus fréquente. Suite à un infarctus, le coeur des patients subit un remodelage ventriculaire pouvant évoluer vers un état d'IC. L'IC se définit comme un état dans lequel le coeur n'est plus capable d'approvisionner suffisamment les organes et cet état s'accompagne souvent de troubles du rythme cardiaque. Le remodelage ventriculaire touche de nombreux gènes codant à la fois pour les voies métaboliques et pour des canaux ioniques favorisant ainsi l'apparition des arythmies responsables de la mort subite des patients atteints d'IC. Comprendre ce passage entre remodelage et IC est crucial afin de pouvoir un jour prévenir l'IC et les complications médicales qui l'accompagnent. Nous nous sommes intéressés aux canaux potassiques dépendants de l'ATP (KATP) car ces canaux ont la capacité de coupler le métabolisme de la cellule à son activité électrique. En effet, les canaux KATP s'ouvrent quand la charge énergétique (rapport ATP/ ADP) de la cellule chute. Dans les cardiomyocytes, l'ouverture des KATP induit une hyperpolarisation de la membrane cellulaire ce qui diminue indirectement la surcharge calcique et de ce fait préserve la cellule. Les canaux KATp sont formés de 4 sous-unités Kir6.x (Kir6.1 ou Kir6.2) formant le pore du canal associées à 4 sous-unités régulatrices SUR. Les propriétés électrophysiologiques ainsi que la sensibilité pharmacologique des canaux KATP dépendent de leur composition et seuls les canaux KATP formés par la sous-unité Kirô.l sont activés par le diazoxyde.Méthodes et résultats. Nous avons d'abord montré dans un modèle in vivo d'IC chez le rat adulte que les sous-unités Kir6.1 et SUR sont surexprimées dans ces conditions pathologiques. Par ailleurs, les cardiomyocytes issus des coeurs infarcis deviennent sensibles au diazoxyde reflétant la surexpression de Kir6.1. Les potentiels d'action qui sont prolongés dans l'IC et qui sont à l'origine d'arythmies majeures sont normalisés par l'ouverture des canaux KATp induite par le diazoxyde. Ainsi, l'ouverture pharmacologique des canaux KATp contribuerait à la cardio-protection. Dans une seconde partie, nous avons déterminé quels étaient les facteurs de transcription responsables de ce changement d'expression des sous-unités formant les KATP. Dans notre modèle, nous avons pu montrer que la surexpression de Kirô.l est due aux facteurs de transcription Fox03 et FoxF2 qui est aussi responsable de la surexpression des sous-unités SUR. Dans la dernière partie de ce travail, nous avons mis au point un modèle d'IC in vitro en cultivant les cardiomyocytes de rats adultes en présence d'angiotensine II (Angll) ou de TNFa. Ce modèle expérimental nous a non seulement permis de mettre en relation l'importance de L'AnglI et du TNFa sur le remodelage des canaux KATP mais aussi de développer un modèle in vitro présentant les mêmes caractéristiques que le modèle in vivo concernant le remodelage des KATP lors de l'IC. Ce dernier modèle expérimental ouvre des perspectives afin de mieux caractériser les voies de signalisation impliquées dans le remodelage des canaux KATp lors de l'IC.Conclusion. Les canaux KATp subissent un remodelage lors de l'IC et les résultats obtenus montrent le potentiel cardio-protecteur de ces canaux.ABSTRACT :Background and aim. Cardiovascular disease is the leading cause of death in developed countries and heart failure (HF) is the most common. Following myocardial infarction, the heart of the patient undergoes ventricular remodeling which may evolve toward a state of HF. HF is defined as a state in which heart is unable to supply enough blood to organs and this state is often accompanied by cardiac arrhythmias. Ventricular remodeling involves many genes coding for both metabolic enzymes and ion channels. Changes in ion channel expression can promote arrhythmias responsible for sudden death in patients with HF. A better understanding of the transition between remodeling and HF is crucial in order to prevent the complications associated to HF We were interested in ATP-dependent potassium channels (KATp) because they couple cell metabolism to electrical activity of the cell. Indeed, KATP channels open when the energy charge (ratio of ATP / ADP) of the cell collapses. In cardiomyocytes, the opening of KATP channels induces hyper- polanzation of the cell membrane which reduces calcium overload and thereby protects the cell. KATp channels are composed by 4 Kir6.x subumts (Kir6.1 or Kir6.2) forming the pore channel associated with 4 regulatory subunits SUR. The electrophysiological properties as well as pharmacological sensitivity of KATp channels depend on their composition and only KATP channels formed by Kir6.1 subunit are activated by diazoxide.Methods and results. Firstly, using an in vivo model of HF in adult rats, we showed that Kir6.1 and SUR subunits are overexpressed in HF. In addition, cardiomyocytes from post-infarction hearts became sensitive to diazoxide reflecting the overexpression of the Kir6.1 subunit. The opening of KATP by diazoxide tended to reduce the action potential duration (APD) which is extended in HF. This increase in APD is known to be a major source of arrhythmias during HF. Therefore, the opening of KATP channels by diazoxide would be cardio-protective. Secondly, we wanted to determine which transcription factors were responsible for this KATP remodeling. In our model of HF, we showed that overexpression of Kir6.1 is due to the transcription factors Fox03 and FOXF2 which is also responsible for SUR subunits overexpression. Thirdly, we developed an in vitro model of HF by cultivation of adult rat cardiomyocytes in the presence of angiotensin II (Angll) or TNFa. This model is very interesting not only because it underlines the importance of Angll and TNFa in KATp remodeling but also because this in vitro model presents the same KATP remodeling as the in vivo model of HF. These findings show that our in vitro model of HF opens up many possibilities to investigate more precisely the signaling pathways involved in remodeling of the KATP channels in HF.Conclusion. KATP channels undergo remodeling during HF and our results show the cardio¬protective potential of KATP channels in this disease.

Preoperative chemoradiotherapy in rectal cancer induces changes in the expression of nuclear β-catenin: prognostic significance.

BACKGROUND Preoperative chemoradiotherapy (CRT) is the cornerstone of treatment for locally advanced rectal cancer (LARC). Although high local control is achieved, overall rates of distant control remain suboptimal. Colorectal carcinogenesis is associated with critical alterations of the Wnt/β-catenin pathway involved in proliferation and survival. The aim of this study was to assess whether CRT induces changes in the expression of β-catenin/E-cadherin, and to determine whether these changes are associated with survival. METHODS The Immunohistochemical expression of nuclear β-catenin and membranous E-cadherin was prospectively analysed in tumour blocks from 98 stage II/III rectal cancer patients treated with preoperative CRT. Tumour samples were collected before and after CRT treatment. All patients were treated with pelvic RT (46-50 Gy in 2 Gy fractions) and 5-fluorouracil (5FU) intravenous infusion (225 mg/m2) or capecitabine (825 mg/m2) during RT treatment, followed by total mesorectal excision (TME). Disease-free survival (DFS) was analysed using the Kaplan-Meier method and a multivariate Cox regression model was employed for the Multivariate analysis. RESULTS CRT induced significant changes in the expression of nuclear β-catenin (49% of patients presented an increased expression after CRT, 17% a decreased expression and 34% no changes; p = 0.001). After a median follow-up of 25 months, patients that overexpressed nuclear β-catenin after CRT showed poor survival compared with patients that experienced a decrease in nuclear β-catenin expression (3-year DFS 92% vs. 43%, HR 0.17; 95% CI 0.03 to 0.8; p = 0.02). In the multivariate analysis for DFS, increased nuclear β-catenin expression after CRT almost reached the cut-off for significance (p = 0.06). CONCLUSIONS In our study, preoperative CRT for LARC induced significant changes in nuclear β-catenin expression, which had a major impact on survival. Finding a way to decrease CRT resistance would significantly improve LARC patient survival.

Control of pancreatic β-cell mass and function by gluco-incretin hormones : identification of novel regulatory mechanisms for the treatment of diabetes

Summary : Control of pancreatic ß-cell mass and function by gluco-incretin hormones: Identification of novel regulatory mechanisms for the treatment of diabetes The ß-cells of islets of Langerhans secrete insulin to reduce hyperglycemia. The number of pancreatic islet ß-cells and their capacity to secrete insulin is modulated in normal physiological conditions to respond to the metabolic demand of the organism. A failure of the endocrine pancreas to maintain an adequate insulin secretory capacity due to a reduced ß-cell number and function underlies the pathogenesis of both type 1 and type 2 diabetes. The molecular mechanisms controlling the glucose competence of mature ß-cells, i.e., the magnitude of their insulin secretion response to glucose, ß-cell replication, their differentiation from precursor cells and protection against apoptosis are poorly understood. To investigate these mechanisms, we studied the effects on ß-cells of the gluco-incretin hormones, glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) and glucagon-like peptide-1 (GLP-1) which are secreted by intestinal endocrine cells after food intake. Besides acutely potentiating glucose-stimulated insulin secretion, these hormones induce ß-cell differentiation from precursor cells, stimulate mature ß-cell replication, and protect them against apoptosis. Therefore, understanding the molecular basis for gluco-incretin action may lead to the uncovering of novel ß-cell regulatory events with potential application for the treatment or prevention of diabetes. Islets from mice with inactivation of both GIP and GLP-1 receptor genes (dK0) present a defect in glucose-induced insulin secretion and are more sensitive than control islets to cytokine-induced apoptosis. To search for regulatory genes, that may control both glucose competence and protection against apoptosis, we performed comparative transcriptomic analysis of islets from control and dK0 mice. We found a strong down-regulation of the IGF1 Rexpression in dK0 islets. We demonstrated in both a mouse insulin-secreting cell line and primary islets, that GLP-1 stimulated IGF-1R expression and signaling. Importantly, GLP-1induced IGF-1R-dependent Akt phosphorylation required active secretion, indicating the presence of an autocrine activation mechanism. We further showed that activation of IGF-1R signaling was dependent on the secretion of IGF-2 and IGF-2 expression was regulated by nutrients. Finally, we demonstrated that the IGF-Z/IGF-1R autocrine loop was required for GLP-1 i) to protect ß-cells against cytokine-induced apoptosis, ii) to enhance their glucose competence and iii) to increase ß-cell proliferation. Résumé : Contrôle de la masse des cellules ß pancréatiques et de leur fonction par les hormones glucoincrétines: Identification de nouveaux mécanismes régulateurs pour le traitement du diabète Les cellules ß des îlots de Langerhans sécrètent l'insuline pour diminuer l'hyperglycémie. Le nombre de cellules ß et leur capacité à sécréter l'insuline sont modulés dans les conditions physiologiques normales pour répondre à la demande métabolique de l'organisme. Un échec du pancréas endocrine à maintenir sa capacité sécrétoire d'insuline dû à une diminution du nombre et de la fonction des cellules ß conduit au diabète de type 1 et de type 2. Les mécanismes moléculaires contrôlant la compétence au glucose des cellules ß matures, tels que, l'augmentation de la sécrétion d'insuline en réponse au glucose, la réplication des cellules ß, leur différentiation à partir de cellules précurseurs et la protection contre l'apoptose sont encore peu connus. Afin d'examiner ces mécanismes, nous avons étudié les effets sur les cellules ß des hormones gluco-incrétines, glucose-dépendent insulinotropic polypeptide (G1P) et glucagon-like peptide-1 (GLP-1) qui sont sécrétées par les cellules endocrines de l'intestin après la prise alimentaire. En plus de potentialiser la sécrétion d'insuline induite par le glucose, ces hormones induisent la différentiation de cellules ß à partir de cellules précurseurs, stimulent leur prolifération et les protègent contre l'apoptose. Par conséquent, comprendre les mécanismes d'action des gluco-incrétines permettrait de découvrir de nouveaux processus régulant les cellules ß avec d'éventuelles applications dans le traitement ou la prévention du diabète. Les îlots de souris ayant une double inactivation des gènes pour les récepteurs du GIP et du GLP-1 (dK0) présentent un défaut de sécrétion d'insuline stimulée par le glucose et une sensibilité accrue à l'apoptose induite par les cytokines. Afin de déterminer les gènes régulés, qui pourraient contrôler à la fois la compétence au glucose et la protection contre l'apoptose, nous avons effectué une analyse comparative transcriptomique sur des îlots de souris contrôles et dKO. Nous avons constaté une forte diminution de l'expression d'IGF-1R dans les îlots dKO. Nous avons démontré, à la fois dans une lignée cellulaire murine sécrétant l'insuline et dans îlots primaires, que le GLP-1 stimulait l'expression d'IGF-1R et sa voie de signalisation. Par ailleurs, la phosphorylation d'Akt dépendante d'IGF1-R induite parle GLP-1 nécessite une sécrétion active, indiquant la présence d'un mécanisme d'activation autocrine. Nous avons ensuite montré que l'activation de la voie de signalisation d'IGF-1R était dépendante de la sécrétion d'IGF-2, dont l'expression est régulée par les nutriments. Finalement, nous avons démontré que la boucle autocrine IGF-2/IGF-1R est nécessaire pour le GLP-1 i) pour protéger les cellules ß contre l'apoptose induite par les cytokines, ii) pour améliorer la compétence au glucose et iii) pour augmenter la prolifération des cellules ß. Résumé tout public : Contrôle de la masse des cellules ß pancréatiques et de leur fonction par les hormones gluco-incrétines: Identification de nouveaux mécanismes régulateurs pour le traitement du diabète Chez les mammifères, la concentration de glucose sanguine (glycémie) est régulée et maintenue à une valeur relativement constante d'environ 5 mM. Cette régulation est principalement contrôlée par 2 hormones produites par les îlots pancréatiques de Langerhans: l'insuline sécrétée par les cellules ß et le glucagon sécrété par les cellules a. A la suite d'un repas, l'augmentation de la glycémie entraîne la sécrétion d'insuline ce qui permet le stockage du glucose dans le foie, les muscles et le tissu adipeux afin de diminuer le taux de glucose circulant. Lors d'un jeûne, la diminution de la glycémie permet la sécrétion de glucagon favorisant alors la production de glucose par le foie, normalisant ainsi la glycémie. Le nombre de cellules ß et leur capacité sécrétoire s'adaptent aux variations de la demande métabolique pour assurer une normoglycémie. Une destruction complète ou partielle des cellules ß conduit respectivement au diabète de type 1 et de type 2. Bien que l'augmentation de la glycémie soit le facteur stimulant de la sécrétion d'insuline, des hormones gluco-incrétines, principalement le GLP-1 (glucagon-like peptide-1) et le GIP (glucose-dependent insulinotropic polypeptide) sont libérées par l'intestin en réponse aux nutriments (glucose, acides gras) et agissent au niveau des cellules ß, potentialisant la sécrétion d'insuline induite par le glucose, stimulant leur prolifération, induisant la différentiation de cellules précurseurs en cellules ß matures et les protègent contre la mort cellulaire (apoptose). Afin d'étudier plus en détail ces mécanismes, nous avons généré des souris déficientes pour les récepteurs du GIP et du GLP-l. Les îlots pancréatiques de ces souris présentent un défaut de sécrétion d'insuline stimulée par le glucose et une sensibilité accrue à l'apoptose par rapport aux îlots de souris contrôles. Nous avons donc cherché les gènes régulés pas ces hormones contrôlant la sécrétion d'insuline et la protection contre l'apoptose. Nous avons constaté une forte diminution de l'expression du récepteur à l'IGF-1 (IGF-1R) dans les îlots de souris déficientes pour les récepteurs des gluco-incrétines. Nous avons démontré dans un model de cellules ß en culture et d'îlots que le GLP-1 augmentait l'expression d'IGF-1R et la sécrétion de son ligand (IGF-2) permettant l'activation de la voie de signalisation. Finalement, nous avons montré que l'activation de la boucle IGF-2/IGF-1R induite par le GLP-1 était nécessaire pour la protection contre l'apoptose, l'augmentation de la sécrétion et la prolifération des cellules ß.

Characterization of novel hypertrophic signaling pathways activated by the AKAP-Lbc signaling complex in cardiomyocytes

RÉSUMÉL'hypertrophie cardiaque représente un mécanisme d'adaptation du myocarde en réponse à différents stress. Sur le long terme, l'hypertrophie cardiaque peut évoluer vers l'insuffisance cardiaque, l'une des principales causes de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés, pour cette raison, la communauté scientifique est très intéressée à élucider les voies de signalisation qui régulent ce phénomène pathologique dans le coeur.Notre laboratoire a montré que AKAP-Lbc, une protéine d'ancrage de la protéine kinase A (AKAPs), est principalement exprimée dans le coeur et peut réguler des processus importants tels que l'hypertrophie des cardiomyocytes.AKAP-Lbc fonctionne comme un facteur d'échange de nucléotides guanine (GEF) pour la petite Rho-GTPase RhoA. Cette fonction est activée par différents récepteurs qui activent son domaine Rho-GEF. Des études récentes ont démontré que AKAP-Lbc est impliquée dans la réponse hypertrophique des cardiomyocytes suite à l'activation des récepteurs α1-adrénergiques. Le but général de ce travail de thèse est la caractérisation de la voie de signalisation hypertrophique activée par AKAP-Lbc dans les cardiomyocytes.Mes travaux montrent que AKAP-Lbc organise un complexe macromoléculaire, comprenant les protéines kinases PKN, MLTK, MKK3 et p38 et active la protéine kinase p38 en réponse à l'activation des récepteurs α1-adrénergiques.Nos résultats indiquent que cette voie de signalisation au cours de la réponse hypertrophique active le facteur de transcription GATA4 et la protéine Hsp27.GATA4 est un important facteur de transcription qui régule la transcription de plusieurs gènes au cours de la réponse hypertrophique, alors que Hsp27 est une protéine chaperonne qui interagit avec le cytosquelette des cardiomyocytes et les protége contre le stress hypertrophique.Pris ensembles, ces études contribuent à comprendre comment le complexe de signalisation formé par AKAP-Lbc régule l'hypertrophie dans les cardiomyocytes. Au-delà de leur intérêt au niveau biochimique, ces travaux pourraient aussi contribuer à la compréhension du phénomène de l'hypertrophie dans le coeur.

Decreased acute vascular remodeling, anaphylaxis and delayed type hypersensitivity in PPARβ/δ-deficient mice

Endothelial cells form a semi-permeable barrier that participates in the exchange of plasma fluids, proteins and cells, and helps to maintain the physiological functions of organs as well as circulatory homeostasis. Vascular permeability and vasodilatation are increased during acute and chronic inflammation, cancer and wound healing. This is mediated by exposure to certain vascular permeability increasing factors, such as vascular endothelial growth factor (VEGF). The peroxisome proliferator-activated receptors (PPAR) belong to the nuclear hormone receptor (NHRs) family of ligand-activated transcription factors. Three isotypes, PPARa, PPARp/5 and PPARy have been identified. They are all expressed in endothelial cells (ECs). Recent data have demonstrated their involvement in important mechanisms for vasculogenesis and angiogenesis, such as cell proliferation/differentiation, directional sensing/migration, and survival. PPARs were reported to modulate the expression of pro-angiogenic soluble factors, such as VEGF-A and may also participate in the regulation of expression of VEGF receptors. The aim of the present work was to elucidate the role of PPARp/δ in endothelial cell functions important for angiogenesis as well as in vascular permeability and vasodilatation. Using organ culture models of mouse aorta expiants, cultures of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and genetically modified mouse models, we studied the consequences of loss and gain of PPARp/5 activity on endothelial cell functions. In the first part of this study, we show that the activation of PPARp/δ promotes EC outgrowth in murine aorta expiants. In vivo we observed that dermal vessel acute permeability in response to VEGF-A stimulation is strongly impaired in PPARfi/δ -I- animals. Additionally, observation of the dermal vessel morphology showed a clear enlargement of the wild-type dermal vessels upon VEGF-A injection, whereas vessels of PPARp/5 -/- animals showed almost no enlargement. The impaired response to VEGF stimulation in the knock-out animals was not due to structural or morphological abnormalities. Based on this data, we suggest that PPARp/5 may act on intracellular signaling cascades in ECs, downstream of the VEGF-A receptor. In the second part of this study, we address the relevance of PPARβ/δ vascular functions in pathophysiological inflammatory conditions, such as delayed- type hypersensitivity (DTH) reaction and anaphylaxis in mice. The DTH reaction is a cell-mediated immune reaction to protein, bacterial and viral antigens, whereas anaphylaxis is the most severe form of allergic reaction. In these in vivo models, we demonstrated that the absence of PPARβ/δ in ECs prevents the formation of severe edema in the DTH reaction, and that Ρ PARβ/δ accelerates recovery following systemic anaphylaxis, at least partially through the control of vascular permeability. Our data not only describe a novel function of PPARβ/δ in vessel permeability and vasodilatation, but also open new routes of research for the development of vessel permeability/vasodilatation regulating agents. - Les cellules endothéliales qui bordent la face interne des vaisseaux sanguins forment l'endothélium, une barrière semi-perméable qui régule les échanges de fluides, de protéines et de cellules immunes entre la circulation et les organes. L'endothélium participe également au maintien de la fonction des organes et de l'homéostasie circulatoire. La perméabilité vasculaire augmente dans des situations inflammatoires aigties ou chroniques, dans les tumeurs, et pendant la réparation de blessures. Cette augmentation de perméabilité est due à la production de facteurs sécrétés, tels que le Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF-A), la thrombine ou I'histamine. Lès récepteurs nucléaires Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPAR) sont des facteurs de transcription mis en activité par des ligands. Trois isotypes de PPARs, PPARa, ΡΡΑΡβ/δ and PPARy ont été caractérisés. Ils sont exprimés dans les cellules endothéliales, et des travaux récents ont montré qu'ils régulent des comportements cellulaires importants pour la vasculogenèse et l'angiogenèse, tels que la prolifération, la différenciation, la migration, et la survie des cellules. Ils régulent également la production de VEGF-A par divers types cellulaires. Le but de ce travail était d'élucider le rôle de PPARβ/δ dans la régulation de la perméabilité vasculaire, plus particulièrement dans les cellules endothéliales. Grâce à des cultures d'expiants d'aortes de souris, à la culture d'une lignée endothéliale humaine (HUVECs) et de souris génétiquement modifiées, nous avons étudié le rôle de PPARβ/δ dans les cellules endothéliales, dans des situations gain et perte de fonction du récepteur. Dans la première partie de ce travail, nous avons montré les propriétés pro-angiogéniques de PPARβ/δ dans des explants d'aortes. In vivo, nous avons observé l'absence d'hyperperméabilité aiguë induite par le VEGF-A, la thrombine et I'histamine chez les souris PPARβ/δ -/-. De plus, l'analyse morphologique des vaisseaux dans le derme des souris après stimulation par VEGF- A a confirmé l'absence de réponse à la stimulation. Ces analyses morphologiques nous ont également permis de montrer que l'absence de réponse aiguë n'était pas due à un défaut de structure des vaisseaux dermiques chez les souris PPARp/δ -/-. Sur la base de ces résultats, nous proposons que PPARp/δ régule des voies de signalisation intracellulaires dans les cellules endothéliales, voie de signalisation impliquées dans la régulation de la perméabilité vasculaire: Dans la seconde partie du travail, nous avons étudié l'importance de la régulation de la perméabilité vasculaire par PPARβ/δ dans des situations pathophysiologiques impliquant une hyperperméabilité aiguë des vaisseaux : une réaction d'hypersensibilité cutanée retardée d'une part (delayed-type hypersensitivity, DTH), et un choc anaphylactique d'autre part. Dans ces deux modèles induits expérimentalement chez la souris, l'absence de PPARβ/δ prévient en partie la formation de l'oedème inflammatoire local (DTH), et accélère la récupération (anaphylaxie), au moins partiellement en réglant la perméabilité vasculaire. Ces résultats ouvrent un nouveau champs d'étude quant au rôle de PPARβ/δ dans les vaisseaux et à d'éventuelles applications thérapeutiques dans des pathologies inflammatoires.

Role of estrogen receptor signaling in mammary gland development

Abstract : Breast cancer incidence rates have increased over the past hundred years, in particular, in Western industrial countries and they continue to rise worldwide. Breast cancer risk has been linked to life exposure to endogenous and exogenous estrogens, and there is increasing concern that exposure to endocrine disruptors which are increasingly accumulating in our environment may also have a role. Using the mouse as model, I have analyzed the physiological role of estrogen signaling in mammary gland development. I have shown that estrogen signaling through the estrogen receptor alpha (ERα) in the mammary epithelium is required for ductal morphogenesis during puberty. Moreover, I have demonstrated that estrogens induce proliferation of mammary epithelial cells through a paracrine mechanism. The presence of estrogen signaling is essential cell intrinsically via ERα or ERβ for the terminal differentiation into milk secreting cells during pregnancy. Furthermore, I have examined how perinatal exposure to the estrogenic plasticizer bisphenol A (BPA) found ubiquitously in consumer goods such as baby bottles formula and beverage containers affects the normal mammary gland development and possibly predispose the mammary gland to tumorigenesis. I have found that C57b16 mice that were exposed, via their drinking water, to several BPA doses ranging from 0.025µg/kg/day to 250µg/kg/day exhibits delayed terminal end bud formation and consequently the ductal outgrowth. Later in life, the mice that were exposed in utero to BPA displayed an increased number of mammary epithelial cells. Acute exposure of 3-week-old mice to BPA can alter gene expression levels of an important estrogen target gene, amphiregulin. Taken together these data are compatible with a scenario in which perinatal BPA exposure may alter mammary gland development by affecting developmental signaling pathways. Résumé : Les taux d'incidence des cancers du sein ont augmenté au cours des cent dernières années en particulier dans les pays industriels occidentaux et ils continuent d'augmenter dans le monde entier. Le risque du cancer du sein a été corrélé à l'exposition au cours de la vie aux oestrogènes endogènes et exogènes. Il y a une préoccupation croissante concernant l'exposition aux perturbateurs endocriniens qui ne cessent de s'accumulent dans notre environnement et qui peuvent également avoir un rôle dans l'augmentation des cancers du sein. En utilisant le modèle de souris, j'ai analysé le rôle physiologique de la voie de signalisation à l'oestrogène dans le développement mammaire. J'ai prouvé que l'oestrogène par l'intermédiaire de son récepteur alpha (ERα) est indispensable dans l'épithélium pour la morphogénèse du système canalaire pendant la puberté. De plus, j'ai démontré que les oestrogènes induisent la prolifération des cellules épithéliales mammaires par un mécanisme paracrine. La présence de la voie de signalisation à l'oestrogène est essentielle de manière intrinsèque à la cellule par l'intermédiaire d'ERα ou ERβ pour la différentiation terminale des cellules épithéliales en cellules sécrétrices de lait pendant la grossesse. En outre, j'ai examiné comment l'exposition périnatale au bisphénol A (BPA), un plastifiant présentant des propriétés ostrogéniques et omniprésent dans divers produits d'usage courant tels que les biberons des bébés et les récipients en plastique, affecte le développement de la glande mammaire et prédispose probablement celle-ci à la tumorigénèse. J'ai constaté que l'exposition périnatale à BPA retarde la formation des bourgeons terminaux et par conséquent la croissance du système canalaire. Plus tard dans la vie, les souris qui ont été exposées dans l'utérus au BPA ont montré un plus grand nombre de cellules épithéliales mammaires. L'exposition aiguë de souris âgées de 3 semaines au BPA perturbe le niveau d'expression d'un gène cible important de l'oestrogène, l'amphiregulin. Ces données sont compatibles avec un scénario dans lequel l'exposition périnatale au BPA peut changer le développement de la glande mammaire en affectant des voies de signalisation développementales.

The role of Toll-like Receptor (TLR) 9 in the development of a T-helper (Th)1/Th2 response in the murine model of infection with " Leishmania major "

1.1 SUMMARY The role of the non-specific innate immune system is as important as the elaboration of the adaptive immune system in the initiation of an immune response to pathogens. The role of the Toll-like receptors (TLRs) in the innate immune response to virus and bacterial pathogens is widely recognised, however, little is known about the role of TLRs in host defence against eukaryotic pathogens. Immunologic investigations on the marine model of infection with Leishmania major (L. major) have correlated the outcome of the disease with expansion of different subsets of CD4+ cells, designated Th1 and Th2. The resistance of C57BL/6, CBA and C3H/He mice is linked with an IL-12 driven Th1 response. In BALB/c mice the susceptibility correlates with an IL-4 driven Th2 response. The initial event promoting the development of a Th1 or Th2 response still remains elusive. Recently, the contribution of the TLR signalling pathway in the innate and acquired immune response to infection with the intracellular protozoan parasite L. major has been demonstrated. Thus, the purpose of this study is to determine whether TLRs may play a role in influencing the outcome of the infection by directing the development of a Th1 or a Th2 response during infection with L, major parasites, in resistant C57BL/6 and susceptible BALB/c mice, respectively. We demonstrated that MyD88, the major TLR adaptor molecule is necessary for C57BL/6 to develop a resistant Th1 response following L. major infection. Our data show the essential role of MyD88 in the establishment of a protective Th1 response. We subsequently aimed to determine which TLRs may be involved in the protective response. Since TLR2 and TLR4 have shown to have a potential role for Leishmania recognition, we analysed the course of infection in TLR2 and TLR4 deficient mice on a C57BL/6 resistant background following L. major infection. Our results clearly demonstrate that TLR2 or TLR4 aze dispensable to control the outcome of the disease as the TLR2 and TLR4 knockout mice developed a protective Th1 response. With the aim of determining a potential TLR candidate important in the initiation of the Thl response, we assessed the mRNA expression of different TLRs (TLR1 to TLR9) using quantitative real-time RT-PCR at different time points during the first week of infection. The results clearly showed an upregulation of TLR7 and TLR9 mRNA expression during the early phase of infection in resistant C57BL/6 mice but not in susceptible BALB/c mice. To provide in vivo evidence for the role for, these TLRs in the outcome of cutaneous leishmaniasis, studies using TLR7 and TLR9 deficient mice on a resistant C57BL/6 background were performed. The TLR7 deficient mice developed a resistance phenotype that was comparable with C57BL/6 wild type mice. Thus, the presence of TLR7 is not indispensable for the development of a Th1 response and resistance to infection. On the contrary, TLR9 deficient mice on the C57BL/6 resistant background showed high variability in the outcome of the disease. Although some mice behave as resistant C57BL/6 mice, half of them developed high lesion following infection and showed a decrease in IFN-γ production and an increase in IL-4 as compared to wild type mice. These results suggest that TLR9 may be involved in the control of infection. To test the hypothesis that regulatory T cells (Treg) are playing a role in the high variability in the disease outcome in TLR9 deficient mice, depletion of CD4+CD25+ T cells with a specific antibody three days before infection with L. major were performed Interestingly, these treated mice developed large lesions, low IL-4 and decreased IFN-γ producion when compared to untreated mice. A better understanding of the mechanism by which Treg cells influence the outcome of the disease in TLR9 deficient mice following L. major infection is currently under investigation. Altogether, this study demonstrates the importance of TLR9 in the induction of a protective T'h1 response, a process that is involved in the resolution of the lesion induced by L. major infection. 1.2 RÉSUMÉ Le rôle de la réponse immunitaire innée a longtemps été négligé quant à l'impact qu'elle pourrait avoir dans l'initiation d'une réponse immune adaptative efficace dirigée contre un pathogène. Si l'importance des récepteurs Toll-like (TLR) du système inné dans la reconnaissance des virus et bactéries a été démontrée, son rôle dans la défense contre les pathogènes eucaryotes reste encore très élusif. Récemment, il a été montré que les voies de signalisation provenant de l'activation des TLRs pouvaient initier la réponse immunitaire innée et adaptative après une infection avec le parasite protozoaire Leishmania major (L. major). Dans un modèle marin d'infection avec L. major alors que la plupart des souches de souris telles que C57BL/6 sont résistantes à l'infection et développent une réponse immunitaire de type T helper 1 (Th1) induite par IL-12, peu de souches dont les BALB/c sont sensibles et développent une réponse Th2 induite par IL-4. La différentiation Th1/Th2 est un événement qui prend place de manière définitive lors de la première semaine après infection. Les événements précoces promouvant le développement d'une réponse Th1 ou Th2 n'étant pas connus, l'objectif de ce travail a été de démontrer un rôle des TLRs dans l'initiation d'une réponse immune innée et adaptative suite à l'infection par L. major. Nous avons démontré que MyD88, une molécule importante dans le processus de signalisation des TLRs, est nécessaire pour que les souris résistantes C57BL/6 développent une réponse Th1 protectrice. L'importance du rôle de TLR2 et TLR4 dans la reconnaissance du parasite Leishmania ayant été démontrée, nous avons privilégié l'analyse de la réponse immunitaire suite à une infection in vivo de souris déficiente en TLR2 ou TLR4 sur un fond génétique résistant. Les résultats obtenus montrent que la présence de ces récepteurs n'est pas indispensable pour le contrôle de l'infection et la polarisation d'une réponse Th1 caractéristique de la résistance à L. major. Cependant d'autres TLRs peuvent aussi activer la voie de signalisation MyD88 dépendante. L'expression de l'ARNm des différents TLRs dans les ganglions drainant de souris sensibles et résistantes pendant la première semaine d'infection a été déterminée par PCR quantitative en temps réel. Les résultats obtenus montrent que l'ARNm de TLR7 et TLR9 était régulé positivement suite à l'infection par L. major chez les souris résistantes C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'était détectable chez les souris sensibles BALB/c. Le rôle des récepteurs TLR7 et TLR9 a donc été évalué par l'infection par L. major des souris déficientes en TLR7 et TLR9 sur fond génétique C57BL/6. Nos résultats ont clairement démontré que les souris déficientes en TLR7 montrent une réponse immunitaire identique à celle des souris résistantes C57BL/6, signifiant que TLR7 n'est pas indispensable au développement d'une Th1 ainsi qu'au contrôle de la parasitémie. Paz contre, les souris déficientes en TLR9 sur un fond génétique résistant ont montré une grande variabilité dans la réponse à l'infection. En effet, la moitié des souris deviennent sensibles à l'infection, ceci étant associé à une diminution dans la production d'IFN-γ et à une augmentation de la production d'IL-4. Ces résultats suggèrent que TLR9 est impliqué dans le contrôle de la lésion et de la réponse immunitaire suite à l'infection avec L. major. Cependant les résultats avec les souris déficientes en TLR9 montrant une grande hétérogénéité et une balance Th1/Th2 instable, nous avons émis l'hypothèse que les cellules T régulatrices pouvaient être impliquées dans ce phénomène. Nous avons effectivement constaté qu'après déplétion des cellules CD4+CD25+, les souris déficientes en TLR9 développent des lésions aussi grandes que les souris BALB/c après infection par L. major. Cependant le nombre de parasites reste le même que chez les souris C57BL/6. De plus la production d'IL-4 ainsi que celle d'IFN-γ reste extrêment bas. Les mécanismes régulateurs impliqués dans ce processus sont en cours d'analyse. Ce travail met en évidence l'importance du TLR9 dans le développement d'une réponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus nécessaire pour la résistance à l'infection. 1.3 RESUME POUR UN LARGE PUBLIC La leishmaniose est une maladie parasitaire répandue dans le monde entier et touchant plus de 88 pays. L'incidence mondiale de la leishmaniose cutanée et de 1 à 1,5 million de nouveaux cas par année. Plus de 12 millions de personnes sont affectées par la maladie et 350 millions de personnes sont une population à risque. Un modèle marin d'infection avec Leishmania major (L. major) a été établi qui reproduit plusieurs tableaux cliniques observés dans le cas de la leishmaniose cutanée chez l'homme. L'analyse de la réponse immunitaire dans les souris infectées par L. major a permis de distinguer deux groupes : les souris de la plupart des souches telles que C57BL/6 sont résistantes à l'infection et développent une réponse immunitaire de type T helper 1 (Th1), alors que quelques souches dont les BALB/c sont sensibles et développent une réponse de type Th2. La réponse immune adaptative dans le modèle d'infection avec L. major à été largement étudiée. Cependant, les événements précoces déterminants pour le développement d'une réponse Th1 ou Th2 restent encore très flous. Récemment, plusieurs publications ont montré que les récepteurs Toll-like (TLR) peuvent contribuer à l'initiation de la réponse immunitaire lors d'une infection avec le parasite intracellulaire L. major. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié le rôle de MyD88, une molécule importante dans le processus de signalisation des TLRs, dans la réponse immune suite à une infection avec L. major. En l'absence de MyD88, les souris normalement résistantes à l'infection avec L. major deviennent sensibles et développent des lésions importantes. Ces souris ne sont plus capables de développer une réponse Thl, normalement caractéristique de leur phénotype résistant. Nous avons ensuite tenté de comprendre quels TLRs, plus précisément, pouvait être impliqué dans ce processus. Malgré quelques évidences démontrant que TLR2 et TLR4 pouvaient avoir un rôle important dans l'initiation d'une réponse immunitaire adaptative à Leishmania, nous avons montré que, in vivo après infection avec L. major, la déficience d'un de ces récepteurs n'était pas suffisante à faire basculer la réponse immunitaire. Les souris C57BL/6 déficient en TLR2 ou TLR4 peuvent parfaitement contrôler l'évolution de la maladie. De plus, ces souris, malgré l'absence de TLR2 ou TLR4, sont capables de monter une parfaite réponse Thl. Etant donné que TLR2 et TLR4 n'étaient pas essentiels pour la résistance à la maladie, nous avons analysé les TLRs, parmi les 12 décrits qui pouvaient être indispensables au développement d'une réponse de type Th1 associée à la résistance à l'infection par Leishmania. Nos expériences ont montré que l'expression de l'ARN messager (ARNm) de TLR7 et TLR9 était modulée suite à l'infection par L. major chez la souris résistante C57BL/6 alors qu'aucune modulation n'était visible chez les souris sensible BALB/c. Pensant que ces TLRs pourraient jouer un rôle dans la réponse immunitaire au parasite, nous avons étudié l'évolution de l'infection dans les souris déficientes en TLR7 et TLR9. Nos résultats ont clairement démontré que TLR7 n'était pas indispensable à la résistance au parasite alors que l'absence de TLR9 avait des conséquences radicales sur le contrôle de la lésion et de la réponse immunitaire suite à l'infection avec L. major. Ce travail révèle ainsi l'importance du TLR9 dans le développement d'une réponse Th1 lors d'une infection avec L. major, un processus nécessaire pour la résistance à l'infection. Il est a noté que nos résultats sont en accord avec le fait que les motifs CpG, qui sont des immunostimulateurs interagissant avec le TLR9, ont une activité adjuvante importante dans la préparation de vaccins contre la leishmaniose. Une meilleure compréhension des mécanismes immunologiques impliquant le TLR9 dans la reconnaissance du parasite est alors indispensable pour le développement de vaccins thérapeutiques efficaces.

Study of the SRR1-gene family in Arabidopsis, yeast and mouse cells

Abstract: Light is a very important environmental cue for plants. In addition to the energy for photosynthesis, it also provides information that is essential for many processes including seed germination, seedlings development, neighbours detection or transition from the vegetative to the reproductive state. Plants evolved different photoreceptors, among which the phytochromes (PHY), which are red/far-red photoreceptors. This family is composed of 5 members in Arabidopsis thaliana, among which phyB plays the major role for detection of red light. Phytochromes are also able to reset the phase of the circadian clock, which is composed of a complicated network of genes able to produce rhythms of about 24 hours, even in constant conditions. SRR1 (Sensitivity to Red light Reduced) is a gene that was shown to act in the phyB pathway as well as in the circadian clock. It was proposed to play a role in the maintenance of rhythms of the core oscillator because of the circadian phenotype of the srr1 mutant in constant light and in constant darkness. In the present study, we present data confirming the role of SRR1 in the core oscillator. Moreover, we show that SRR1 levels are not limiting for circadian rhythms nor for light perception. We show that the protein levels, the sub-cellular localisation or the complex in which SRR1 is found are not regulated in a circadian manner. Orthologues of SRR1 exist in numerous eukaryotes, forming a new gene family. None of the members of this family have been described. Here, we present data suggesting that the mouse orthologue of SRR1 may not be required for oscillation of the circadian clock of mouse cells in culture. The yeast gene (called BER1 for Benomyl REsistant) was studied to understand the biochemical function of this gene family. Based on synthetic genetic screens, a role of Ber1 was inferred in microtubules dynamics, N-terminal acetylation of protein and proteasome biogenesis. The effect of Ber1 on microtubules was confirmed by the observation that the ber1Δ mutant is more resistant to microtubule-depolymerising drugs and microscopic examination of microtubules in ber 1 Δ mutants. Complementation assays of ber1 Δ mutants and srrl mutants failed to reveal any obvious functional conservation of the mouse, yeast and Arabidopsis orthologues. In conclusion, the SRR1 family might encode genes that either plays different roles in different organisms, or have similar biochemical function but are involved in diverse pathway. Résumé: La lumière est un des facteurs abiotiques les plus important pour les plantes. En plus de l'énergie fournie pour la photosynthèse, elle fourni également de l'information nécessaire pour différents processus comme la germination, le développement des jeunes plantules, la détection de plantes avoisinantes ou encore la transition entre le développement végétatif et reproductif. Plusieurs types de photorécepteurs sont apparus chez les plantes au cours de l'évolution, notamment les phytochromes (PHI, qui perçoivent la lumière rouge et rouge lointaine. Cette famille est composé de 5 membres chez Arabidopsis thaliana, parmi lesquels phyB est le principal récepteur pour la lumière rouge. Les phytochromes sont aussi utiles pour la synchronisation entre les cycles jour-nuit dus à la rotation de la terre et l'horloge circadienne. Cette dernière est composée d'un réseau compliqué qui permet la production de rythmes capables de perdurer même en conditions constantes. SRRI (Sensitivity to Red light Reduced) est un gène qui agit dans la voie de signalisation de phyB ainsi que dans l'horloge circadienne. Il a été proposé que SRRI joue un rôle dans la maintenance des rythmes de l'oscillateur principal à cause des phénotypes circadiens du mutant srrl observés en lumière et en obscurité continue. Dans ce travail, nous présentons des données confirmant le rôle de SRR1 dans l'oscillateur principal. Nous montrons que les niveaux d'expression de SRRI ne sont pas limitants pour les rythmes circadiens ou la perception de la lumière. Enfin, nous montrons que le niveau d'accumulation de la protéine, sa localisation subcellulaire ou encore la taille du complexe dans lequel SRRl est trouvé ne sont pas régulés de façon circadiennes. Des orthologues de SRRI existent chez de nombreux eucaryotes, formant une nouvelle famille de gènes. Aucun des membres de cette famille n'a été étudié avant ce travail. Nous présentons des données suggérant que l'orthologue de la souris n'est peut-être pas requis pour les oscillations de l'horloge circadienne de cellules de souris en culture. Le gène de la levure (appelé SERI pour Benomyl REsistant) a été étudié afin de mieux comprendre la fonction biochimique de cette famille de gène. Une analyse par crible synthétique léthal a révélé un rôle de Ber1 dans la dynamique des microtubules, l'acétylation des protéines en N-terminal et la biogenèse du protéasome. L'effet de Ber1 sur les microtubules a été confirmé par l'observation du mutant ber1 en présence de drogue capable de dépolymériser les microtubules. Celui-ci est plus résistant à ces drogues que le type sauvage. Des expériences de complémentation n'ont pas montré de conservation de la fonction entre SRRI et ses homologues de souris ou de levure. En conclusion, la famille SRRI code pour des gènes qui pourraient avoir soit des rôles différents selon les organismes, soit la même fonction biochimique mais qui serait utile pour des voies de signalisation différentes.

Novel immunotherapeutic strategies against human papillomavirus type 16 (HPV 16) induced lesions and cervical cancer

RESUME Le cancer du col de l'utérus, deuxième cause de mort par cancer chez la femme, a pu être associé à une infection par plusieurs types de virus du Papillome Humain (HPV), et en particulier HPV 16. Les vaccins prophylactiques sont efficaces à prévenir le cancer du col utérin alors que les lésions de haut grade sont généralement traitées par ablation chirurgicale et par d'éventuels traitements additionnels. Les risques de récurrence liés aux ablations et le taux de mortalité (50%) lié au cancer, démontrent le besoin de développer des stratégies alternatives afin de cibler les lésions précancéreuses. A ce jour, les vaccins thérapeutiques ont démontré peu de résultats cliniques, contrastant avec les régressions de tumeurs ectopiques observées après vaccination dans des modèles murins avec tumeurs associées à HPV. L'induction de réponses immunitaires protectrices dans la muqueuse génitale semble être cruciale pour l'efficacité des vaccins thérapeutiques HPV et évaluer leur efficacité dans un modèle murin avec tumeurs-HPV génitales représente un pré-requis important avant de procéder à des études cliniques. Par conséquent, nous avons établi un modèle murin orthotopique où des tumeurs se développent dans (a muqueuse génitale après une instillation intra-vaginale (i.vag) de cellules tumorales exprimant les oncogènes E6/E7 d'HPV 16 et transduites par un vecteur lentiviral codant la luciferase afin de suivre le développement de ces tumeurs in vivo par imagerie. La caractérisation histologique a démontré que les tumeurs grandissaient dans l'épithélium vaginal et en accord avec leur localisation, des cellules Τ CD8 spécifiques à E7 induites par la tumeur n'étaient détectées que dans la muqueuse génitale et les ganglions drainants. Une infiltration de cellules Τ régulatrices a aussi été mise en évidence, empêchant la régression spontanée de ces tumeurs. Par conséquent, ce modèle devrait être plus adéquat pour tester des stratégies thérapeutiques, étant donné qu'il partage certaines similarités immunologiques avec les lésions génitales naturelles causées par HPV. Etant donné que les oncogènes E6 et E7 d'HPV sont nécessaires à la maintenance du phénotype cancéreux des cellules cervicales, elles représentent des antigènes cibles pour la vaccination thérapeutique. Nous avons démontré que des souris immunisées par voie sous-cutanée (s.c.) avec une dose d'un vaccin à base de polypeptide E7 d'HPV 16 et d'adjuvants, présentaient de nombreuses cellules Τ CD8 sécrétant de l'IFN-γ spécifiquement à E7 dans leurs organes lymphatiques mais également dans la muqueuse génitale. De plus, le manque de corrélation entre les réponses spécifiques mesurées dans la périphérie et dans la muqueuse génitale souligne la nécessité et l'importance de déterminer les réponses immunitaires localement là où les lésions dues à HPV se développent. Si une vaccination par voie muqueuse est plus propice à traiter/régresser des infections génitales/tumeurs que le voie parentérale est un sujet débattu. Nos données montrent que seule la voie s.c. était capable de régresser la quasi totalité des tumeurs génitales chez la souris bien que des réponses CD8 spécifiques à E7 similaires étaient mesurées dans la muqueuse génitale après des vaccinations intra-nasale et i.vag. Afin d'augmenter la réponse spécifique au vaccin dans la muqueuse génitale, des immunostimulants ont été administrés par voie i.vag après vaccination. Nous avons démontré qu'une application i.vag d'agonistes des Toll like receptors après une vaccination s.c. induisait de manière significative une augmentation des cellules Τ CD8 sécrétant de l'IFN-γ spécifiquement à E7 dans la muqueuse génitale. Plus précisément et concernant les CpG et Poly l:C, l'effet était probablement associé à une attraction locale des cellules Τ CD8 et deuxièmement dépendait respectivement des voies de signalisation TLR9 et TLR3/Mda5. Finalement, cette stratégie combinatoire a permis de régresser des grosses tumeurs génitales chez la souris, suggérant qu'une telle immunothérapie pourrait adéquatement traiter des lésions dues à HPV chez les femmes. SUMMARY Cervical cancer is the second leading cause of cancer mortality in women worldwide and results from an infection with a subset of Human Papillomavirus (HPV), HPV 16 representing the most prevalent type. The available prophylactic vaccines are an effective strategy to prevent cervical cancer while already established high grade lesions usually require surgical ablation of lesion with possible additional treatments. Recurrence risks linked to conventional ablations and the high mortality (50%) related to cervical cancer demonstrate the need for alternative strategies like immunotherapies to target pre¬cancerous lesions. Until now, therapeutic vaccines only showed limited clinical results, which strongly contrast with the regression of ectopic tumors observed in the available murine HPV tumor models after vaccination. Induction of protective immune responses in the genital mucosa (GM) may be crucial for efficacy of HPV therapeutic vaccines and evaluating their efficacy in a murine model with genital HPV- tumors represents an important prerequisite for clinical trials. Thus, we have here established an orthotopic mouse model where tumors in the GM develop after an intravaginal (i.vag) instillation of HPV 16 E6/E7 oncogenes-expressing tumor cells transduced with a luciferase encoding lentivirus vector for in vivo imaging of tumor growth. Histological characterization showed that tumor grew within the vaginal epithelium and according to their mucosal location tumor- induced E7-specific CD8 Τ cells were restricted to the GM and genital draining lymph nodes together with high Τ regulatory cells infiltrates preventing spontaneous regression. Consequently, sharing several immunological similarities with natural genital HPV lesions, this novel genital tumor model may be more adequate to test therapeutic strategies. As E6 and/or E7 HPV oncogenes expression is required for the maintenance of the cancerous phenotype of cervical cells, they represent target antigens for therapeutic vaccination. We reported that mice subcutaneously (s.c.) immunized once with an adjuvanted HPV 16 E7 polypeptide vaccine harbored high E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells in their lymphoid organs and more importantly in the GM. In addition, the lack of correlation between specific responses measured in the periphery with those measured in the GM highlighted the necessity and relevance to determine the immune responses locally where HPV 16-induced lesions develop. Whether a mucosal route of immunization is better to treat/regress genital infections/tumors than parenteral immunization is still debated. Our data shows that although similar E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells responses were measured in the GM upon mucosal routes of E7 vaccine delivery (nasal and vaginal immunizations), only the s.c immunization was able to regress at least all genital tumors in mice. To further increase the vaccine-specific responses in the GM, immunostimulatory agents were i.vag administrated after vaccination. We demonstrated that a single i.vag application of toll like receptor (TLR) agonists after a s.c. E7 vaccination induced a significant increase of E7-specific IFN-γ secreting CD8 Τ cells in the GM. More precisely, regarding CpG and Poly l:C, the effect is most probably associated with a local attraction of total CD8 Τ cells and secondly depends on TLR9 and TLR3/Mda5 signaling pathways, respectively. Finally, this combinatorial strategy induced tumor regression in mice harboring large genital tumors, suggesting that such an immunotherapy could be adequate to treat HPV-induced lesions in women.

" Leishmania major " metacaspase in programmed cell death

Abstract: The human protozoan parasite Leishmania major has been shown to exhibit several morphological and biochemical features characteristic of a programmed cell death (PCD) when differentiating into infectious stages and under a variety of stress conditions. In mammalian cells, the principal effector molecules of PCD or apoptosis are caspases. Although some caspase-like peptidase activity has been reported in dying parasites, no caspase gene is present in the L. major genome. However, a single metacaspase gene is present in L. major whose encoded protein harbors the predicted secondary structure and the catalytic dyad histidine/cysteine described for caspases and other metacaspases identified in plants and yeast. Metacaspases are also present in other protozoan parasites such as Trypanosoma and Plasmodium species and are not present in mammalian cells, which make them a possible drug target for the treatment of the parasitic diseases they cause. The Saccharomyces cerevisiae metacaspase YCA1 has been implicated in the death of aging cells, cells defective in some biological functions, and cells exposed to different environmental stresses. In this study, we evaluated the functional heterologous complementation of a S. cerevisiae ycal null mutant with the L. major metacaspase (LmjMCA} in cell death induced by oxidative stress. We show that LmjMCA is involved in yeast cell death, similar to YCA1, and that this function depends on its catalytic activity. LmjMCA was found to be auto-processed as occurs for caspases, however, LmjMCA did not exhibit any activity with caspase substrates. In contrast, LmjMCA was active towards substrates with arginine in the P1 position, with the activity being abolished following H147A and C202A catalytic site mutations and addition of the arginal inhibitor leupeptin. In order to identify the L. major proteins that may function as substrates, inhibitors, or may bind and recruit LmjMCA, a yeast two-hybrid screening with cDNA libraries from different life cycle stages of the parasite was conducted. Proteins putatively involved in PCD were identified as interacting with LmjMCA, however, the interaction of LmjMCA with proteins involved in other physiological processes such as vesicle transport, suggests that LmjMCA could have additional roles in the different life cycle stages of the parasite. Résumé: Plusieurs caractéristiques morphologiques et biochimiques rappelant la mort cellulaire programmée ont été identifiées dans les stades infectieux et sous des conditions de stress, chez le parasite protozoaire humain, Leishmania major. Dans les cellules de mammifères, les caspases sont les molécules effectrices principales impliquées dans la mort cellulaire programmée et l'apoptose. Bien qu'une activité caspase ait été retrouvée dans des parasites en mon` cellulaire, le génome de Leishmania ne contient aucun gène qui pourrait coder pour une caspase. À la place, on retrouve un gène unique codant pour une métacaspase. Une prédiction de la structure secondaire de la métacaspase montre que cette métacaspase a un domaine catalytique contenant la dyade histidine/cystéine présente dans les caspases et les autres métacaspases décrites chez les plantes et la levure. Les métacaspases sont aussi présentes dans d'autres parasites protozoaires tels que Trypanosome et Plasmodium, mais ne sont pas présentes dans les cellules de mammifères, ce qui en fait des cibles intéressantes pour le développement de drogue. Dans la levure, Saccharomyces cerevisiae, la métacaspase YCA1 est impliquée dans la mort des cellules âgées, la mort des cellules défectueuses dans certaines fonctions biologiques et dans les cellules exposées à différents stress environnementaux. Dans cette étude, une complémentation hétérologue fonctionnelle d'un mutant de la levure déficient en YCA1 par le gène LmjMCA de L. major lors de l'induction de ta mort par stress oxydatif a été évaluée. Nos résultats montrent que LmjMCA peut remplacer YGA1 dans le programme de mort cellulaire chez la levure et que celte fonction dépend de son activité catalytique. De plus, LmjMCA subit une auto clivage comme les caspases mais n'exhibe aucune spécificité pour les substrats des caspases. Au contraire, LmjMCA est active envers des substrats ayant une arginine en position P1, son activité étant détruite suite à des changements de son domaine catalytique par les mutations H147A et C202A ou suite à une inhibition para la leupeptine. Afin d'identifier quels pourraient être les substrats, les inhibiteurs ou les molécules interagissant avec LmjMCA, nous avons entrepris un criblage double-hybride en utilisant des librairies de d'ADNc provenant de différents stades du cycle parasitaire. Plusieurs protéines potentiellement impliquées dans un programme de mort cellulaire ont été identifiées comme interagissant avec LmjMCA. Cependant, l'identification de protéines impliquées dans le transport vésiculaire suggère aussi que LmjMCA pourrait avoir un rôle additionnel dans les différents stades du cycle parasitaire. Résumé destiné à un large public: De nos jours, la leishmaniose est la deuxième plus importante maladie parasitaire après la malaria. Malgré les avancées accomplies dans les stratégies de contrôle, près de deux millions de nouveaux cas apparaissent chaque année. Actuellement, la principale stratégie pour faire face à ce problème épidémiologique consiste en un traitement pharmacologique des personnes infectées. Pourtant, seule une dizaine de médicaments, dont la plupart sont toxiques, est disponible pour traiter la leishmaniose et des cas de résistance émergent dans certains pays endémiques. Il devient donc urgent de mettre au point de nouveaux traitements anti-leishmaniens capables d'éliminer le parasite sans effets indésirables sur le patient. Récemment, des caractéristiques morphologiques et biochimiques de la mort cellulaire programmée (MCP) semblables au processus de l'apoptose chez les mammifères ont été décrites dans Leishmania. Cependant, des gènes codant pour des protéines similaires à celles qui sont impliquées dans l'apoptose, comme les caspases, ne se retrouvent pas dans le génome de Leishmanía major. Néanmoins, les espèces de Leishmanía, aussi bien que d'autres parasites protozoaires responsables des trypanosomiases et de la malaria, possèdent des métacaspases qui sont des protéines homologues aux caspases mais qui ne sont pas présentes chez les mammifères. C'est pourquoi, la caractérisation de la métacaspase de Leishmania (LmjMCA) ainsi que ses mécanismes d'activation pourrait être une piste d'investigation intéressante dans l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans les voies de signalisation de la MCP des parasites protozoaires. Dans la levure, Saccharomyces cerevisiae, la métacaspase YCA1 est impliquée dans la mort des cellules âgées, la mort des cellules défectueuses dans certaines fonctions biologiques et dans les cellules exposées à différents stress environnementaux. Dans cette étude, une complémentation hétérologue fonctionnelle d'un mutant de la levure déficient en YCA1 par le gène LmjMCA de L major lors de l'induction de la mort par stress oxydatif a été évaluée. Nos résultats montrent que LmjMCA peut remplacer YCA1 dans le programme de mort cellulaire chez la levure et que cette fonction dépend de son activité catalytique. De plus, LmjMCA subit une auto clivage comme les caspases mais n'exhibe aucune spécificité pour les substrats des caspases. Au contraire, LmjMCA est active envers des substrats ayant une arginine en position P1, son activité étant détruite suite à des changements de son domaine catalytique par les mutations H147A et C202A ou suite à une inhibition para la leupeptine. Afin d'identifier quels pourraient être les substrats, les inhibiteurs ou les molécules interagissant avec LmjMCA, nous avons entrepris un criblage double-hybride en utilisant des librairies de d'ADNe provenant de différents stades du cycle parasitaire. Plusieurs protéines potentiellement impliquées dans un programme de mort cellulaire ont été identifiées comme interagissant avec LmjMCA. Cependant, l'identification de protéines impliquées dans le transport vésiculaire suggère aussi que LmjMCA pourrait avoir un rôle additionnel dans les différents stades du cycle parasitaire. Resumen destinado al público en general: La leishmaniasis es la segunda enfermedad parasitaria más importante en el mundo actual. Aproximadamente 2 millones de nuevos casos ocurren cada año a pesar de los avances logrados en el desarrollo de nuevos métodos de control. El tratamiento farmacológico de las personas infectadas es actualmente la principal estrategia de control, sin embargo, menos de una decena de medicamentos se encuentran disponibles en el mercado, la mayoría de ellos son tóxicos, y ya empiezan a encontrarse parásitos resistentes en algunos países endémicos para la leishmaniasis. El desarrollo de nuevos medicamentos capaces de eliminar los parásitos sin producir efectos indeseables en los humanos, es una necesidad inminente. Recientemente, algunas de las características morfológicas y bioquímicas de la muerte celular programada (MCP) similares al proceso de la apoptosis en mamíferos, han sido descritas en parasitos de Leishmania. Sin embargo, genes que codifiquen proteínas similares a aquellas involucradas en la apoptosis, como las caspasas, no se encuentran en el genoma de Leishmania major. AI contrario, las especies de Leishmania, así como de los otros parásitos responsables de la tripanosomiasis y de la malaria, poseen metacaspases, proteínas homologas a las caspases pero que no están presentes en las células de mamíferos. La caracterización de la metacaspasa de L. major y de sus mecanismos de activación constituye, por lo tanto, un área de investigación interesante para la identificación de nuevos blancos terapéuticos en el proceso de MCP de los parásitos protozoarios. En la levadura Saccharomyces cerevisiae, la metacaspasa YCA1 ha sido descrita como implicada en la muerte de células envejecidas, células defectuosas en algunas funciones biológicas, y en células expuestas a diferentes tipos de estrés ambiental. En el presente estudio se evaluó la complementación heteróloga funcional de una levadura mutante deficiente en YCA1 con el gen de metacaspase de L. major (LmjMCA) en la MCP inducida por estrés oxidativo. Nuestros resultados muestran que la LmjMCA puede reemplazarla YCA1 en la MCP de la levadura dependiente de su actividad catalítica y que la LmjMCA se auto-procesa similar a las caspasas. Sin embargo, LmjMCA no reconoce los substratos de caspasas sino substratos con una arginina en ta posición P1. Dicha actividad enzimática fue abolida con la inducción de las mutaciones puntuales H147A y C202A en la díada catalítica de LmjMCA y con la adición de leupeptina, un inhibidor con arginina. Con el fin de identificar proteínas que pudieran funcionar como substratos, inhibidores o moléculas modificadoras de LmjMCA, se aplicó el método de doble-híbrido en levadura con bibliotecas de ADNc provenientes de diferentes estadios del ciclo de vida del parásito. Algunas proteínas potencialmente implicadas. en la MCP del parásito fueron identiñcadas interactuando con LmjMCA. La identificación de otras proteínas involucradas en transporte vesicular sugiere que la LmjMCA podría tener una función biológica adicional en los diferentes estadios del ciclo de vida dei parásito.

Identification et caractérisation de gènes suppresseurs de tumeurs dans le glioblastome

Introduction: Glioblastoma (WHO Grade IV glioma) is the most frequent and most¦malignant primary tumor of the brain. With a mean survival of 15 months despite¦multidisciplinary management combining surgery, chemo- and radiotherapy, the prognosis¦is poor. Different studies measured a down-regulation of Wnt Inhibitory Factor 1 (WIF1)¦expression in a majority of gliobastoma due to genetic and epigenetic regulation. Recently,¦a focus on chromosome 12 identified WIF1 as a potential tumor suppressor gene. In¦previous results, transfected glioblastoma cells with ectopic expression of WIF1 had a¦decreased growth rate and adopted a senescence-like phenotype. In this report, we first¦investigated the effect of WIF1 re-expression in glioblastoma cell lines to see if Wnt¦inhibition by WIF1 can lead to senescence. To look further, we assessed p21 and c-Myc¦expression. p21 has a key role in senescence onset and is directly inhibited by c-Myc,¦itself a target of Wnt-pathway. We thus looked if a variation of expression of these genes is¦triggered by WIF1 activity. Finally, as autophagy is thought to play a role in senescence¦onset, we analyzed the expression of different autophagy genes. We therefore looked for¦an association between autophagy activity and senescent phenotype in WIF1-¦overexpressing cell lines.¦Methods: WIF1-overexpressing clones were selected after transfection of stable¦glioblastoma cell lines. Analysis were made through quantitative Polymerase Chain¦Reaction (qPCR), Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) and histochemistry.¦IGFBP7 and ALDH1A3 have been selected to reflect senescence. ATG5, ATG7 and ULK3¦have been selected to reflect autophagy activity.¦Results: Using FACS analysis, we found a higher percentage of large cells with increased¦granularity amongst WIF1-overexpressing cell lines, which are characteristics of¦senescence. In addition, histochemistry showed a higher percentage of multi-nucleated,¦beta-galactosidase positive cells in the same cell lines. An increased expression of genes¦associated with senescence was found as well. All characteristics were correlated with¦levels of WIF1 expression. We did not find any association between p21 and WIF1¦expression. No correlation between WIF1 and c-Myc expression was noticed either. In one¦of the two cell lines analyzed, the expression of autophagy genes showed some¦correlation with expression of WIF1 and expression of genes associated with senescence.¦Discussion: After investigations and characterizations on multiple levels, we have¦evidence for a senescence phenotype upon WIF1-overexpressing cell lines. This gives a¦role to Wnt pathway in the tumorigenicity of glioblastoma. Further experiments are¦required to investigate how Wnt inhibition leads to senescence. The role of autophagy in¦our senescent cells is here still unclear. Some correlations can be found, letting us think¦that there is indeed some involvement of autophagy. However, it is yet to soon to explain¦this relationship. Further experiments are required again to confirm the preliminary results¦and analyze the variations of autophagy activity within time.