336 resultados para hibridação somática


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En El Malestar en la Cultura, S. Freud afirma que el sufrimiento acecha al ser humano desde tres fuentes: los lazos con el prójimo, la relación con la naturaleza y el vínculo con el propio cuerpo. Si nos detenemos a pensar en este último punto, acaso el dolor se nos presente como la experiencia paradigmática que ilustra la relación con el propio cuerpo como fuente de malestar. El contexto de realización del presente trabajo involucra la participación de su autor en un equipo interdisciplinario perteneciente a un hospital público que atiende pacientes que padecen enfermedades orgánicas graves. Su objetivo es abordar la problemática del dolor, acontecimiento central en la vida cotidiana de dichos pacientes, como experiencia subjetiva. Esto supone poner en tensión la concepción biomédica tradicional del dolor (que lo reduce a una mera sensación derivada mecánicamente de una lesión orgánica) con desarrollos basados en disciplinas varias, que conceptualizan el dolor como percepción compleja anclada en variables subjetivas, culturales y sociales. A estos fines se discuten las concepciones biomédicas que abordan el dolor como mero epifenómeno de lo orgánico, acorde con la reducción del cuerpo a la dimensión de organismo biológico. Someramente, dichas concepciones tratan el dolor como un simple suceso bioquímico, basándose en los supuestos mecanicistas de la medicina tradicional moderna. Como contrapartida, se trabajan referencias bibliográficas provenientes de diversas disciplinas que cuestionan dicha concepción mecanicista, heredera de la partición cartesiana entre cuerpo y espíritu, considerando especialmente algunos aportes provenientes del psicoanálisis, que permiten pensar la articulación entre dolor, sujeto, cuerpo y demanda. El dolor y la angustia constituyen experiencias fundamentales de la existencia humana, que involucran al cuerpo de manera radical, y establecen relaciones complejas entre sí. Así, la referencia al dolor físico impresiona en algunos pacientes como una manera de darle una forma nombrable a su malestar. El dolor es sin duda algo que se percibe bajo modalidades de relación con el cuerpo que son propios de cada sujeto, de allí la preservación de una cierta marca de intimidad 'década quien con su dolor'; pero el propio dolor entra a la vez en un circuito de relaciones intersubjetivas, donde se plasman demandas dediversa índole. Se dirige al otro, al médico por caso, como un pedido de alivio. Pero los sujetos establecen con su dolor relaciones que no siempre resultan tan lineales, de allí que el dolor pueda cobrar valores disímiles, y jugar en las relaciones con los otros de modos variados. Desde 'aguantarse el dolor', hasta 'hacerse el que le duele' (el dolor como demanda al Otro, tal como atestigua con frecuencia la queja somática en los niños). Incluso que alguien llegue a 'querer (y pedir) que le duela un poco'. La situación de enfermedad grave y la experiencia de dolor colocan al sujeto en una posición de radical dependencia del otro, actualizando la estructura de la situación original bajo la que venimos al mundo. Se intenta demostrar que todo intento de abordaje interdisciplinario del dolor nos instala indefectiblemente en el terreno de la subjetividad, más allá de los impasses del organismo. '(...) que una patología esté ligada o no a una causalidad orgánica, es la cuestión del sujeto lo que está en juego para el psicoanálisis. Aún cuando una patología orgánica priva de ciertos medios, se trata de estar atentos a los que se manifiesta del lado del sujeto, la elección que puede operar el sujeto más allá de los impasses de su organismo' F. Ansermet, Medicina y psicoanálisis en interfase, (en revista Quarto, no 59. ECF (1996))

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En el presente trabajo se propone delimitar el hecho psicosomático en tanto fenómeno clínico, y mediante una explicación metapsicológica poder pensar su determinación, tanto como su abordaje terapéutico en el marco de la transferencia. Para ello se han escogido por un lado, algunos desarrollos teóricos de Kreisler, Fain y Soulé. Una segunda línea conceptual tenida en cuenta, comprende los aportes de Silvia Bleichmar, que en filiación teórica con Laplanche, posibilitan otra lectura de las manifestaciones psicosomáticas a partir del modo en que considera las relaciones entre psique y soma, como también las cualidades de la materialidad psíquica y sus enclaves dinámicos, tópicos y económicos.La explicación metapsicológica que ofrece Bleichmar constituye un aporte imprescindible para comprender la especificidad de estas manifestaciones y para implementar intervenciones clínicas adecuadas. Kreisler circunscribe el hecho psicosomático. Demuestra su existencia en el niño. Define como objeto de la clínica psicosomática a las enfermedades físicas en cuyo determinismo o evolución influyen factores psíquicos o conflictivos. Sustenta la concepción psicopatogénica de Fain elaboradas en colaboración con los psicosomatistas del Instituto Psicoanalítico de París, donde los trastornos somáticos son el resultado de situaciones conflictivas sin elaboración mental. Destaca la tendencia de ciertos psicoanalistas de asimilar los trastornos psicosomáticos a la neurosis, otorgándoles un sentido simbólico. Relaciona el stress con el trauma y a este con la falla de los mecanismos mentales de defensa. Desde la perspectiva teórica de Laplanche y Silvia Bleichmar, se sustenta el concepto de freudiano de pulsión, por considerarlo fundamental para situar las relaciones entre lo somático y lo psíquico. Silvia Bleichmar, destaca la importancia de rescatar lo pulsional como materialidad representacional, en sus nexos con la excitabilidad somática. Las relaciones entre lo psíquico y lo somático, parecen organizarse en tanto el ser biológico es condición de posibilidad para la materialidad psíquica, pero quepor si solo no garantiza la vida representacional. Entender las relaciones entre la materialidad biológica y la representacional de este modo, quiebra todo monismo y se inscribe en una concepción epistemológica de la discontinuidad entre dichas materialidades. De este modo los intercambios directos y simétricos entre psique y soma se hallan imposibilitados. Silvia Bleichmar caracteriza lo traumático como aquello que en el momento de su ingreso en el psiquismo, no encuentra modos de simbolización. Sostiene que el aparato psíquico se encuentra abierto a lo real, que se constituye a partir de inscripciones provenientes del exterior al sujeto, a partir de la decodificación de la lengua, y de inscripciones no lenguajeras. Las inscripciones no son todas del mismo orden, ni ingresan al psiquismo de la misma manera, ya que pueden hacerlo en momentos de diversas potencialidades simbólicas. Diferencia lo arcaico de originario, lo arcaico sehallaría inscripto pero no articulado a ninguno de los dos sistemas de la tópica inaugurada por la represión originaria. Se trataría de inscripciones que no están fijadas a ningún sistema psíquico, que conservan su carga energética puesto que la represión no ha operado sobre ellas. Diferencia entonces el síntoma neurótico en sentido estricto del trastorno. Este último correspondería a manifestaciones sintomáticas en sentido amplio relacionadas con una falla en la instalación de la represión originaria, serían manifestaciones psíquicas que no derivan de un conflicto intersistémico. Lo psicosomático se emplazaría en este orden de fenómenos, diferentes del síntoma neurótico. Los trastornos psicosomáticos carecerían de un sentido inconciente; responderían a una dificultad de mentalización del afecto, de darle curso a la angustia y a la trasmutación en descarga corporal. Bleichmar lo caracteriza como un exceso no significable. Considera que son el resultado de una incapacidad de simbolización limitada a ciertas problemáticas angustiosas y no una incapacidad general en la simbolización del sujeto. Respecto al modo de intervención clínica frente a materialidad psíquica del orden de lo arcaico, las simbolizaciones de transición son intervenciones capaces de capturar restos de lo real que insiste en formaciones sintomáticas en sentido amplio (trastornos), que promueven la apropiación representacional de aquello que no puede ser capturado por la libre asociación. Mediante este modo de intervención se ofrece una trama simbólica que posibilite articular las simbolizaciones faltantes. Postula un funcionamiento del psiquismo a dominancias estructurales y no como una homogeneidad. Será en función de la dominancia que esté operando, la elección de las intervenciones en el marco de la transferencia

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En El Malestar en la Cultura, S. Freud afirma que el sufrimiento acecha al ser humano desde tres fuentes: los lazos con el prójimo, la relación con la naturaleza y el vínculo con el propio cuerpo. Si nos detenemos a pensar en este último punto, acaso el dolor se nos presente como la experiencia paradigmática que ilustra la relación con el propio cuerpo como fuente de malestar. El contexto de realización del presente trabajo involucra la participación de su autor en un equipo interdisciplinario perteneciente a un hospital público que atiende pacientes que padecen enfermedades orgánicas graves. Su objetivo es abordar la problemática del dolor, acontecimiento central en la vida cotidiana de dichos pacientes, como experiencia subjetiva. Esto supone poner en tensión la concepción biomédica tradicional del dolor (que lo reduce a una mera sensación derivada mecánicamente de una lesión orgánica) con desarrollos basados en disciplinas varias, que conceptualizan el dolor como percepción compleja anclada en variables subjetivas, culturales y sociales. A estos fines se discuten las concepciones biomédicas que abordan el dolor como mero epifenómeno de lo orgánico, acorde con la reducción del cuerpo a la dimensión de organismo biológico. Someramente, dichas concepciones tratan el dolor como un simple suceso bioquímico, basándose en los supuestos mecanicistas de la medicina tradicional moderna. Como contrapartida, se trabajan referencias bibliográficas provenientes de diversas disciplinas que cuestionan dicha concepción mecanicista, heredera de la partición cartesiana entre cuerpo y espíritu, considerando especialmente algunos aportes provenientes del psicoanálisis, que permiten pensar la articulación entre dolor, sujeto, cuerpo y demanda. El dolor y la angustia constituyen experiencias fundamentales de la existencia humana, que involucran al cuerpo de manera radical, y establecen relaciones complejas entre sí. Así, la referencia al dolor físico impresiona en algunos pacientes como una manera de darle una forma nombrable a su malestar. El dolor es sin duda algo que se percibe bajo modalidades de relación con el cuerpo que son propios de cada sujeto, de allí la preservación de una cierta marca de intimidad 'década quien con su dolor'; pero el propio dolor entra a la vez en un circuito de relaciones intersubjetivas, donde se plasman demandas dediversa índole. Se dirige al otro, al médico por caso, como un pedido de alivio. Pero los sujetos establecen con su dolor relaciones que no siempre resultan tan lineales, de allí que el dolor pueda cobrar valores disímiles, y jugar en las relaciones con los otros de modos variados. Desde 'aguantarse el dolor', hasta 'hacerse el que le duele' (el dolor como demanda al Otro, tal como atestigua con frecuencia la queja somática en los niños). Incluso que alguien llegue a 'querer (y pedir) que le duela un poco'. La situación de enfermedad grave y la experiencia de dolor colocan al sujeto en una posición de radical dependencia del otro, actualizando la estructura de la situación original bajo la que venimos al mundo. Se intenta demostrar que todo intento de abordaje interdisciplinario del dolor nos instala indefectiblemente en el terreno de la subjetividad, más allá de los impasses del organismo. '(...) que una patología esté ligada o no a una causalidad orgánica, es la cuestión del sujeto lo que está en juego para el psicoanálisis. Aún cuando una patología orgánica priva de ciertos medios, se trata de estar atentos a los que se manifiesta del lado del sujeto, la elección que puede operar el sujeto más allá de los impasses de su organismo' F. Ansermet, Medicina y psicoanálisis en interfase, (en revista Quarto, no 59. ECF (1996))

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En El Malestar en la Cultura, S. Freud afirma que el sufrimiento acecha al ser humano desde tres fuentes: los lazos con el prójimo, la relación con la naturaleza y el vínculo con el propio cuerpo. Si nos detenemos a pensar en este último punto, acaso el dolor se nos presente como la experiencia paradigmática que ilustra la relación con el propio cuerpo como fuente de malestar. El contexto de realización del presente trabajo involucra la participación de su autor en un equipo interdisciplinario perteneciente a un hospital público que atiende pacientes que padecen enfermedades orgánicas graves. Su objetivo es abordar la problemática del dolor, acontecimiento central en la vida cotidiana de dichos pacientes, como experiencia subjetiva. Esto supone poner en tensión la concepción biomédica tradicional del dolor (que lo reduce a una mera sensación derivada mecánicamente de una lesión orgánica) con desarrollos basados en disciplinas varias, que conceptualizan el dolor como percepción compleja anclada en variables subjetivas, culturales y sociales. A estos fines se discuten las concepciones biomédicas que abordan el dolor como mero epifenómeno de lo orgánico, acorde con la reducción del cuerpo a la dimensión de organismo biológico. Someramente, dichas concepciones tratan el dolor como un simple suceso bioquímico, basándose en los supuestos mecanicistas de la medicina tradicional moderna. Como contrapartida, se trabajan referencias bibliográficas provenientes de diversas disciplinas que cuestionan dicha concepción mecanicista, heredera de la partición cartesiana entre cuerpo y espíritu, considerando especialmente algunos aportes provenientes del psicoanálisis, que permiten pensar la articulación entre dolor, sujeto, cuerpo y demanda. El dolor y la angustia constituyen experiencias fundamentales de la existencia humana, que involucran al cuerpo de manera radical, y establecen relaciones complejas entre sí. Así, la referencia al dolor físico impresiona en algunos pacientes como una manera de darle una forma nombrable a su malestar. El dolor es sin duda algo que se percibe bajo modalidades de relación con el cuerpo que son propios de cada sujeto, de allí la preservación de una cierta marca de intimidad 'década quien con su dolor'; pero el propio dolor entra a la vez en un circuito de relaciones intersubjetivas, donde se plasman demandas dediversa índole. Se dirige al otro, al médico por caso, como un pedido de alivio. Pero los sujetos establecen con su dolor relaciones que no siempre resultan tan lineales, de allí que el dolor pueda cobrar valores disímiles, y jugar en las relaciones con los otros de modos variados. Desde 'aguantarse el dolor', hasta 'hacerse el que le duele' (el dolor como demanda al Otro, tal como atestigua con frecuencia la queja somática en los niños). Incluso que alguien llegue a 'querer (y pedir) que le duela un poco'. La situación de enfermedad grave y la experiencia de dolor colocan al sujeto en una posición de radical dependencia del otro, actualizando la estructura de la situación original bajo la que venimos al mundo. Se intenta demostrar que todo intento de abordaje interdisciplinario del dolor nos instala indefectiblemente en el terreno de la subjetividad, más allá de los impasses del organismo. '(...) que una patología esté ligada o no a una causalidad orgánica, es la cuestión del sujeto lo que está en juego para el psicoanálisis. Aún cuando una patología orgánica priva de ciertos medios, se trata de estar atentos a los que se manifiesta del lado del sujeto, la elección que puede operar el sujeto más allá de los impasses de su organismo' F. Ansermet, Medicina y psicoanálisis en interfase, (en revista Quarto, no 59. ECF (1996))

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La mejora y conservación de recursos genéticos en especies forestales lleva siglos de retraso con respecto a las especies agrícolas. Los recursos forestales se han considerado tradicionalmente como recursos �mineros�, en los que primaba la mera extracción dejando exclusivamente a la regeneración natural la labor de sostenibilidad en los montes y dehesas o montados. Hoy en día, el necesario desarrollo del medio rural obliga a la explotación racional de los recursos como medio de garantizar su sostenibilidad. Por ello se está empezando a extender el criterio de que las especies forestales se pueden y deben �cultivar� en determinados espacios. Las características biológicas de las especies forestales las hacen, a menudo, recalcitrantes a las técnicas de mejora y conservación de recursos genéticos tradicionalmente aplicadas a especies agrícolas. En particular, la propagación vegetativa se ha utilizado ampliamente en muchos cultivos leñosos como una herramienta muy poderosa para capturar todo el potencial genético de combinaciones genéticas valiosas. En especies forestales, en particular en las mediterráneas, esta posibilidad raramente se ha podido aplicar debido a la baja capacidad morfogénica de estas especies y la fuerte influencia de la maduración o cambio de fase. En los últimos años la biotecnología forestal ha tenido un desarrollo espectacular. En particular las técnicas de regeneración clonal de plantas basadas en técnicas de cultivo in vitro, fundamentalmente vía embriogénesis somática, se están ya aplicando por muchas empresas privadas e instituciones públicas a nivel semi-operativo con diversas especies, para la conservación de material selecto y el establecimiento de ensayos clonales. Nuestros grupos de trabajo están desarrollando protocolos de regeneración por embriogénesis somática en distintas especies forestales. En esta comunicación se presenta el estado actual de los conocimientos en dos especies típicamente mediterráneas, el alcornoque (Quercus suber L.) y el pino piñonero (Pinus pinea L.), destacando los principales cuellos de botella para su aplicación a gran escala.

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En el marco del proyecto SEFEAL-2, liderado por TRAGSA, se aplican protocolos de embriogénesis somática (ES) para desarrollar variedades de alcornoque de alta calidad y productividad. Al mismo tiempo se mejora la técnica de ES para abaratar los costes y permitir su aplicación a escala comercial. En el alcornoque, como en otras especies, el desarrollo comercial de la embriogénesis como técnica de multiplicación masiva se basa en el uso de biorreactores y medios líquidos agitados. El diseño del biorreactor, su sistema de cierre y el nivel de agitación determinan el grado de mezclado, el estrés hidrodinámico y el intercambio gaseoso, y por ello afectan tanto al crecimiento como al desarrollo de los cultivos embriogénicos. Mediante un ensayo factorial se testaron 3 tipos de envase y tres niveles de agitación. Los efectos sobre el intercambio gaseoso se estimaron a través de la tasa de transferencia de O2 (OTR) y su coeficiente volumétrico de transferencia de masa (KLa), y los efectos sobre el nivel de mezclado mediante el “shear force index” (SFI), un indicador de estrés hidrodinámico. El tipo de envase afectó básicamente al número total de agregados embriogénicos y a la frecuencia de formación de los agregados de mayor tamaño. El nivel de agitación tuvo mayores efectos que el tipo de envase tanto sobre el número como sobre el tamaño de los agregados. Para las condiciones ensayadas, que dieron lugar a valores de KLa comprendidos entre 0,11 h-1 y 1,47 h-1, la disponibilidad de oxígeno no pareció limitante. En cualquier caso, los efectos del tipo de envase y del nivel de agitación sobre los procesos de crecimiento y desarrollo de los materiales embriogénicos de alcornoque fueron complejos resultando muy significativa la interacción tipo de envase por nivel de agitación.

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Los receptores constituyen la puerta por donde el ser humano recibe información de su propio organismo y de su mundo exterior. Son los «sentidos», toda una teoría de órganos que producen en el sujeto las sensaciones de color, de sonido, de sabor, de tacto, pero también de dolor, de placer, de nivel de equilibrio o de movimiento, y que perciben constantemente e informan al sistema nervioso de cualquier alteración somática.

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La encina (Quercus ilex L.) es una de las especies forestales mediterráneas más importantes. Constituye gran parte del estrato arbóreo de dehesas o montados, produce bellota como alimento del ganado y establece simbiosis con hongos micorrizógenos de gran valor económico. La encina está considerada como una especie recalcitrante en términos de conservación de semillas y capacidad morfogénica, lo que dificulta los programas de conservación de recursos genéticos y la mejora de la especie. La propagación vegetativa es una potente herramienta de los programas de mejora, por lo que es preciso desarrollar protocolos de regeneración somática en encina. La embriogénesis somática está considerada como la modalidad más adecuada de regeneración basada en técnicas de cultivo de tejidos vegetales utilizada en biotecnología forestal. Este trabajo se centra en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática para la regeneración clonal de encinas adultas. La memoria de esta tesis se ha dividido en capítulos que se corresponden con diferentes aspectos del sistema embriogénico. La embriogénesis somática se indujo en tegumentos maternos de óvulos en desarrollo procedentes de bellotas inmaduras de encinas adultas. A pesar de las bajas frecuencias de inducción, las líneas embriogénicas generadas se amplificaron mediante embriogénesis secundaria observándose cierta pérdida de la capacidad de diferenciación con el tiempo. Tanto el genotipo como la formulación del medio de cultivo influyeron en la respuesta embriogénica, concluyendo que la formulación de macronutrientes de Schenk y Hildebrant del medio sin reguladores de crecimiento fue la combinación más efectiva en la inducción. Los resultados sugirieron la existencia de una ventana en el desarrollo del óvulo más sensible a la inducción. El genotipo in[luyó en la capacidad proliferativa de los cultivos y en la conversión de los embriones somáticos, que se incrementó suplementando el medio con ácido indol-3-butírico y 6-benciladenina. El cultivo en medio líquido de líneas embriogénicas en condiciones de inmersión transitoria incrementó el crecimiento, dependiendo del genotipo, con respecto al cultivo en medio semisólido. Sin embargo, no mejoró la capacidad de diferenciar embriones cotiledonares aislados. Se estableció un protocolo de inicio y mantenimiento de cultivos en suspensión para varias líneas embriogénicas mediante inoculación en alta densidad de agregados embrionarios procedentes del medio semisólido. Para evitar la pérdida de vigor y la capacidad morfogénica debida al cultivo prolongado se desarrolló un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas mediante vitrificación. Al determinar la influencia de los agentes crioprotectores antes y después de su inmersión en nitrógeno líquido se concluyó que las respuestas de capacidad de crecimiento y de diferenciación del material embriogénico son independientes, además de estar bajo influencia del genotipo y el tipo de material crioconservado. La combinación de sacarosa y PVS2 previa a la inmersión en nitrógeno líquido proporcionó la mayor tasa de recuperación. Cuando las líneas fueron crioconservadas 30 días la capacidad de diferenciación se perdió en todas ellas. El análisis de SSR detectó variación somaclonal en el material crioconservado a corto plazo. SSR y RAPD mostraron importantes diferencias genéticas entre los árboles donantes y el material embriogénico que dependieron del genotipo. El grado de detección dependió del marcador empleado. Ambos marcadores revelaron baja inestabilidad intraclonal. Los RAPD revelaron variación genética intra-individuo en las encinas donantes. Se discuten la variación genética pre-existente en encina, su aparición durante las primeras fases de la inducción de embriogénesis, y la presencia de tejidos provenientes de la fertilización en el explanto materno. Esto hace preciso definir la identidad genética del material donante y acometer ensayos de detección precoz de variación somaclonal. ABSTRACT Holm oak (Quercus ilex L.) is one of the most important Mediterranean forest species. It conforms the tree layer of dehesas or montados, it produces acorns to feed the livestock and it establishes symbiosis with profitable mycorrhizal fungi. Holm oak is considered as recalcitrant species in terms of seed conservation and morphogenic capacities, which complicates the development of genetic conservation and improvement programs. Vegetative propagation is one of the mightiest tools for breeding programs therefore; developing protocols for clonal regeneration of holm oak is essential. Somatic embryogenesis is considered the best tissue culture-based way of plant regeneration in forest biotechnology. The present study is focused on the study of certain aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of mature holm oak. This thesis manuscript is divided into several chapters that match with different aspects of the embryogenic system. Somatic embryogenesis induction was achieved on maternal teguments of developing ovules from immature acorns of adult holm oak trees. Despite the low induction frequencies, the generated embryogenic lines were amplified by secondary embryogenesis. A decline in the differentiation capacity over time was also observed. It was concluded that both genotype and culture media formulation influenced the embryogenic response, being the Schenk and Hildebrandt´s macronutrients formulation from culture medium and the lack of plant growth regulators the most effective combination for the induction of the embryogenic response. It has been suggested the existence of a developmental window in which ovules are prone to induction. Genotype influenced the proliferation capacity and the plant conversion of somatic embryos, which was also favoured by the presence of indol-3-butyric acid and 6-bencyladenine. The use of temporary immersion systems as proliferation in liquid culture of the embryogenic lines increased the growth depending on genotype, when compared to semisolid cultures. However, it did not improve the differentiation of single cotyledonary embryos. A protocol for the initiation and maintenance of embryogenic suspension cultures was established for several embryogenic lines with highly dense inoculi of embryogenic clusters from proliferating semisolid cultures. In order to avoid the loss of vigour and morphogenic ability of embryogenic lines due to prolonged cultures, a cryopreservation protocol for embryogenic lines of holm oak has been developed. During the determination of the influence of cryoprotective agents on the growth and differentiation capacities before and after liquid nitrogen immersion, it was concluded that both responses were independent from each other and also under the influence of genotype and the type of cryopreserved material. The combination of sucrose and PVS2 prior liquid nitrogen immersion provided higher recovery rates. When the same embryogenic lines were cryopreserved for 30 days, none was able to differentiate. The SSRs analysis of the short-term cryopreserved material detected somaclonal variation. Both SSR and RAPD markers showed high sensitivity to detect genetic differences between the donor trees and the generated embryogenic material. Nevertheless, the degree of instability detection depended on the marker. The SSR analysis indicated a relationship between genotype, the studied loci and the located polymorphisms. Also, both markers revealed low intraclonal genetic variation. The RAPD detected genetic variation within the donor trees. The presence of pre-existent genetic variation within mature trees, in addition to its occurrence during the early stages of the embryogenic induction, and the presence of tissues of fertilisation origin within the maternal explants are all discussed. Nonetheless, the determination of the genetic identity of donor material is required, in addition to early detection methods of somaclonal variation.

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La encina (Quercus ilex L.) es una de las especies forestales mediterráneas más importantes. Constituye gran parte del estrato arbóreo de dehesas o montados, produce bellota como alimento del ganado y establece simbiosis con hongos micorrizógenos de gran valor económico. La encina está considerada como una especie recalcitrante en términos de conservación de semillas y capacidad morfogénica, lo que dificulta los programas de conservación de recursos genéticos y la mejora de la especie. La propagación vegetativa es una potente herramienta de los programas de mejora, por lo que es preciso desarrollar protocolos de regeneración somática en encina. La embriogénesis somática está considerada como la modalidad más adecuada de regeneración basada en técnicas de cultivo de tejidos vegetales utilizada en biotecnología forestal. Este trabajo se centra en el estudio de determinados aspectos de la embriogénesis somática para la regeneración clonal de encinas adultas. La memoria de esta tesis se ha dividido en capítulos que se corresponden con diferentes aspectos del sistema embriogénico. La embriogénesis somática se indujo en tegumentos maternos de óvulos en desarrollo procedentes de bellotas inmaduras de encinas adultas. A pesar de las bajas frecuencias de inducción, las líneas embriogénicas generadas se amplificaron mediante embriogénesis secundaria observándose cierta pérdida de la capacidad de diferenciación con el tiempo. Tanto el genotipo como la formulación del medio de cultivo influyeron en la respuesta embriogénica, concluyendo que la formulación de macronutrientes de Schenk y Hildebrant del medio sin reguladores de crecimiento fue la combinación más efectiva en la inducción. Los resultados sugirieron la existencia de una ventana en el desarrollo del óvulo más sensible a la inducción. El genotipo in[luyó en la capacidad proliferativa de los cultivos y en la conversión de los embriones somáticos, que se incrementó suplementando el medio con ácido indol-3-butírico y 6-benciladenina. El cultivo en medio líquido de líneas embriogénicas en condiciones de inmersión transitoria incrementó el crecimiento, dependiendo del genotipo, con respecto al cultivo en medio semisólido. Sin embargo, no mejoró la capacidad de diferenciar embriones cotiledonares aislados. Se estableció un protocolo de inicio y mantenimiento de cultivos en suspensión para varias líneas embriogénicas mediante inoculación en alta densidad de agregados embrionarios procedentes del medio semisólido. Para evitar la pérdida de vigor y la capacidad morfogénica debida al cultivo prolongado se desarrolló un protocolo de crioconservación de líneas embriogénicas mediante vitrificación. Al determinar la influencia de los agentes crioprotectores antes y después de su inmersión en nitrógeno líquido se concluyó que las respuestas de capacidad de crecimiento y de diferenciación del material embriogénico son independientes, además de estar bajo influencia del genotipo y el tipo de material crioconservado. La combinación de sacarosa y PVS2 previa a la inmersión en nitrógeno líquido proporcionó la mayor tasa de recuperación. Cuando las líneas fueron crioconservadas 30 días la capacidad de diferenciación se perdió en todas ellas. El análisis de SSR detectó variación somaclonal en el material crioconservado a corto plazo. SSR y RAPD mostraron importantes diferencias genéticas entre los árboles donantes y el material embriogénico que dependieron del genotipo. El grado de detección dependió del marcador empleado. Ambos marcadores revelaron baja inestabilidad intraclonal. Los RAPD revelaron variación genética intra-individuo en las encinas donantes. Se discuten la variación genética pre-existente en encina, su aparición durante las primeras fases de la inducción de embriogénesis, y la presencia de tejidos provenientes de la fertilización en el explanto materno. Esto hace preciso definir la identidad genética del material donante y acometer ensayos de detección precoz de variación somaclonal. ABSTRACT Holm oak (Quercus ilex L.) is one of the most important Mediterranean forest species. It conforms the tree layer of dehesas or montados, it produces acorns to feed the livestock and it establishes symbiosis with profitable mycorrhizal fungi. Holm oak is considered as recalcitrant species in terms of seed conservation and morphogenic capacities, which complicates the development of genetic conservation and improvement programs. Vegetative propagation is one of the mightiest tools for breeding programs therefore; developing protocols for clonal regeneration of holm oak is essential. Somatic embryogenesis is considered the best tissue culture-based way of plant regeneration in forest biotechnology. The present study is focused on the study of certain aspects of somatic embryogenesis for clonal regeneration of mature holm oak. This thesis manuscript is divided into several chapters that match with different aspects of the embryogenic system. Somatic embryogenesis induction was achieved on maternal teguments of developing ovules from immature acorns of adult holm oak trees. Despite the low induction frequencies, the generated embryogenic lines were amplified by secondary embryogenesis. A decline in the differentiation capacity over time was also observed. It was concluded that both genotype and culture media formulation influenced the embryogenic response, being the Schenk and Hildebrandt´s macronutrients formulation from culture medium and the lack of plant growth regulators the most effective combination for the induction of the embryogenic response. It has been suggested the existence of a developmental window in which ovules are prone to induction. Genotype influenced the proliferation capacity and the plant conversion of somatic embryos, which was also favoured by the presence of indol-3-butyric acid and 6-bencyladenine. The use of temporary immersion systems as proliferation in liquid culture of the embryogenic lines increased the growth depending on genotype, when compared to semisolid cultures. However, it did not improve the differentiation of single cotyledonary embryos. A protocol for the initiation and maintenance of embryogenic suspension cultures was established for several embryogenic lines with highly dense inoculi of embryogenic clusters from proliferating semisolid cultures. In order to avoid the loss of vigour and morphogenic ability of embryogenic lines due to prolonged cultures, a cryopreservation protocol for embryogenic lines of holm oak has been developed. During the determination of the influence of cryoprotective agents on the growth and differentiation capacities before and after liquid nitrogen immersion, it was concluded that both responses were independent from each other and also under the influence of genotype and the type of cryopreserved material. The combination of sucrose and PVS2 prior liquid nitrogen immersion provided higher recovery rates. When the same embryogenic lines were cryopreserved for 30 days, none was able to differentiate. The SSRs analysis of the short-term cryopreserved material detected somaclonal variation. Both SSR and RAPD markers showed high sensitivity to detect genetic differences between the donor trees and the generated embryogenic material. Nevertheless, the degree of instability detection depended on the marker. The SSR analysis indicated a relationship between genotype, the studied loci and the located polymorphisms. Also, both markers revealed low intraclonal genetic variation. The RAPD detected genetic variation within the donor trees. The presence of pre-existent genetic variation within mature trees, in addition to its occurrence during the early stages of the embryogenic induction, and the presence of tissues of fertilisation origin within the maternal explants are all discussed. Nonetheless, the determination of the genetic identity of donor material is required, in addition to early detection methods of somaclonal variation.

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Este estudo teve como objetivos (a) identificar mecanismos pelos quais rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados possam estar associados de maneira causal a determinados quadros clínicos e (b) contribuir para a compreensão dos mecanismos de formação desses rearranjos. Para isso, foram estudados 45 rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados (29 translocações, 10 inversões e seis rearranjos complexos), detectados em pacientes que apresentavam malformações congênitas, comprometimento do desenvolvimento neuropsicomotor ou déficit intelectual. Foram 31 rearranjos cromossômicos esporádicos, três familiais que segregavam com o quadro clínico e mais 11 rearranjos cromossômicos herdados de genitores fenotipicamente normais. Inicialmente os pontos de quebra desses rearranjos foram mapeados por hibridação in situ fluorescente (FISH). A busca por microdeleções e duplicações genômicas foi realizada por a-CGH. A investigação dos pontos de quebra prosseguiu com a aplicação da técnica de Mate-Pair Sequencing (MPS), que permite localizar as quebras em segmentos de 100 pb - 1 kb, na maioria dos casos. Para obter os segmentos de junção das quebras no nível de pares de bases, os segmentos delimitados por MPS foram sequenciados pelo método de Sanger. A análise por aCGH revelou microdeleções ou microduplicações localizadas nos cromossomos rearranjados, em 12 dos 45 pacientes investigados (27%). A análise de 27 rearranjos por MPS permitiu a caracterização dos pontos de junção das quebras. MPS expandiu o número de pontos de quebra, detectados por análise do cariótipo ou aCGH, de 114 para 156 (em resolução < 2kb, na maioria dos casos). O número de pontos de quebra/rearranjo variou de 2 a 20. Os 156 pontos de quebra resultaram em 86 variantes estruturais equilibradas e outras 32 variantes não equilibradas. Perdas e ganhos de segmentos submiscroscópicos nos cromossomos rearranjados constituíram a principal causa ou, provavelmente, contribuíram para o quadro clínico de 12 dos 45 pacientes. Em cinco desses 12 rearranjos foram detectadas por MPS a interrupção de genes já relacionados à doença, ou provável alteração de sua região reguladora, contribundo para o quadro clínico. Em quatro dos 33 rearranjos não associados a perdas ou ganhos de segmentos, a análise por MPS revelou a interrupção de genes que já foram anteriormente relacionados a doenças, explicando-se, assim, as características clínicas dos portadores; outro rearranjo pode ter levando alteração da expressão gênica de gene sensível a dosagem e ao quadro clínico. Um rearranjo cromossômico familial, identificado na análise após bandamento G como uma translocação equilibrada, t(2;22)(p14;q12), segregava com quadro de atraso do desenvolvimento neuropsicomotor e dificuldade de aprendizado associados a dismorfismos. A combinação das análises por FISH, aCGH e MPS revelou que se tratava, na verdade, de rearranjo complexo entre os cromossomos 2, 5 e 22, incluindo 10 quebras. A segregação de diferentes desequilíbrios submicroscópicos em indivíduos afetados e clinicamente normais permitiu a compreensão da variabilidade clínica observada na família. Rearranjos equilibrados detectados em indivíduos afetados, mas herdados de genitores clinicamente normais, são, em geral, considerados como não tendo relação com o quadro clínico, apesar da possibilidade de desequilíbrios cromossômicos gerados por permuta desigual na meiose do genitor portador do rearranjo. Neste trabalho, a investigação de 11 desses rearranjos por aCGH não revelou perdas ou ganhos de segmentos nos cromossomos rearranjados. No entanto, a análise por aCGH da portadora de um desses rearranjos - inv(12)mat - revelou deleção de 8,7 Mb no cromossomo 8, como causa de seu fenótipo clínico. Essa deleção estava relacionada com outro rearranjo equilibrado também presente em sua mãe, independente da inversão. Para compreender os mecanismos de formação de rearranjos citogeneticamente equilibrados, investigamos os segmentos de junção no nível de pares de base. A análise por MPS que levou, na maioria dos casos, ao mapeamento dos pontos de quebras em segmentos <1kb permitiu o sequenciamento pelo método de Sanger de 51 segmentos de junções de 17 rearranjos. A ocorrência de blunt fusions ou inserções e deleções <10 pb, e a ausência de homologia ou a presença de micro homologia de 2 pb a 4 pb de extensão indicaram o mecanismo de junção de extremidades não homólogas (non-homologous end joinging; NHEJ), na maioria das 51 junções caracterizadas. As características de três dos quatro rearranjos mais complexos, com 17-20 quebras, indicaram sua formação pelo mecanismo de chromothripsis. Este estudo mostra a importância da análise genômica de variações de número de cópias por microarray, juntamente com o mapeamento dos pontos de quebra por MPS, para determinar a estrutura de rearranjos cromossômicos citogeneticamente equilibrados e seu impacto clínico. O mapeamento dos segmentos de junção por MPS, permitindo o sequenciamento pelo método de Sanger, foi essencial para a compreensão de mecanismos de formação desses rearranjos

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Tese de mestrado integrado em Engenharia Biomédica e Biofísica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2016

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Tese de mestrado, Nutrição Clínica, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2016

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CONTEXTO: A nossa investigação estuda o stress no trabalho e a sua relação com a saúde mental. Descrevemos fatores específicos e de risco psicossocial no trabalho, particularmente no trabalho dos enfermeiros, e as suas implicações para a saúde mental e para o bem-estar biopsicossocial, tais como: Tipo de trabalho; Conteúdo do trabalho; Desempenho de papel; Relações interpessoais e grupais; Desenvolvimento da carreira; Novas tecnologias e Aspetos organizacionais. OBJETIVO(S): O objetivo fundamental foi estudar a influência de algumas variáveis pessoais e situacionais de risco biopsicossocial na saúde mental e no bem-estar dos profissionais de saúde, em contexto hospitalar METODOLOGIA: Trata-se de um estudo quantitativo, transversal e descritivo, do tipo correlacional. A recolha de informação obedeceu a um protocolo constituído por dados pessoais e as escalas: Satisfação geral do trabalho, Questionário geral de saúde, Questionário de saúde, Escala de fadiga crónica, Escala de ansiedade cognitiva-somática, Inventário de personalidade de Eysenck, Inventário clínico de autoconceito, Inventário de resolução de problemas, Questionário de vulnerabilidade ao stress e Questionário de stress ao trabalho. A amostra foi não probabilística intencional, constituída por 570 enfermeiros, a laborarem por turnos e em regime normal, no contexto hospitalar, perfazendo, no final, 360 enfermeiros. RESULTADOS: Os principais resultados apontam o seguinte: Os enfermeiros manifestam algum descontentamento com o ambiente de trabalho; A globalidade da amostra demonstra índices de saúde baixos; Regra geral, todos os enfermeiros estão vulneráveis ao stress; Em relação ao stress produzido pelas circunstâncias organizacionais, a totalidade da amostra revela elevados índices de stress e o seu bem-estar biopsicossocial, manifestamente afetado. CONCLUSÕES: Destes resultados fomos levados a concluir que quanto maior for a fadiga crónica, o neuroticíssimo e a ansiedade cognitiva, maior será a tendência dos enfermeiros para diminuírem a autorresponsabilização e o medo. Esta relação pode tornar-se circular e levar a comportamentos desajustados como, por exemplo, indiferença, desinteresse, relações interpessoais conflituosas, entre outros aspetos. As consequências de tais comportamentos poderão traduzir-se em absentismo, erros de desempenho ou vontade de abandonar a instituição.