Caractérisation d’un nouveau récepteur à octopamine exprimé chez la palourde Spisula solidissima

À partir des ovocytes de la palourde Spisula solidissima, un ADNc codant un récepteur nommé Spi-OAR a été cloné et séquencé. Une analyse de la séquence en acides aminés a indiqué que ce nouveau récepteur possède une forte similarité avec les récepteurs β-adrénergiques et les récepteurs à octopamine. En effet, il est étroitement lié à la classe des récepteurs à octopamine « β-adrénergique-like » couplés à une protéine Gs. L’ADNc de Spi-OAR a été introduit dans un vecteur d'expression (pCEP4) et un épitope reconnaissable par un anticorps commercial a été ajouté au segment N-terminal. Cette construction a été transfectée dans des cellules hôtes (HEK 293) et des études d’immunofluorescence ont montré une expression efficace du récepteur au niveau membranaire. Également, des mesures d'AMPc pour les cellules exprimant Spi-OAR ont révélé une augmentation de ce messager secondaire lors de l'ajout de l'octopamine, et dans une moindre mesure, la tyramine, tandis que la dopamine, la sérotonine et l'histamine n’ont engendré aucun effet. Une légère activité constitutive de ce récepteur dans les cellules hôtes a été observée. De plus, une analyse RT-PCR avec des oligonucléotides spécifiques a révélé l'ARNm de Spi-OAR non seulement dans les ovocytes, mais aussi dans les gonades, le cœur, les muscles adducteurs, les branchies et les ganglions suggérant que ce récepteur soit exprimé de façon ubiquitaire dans divers tissus et dans différents stades embryonnaires chez la palourde. En outre, des études avec des ovocytes isolés n'ont montré aucun effet de l’octopamine sur la réactivation méiotique. Des études éventuelles pourront finalement confirmer le rôle fonctionnel de Spi-OAR.

In silico analysis of mitochondrial proteins

Le rôle important joué par la mitochondrie dans la cellule eucaryote est admis depuis longtemps. Cependant, la composition exacte des mitochondries, ainsi que les processus biologiques qui sy déroulent restent encore largement inconnus. Deux facteurs principaux permettent dexpliquer pourquoi létude des mitochondries progresse si lentement : le manque defficacité des méthodes didentification des protéines mitochondriales et le manque de précision dans lannotation de ces protéines. En conséquence, nous avons développé un nouvel outil informatique, YimLoc, qui permet de prédire avec succès les protéines mitochondriales à partir des séquences génomiques. Cet outil intègre plusieurs indicateurs existants, et sa performance est supérieure à celle des indicateurs considérés individuellement. Nous avons analysé environ 60 génomes fongiques avec YimLoc afin de lever la controverse concernant la localisation de la bêta-oxydation dans ces organismes. Contrairement à ce qui était généralement admis, nos résultats montrent que la plupart des groupes de Fungi possèdent une bêta-oxydation mitochondriale. Ce travail met également en évidence la diversité des processus de bêta-oxydation chez les champignons, en corrélation avec leur utilisation des acides gras comme source dénergie et de carbone. De plus, nous avons étudié le composant clef de la voie de bêta-oxydation mitochondriale, lacyl-CoA déshydrogénase (ACAD), dans 250 espèces, couvrant les 3 domaines de la vie, en combinant la prédiction de la localisation subcellulaire avec la classification en sous-familles et linférence phylogénétique. Notre étude suggère que les gènes ACAD font partie dune ancienne famille qui a adopté des stratégies évolutionnaires innovatrices afin de générer un large ensemble denzymes susceptibles dutiliser la plupart des acides gras et des acides aminés. Finalement, afin de permettre la prédiction de protéines mitochondriales à partir de données autres que les séquences génomiques, nous avons développé le logiciel TESTLoc qui utilise comme données des Expressed Sequence Tags (ESTs). La performance de TESTLoc est significativement supérieure à celle de tout autre outil de prédiction connu. En plus de fournir deux nouveaux outils de prédiction de la localisation subcellulaire utilisant différents types de données, nos travaux démontrent comment lassociation de la prédiction de la localisation subcellulaire à dautres méthodes danalyse in silico permet daméliorer la connaissance des protéines mitochondriales. De plus, ces travaux proposent des hypothèses claires et faciles à vérifier par des expériences, ce qui présente un grand potentiel pour faire progresser nos connaissances des métabolismes mitochondriaux.

N-acétyltransférase lysosomale : organisation, fonctionnement et défauts moléculaires chez les patients atteints du syndrome de Sanfilippo type C

L’acétylation des résidus de glucosamine terminaux par la N-acétyltransférase lysosomale (HGSNAT) est une étape essentielle de la dégradation catabolique de l’héparan sulfate. Des défauts dans cette réaction causent une maladie de surcharge lysosomale autosomale récessive rare : le désordre de Sanfilippo type C (SFC). À ce jour, 54 mutations ont été rapportées chez des patients SFC, incluant 13 mutations des sites d’épissage, 11 insertions et délétions, 8 mutations non-sens, 18 mutations faux-sens et 4 polymorphismes, avec différentes manifestations phénotypiques. Nous avons identifié 10 d’entre elles et effectué une étude exhaustive portant sur l’éventail des mutations SFC, leur distribution dans la population de patients, ainsi que leur impact potentiel sur la structure de la HGSNAT. Les erreurs d’épissage, les mutations non-sens, les insertions et les délétions devraient toutes entraîner un ARN non fonctionnel qui est rapidement dégradé par des mécanismes de contrôle qualité cellulaire. Les 4 polymorphismes identifiés sont des changements d'acides aminés qui ne modifient pas l'activité enzymatique, la glycosylation ou la localisation et n'ont donc pas de signification au niveau clinique. Au niveau des enzymes, les polymorphismes sont des changements d’acides aminés qui n’affectent pas la fonction, mais dans un contexte d’acides nucléiques ils peuvent être considérés comme des mutations faux-sens. Les dix-huit mutations faux-sens qui ont été exprimées ont produit des protéines inactives, en raison d'erreurs dans leur repliement. Ceci expliquerait donc la progression sévère de la maladie chez les personnes porteuses de ces mutations. Les protéines mutantes mal repliées sont anormalement glycosylées et conservées dans le réticulum endoplasmique. La thérapie par amélioration de l’activité enzymatique par des chaperonnes est une option thérapeutique potentielle, spécifiquement conçue pour exploiter l'activité enzymatique résiduelle de mutants mal repliés, afin d’éliminer les substrats stockés. Nous avons démontré que le traitement de plusieurs lignées de fibroblastes de patients SFC avec le chlorhydrate de glucosamine, un inhibiteur spécifique de la HGSNAT, a partiellement restauré l’activité de l'enzyme mutante, fournissant une preuve de l’utilité future de la thérapie par des chaperonnes dans le traitement de la maladie de SFC.

Évaluation gastro-intestinale chez des chiens présentant un comportement de léchage excessif de surface

L’objectif de cette étude était de démontrer que le léchage excessif de surface (LES) chez le chien représente un signe clinique d’un trouble digestif sous-jacent plutôt qu’un trouble obsessionnel compulsif. Vingt chiens présentés pour LES (groupe L) ont été divisés en 2 sous-groupes de 10 chiens chacun : L0, sans, et LD, avec des signes cliniques digestifs concomitants. Dix chiens en santé ont été assignés à un groupe contrôle (groupe C). Une évaluation comportementale complète, un examen physique et neurologique ont été réalisés avant un bilan diagnostic gastro-intestinal (GI) complet (hématologie, biochimie, analyse urinaire, mesure des acides biliaires pré et post-prandiaux et de l’immunoréactivité spécifique de la lipase pancréatique canine, flottaison fécale au sulfate de zinc, culture de selles, échographie abdominale et endoscopie GI haute avec prise de biopsies). En fonction des résultats, un interniste recommandait un traitement approprié. Les chiens étaient suivis pendant 90 jours durant lesquels le comportement de léchage était enregistré. Des troubles GI ont été identifiés chez 14/20 chiens du groupe L. Ces troubles GI sous-jacents incluaient une infiltration éosinophilique du tractus GI, une infiltration lymphoplasmocytaire du tractus GI, un retard de vidange gastrique, un syndrome du côlon irritable, une pancréatite chronique, un corps étranger gastrique et une giardiose. Une amélioration >50% en fréquence ou en durée par rapport au comportement de léchage initial a été observée chez une majorité de chiens (56%). La moitié des chiens ont complètement cessé le LES. En dehors du LES, il n’y avait pas de différence significative de comportement (p.ex. anxiété), entre les chiens L et les chiens C. Les troubles GI doivent être considérés dans le diagnostic différentiel du LES chez le chien.

Impacts de la fertilisation phosphatée sur la biodiversité microbienne de sols agricoles

La fertilisation phosphatée est très répandue dans les pratiques agricoles Nord-Américaines. Bien que généralement très efficace pour augmenter la production végétale, son utilisation peut engendrer certaines contaminations environnementales. Afin de diminuer ce problème, plusieurs pratiques de gestion sont envisagées. Parmi celles-ci, on retrouve l’intéressante possibilité de manipuler la flore microbienne car cette dernière est reconnue pour son implication dans bons nombres de processus fondamentaux liés à la fertilité du sol. Cette étude a démontré que lors d’essais en champs, la forme de fertilisant ajouté au sol ainsi que la dose de phosphore (P) appliquée avaient un impact sur la distribution des microorganismes dans les différentes parcelles. Une première expérience menée sur une culture de luzerne en prairie semi-aride a montré que les échantillons provenant de parcelles ayant reçu différentes doses de P présentaient des différences significatives dans leurs communautés bactériennes et fongiques. La communauté de CMA est restée similaire entre les différents traitements. Une deuxième expérience fut menée pendant trois saisons consécutives afin de déterminer l’effet de différentes formes de fertilisation organiques et minérale ajustées selon une dose unique de P sur les populations bactériennes et fongiques d’une culture intensive de maïs en rotation avec du soja. Les résultats des analyses ont montrés que les populations varient selon le type de fertilisation reçu et que les changements sont indépendants du type de végétaux cultivé. Par contre, les populations microbiennes subissent une variation plus marquée au cours de la saison de culture. La technique de DGGE a permis d’observer les changements frappant la diversité microbienne du sol mais n’a permis d’identifier qu’une faible proportion des organismes en cause. Parallèlement à cette deuxième étude, une seconde expérience au même site fut menée sur la communauté de champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) puisqu’il s’agit d’organismes vivant en symbiose mutualiste avec la majorité des plantes et favorisant la nutrition de même que l’augmentation de la résistance aux stress de l’hôte. Ceci permit d’identifier et de comparer les différents CMA présents dans des échantillons de sol et de racines de maïs et soja. Contrairement aux bactéries et aux champignons en général, les CMA présentaient une diversité très stable lors des différents traitements. Par contre, au cours des trois années expérimentales, il a été noté que certains ribotypes étaient significativement plus liés au sol ou aux racines. Finalement, l’ensemble de l’étude a démontré que la fertilisation phosphatée affecte la structure des communautés microbiennes du sol dans les systèmes évalués. Cependant, lors de chaque expérience, la date d’échantillonnage jouait également un rôle prépondérant sur la distribution des organismes. Plusieurs paramètres du sol furent aussi mesurés et ils présentaient aussi une variation au cours de la saison. L’ensemble des interactions possibles entre ces différents paramètres qui, dans certains cas, variaient selon le traitement appliqué, aurait alors probablement plus d’impact sur la biodiversité microbienne que la seule fertilisation.

Mécanismes moléculaires d’activation du récepteur A des peptides natriurétiques

Le récepteur A des peptides natriurétiques (NPRA) fait partie de la famille des guanylates cyclases membranaires. L’activation du NPRA par ses agonistes naturels, ANP et BNP, induit une production de GMPc qui est responsable de leur rôle dans l’homéostasie cardiovasculaire, l’inhibition de l’hypertrophie et de la fibrose cardiaques et la régulation de la lipolyse. Le NPRA est un homodimère non covalent composé d’un domaine extracellulaire de liaison du ligand (ECD), d’un unique domaine transmembranaire (TM), d’un domaine d’homologie aux kinases et d’un domaine guanylate cyclase. Bien que le NPRA ait un rôle physiologique important, les mécanismes moléculaires régissant son processus d’activation restent inconnus. Nous avons donc analysé les premières étapes du processus d’activation du NPRA. Nous avons d'abord étudié le rôle de la dimérisation des ECD dans l’activation du récepteur. Nous avons utilisé les techniques de liaison de radioligand, de FRET et de modélisation moléculaire, pour caractériser la liaison à l’ECD des agonistes naturels, d’un superagoniste et d’un antagoniste. L’ANP se lie à un dimère d’ECD préformé et la dimérisation spontanée est l’étape limitante du processus de liaison. De plus, comme le démontrent nos études de FRET, tous les peptides, incluant l’antagoniste, stabilisent le récepteur sous sa forme dimérique. Cependant, l’antagoniste A71915 stabilise le dimère d’ECD dans une conformation différente de celle induite par l’ANP. La dimérisation du NPRA semble donc nécessaire, mais non suffisante à l’activation du récepteur. L’état d’activation du NPRA dépend plutôt de l’orientation des sous unités dans le dimère. Nous avons ensuite étudié le mécanisme moléculaire de transduction du signal à travers la membrane. Plusieurs études ont suggéré que l’activation du NPRA implique un changement de conformation du domaine juxtamembranaire (JM). Cependant, les études de cristallographie de l’ECD soluble de NPRA n’ont pas permis de documenter la structure du JM et le changement de conformation impliqué dans la transduction du signal reste inconnu. Pour analyser ce changement de conformation, nous avons d’abord séquentiellement substitué les neuf acides aminés du JM par une cystéine. En étudiant la capacité des mutants à former des dimères covalents de façon constitutive ou induite par l’ANP, nous avons pu évaluer la proximité relative des résidus du JM, avant et après activation du NPRA. Ces résultats ont démontré la proximité élevée de certains résidus spécifiques et sont en contradiction avec les données cristallographiques. Nous avons également démontré que le domaine intracellulaire impose une contrainte conformationnelle au JM à l’état de base, qui est levée après liaison de l’ANP. En introduisant de 1 à 5 alanines dans l’hélice-α transmembranaire, nous avons montré qu’une rotation des TM de 40° induit une activation constitutive du NPRA. Le signal d’activation pourrait donc être transmis à travers la membrane par un mécanisme de rotation des TM. En utilisant nos données expérimentales, nous avons généré le premier modèle moléculaire illustrant la conformation active du NPRA, où les domaines JM et TM sont représentés. Dans son ensemble, cette étude apporte une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régissant les premières étapes du processus complexe d’activation du NPRA.

Fonction de l'AmtB dans la régulation de la nitrogénase chez Rhodobacter capsulatus

La fixation de l’azote diatomique est un processus très important à la vie, vu sa nécessité dans la biosynthèse de plusieurs molécules de base; acides aminés, acides nucléiques, etc. La réduction de l’azote en ammoniaque est catalysée par la nitrogénase, une enzyme consommatrice de beaucoup d’énergie étant donné qu’elle nécessite 20 à 30 moles d’ATP pour la réduction d’une mole d’azote. De ce fait une régulation rigoureuse est exigée afin de minimiser le gaspillage d’énergie. Plusieurs systèmes de contrôle sont connus, aussi bien au niveau post-traductionnel que traductionnel. Chez la bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse R. capsulatus, la régulation de l’activité de la nitrogénase nécessite une panoplie de protéines dont la protéine membranaire AmtB, qui est impliquée dans le transport et la perception d’ammonium, et les protéines PII qui jouent plusieurs rôles clés dans la régulation de l’assimilation d’azote. Suite à l’ajout de l’ammonium dans le milieu, une inhibition réversible de l’activité de la nitrogénase est déclenchée via un mécanisme d’ADP-ribosylation de la nitrogénase. La séquestration de GlnK (une protéine PII) par l’AmtB permet à DraT, une ADP-ribosyltransférase, d’ajouter un groupement ADP-ribose sur la protéine-Fe de la nitrogénase l’empêchant ainsi de former un complexe avec la protéine-MoFe. Donc, le transfert d’électrons est bloqué, engendrant ainsi l’inhibition de l’activité de la nitrogénase qui dure aussi long que la concentration d’azote fixé reste élevé, phénomène appelé le « Switch-off/Switch-on » de la nitrogénase. Dans ce mémoire, pour mieux comprendre ce phénomène de régulation, des mutations ponctuelles au niveau de certains résidus conservés de la protéine AmtB, dont D338, G367, H193 et W237, étaient générées par mutagénèse dirigée, afin d’examiner d’avantage leur rôle dans le transport d’ammonium, la formation du complexe AmtB-GlnK, ainsi que dans le « Switch-off » et l’ADP-ribosylation. Les résultats permettent de conclure l’importance et la nécessité de certains résidus telle que le G367 dans la régulation de la nitrogénase et le transport d’ammonium, contrairement au résidu D338 qui ne semble pas être impliqué directement dans la régulation de l’activité de la nitrogénase. Ces résultats suggèrent d’autres hypothèses sur les rôles des acides aminés spécifiques d’AmtB dans ses fonctions comme transporteur et senseur d’ammonium.

Synthesis and characterization of main-chain bile acid-based degradable polymers

Les acides biliaires sont des composés naturels existants dans le corps humain. Leur biocompatibilité, leur caractère amphiphile et la rigidité de leur noyau stéroïdien, ainsi que l’excellent contrôle de leurs modifications chimiques, en font de remarquables candidats pour la préparation de matériaux biodégradables pour le relargage de médicaments et l'ingénierie tissulaire. Nous avons préparé une variété de polymères à base d’acides biliaires ayant de hautes masses molaires. Des monomères macrocycliques ont été synthétisés à partir de diènes composés de chaînes alkyles flexibles attachées à un noyau d'acide biliaire via des liens esters ou amides. Ces synthèses ont été réalisées par la fermeture de cycle par métathèse, utilisant le catalyseur de Grubbs de première génération. Les macrocycles obtenus ont ensuite été polymérisés par ouverture de cycle, entropiquement induite le catalyseur de Grubbs de seconde génération. Des copolymères ont également été préparés à partir de monolactones d'acide ricinoléique et de monomères cycliques de triester d’acide cholique via la même méthode. Les propriétés thermiques et mécaniques et la dégradabilité de ces polymères ont été étudiées. Elles peuvent être modulées en modifiant les différents groupes fonctionnels décorant l’acide biliaire et en ayant recours à la copolymérisation. La variation des caractéristiques physiques de ces polymères biocompatibles permet de moduler d’autres propriétés utiles, tel que l’effet de mémoire de forme qui est important pour des applications biomédicales.

Synthèse de 4-désoxy hexopyrannoses, C-disaccharides et C-glycosides biologiquement actifs

Les glucides constituent la classe de molécules organiques la plus abondante et ceux-ci jouent des rôles cruciaux dans divers processus biologiques. De part leur importance médicinale, la préparation des désoxy-sucres, des C-glycosides et des C-disaccharides est devenue un sujet de pointe en synthèse organique. De façon générale, cette thèse décrit une nouvelle synthèse de novo des 4-désoxy hexopyrannoses en plus de la préparation de C-glycosides biologiquement actifs. De plus, une attention particulière a été portée à la préparation de novo de 4-désoxy-C-disaccharides. Dans un premier temps, le catalyseur de Cr(III) de Jacobsen et un complexe binaphtol/titane ont été utilisés pour réaliser des hétéro-Diels-Alder énantiosélectives. Les dihydropyrannes ainsi générés ont été transformés en 4-désoxy hexopyrannoses présents dans la nature. De cette façon, un dérivé de l’acide ézoaminuroïque, un précurseur de la désosamine et de la néosidomycine, a été préparé suivant cette approche de novo. De plus, à titre comparatif, la néosidomycine a également été fabriquée selon une approche chiron, à partir du méthyl alpha-D-mannopyrannoside. Finalement, une évaluation biologique préliminaire de la néosidomycine a été effectuée sur une la concanavaline-A (Chapitre 2). Dans un deuxième temps, une allylation stéréosélective sur un aldéhyde lié via des liens C-C à une unité mannoside a permis de générer un alcool homoallylique. Cette dernière fonctionnalité a été transformée en 4-désoxy hexopyrannose de configuration D ou L. De cette façon, la préparation de pseudo 4-désoxy-C-disaccharides, de 4-désoxy-C-disaccharides et de pseudo 4-désoxy aza-C-disaccharides a facilement été réalisée. Les rapports diastéréoisomériques de la réaction d’allylation ont été déterminés en plus de la configuration absolue des nouveaux centres stéréogéniques formés. La transformation des alcools homoallyliques en pyrannes poly hydroxylés ou en lactames poly hydroxylés a été réalisée, en plus de la déprotection de certains membres de cette famille pour une évaluation biologique préliminaire sur la concanavaline-A (Chapitre 3). Finalement, la synthèse de C-glycosides biologiquement actifs a été réalisée selon deux volets: i) préparation de 3-C-mannopyrannosyl coumarines et ii) synthèse de C-galactosides, inhibiteurs de la lectine PA-IL. Pour ce faire, le couplage de Heck a été utilisé à partir d’un ester alpha,bêta-insaturé, attaché à une unité glycosidique via des liens C-C, pour générer un dérivé glycosyl cinnamate de méthyle. Cependant, lorsque le 2-iodophénol est utilisé comme partenaire de Heck, la coumarine correspondante a été isolée. Les dérivés C-galactopyrannosyl cinnamates de méthyle représentent de bons inhibiteurs monovalents de la PA-IL avec un Kd aussi bas que 37 micro M (Chapitre 4).

Le droit à un environnement de qualité au Québec : une réponse aux problèmes de pollution diffuse?

Les Québécois sont de plus en plus conscients de l’environnement qui les entoure et de l’importance d’en assurer la qualité et la pérennité. Certains phénomènes, tels les changements climatiques, l’accumulation de polluants organiques persistants et l’amincissement de la couche d’ozone, que nous qualifierons de phénomènes environnementaux diffus, sont engendrés par de multiples émetteurs de polluants et ont des effets globaux qui ne peuvent être liés à un événement précis et dont les impacts sont difficiles à identifier et à quantifier pour le moment. En l’absence de preuve quant aux effets qu’auront ces phénomènes diffus sur les citoyens et les difficultés liées à la preuve scientifique du lien causal entre ce dommage et un émetteur de polluant donné, les recours classiques en responsabilité civile et pour troubles de voisinage, prévus aux articles 1457 et 976 C.c.Q., apparaissent inopérants. Nous nous interrogeons donc sur l’existence d’un droit à l’environnement qui conférerait aux citoyens le droit de vivre dans un environnement sain et leur permettrait ainsi de réclamer que cesse toute atteinte environnementale engendrée par ces phénomènes, même si elle n’a pas d’effet directement sur eux. Considérant l’importance de l’efficacité des recours qui pourraient permettre une mise en œuvre de ce droit, nous procéderons à l’analyse de trois sources potentielles d’un droit à l’environnement sous cet angle. À cet effet, nous étudierons les recours constitutionnels et quasi-constitutionnels liés à la Charte canadienne des droits et libertés, à la Charte des droits et libertés de la personne et au recours institutionnel prévu dans la Loi sur la qualité de l’environnement. Considérant l’absence de reconnaissance suffisante d’un droit à l’environnement et de recours efficaces pour en assurer la mise en œuvre, nous proposerons ensuite des pistes de solution afin que puisse être développé un mécanisme permettant une réponse judiciaire aux phénomènes environnementaux diffus.

Rôle de GPR40 dans la survie et la prolifération cellulaires induites par l’oléate dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de cancer de la prostate DU145

La relation entre l’obésité et le cancer, bien qu’établie par des études épidémiologiques, est peu connue. Pourtant, environ 25 % des cancers pourraient y être attribuables. Parmi les cancers reliés à l’obésité, les cancers du côlon, du sein chez les femmes ménopausées et de la prostate sont les plus fréquents. Des études sur modèles animaux ont suggéré une association positive entre une diète riche en gras et le développement du cancer mammaire et de la prostate. Nous avons étudié les mécanismes moléculaires par lesquels les acides gras influencent le devenir de lignées de cellules cancéreuses du sein et de la prostate. Ces travaux ont montré que les acides gras insaturés, dont l’oléate, induisent la prolifération cellulaire tandis que les acides gras saturés, dont le palmitate, diminuent la prolifération. Un traitement à l’oléate stimule la formation de gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme des cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145 alors qu’un traitement au palmitate entraîne l’apoptose. Le mécanisme d’action de l’oléate sur la prolifération a été étudié de façon plus approfondie. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques nous a permis de déterminer que l’effet prolifératif de l’oléate implique la voie PI3K/Akt, la voie ERK1/2 et l’activation d’un ou de plusieurs récepteur(s) couplé(s) aux protéines G (GPCR). L’oléate induit la phosphorylation rapide des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145. Au cours des dernières années, deux GPCRs ont été identifiés comme étant activables par des acides gras à moyennes et à longues chaînes, GPR40 et GPR120. GPR40 étant exprimé dans plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein et de la prostate contrairement à l’expression de GPR120 qui était inexistante dans la plupart des lignées, nous avons étudié l’implication de GPR40 dans l’effet prolifératif de l’oléate. Ces deux récepteurs n’étant pas exprimés dans les cellules épithéliales mammaires humaines en culture primaire, ces cellules ne répondent pas aux effets de l’oléate sur la prolifération et l’activation des voies de signalisation. L’activation des voies Akt et ERK1/2 par l’oléate dans les cellules MDA-MB-231 et DU145 est potentialisée par la surexpression du récepteur GPR40 et inhibée par l’utilisation d’un siRNA dirigé contre ce récepteur. Cependant, la prolifération induite par l’oléate ne semble pas affectée par la présence d’un siRNA dirigé contre GPR40. L’oléate étant un acide gras, il est capable d’entrer librement dans les cellules et une partie de ses effets sur la prolifération pourrait être attribuée à sa métabolisation. Un agoniste de GPR40, le GW9508, est en mesure d’activer GPR40 sans toutefois entrer dans les cellules ni activer le métabolisme de l’oléate. Le GW9508 stimule la phosphorylation des protéines Akt et ERK1/2 dans les cellules du cancer du sein MDA-MB-231 et de la prostate DU145, mais il n’est pas en mesure d’induire la prolifération cellulaire comme le fait l’oléate. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre le mécanisme d’action de l’oléate sur les cellules de cancer du sein et de la prostate. L’oléate induit la signalisation de GPR40 qui est impliquée dans l’activation rapide des voies de signalisation Akt et ERK1/2. De son côté, l’effet prolifératif induit par l’oléate s’effectue par un mécanisme GPR40-indépendant, possiblement lié au métabolisme de l’oléate.

Régulation de protéine C-réactive vasculaire dans le diabète de type 2

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans les pays occidentaux et représentent une complication majeure du syndrome métabolique. Il est maintenant largement admis que l’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique et que l’inflammation joue un rôle pathogénique majeur dans l’initiation et la progression de la maladie athéromateuse. Il a été démontré qu’une augmentation des niveaux sériques de la protéine c-réactive (CRP), une protéine de la phase aigüe et un important constituant de la réponse immunitaire de type inné, est associée à un risque cardiovasculaire accru. Ainsi, il a été documenté qu’une augmentation de CRP, tant chez les sujets sains que chez les sujets diabétiques, était associée à une augmentation du risque de morbidité et de mortalité cardiovasculaires. De multiples évidences suggèrent que la CRP puisse non seulement constituer un marqueur de risque des maladies cardiovasculaires mais aussi représenter un facteur pro-athérogénique direct. La dysfonction endothéliale représente un des stades les plus précoces du processus athérosclérotique et un rôle de la CRP dans la pathogenèse de la dysfonction endothéliale est postulé. Outre son origine systémique, la CRP est produite dans la lésion athérosclérotique et par diverses cellules vasculaires, dont les cellules endothéliales. Afin d’élucider le rôle de la CRP vasculaire dans l’altération de la fonction endothéliale associée au syndrome métabolique, nous avons étudié la régulation de l’expression endothéliale de la CRP par les acides gras libres (AGL) et le rôle de la CRP endothéliale dans l’inhibition de la synthèse d’oxyde nitrique (NO) par les AGL. Nos résultats démontrent que :1) l’acide palmitique (PA) induit l’expression génique de CRP au niveau de cellules endothéliales aortiques humaines (HAECs) en culture et, augmente, de manière dose-dépendante, l’expression protéique de la CRP; 2) La pré-incubation des HAECs avec des antioxydants et des inhibiteurs de la i) protéine kinase C (PKC), ii) du facteur nucléaire-kappa B, iii) des Janus kinases et des protéines de transduction et de régulation de la transcription et iv) des protéines kinases activées par les mitogènes prévient l’effet stimulant du PA sur l’expression protéique et génique de la CRP; 3) Le traitement des HAECs par le PA induit une augmentation de la production des espèces réactives oxygénées, un effet prévenu par les inhibiteurs de la PKC et par l’AICAR(5-amino-4-imidazole carboxamide 1-β-D-ribofuranoside), un activateur de la protéine kinase activée par l’AMP; 4) L’incubation des HAECs en présence de PA résulte enfin en une diminution de la production basale endothéliale de NO, un effet abrogé par la préincubation de ces cellules avec un anticorps anti-CRP. Dans l’ensemble, ces données démontrent un effet stimulant du PA sur l’expression de la CRP endothéliale via l’activation de kinases et de facteurs de transcription sensibles au stress oxydatif. Ils suggèrent en outre un rôle de la CRP dans la dysfonction endothéliale induite par les AGL.

Étude de la régulation de la nitrogénase chez Rhodobacter capsulatus dans la noirceur

L’atmosphère terrestre est très riche en azote (N2). Mais cet azote diatomique est sous une forme très stable, inutilisable par la majorité des êtres vivants malgré qu’il soit indispensable pour la synthèse de matériels organiques. Seuls les procaryotes diazotrophiques sont capables de vivre avec le N2 comme source d’azote. La fixation d’azote est un processus qui permet de produire des substances aminées à partir de l’azote gazeux présent dans l’atmosphère (78%). Cependant, ce processus est très complexe et nécessite la biosynthèse d’une vingtaine de protéines et la consommation de beaucoup d’énergie (16 molécules d’ATP par mole de N2 fixé). C’est la raison pour laquelle ce phénomène est rigoureusement régulé. Les bactéries photosynthétiques pourpres non-sulfureuses sont connues pour leur capacité de faire la fixation de l’azote. Les études faites à la lumière, dans le mode de croissance préféré de ces bactéries (photosynthèse anaérobie), ont montré que la nitrogénase (enzyme responsable de la fixation du diazote) est sujet d’une régulation à trois niveaux: une régulation transcriptionnelle de NifA (protéine activatrice de la transcription des gènes nif), une régulation post-traductionnelle de l’activité de NifA envers l’activation de la transcription des autres gènes nif, et la régulation post-traductionnelle de l’activité de la nitrogénase quand les cellules sont soumises à un choc d’ammoniaque. Le système de régulation déjà décrit fait intervenir essentiellement une protéine membranaire, AmtB, et les deux protéines PII, GlnB et GlnK. Il est connu depuis long temps que la nitrogénase est aussi régulée quand une culture photosynthétique est exposée à la noirceur, mais jusqu’aujourd’hui, on ignore encore la nature des systèmes intervenants dans cette régulation. Ainsi, parmi les questions qui peuvent se poser: quelles sont les protéines qui interviennent dans l’inactivation de la nitrogénase lorsqu’une culture anaérobie est placée à la noirceur? Une analyse de plusieurs souches mutantes, amtB- , glnK- , glnB- et amtY- poussées dans différentes conditions de limitation en azote, serait une façon pour répondre à ces interrogations. Alors, avec le suivi de l’activité de la nitrogénase et le Western Blot, on a montré que le choc de noirceur provoquerait un "Switch-off" de l’activité de la nitrogénase dû à une ADP-ribosylation de la protéine Fe. On a réussit aussi à montrer que ii tout le système déjà impliqué dans la réponse à un choc d’ammoniaque, est également nécessaire pour une réponse à un manque de lumière ou d’énergie (les protéines AmtB, GlnK, GlnB, DraG, DraT et AmtY). Or, Rhodobacter capsulatus est capable de fixer l’azote et de croitre aussi bien dans la micro-aérobie à la noirceur que dans des conditions de photosynthèse anaérobies, mais jusqu'à maintenant sa régulation dans l’obscurité est peu étudiée. L’étude de la fixation d’azote à la noirceur nous a permis de montrer que le complexe membranaire Rnf n’est pas nécessaire à la croissance de R. capsulatus dans de telles conditions. Dans le but de développer une façon d’étudier la régulation de la croissance dans ce mode, on a tout d’abord essayé d’identifier les conditions opératoires (O2, [NH4 + ]) permettant à R. capsulatus de fixer l’azote en microaérobie. L’optimisation de cette croissance a montré que la concentration optimale d’oxygène nécessaire est de 10% mélangé avec de l’azote.

Polyoxométallates hybrides : vers des systèmes covalents photoactifs dans le visible

Réalisé en cotutelle, sous la direction du Pr. Bernold Hasenknopf, à l'Institut Parisien de Chimie Moléculaire, Université Pierre et Marie Curie (Paris VI, France) et dans le cadre de l'Ecole Doctorale "Physique et Chimie des Matériaux" - Spécialité Chimie Inorganique (ED397).

Effet des changements du ratio alimentaire oméga-3/oméga-6 dans un modèle d’infarctus du myocarde reperfusé chez le rat

Une mort cellulaire par apoptose impliquant un processus inflammatoire est observée dans le système limbique, suite à un infarctus du myocarde. Les oméga-3 et ses métabolites, en plus de leurs propriétés bénéfiques pour le système cardiovasculaire, réduisent l’inflammation, contrairement aux oméga-6 qui sont plus pro-inflammatoires. Comme le métabolisme de ces deux acides gras essentiels impliquent les mêmes enzymes, le ratio alimentaire oméga-3/6 aurait donc des impacts importants sur l'état inflammatoire et ainsi indirectement sur l'apoptose. Conséquemment, cette étude a pour but d'évaluer l'effet de différents ratios oméga-3/6 sur la taille de l’infarctus, l’inflammation et l’apoptose dans le système limbique suite à un infarctus du myocarde. Des rats Sprague-Dawley ont été aléatoirement distribués dans trois groupes contenant des ratios 1:1, 1:5 et 5:1 oméga-3/6. Ils ont été nourris pendant 2 semaines, suivie d’une occlusion de l’artère coronaire gauche descendante pendant 40 minutes et d’une période de reperfusion (15 min et 24 h). De hauts ratios d’oméga-3 (5:1 et 1:1) diminuent significativement la taille de l’infarctus de 32 % et augmentent l’activité d’Akt, impliquée dans la voie cardioprotectrice RISK, comparativement au ratio 1:5. Ils diminuent aussi la concentration plasmatique de TNF-D. Dans le système limbique, l’activité de la caspase-3 est augmentée dans la région CA1, après 15 min, et dans les régions du CA1 et du gyrus dentelé (Gd), après 24 h, avec la diète 1:5 en comparaison aux diètes 1:1 et 5:1. L’activité enzymatique de la caspase-8 est augmentée dans le Gd, alors que dans le CA1, il y a une activité plus importante de la caspase-9 aux temps de reperfusion étudiés. Conclusion: Les diètes élevées en oméga-3/oméga-6 réduisent la taille de l'infarctus, l’inflammation et diminuent l’apoptose dans le système limbique après un infarctus du myocarde.