Étude du transcriptome des cellules non tumorales de l’épithélium de surface de l’ovaire des femmes porteuses d’une mutation des gènes BRCA1 et BRCA2

Nous avons étudié le transcriptome de neuf échantillons d'ARN extraits de cultures primaires de cellules non tumorales de l’épithélium de surface de l’ovaire (NOSE) provenant de quatre donneuses non porteuses de mutation, deux mutées sur BRCA1 et trois sur BRCA2, ainsi que de quatre échantillons d’ARN extraits de cultures primaires de cellules tumorales de l’ovaire (TOV) provenant de trois donneuses porteuses de mutation sur BRCA1 et une sur BRCA2. Nous avons identifié, pour la première fois, les signatures moléculaires associées à la présence d’une mutation de BRCA1 et BRCA2 dans les cellules NOSEs ainsi que la signature associée à la transformation tumorale des cellules NOSEs en TOVs chez les porteuses de mutation de BRCA1. Nous avons également localisé les domaines chromosomiques comportant des gènes corégulés en association avec la présence d’une mutation de BRCA1 dans les cellules NOSEs. Les allèles sauvage et muté de BRCA2 étaient exprimés dans les cellules TOVs provenant des porteuses de la mutation 8765delAG sur BRCA2. Nous avons observé que le niveau d’expression des transcrits de BRCA2 était plus élevé dans les cellules provenant des tumeurs ovariennes les plus agressives chez les femmes porteuses de la mutation 8765delAG sur BRCA2, les transcrits correspondants à l’allèle muté contribuant avec un pourcentage élevé du niveau d’expression total du gène. Le phénotype tumoral observé chez les Canadiennes Françaises porteuses de cette mutation pourrait résulter d’un effet de dosage de l’allèle muté.

Étude structure-fonction des fructose-1,6-bisphosphate aldolases métallo-dépendantes : mécanisme catalytique et développement d’antimicrobiens

Les fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) sont des enzymes glycolytiques (EC 4.1.2.13) qui catalysent la transformation réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en deux trioses-phosphates, le glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et le dihydroxyacétone phosphate (DHAP). Il existe deux classes de FBPA qui diffèrent au niveau de leur mécanisme catalytique. Les classes I passent par la formation d’un intermédiaire covalent de type iminium alors que les classes II, métallodépendantes, utilisent généralement un zinc catalytique. Contrairement au mécanisme des classes I qui a été très étudié, de nombreuses interrogations subsistent au sujet de celui des classes II. Nous avons donc entrepris une analyse détaillée de leur mécanisme réactionnel en nous basant principalement sur la résolution de structures cristallographiques. De nombreux complexes à haute résolution furent obtenus et ont permis de détailler le rôle de plusieurs résidus du site actif de l’enzyme. Nous avons ainsi corrigé l’identification du résidu responsable de l’abstraction du proton de l’O4 du FBP, une étape cruciale du mécanisme. Ce rôle, faussement attribué à l’Asp82 (chez Helicobacter pylori), est en fait rempli par l’His180, un des résidus coordonant le zinc. L’Asp82 n’en demeure pas moins essentiel car il oriente, active et stabilise les substrats. Enfin, notre étude met en évidence le caractère dynamique de notre enzyme dont la catalyse nécessite la relocalisation du zinc et de nombreux résidus. La dynamique de la protéine ne permet pas d’étudier tous les aspects du mécanisme uniquement par l’approche cristallographique. En particulier, le résidu effectuant le transfert stéréospécifique du proton pro(S) sur le carbone 3 (C3) du DHAP est situé sur une boucle qui n’est visible dans aucune de nos structures. Nous avons donc développé un protocole de dynamique moléculaire afin d’étudier sa dynamique. Validé par l’étude d’inhibiteurs de la classe I, l’application de notre protocole aux FBPA de classe II a confirmé l’identification du résidu responsable de cette abstraction chez Escherichia coli (Glu182) mais pointe vers un résidu diffèrent chez H. pylori (Glu149 au lieu de Glu142). Nos validations expérimentales confirment ces observations et seront consolidées dans le futur. Les FBPA de classe II sont absentes du protéome humain mais sont retrouvées chez de nombreux pathogènes, pouvant même s'y révéler essentielles. Elles apparaissent donc comme étant une cible idéale pour le développement de nouveaux agents anti-microbiens. L’obtention de nouveaux analogues des substrats pour ces enzymes a donc un double intérêt, obtenir de nouveaux outils d’étude du mécanisme mais aussi développer des molécules à visée pharmacologique. En collaboration avec un groupe de chimistes, nous avons optimisé le seul inhibiteur connu des FBPA de classe II. Les composés obtenus, à la fois plus spécifiques et plus puissants, permettent d’envisager une utilisation pharmacologique. En somme, c’est par l’utilisation de techniques complémentaires que de nouveaux détails moléculaires de la catalyse des FBPA de classe II ont pu être étudiés. Ces techniques permettront d’approfondir la compréhension fine du mécanisme catalytique de l’enzyme et offrent aussi de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Rôle du gène Polycomb BMI1 dans le maintien et la radiorésistance des cellules souches cancéreuses

Le glioblastome multiforme (GBM) est la tumeur cérébrale la plus commune et létale chez l’adulte. Malgré les avancés fulgurantes dans la dernière décennie au niveau des thérapies contre le cancer, le pronostique reste inchangé. Le manque de spécificité des traitements est la cause première de la récurrence de cette tumeur. Une meilleure compréhension au niveau des mécanismes moléculaires et biologiques de cette tumeur est impérative. La découverte des cellules souches cancéreuses (CD133+) au niveau du GBM offre une nouvelle opportunité thérapeutique contre cette tumeur. Effectivement, les cellules CD133+ seraient responsables de l’établissement, le maintien et la progression du GBM. De plus, elles sont également la cause de la résistance du GBM faces aux traitements de radiothérapies. Ces cellules représentent une cible de choix dans le but d’éradiquer le GBM. L’oncogène BMI1 a été associé à plusieurs types de tumeurs et est également essentielle au maintien de différentes populations de cellules souches normales et cancéreuses. Une forte expression de BMI1 est observée au niveau du GBM et plus précisément, un enrichissement préférentiel de cette protéine est noté au niveau des cellules CD133+. L’objectif principal de cette thèse est d’évaluer le rôle potentiel de BMI1 dans le maintien et la radiorésistance des cellules souches cancéreuses (CSC), CD133+ du GBM. La fonction principale de BMI1 est la régulation négative du locus INK4A/ARF. Ce locus est impliqué dans l’activation de deux voies majeurs anti-tumorales : P53 et RB. Or, la perte de BMI1 induit in vitro une diminution des capacités prolifératives, une augmentation de la différentiation et de l’apoptose, ainsi qu’une augmentation de la radiosensibilité des CSC du GBM indépendamment de la présence du locus INK4A/ARF. Effectivement, deux tumeurs sur trois possèdent une délétion de ce locus, ce qui suggère que BMI1 possède d’autre(s) cible(s) transcriptionnelle(s). Parmi ces nouvelles cibles ont retrouve la protéine P21, un régulateur négatif du cycle cellulaire. De plus, la perte de BMI1 inhibe l’établissement d’une tumeur cérébrale lors d’études de xénogreffe chez la souris NOD/SCID. Également, une nouvelle fonction de BMI1 indépendante de son activité transcriptionnel a été démontrée. Effectivement, suite à l’induction d’un bris double brin (BDB) de l’ADN, BMI1 est rapidement recruté au niveau de la lésion et influence le recrutement des protéines de reconnaissance du dommage à l’ADN. La perte de BMI1 mène à un défaut au niveau de la reconnaissance et la réparation de l’ADN, alors que sa surexpression induit plutôt une augmentation de ces mécanismes et procure une radiorésistance. Ces résultats décrivent pour la première fois l’importance de BMI1 au niveau du maintien, de l’auto-renouvellement et la radiorésistance des CSC du GBM. Ainsi, ces travaux démontrent que la protéine BMI1 représente une cible thérapeutique de choix dans le but d’éradiquer le GBM, une tumeur cérébrale létale.

Self-assembly of PS-PVP block copolymers and their complexes at the air/water interface

Une compréhension approfondie et un meilleur contrôle de l'auto-assemblage des copolymères diblocs (séquencés) et de leurs complexes à l'interface air/eau permettent la formation contrôlée de nanostructures dont les propriétés sont connues comme alternative à la nanolithographie. Dans cette thèse, des monocouches obtenues par les techniques de Langmuir et de Langmuir-Blodgett (LB) avec le copolymère dibloc polystyrène-poly(4-vinyl pyridine) (PS-PVP), seul ou complexé avec de petites molécules par liaison hydrogène [en particulier, le 3-n-pentadécylphénol (PDP)], ont été étudiées. Une partie importante de notre recherche a été consacrée à l'étude d'une monocouche assemblée atypique baptisée réseau de nanostries. Des monocouches LB composées de nanostries ont déjà été rapportées dans la littérature mais elles coexistent souvent avec d'autres morphologies, ce qui les rend inutilisables pour des applications potentielles. Nous avons déterminé les paramètres moléculaires et les conditions expérimentales qui contrôlent cette morphologie, la rendant très reproductible. Nous avons aussi proposé un mécanisme original pour la formation de cette morphologie. De plus, nous avons montré que l'utilisation de solvants à haut point d’ébullition, non couramment utilisés pour la préparation des films Langmuir, peut améliorer l'ordre des nanostries. En étudiant une large gamme de PS-PVP avec des rapports PS/PVP et des masses molaires différents, avec ou sans la présence de PDP, nous avons établi la dépendance des types principaux de morphologie (planaire, stries, nodules) en fonction de la composition et de la concentration des solutions. Ces observations ont mené à une discussion sur les mécanismes de formation des morphologies, incluant la cinétique, l’assemblage moléculaire et l’effet du démouillage. Nous avons aussi démontré pour la première fois que le plateau dans l'isotherme des PS-PVP/PDP avec morphologie de type nodules est relié à une transition ordre-ordre des nodules (héxagonal-tétragonal) qui se produit simultanément avec la réorientation du PDP, les deux aspects étant clairement observés par AFM. Ces études ouvrent aussi la voie à l'utilisation de films PS-PVP/PDP ultraminces comme masque. La capacité de produire des films nanostructurés bien contrôlés sur différents substrats a été démontrée et la stabilité des films a été vérifiée. Le retrait de la petite molécule des nanostructures a fait apparaître une structure interne à explorer lors d’études futures.

Recherche des facteurs génétiques à l’origine de la maladie de Parkinson dans la population canadienne-française du Québec

La maladie de Parkinson (MP) est une affection neurodégénérative invalidante et incurable. Il est maintenant clairement établi que d’importants déterminants génétiques prédisposent à son apparition. La recherche génétique sur des formes familiales de la MP a mené à la découverte d’un minimum de six gènes causatifs (SNCA, LRRK2, Parkin, PINK1, DJ-1 and GBA) et certains, par exemple LRRK2, contiennent des variations génétiques qui prédisposent également aux formes sporadiques. La caractérisation des protéines codées par ces gènes a mené à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sousjacents. Toutefois, en dépit de ces efforts, les causes menant à l’apparition de la MP restent inconnues pour la majorité des patients. L’objectif général des présents travaux était d’identifier des mutations prédisposant à la MP dans la population canadienne-française du Québec à partir d’une cohorte composée principalement de patients sporadiques. Le premier volet de ce projet consistait à déterminer la présence de mutations de LRRK2 dans notre cohorte en séquençant directement les exons contenant la majorité des mutations pathogéniques et en effectuant une étude d’association. Nous n’avons identifié aucune mutation et l’étude d’association s’est avérée négative, suggérant ainsi que LRRK2 n’est pas une cause significative de la MP dans la population canadienne-française. La deuxième partie du projet avait pour objectif d’identifier de nouveaux gènes causatifs en séquençant directement des gènes candidats choisis à cause de leurs implications dans différents mécanismes moléculaires sous-tendant la MP. Notre hypothèse de recherche était basée sur l’idée que la MP est principalement due à des mutations individuellement rares dans un grand nombre de gènes différents. Nous avons identifié des mutations rares dans les gènes PICK1 et MFN1. Le premier code pour une protéine impliquée dans la régulation de la transmission du glutamate tandis que le second est un des acteurs-clés du processus de fusion mitochondriale. Nos résultats, qui devront être répliqués, suggèrent que le séquençage à grande échelle pourrait être une méthode prometteuse d’élucidation des facteurs de prédisposition génétiques à la MP ; ils soulignent l’intérêt d’utiliser une population fondatrice comme les canadiens-français pour ce type d’étude et devraient permettre d’approfondir les connaissances sur la pathogénèse moléculaire de la MP.

Essential role of GATA5 in the mammalian heart

réalisé en cotutelle avec le Dr. Marie Kmita et Dr. Marco Horb

Association de polymorphismes dans le gène GPIHBP1 avec l’hypertriglycéridémie

L’hypertriglycéridémie (hyperTG) est une dyslipidémie fréquente, caractérisée par une augmentation de la concentration plasmatique en triglycérides (TG). L’hyperTG est considérée comme un facteur de risque indépendant de la maladie cardiovasculaire, particulièrement de la maladie coronarienne athérosclérotique. Plusieurs facteurs environnementaux et génétiques ont été associés avec l’hyperTG. Cependant, près de 90% des cas d’hyperTG primaire sont encore incomplètement caractérisés au niveau moléculaire. Dernièrement, la protéine GPIHBP1 (glycosylphosphatidylinositol-anchored high-density lipoprotein-binding protein 1), qui a un rôle clef dans le métabolisme des TG, a été associée à l’expression d’hyperTG sévère et rare chez l’humain. Ce mémoire présente les résultats de nos travaux qui ont été effectués afin d’identifier de nouvelles bases moléculaires associées à l’expression de l’hyperTG dans le locus du gène GPIHBP1. Nous avons observé que le polymorphisme GPIHBP1 g.-469G>A (rs72691625), dont la fréquence de l’allèle mineure a été évaluée à 19,6% dans notre échantillon, serait associé à l’expression d’hyperTG (TG ≥ 2mmol/L) dans une population canadienne-française. Ce polymorphisme est associé à un risque 1,67 fois plus grand d’exprimer une triglycéridémie ≥ 2mmol/L chez les porteurs hétérozygotes et 5,7 fois plus grand chez les porteurs homozygotes, comparativement aux non-porteurs. Ce risque d’hyperTG serait exacerbé par la présence concomitante d’une mutation hypertriglycéridémiante dans le gène codant pour la lipoprotéine lipase. La présence de ce polymorphisme serait particulièrement associée à l’expression de la dysbêtalipoprotéinémie familiale et de l’hypertriglycéridémie familiale endogène. GPIHBP1 g.-469G>A est le premier polymorphisme fréquent identifié dans le promoteur du gène à être associé avec l’expression d’hyperTG. GPIHBP1 émerge de plus en plus comme un gène candidat intéressant pour la recherche de nouvelles bases moléculaires pouvant expliquer certaines formes d’hyperTG primaire fréquente.

Morphologie évolutive et fonctionnelle des hémichordés

L’embranchement Hemichordata regroupe les classes Enteropneusta et Pterobranchia. Hemichordata constitue, avec l’embranchement Echinodermata, le groupe-frère des chordés. Les entéropneustes sont des organismes vermiformes solitaires qui vivent sous ou à la surface du substrat et s’alimentent généralement par déposivorie, alors que les ptérobranches sont des organismes coloniaux filtreurs habitant dans un réseau de tubes appelé coenecium. Ce mémoire présente trois études dont le point commun est l’utilisation des hémichordés actuels pour répondre à des questions concernant l’évolution des hémichordés, des chordés, et du super-embranchement qui les regroupe, Deuterostomia. Notre première étude démontre que les fentes pharyngiennes, l’organe pré-oral cilié (POCO) et le pharynx de l’entéropneuste Protoglossus graveolens sont utilisés pour l’alimentation par filtration. Le système de filtration de P. graveolens permet la capture de particules jusqu’à 1.3 um, à un débit de 4.05 mm.s-1, pour une demande énergétique de 0.009 uW. Les similarités structurales et fonctionnelles avec le système de filtration des céphalochordés suggèrent que la filtration pharyngienne est ancestrale aux deutérostomes. Lors de notre deuxième étude, nous avons exploré l’hypothèse selon laquelle le POCO des entéropneustes, une structure ciliée pré-buccale au rôle possiblement chémorécepteur, serait homologue au « wheel organ » des céphalochordés et à l’adénohypophyse des vertébrés. Pour cela, nous avons déterminé par immunohistochimie l’expression de Pit-1, un facteur de transcription spécifique à ces deux structures, chez l’entéropneuste Saccoglossus pusillus. Pit-1 est exprimé dans des cellules sensorielles du POCO, mais aussi dans des cellules épithéliales distribuées dans le proboscis, collet et tronc. Ce patron d’expression ne permet pas de confirmer ou rejeter l’homologie du POCO et de l’adénohypophyse des vertébrés. Lors de notre troisième étude, nous avons caractérisé l’ultrastructure du coenecium des ptérobranches Cephalodiscus hodgsoni, Cephalodiscus nigrescens et Cephalodiscus densus par microscopie électronique à transmisison et à balayage. Cephalodiscus est le groupe frère de Graptolithina, un groupe qui inclut les graptolithes éteints ainsi que les ptérobranches du genre Rhabdopleura. Nous avons décrit les types de fibrilles de collagène présents, leur taille et leur organisation, ainsi que l’organisation globale du coenecium. Nous avons ainsi démontré la présence chez Cephalodiscus d’une organisation similaire au paracortex, pseudocortex et eucortex des graptolithes. La présence chez Cephalodiscus de ce type d’organisation suggère que le cortex est ancestral à la classe Pterobranchia. Ces trois études illustrent plusieurs axes importants de la recherche sur les hémichordés, qui en intégrant des données morphologiques, fonctionnelles et moléculaires permet de reconstruire certains évènements clés de l’évolution des deutérostomes.

L’œstrogène : un rôle potentiel dans la modulation de l’activation pro-inflammatoire des cellules endothéliales vasculaires par la voie du Toll-Like Receptor 2

Grâce aux nombreuses études sur le sujet, nous savons qu’une stimulation inflammatoire vasculaire excessive entraîne un débalancement des fonctions homéostatiques de l’endothélium. Ce débalancement est à l’origine d’une dysfonction endothéliale définie comme étant l’étape clé contribuant au développement de l’athérosclérose. Le Toll-like receptor-2 (TLR2) est impliqué dans l’activation cellulaire via la transcription des gènes liés à l’inflammation. Il reconnaît des molécules microbiennes mais également des facteurs endogènes non-infectieux tels que sécrétés par les tissus endommagés provenant de la dysfonction endothéliale. Ainsi, l’activation et la signalisation du TLR2 sont en étroite relation avec le développement de l’athérosclérose. Les études épidémiologiques ont confirmé le rôle athéroprotecteur de l’œstrogène via de nombreux mécanismes d’action. Ainsi, nous avons cherché à identifier de nouvelles cibles moléculaires permettant de mieux interpréter les bénéfices potentiels de l’œstrogène sur le système cardiaque. Pour la première fois chez les cellules endothéliales (CE) vasculaires de souris, nos travaux ont confirmé l’effet anti-inflammatoire de l’œstrogène via la diminution de l’expression et de l’activité du TLR2. Nous avons également déterminé l’influence de l’œstrogène sur le profil de la réponse inflammatoire de ce récepteur en mesurant les potentiels endothéliaux de migration et d’adhésion. De plus, nous avons caractérisé les voies de signalisation impliquées en démontrant l’influence négative de l’œstrogène sur la phosphorylation des kinases activées par le TLR2; illustrant l’interaction entre l’œstrogène et la signalisation de ce récepteur. Nos travaux amènent ainsi de nouvelles connaissances sur la régulation endothéliale du TLR2 et mettent en lumière les effets anti-inflammatoires et vasculaires rapides de l’œstrogène.

Les cellules dendritiques plasmacytoides dans le sang de cordon et après greffe de sang de cordon

La greffe de sang de cordon est de plus en plus utilisée et a permis de traiter avec succès chez l’enfant des déficits immunitaires ainsi que des hémopathies malignes comme les leucémies. Malgré d’importants avantages tels que l’absence de risque pour le donneur ou la plus faible incidence de maladie du greffon contre l’hôte (GvHD), utiliser le sang de cordon comporte certains inconvénients. En effet, une reconstitution immunitaire retardée, des infections opportunistes en plus grand nombre et un risque de rechute sont des complications qui peuvent survenir et engendrer un risque pour le pronostic vital du patient. Par conséquent, de nouvelles stratégies d’immunothérapies doivent être envisagées. Dans le cadre de ce travail, nous nous sommes particulièrement intéressés aux cellules dendritiques plasmacytoides (pDC) dont les fonctions sont importantes pour l’initiation des réponses immunitaires innée et adaptative et particulièrement pour leur capacité à activer les cellules NK. Afin d’élucider le rôle et l’impact de ces cellules dans les greffes de sang de cordon, le nombre et la fonction des pDC et des NK a été suivi longitudinalement chez des patients ayant subi une greffe de sang de cordon comparativement à des patients transplantés avec de la moelle osseuse. Nous avons ainsi démontré que les pDC et les NK apparaissent précocement suite à une greffe de sang de cordon et que ces cellules sont fonctionnelles. Ces résultats mettent donc en lumière que ces cellules pourraient être de bons outils pour l’établissement d’une immunothérapie après greffe de sang de cordon. De plus, la caractérisation fonctionnelle des pDC du greffon de sang de cordon a permis de révéler une plus faible production d’IFN-α par les pDC, comparativement aux pDC de sang d’adulte. Cette différence pourrait jouer un rôle dans la plus faible incidence de GvHD après les greffes de sang de cordon. Dans le but de préciser les mécanismes moléculaires de régulation négative de la production d’IFN-α par les pDC de sang de cordon, nous avons étudié les protéines de la voie de signalisation TLR9-IRF7. L’expression similaire de l’ARN du TLR9, MyD88, IRAK1 et IRF7 contraste avec la plus faible expression des protéines correspondantes. De plus, l’expression des MicroARNs miR-146a et miR-155 est plus élevé dans les pDC de sang de cordon comparativement aux pDC de sang d’adultes. Ensemble, ces données pointent une régulation négative post-transcriptionnelle de la voie TLR9-IRF7 qui pourrait expliquer la plus faible production d’IFN-α des pDC du sang de cordon. L’ensemble des ces travaux suggère que les pDC pourraient représenter une cible de choix dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques dans les greffes de sang de cordon.

L'évolution du phagosome

La phagocytose est un processus cellulaire par lequel de larges particules sont internalisées dans une vésicule, le phagosome. Lorsque formé, le phagosome acquiert ses propriétés fonctionnelles à travers un processus complexe de maturation nommé la biogénèse du phagolysosome. Cette voie implique une série d’interactions rapides avec les organelles de l’appareil endocytaire permettant la transformation graduelle du phagosome nouvellement formé en phagolysosome à partir duquel la dégradation protéolytique s’effectue. Chez l’amibe Dictyostelium discoideum, la phagocytose est employée pour ingérer les bactéries de son environnement afin de se nourrir alors que les organismes multicellulaires utilisent la phagocytose dans un but immunitaire, où des cellules spécialisées nommées phagocytes internalisent, tuent et dégradent les pathogènes envahissant de l’organisme et constitue la base de l’immunité innée. Chez les vertébrés à mâchoire cependant, la transformation des mécanismes moléculaires du phagosome en une organelle perfectionnée pour l’apprêtement et la présentation de peptides antigéniques place cette organelle au centre de l’immunité innée et de l’immunité acquise. Malgré le rôle crucial auquel participe cette organelle dans la réponse immunitaire, il existe peu de détails sur la composition protéique et l’organisation fonctionnelles du phagosome. Afin d’approfondir notre compréhension des divers aspects qui relient l’immunité innée et l’immunité acquise, il devient essentiel d’élargir nos connaissances sur les fonctions moléculaire qui sont recrutées au phagosome. Le profilage par protéomique à haut débit de phagosomes isolés fut extrêmement utile dans la détermination de la composition moléculaire de cette organelle. Des études provenant de notre laboratoire ont révélé les premières listes protéiques identifiées à partir de phagosomes murins sans toutefois déterminer le ou les rôle(s) de ces protéines lors du processus de la phagocytose (Brunet et al, 2003; Garin et al, 2001). Au cours de la première étude de cette thèse (Stuart et al, 2007), nous avons entrepris la caractérisation fonctionnelle du protéome entier du phagosome de la drosophile en combinant diverses techniques d’analyses à haut débit (protéomique, réseaux d’intéractions protéique et ARN interférent). En utilisant cette stratégie, nous avons identifié 617 protéines phagosomales par spectrométrie de masse à partir desquelles nous avons accru cette liste en construisant des réseaux d’interactions protéine-protéine. La contribution de chaque protéine à l’internalisation de bactéries fut ensuite testée et validée par ARN interférent à haut débit et nous a amené à identifier un nouveau régulateur de la phagocytose, le complexe de l’exocyst. En appliquant ce modèle combinatoire de biologie systémique, nous démontrons la puissance et l’efficacité de cette approche dans l’étude de processus cellulaire complexe tout en créant un cadre à partir duquel il est possible d’approfondir nos connaissances sur les différents mécanismes de la phagocytose. Lors du 2e article de cette thèse (Boulais et al, 2010), nous avons entrepris la caractérisation moléculaire des étapes évolutives ayant contribué au remodelage des propriétés fonctionnelles de la phagocytose au cours de l’évolution. Pour ce faire, nous avons isolé des phagosomes à partir de trois organismes distants (l’amibe Dictyostelium discoideum, la mouche à fruit Drosophila melanogaster et la souris Mus musculus) qui utilisent la phagocytose à des fins différentes. En appliquant une approche protéomique à grande échelle pour identifier et comparer le protéome et phosphoprotéome des phagosomes de ces trois espèces, nous avons identifié un cœur protéique commun à partir duquel les fonctions immunitaires du phagosome se seraient développées. Au cours de ce développement fonctionnel, nos données indiquent que le protéome du phagosome fut largement remodelé lors de deux périodes de duplication de gènes coïncidant avec l’émergence de l’immunité innée et acquise. De plus, notre étude a aussi caractérisée en détail l’acquisition de nouvelles protéines ainsi que le remodelage significatif du phosphoprotéome du phagosome au niveau des constituants du cœur protéique ancien de cette organelle. Nous présentons donc la première étude approfondie des changements qui ont engendré la transformation d’un compartiment phagotrophe à une organelle entièrement apte pour la présentation antigénique.

Rôle de l'axe CD40/CD40L dans la régulation de la fonction paquettaire

Le CD40 ligand (CD40L) est une molécule inflammatoire appartenant à la famille du Facteur de Nécrose Tumorale ("Tumor Necrosis Factor", TNF), originalement identifié au niveau des cellules immunitaires. L’interaction du CD40L avec son récepteur de haute affinité présent sur les cellules B, le CD40, est d’une importance cruciale à la production d’immunoglobulines lors de la réponse immunitaire. Aujourd’hui, nous savons que ces deux molécules qui constituent l’axe CD40/CD40L sont aussi exprimées au niveau des cellules du système vasculaire et occupent une place importante dans une variété de réactions inflammatoires, de sorte que le CD40L est présentement reconnu comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des évènements cardiovasculaires. Les plaquettes sont la principale source du CD40L soluble ("soluble CD40L", sCD40L) plasmatique et il fut démontré être impliqué dans l’activation plaquettaire, malgré que son impact exact sur la fonction plaquettaire et les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Ainsi, le but de ce projet était de déterminer l’impact du sCD40L sur la fonction plaquettaire et d’élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. Les objectifs spécifiques étaient : 1) d’évaluer l’impact du sCD40L sur l’activation et l’agrégation plaquettaire in vitro; 2) de déterminer le récepteur cible (CD40 ou autre) impliqué dans ces effets; 3) de décortiquer les voies signalétiques intracellulaires et moléculaires induites par le sCD40L, impliquant la participation potentielle de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor", TRAF) et 4) d’analyser l’effet du sCD40L sur la formation du thrombus in vivo. Le sCD40L augmente fortement l’activation et l’agrégation plaquettaire induite par de faibles doses d’agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n’interagit pas avec le CD40 et les plaquettes de souris CD40 déficientes (CD40-/-) ne furent pas en mesure d’induire ces effets. De plus, nous démontrons la présence de plusieurs membres de la famille des TRAFs dans les plaquettes, parmi lesquels seulement TRAF-2 interagit avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Le sCD40L agit sur les plaquettes au repos par l’entremise de la protéine Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase activatrice du mitogène p38 ("Mitogen Activating Protein Kinase", MAPK). Ceci mène ultimement au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l’actine. Par ailleurs, il est intéressant de noter que les souris CD40-/- démontrent un défaut significatif de l’agrégation plaquettaire en réponse au collagène, ce qui souligne l’importance du CD40 dans les interactions plaquettes-plaquettes. Dans un deuxième temps, le sCD40L amplifie l’agrégation plaquettaire en sang complet, accélère les temps de thrombose in vitro mesurés à l’aide du système PFA-100 et augmente l’adhésion plaquettaire au collagène sous condition de flux, le tout par l’entremise du CD40. Finalement, dans un modèle de thrombose artérielle murin, l’infusion du sCD40L exacerbe la formation du thrombus chez les souris du type sauvage ("Wild Type", WT), mais non chez les souris CD40-/-. Ceci fut en plus associé à une augmentation significative du nombre de leucocytes au sein du thrombus des souris WT traitées à l’aide du sCD40L, tel que démontré par marquage immuno-histologique anti-CD45 et par quantification des coupes artérielles par microscopie optique. En résumé, ce projet identifie une nouvelle voie signalétique, TRAF-2/Rac1/p38 MAPK, en réponse au sCD40L et démontre ses effets sur l’activation et l’agrégation plaquettaire. De manière encore plus importante, nous démontrons pour la première fois la présence d’une corrélation positive entre les niveaux circulants du sCD40L et la thrombose artérielle, tout en soulignant l’importance du CD40 dans ce processus. Ainsi, le sCD40L constitue un activateur important des plaquettes, les prédisposant à une thrombose exacerbée en réponse au dommage vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer le lien étroit qui existe entre les niveaux circulants du sCD40L et l’incidence des maladies cardiovasculaires.

Actin cytoskeleton regulates pollen tube growth and tropism

La fertilisation chez les plantes dépend de la livraison des cellules spermatiques contenues dans le pollen à l’ovule. Au contact du stigmate, le grain de pollen s’hydrate et forme une protubérance, le tube pollinique, chargé de livrer les noyaux spermatiques à l’ovule. Le tube pollinique est une cellule à croissance rapide, anisotrope et non autotrophe; ainsi tout au long de sa croissance à travers l’apoplaste du tissu pistillaire, le tube pollinique puise ses sources de carbohydrates et de minéraux du pistil. Ces éléments servent à la synthèse des constituants de la paroi qui seront acheminés par des vésicules de sécrétion jusqu’à l’apex du tube. Ce dernier doit aussi résister à des pressions mécaniques pour maintenir sa forme cylindrique et doit répondre à différents signaux directionnels pour pouvoir atteindre l’ovule. Mon projet de doctorat était de comprendre le rôle du cytosquelette dans la croissance anisotrope du tube pollinique et d’identifier les éléments responsables de sa croissance et de son guidage. Le cytosquelette du tube pollinique est composé des microfilaments d’actine et des microtubules. Pour assurer une bonne croissance des tubes polliniques in vitro, les carbohydrates et les éléments de croissance doivent être ajoutés au milieu à des concentrations bien spécifiques. J’ai donc optimisé les conditions de croissance du pollen d’Arabidopsis thaliana et de Camellia japonica qui ont été utilisés avec le pollen de Lilium longiflorum comme modèles pour mes expériences. J’ai développé une méthode rapide et efficace de fixation et de marquage du tube pollinique basée sur la technologie des microondes. J’ai aussi utilisé des outils pharmacologiques, mécaniques et moléculaires couplés à différentes techniques de microscopie pour comprendre le rôle du cytosquelette d’actine lors de la croissance et le tropisme du tube pollinique. J’ai trouvé que le cytosquelette d’actine et plus précisément l’anneau d’actine localisé dans la partie sub-apicale du tube est fortement impliqué dans la croissance et le maintien de l’architecture du tube à travers le contrôle de la livraison des vésicules de sécrétion. J’ai construit une chambre galvanotropique qui peut être montée sur un microscope inversé et qui sert à envoyer des signaux tropistiques bien précis à des tubes polliniques en croissance. J’ai trouvé que les filaments d’actine sont impliqués dans la capacité du tube pollinique à changer de direction. Ce comportement tropistique dépend de la concentration du calcium dans le milieu de croissance et du flux de calcium à travers des canaux calciques. Le gradient de calcium établi dans le tube pollinique affecte l’activité de certaines protéines qui se lient à l’actine et dont le rôle est la réorganisation des filaments d’actine. Parmi ces protéines, il y a celles de dépolymérisation de l’actine (ADF) dont deux spécifiquement exprimées dans le gamétophyte mâle d’Arabidopsis (ADF7 et ADF10). Par marquage avec des proteins fluorescents, j’ai trouvé que l’ADF7 et l’ADF10 ont des expressions différentielles pendant la microsporogenèse et la germination et croissance du tube pollinique et qu’elles partagent entre elles des rôles importants durant ces différents stades.

Études de type structure fonction du couplage électromécanique et de la coopérativité sous-unitaire chez les canaux potassiques dépendants du voltage

Les canaux potassiques voltage-dépendants forment des tétramères dont chaque sous-unité comporte six segments transmembranaires (S1 à S6). Le pore, formé des segments S5-S6 de chaque sous-unité, est entouré de quatre domaines responsables de la sensibilité au potentiel membranaire, les senseurs de voltage (VS; S1-S4). Lors d’une dépolarisation membranaire, le mouvement des résidus chargés situés dans le VS entraine un mouvement de charges détectable en électrophysiologie, le courant de « gating ». L’activation du VS conduit à l'ouverture du pore, qui se traduit par un changement de conformation en C-terminal du segment S6. Pour élucider les principes qui sous-tendent le couplage électromécanique entre ces deux domaines, nous avons étudié deux régions présumées responsables du couplage chez les canaux de type Shaker K+, soit la région carboxy-terminale du segment S6 et le lien peptidique reliant les segments transmembranaire S4-S5 (S4-5L). Avec la technique du « cut-open voltage clamp fluorometry » (COVCF), nous avons pu déterminer que l’interaction inter-sous-unitaire RELY, formée par des acides aminés situés sur le lien S4-5L et S6 de deux sous-unités voisines, est impliquée dans le développement de la composante lente observée lors du retour des charges de « gating » vers leur état de repos, le « OFF-gating ». Nous avons observé que l’introduction de mutations dans la région RELY module la force de ces interactions moléculaires et élimine l’asymétrie observée dans les courants de « gating » de type sauvage. D’ailleurs, nous démontrons que ce couplage inter-sous-unitaire est responsable de la stabilisation du pore dans l’état ouvert. Nous avons également identifié une interaction intra-sous-unitaire entre les résidus I384 situé sur le lien S4-5L et F484 sur le segment S6 d’une même sous-unité. La déstabilisation de cette interaction hydrophobique découple complètement le mouvement des senseurs de voltage et l'ouverture du pore. Sans cette interaction, l’énergie nécessaire pour activer les VS est moindre en raison de l’absence du poids mécanique appliqué par le pore. De plus, l’abolition du couplage électromécanique élimine également le « mode shift », soit le déplacement de la dépendance au voltage des charges de transfert (QV) vers des potentiels hyperpolarisants. Ceci indique que le poids mécanique du pore imposé au VS entraine le « mode shift », en modulant la conformation intrinsèque du VS par un processus allostérique.

Genome wide search for genetic determinants of habitual alcohol, tobacco and coffee use, obesity-related traits, response to mental and physical stress and hemodynamic traits

Les habitudes de consommation de substances psychoactives, le stress, l’obésité et les traits cardiovasculaires associés seraient en partie reliés aux mêmes facteurs génétiques. Afin d’explorer cette hypothèse, nous avons effectué, chez 119 familles multi-générationnelles québécoises de la région du Saguenay-Lac-St-Jean, des études d’association et de liaison pangénomiques pour les composantes génétiques : de la consommation usuelle d’alcool, de tabac et de café, de la réponse au stress physique et psychologique, des traits anthropométriques reliés à l’obésité, ainsi que des mesures du rythme cardiaque (RC) et de la pression artérielle (PA). 58000 SNPs et 437 marqueurs microsatellites ont été utilisés et l’annotation fonctionnelle des gènes candidats identifiés a ensuite été réalisée. Nous avons détecté des corrélations phénotypiques significatives entre les substances psychoactives, le stress, l’obésité et les traits hémodynamiques. Par exemple, les consommateurs d’alcool et de tabac ont montré un RC significativement diminué en réponse au stress psychologique. De plus, les consommateurs de tabac avaient des PA plus basses que les non-consommateurs. Aussi, les hypertendus présentaient des RC et PA systoliques accrus en réponse au stress psychologique et un indice de masse corporelle (IMC) élevé, comparativement aux normotendus. D’autre part, l’utilisation de tabac augmenterait les taux corporels d’épinéphrine, et des niveaux élevés d’épinéphrine ont été associés à des IMC diminués. Ainsi, en accord avec les corrélations inter-phénotypiques, nous avons identifié plusieurs gènes associés/liés à la consommation de substances psychoactives, à la réponse au stress physique et psychologique, aux traits reliés à l’obésité et aux traits hémodynamiques incluant CAMK4, CNTN4, DLG2, DAG1, FHIT, GRID2, ITPR2, NOVA1, NRG3 et PRKCE. Ces gènes codent pour des protéines constituant un réseau d’interactions, impliquées dans la plasticité synaptique, et hautement exprimées dans le cerveau et ses tissus associés. De plus, l’analyse des sentiers de signalisation pour les gènes identifiés (P = 0,03) a révélé une induction de mécanismes de Potentialisation à Long Terme. Les variations des traits étudiés seraient en grande partie liées au sexe et au statut d’hypertension. Pour la consommation de tabac, nous avons noté que le degré et le sens des corrélations avec l’obésité, les traits hémodynamiques et le stress sont spécifiques au sexe et à la pression artérielle. Par exemple, si des variations ont été détectées entre les hommes fumeurs et non-fumeurs (anciens et jamais), aucune différence n’a été observée chez les femmes. Nous avons aussi identifié de nombreux traits reliés à l’obésité dont la corrélation avec la consommation de tabac apparaît essentiellement plus liée à des facteurs génétiques qu’au fait de fumer en lui-même. Pour le sexe et l’hypertension, des différences dans l’héritabilité de nombreux traits ont également été observées. En effet, des analyses génétiques sur des sous-groupes spécifiques ont révélé des gènes additionnels partageant des fonctions synaptiques : CAMK4, CNTN5, DNM3, KCNAB1 (spécifique à l’hypertension), CNTN4, DNM3, FHIT, ITPR1 and NRXN3 (spécifique au sexe). Ces gènes codent pour des protéines interagissant avec les protéines de gènes détectés dans l’analyse générale. De plus, pour les gènes des sous-groupes, les résultats des analyses des sentiers de signalisation et des profils d’expression des gènes ont montré des caractéristiques similaires à celles de l’analyse générale. La convergence substantielle entre les déterminants génétiques des substances psychoactives, du stress, de l’obésité et des traits hémodynamiques soutiennent la notion selon laquelle les variations génétiques des voies de plasticité synaptique constitueraient une interface commune avec les différences génétiques liées au sexe et à l’hypertension. Nous pensons, également, que la plasticité synaptique interviendrait dans de nombreux phénotypes complexes influencés par le mode de vie. En définitive, ces résultats indiquent que des approches basées sur des sous-groupes et des réseaux amélioreraient la compréhension de la nature polygénique des phénotypes complexes, et des processus moléculaires communs qui les définissent.