Données nouvelles sur l’innervation à dopamine du striatum et son co-phénotype glutamatergique

Une sous-population des neurones à dopamine (DA) du mésencéphale ventral du rat et de la souris étant connue pour exprimer l'ARN messager du transporteur vésiculaire 2 du glutamate (VGLUT2), nous avons eu recours à l'immunocytochimie en microscopie électronique, après simple ou double marquage de l'enzyme de synthèse tyrosine hydroxylase (TH) et de VGLUT2, pour déterminer la présence de l'une et/ou l'autre protéine dans les terminaisons (varicosités) axonales de ces neurones et caractériser leur morphologie ultrastructurale dans diverses conditions expérimentales. Dans un premier temps, des rats jeunes (P15) ou adultes (P90), ainsi que des rats des deux âges soumis à l'administration intraventriculaire cérébrale de la cytotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans les jours suivant la naissance, ont été examinés, afin d'étayer l'hypothèse d'un rôle de VGLUT2 au sein des neurones DA, au cours du développement normal ou pathologique de ces neurones. Chez le jeune rat, ces études ont montré: i) la présence de VGLUT2 dans une fraction importante des varicosités axonales TH immunoréactives du coeur du noyau accumbens ainsi que du néostriatum; ii) une augmentation de la proportion de ces terminaisons doublement marquées dans le noyau accumbens par suite de la lésion 6-OHDA néonatale; iii) le double marquage fréquent des varicosités axonales appartenant à l'innervation DA aberrante (néoinnervation), qui se développe dans la substance noire, par suite de la lésion 6-OHDA néonatale. Des différences significatives ont aussi été notées quant à la dimension des terminaisons axonales marquées pour la TH seulement, VGLUT2 seulement ou TH et VGLUT2. Enfin, à cet âge (P15), toutes les terminaisons doublement marquées sont apparues dotées d'une spécialisation membranaire synaptique, contrairement aux terminaisons marquées pour la TH ou pour VGLUT2 seulement. Dans un deuxième temps, nous avons voulu déterminer le devenir du double phénotype chez le rat adulte (P90) soumis ou non à la lésion 6-OHDA néonatale. Contrairement aux observations recueillies chez le jeune rat, nous avons alors constaté: i) l'absence complète de terminaisons doublement marquées dans le coeur du noyau accumbens et le néostriatum d'animaux intacts, de même que dans les restes de la substance noire des animaux 6-OHDA lésés; ii) une très forte baisse de leurnombre dans le coeur du noyau accumbens des animaux 6-OHDA lésés. Ces observations, suggérant une régression du double phénotype TH/VGLUT2 avec l'âge, sont venues renforcer l'hypothèse d'un rôle particulier d'une co-libération de glutamate par les neurones mésencéphaliques DA au cours du développement. Dans ces conditions, il est apparu des plus intéressants d'examiner l'innervation DA méso-striatale chez deux lignées de souris dont le gène Vglut2 avait été sélectivement invalidé dans les neurones DA du cerveau, ainsi que leurs témoins et des souris sauvages. D'autant que malgré l'utilisation croissante de la souris en neurobiologie, cette innervation DA n'avait jamais fait l'objet d’une caractérisation systématique en microscopie électronique. En raison de possibles différences entre le coeur et la coque du noyau accumbens, l'étude a donc porté sur les deux parties de ce noyau ainsi que le néostriatum et des souris jeunes (P15) et adultes (P70-90) de chaque lignée, préparées pour l'immunocytochimie de la TH, mais aussi pour le double marquage TH et VGLUT2, selon le protocole précédemment utilisé chez le rat. Les résultats ont surpris. Aux deux âges et quel que soit le génotype, les terminaisons axonales TH immunoréactives des trois régions sont apparues comparables quant à leur taille, leur contenu vésiculaire, le pourcentage contenant une mitochondrie et une très faible incidence synaptique (5% des varicosités, en moyenne). Ainsi, chez la souris, la régression du double phénotype pourrait être encore plus précoce que chez le rat, à moins que les deux protéines ne soient très tôt ségréguées dans des varicosités axonales distinctes des mêmes neurones DA. Ces données renforcent aussi l’hypothèse d’une transmission diffuse (volumique) et d’un niveau ambiant de DA comme élément déterminant du fonctionnement du système mésostriatal DA chez la souris comme chez le rat.

La modulation transcriptionnelle du neuropeptide enképhaline par les récepteurs nucléaires Nur77 et RXRγ

Certains neuropeptides (enképhaline et neurotensine) sont des modulateurs du système dopaminergique. Chez les rongeurs, le traitement avec l’antipsychotique typique halopéridol (antagoniste des récepteurs D2), augmente fortement leurs niveaux d’ARNm dans le striatum, une structure centrale du système dopaminergique qui contrôle l’activité locomotrice. Comme l’halopéridol est associé avec de nombreux effets secondaires moteurs, on peut penser que la modulation des neuropeptides est possiblement un mécanisme d’adaptation visant à rétablir l’homéostasie du système dopaminergique après le blocage des récepteurs D2. Cependant, le mécanisme moléculaire de cette régulation transcriptionnelle n’est pas bien compris. Nur77 est un facteur de transcription de la famille des récepteurs nucléaires orphelins qui agit en tant que gène d’induction précoce. Le niveau de son ARNm est aussi fortement augmenté dans le striatum suivant un traitement avec halopéridol. Plusieurs évidences nous suggèrent que Nur77 est impliqué dans la modulation transcriptionnelle des neuropeptides. Nur77 peut former des hétérodimères fonctionnels avec le récepteur rétinoïde X (RXR). En accord avec une activité transcriptionnelle d’un complexe Nur77/RXR, l’agoniste RXR (DHA) réduit tandis que l’antagoniste RXR (HX531) augmente les troubles moteurs induits par un traitement chronique à l’halopéridol chez les souris sauvages tandis que ces ligands pour RXR n’ont aucun effet chez les souris Nur77 nulles. Nos travaux ont révélé que l’antagoniste RXR (HX531) réduit l’augmentation des niveaux d’enképhaline suivant un traitement chronique avec l’halopéridol. Nous avons ensuite démontré la liaison in vitro de Nur77 sur un élément de réponse présent dans le promoteur proximal de la proenképhaline, le peptide précurseur de l’enképhaline. Ces résultats supportent l’hypothèse que Nur77, en combinaison avec RXR, pourrait participer à la régulation transcriptionnelle des neuropeptides dans le striatum et donc contribuer à la neuroadaptation du système dopaminergique suivant un traitement aux antipsychotiques typiques.

Impact du stress oxydant sur les mécanismes de clairance alvéolaire et de réparation épithéliale pulmonaires

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Inhibition of respiratory syncytial virus by nasally administered siRNA modified with F-ANA

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les cibles transcriptionnelles du polycomb Rae28 lors du développement de l'oeil : l'hypothèse du locus Ink4a/Arf

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Implications des canaux K+ sur la régulation génique du canal ENaC, et impact de l'hyperglycémie sur le transport ionique et la réparation de l'épithélium respiratoire

Dans mon projet de doctorat, j’ai étudié des fonctions primordiales de l’épithélium respiratoire telles que la régulation du transport ionique, la clairance liquidienne et la réparation épithéliale. J’ai particulièrement mis l’emphase sur le rôle des canaux potassiques qui interviennent dans ces trois fonctions de l’épithélium respiratoire. J’ai tout d’abord prouvé que la modulation des canaux potassiques régulait l’activité du promoteur de αENaC, en partie via la voie de signalisation ERK1/2, dans des cellules alvéolaires. Cette régulation entraîne une variation de l’expression génique et protéique du canal ENaC. Physiologiquement, il en résulte une augmentation du phénomène de clairance liquidienne suite à l’activation des canaux K+, tandis que l’inhibition de ces canaux la diminue sévèrement. J’ai aussi pu démontrer que l’absence de canal KvLQT1 entraînait une diminution du courant (ENaC) sensible à l’amiloride, dans les cellules de trachée en culture primaire, isolées de souris KO pour kcnq1. Dans la seconde partie de mon étude, j’ai évalué l’impact de l’hyperglycémie sur la capacité de transport ionique et de réparation de cellules épithéliales bronchiques saines ou Fibrose Kystique. Mes résultats montrent que l’hyperglycémie diminue le transport transépithélial de chlore et le transport basolatéral de potassium. Des études préalables du laboratoire ayant montré que les canaux K+ et Cl- contrôlent les processus de réparation, j’ai donc évalué si ceux-ci étaient modifiés par l’hyperglycémie. Et en effet, l’hyperglycémie ralentit la vitesse de réparation des cellules issues des voies aériennes (CFBE-wt et CFBE-ΔF508). J’ai donc démontré que le transport de potassium intervenait dans des fonctions clés de l’épithélium respiratoire, comme dans la régulation génique de canaux ioniques, le contrôle de la clairance liquidienne alvéolaire, et que l’hyperglycémie diminuait le transport ionique (K+ et Cl-) et la réparation épithéliale.

Régulation du métabolisme et du transport des lipides dans les macrophages : potentiel anti-athérosclérotique des ligands du CD36

Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans les pays industrialisés. Le récepteur CD36, exprimé à la surface des macrophages, joue un rôle déterminant dans l’internalisation des lipoprotéines oxydées menant à la formation des cellules spumeuses dans l’espace sous endothélial, première étape du développement des lésions athérosclérotiques. Nous avons montré précédemment que les sécrétines de l’hormone de croissance sont des ligands du récepteur CD36 qui possèdent un site de liaison qui chevauche celui des lipoprotéines oxydées. Cependant, aucune étude n’avait rapporté les effets potentiels des ligands sélectifs du CD36 sur la progression des lésions athérosclérotiques et le métabolisme lipidique au niveau des macrophages. Ainsi, ce projet de doctorat visait à évaluer le potentiel anti-athérosclérotique du EP 80317, un ligand sélectif du CD36, et élucider les mécanismes à l’origine de ses effets sur le métabolisme et le transport des lipides au niveau des macrophages. À cette fin, des souris déficientes en apolipoprotéine E (apoE-/-), nourries avec une diète riche en lipides et en cholestérol, ont été traitées quotidiennement pendant 12 semaines avec le EP 80317, montrant un puissant effet anti-athérosclérotique associé à une réduction de 51% des lésions aortiques et de 30% du taux plasmatique de cholestérol total. Cette même étude a permis de montrer une réduction de l’internalisation des lipoprotéines oxydées ainsi qu’une augmentation de l’expression des gènes/protéines impliqués dans l’efflux du cholestérol au niveau des macrophages, comme le peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), liver x receptor α (LXRα) et les transporteurs ABCA1 et ABCG1, entraînant une réduction de la formation des cellules spumeuses. Ces observations nous ont conduits à élucider les mécanismes moléculaires engendrés par la liaison d’un ligand sélectif au récepteur CD36 dans les macrophages. Les études ont permis de montrer que les ligands du CD36 entraînent une augmentation de l’efflux du cholestérol vers les transporteurs ABCA1 et ABCG1 en augmentant l’expression protéique de la cyclooxygénase 2 (COX-2) consécutive à la phosphorylation de la MAP kinase ERK1/2. L’activation de COX-2 stimule la production intracellulaire de la prostaglandine 15d-PGJ2, cette dernière conduisant à l’activation du PPARγ. Finalement, une troisième étude nous a permis de mettre en évidence les effets du EP 80317 sur le transport inverse du cholestérol in vivo. L’injection de macrophages J774 radiomarqués avec du cholestérol tritié dans la cavité péritonéale de souris avec le EP 80317 nous a permis de montrer que le EP 80317 entraîne une réduction de la radioactivité retrouvée dans le foie tandis qu’il augmente celle retrouvée dans les fèces par comparaison aux souris contrôles, sans néanmoins modifier le profil plasmatique du radiotraceur entre les deux groupes. De plus, l’expression des gènes impliqués dans le transport du cholestérol au niveau intestinal comme le LXRα, ABCA1, ABCG5 ainsi que ABCG8 ont été régulés à la hausse par le EP 80317 tandis que l’expression de NPC1L1, un transporteur impliqué dans l’absorption du cholestérol, a été régulé à la baisse. Toutefois, les gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol au niveau du foie ne sont pas modulés par le EP 80317. En conclusion, les travaux effectués dans le cadre de cette thèse nous ont permis de montrer que l’activation du récepteur CD36 par le EP 80317 pourrait s’avérer être une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l’athérosclérose. Les effets anti-athérosclérotiques et hypocholestérolémiants des ligands synthétiques du récepteur CD36 sont en partie engendrés par 1) la régulation du métabolisme des lipides au niveau des macrophages en réponse à l’activation du PPARγ par son ligand endogène, le 15d-PGJ2 et 2) par une augmentation du transport inverse du cholestérol, particulièrement par une augmentation de l’efflux transintestinal.

Mécanismes cellulaires de l'induction du facteur de transcription Nur77 après un traitement aux antipsychotiques

Les antipsychotiques sont utilisés en clinique depuis plus de 50 ans pour pallier aux symptômes de la schizophrénie. Malgré une recherche intensive, les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’effet clinique de cette médication demeurent encore nébuleux. Ces drogues sont reconnues comme des antagonistes des récepteurs D2 de la dopamine et peuvent moduler la transcription génique dans le striatum. Au cours des recherches qui ont mené à l'écriture de cette thèse, nous avons exploré l’expression de Nur77, un facteur de transcription de la famille des récepteurs nucléaires, afin de caractériser le rôle de la dopamine, la sérotonine, l’adénosine et le glutamate dans la régulation génique contrôlée par les antagonistes D2. En premier lieu, nous avons examiné l’impact de la co-administration d’agents sérotonergiques et adrénergiques sur l’expression de l’ARNm de Nur77 induite par l’halopéridol, un antipsychotique de première génération. Nous avons observé que le 8-OH-DPAT et le MDL11939 préviennent partiellement l’induction de Nur77 dans le striatum. Au contraire, l’idazoxan potentialise l’effet de l’halopéridol sur l’expression de Nur77 alors que le prazosin reste sans effet. Ces résultats démontrent que l’expression striatale de Nur77 induite par l’halopéridol peut être modulée à la baisse avec un agoniste 5-HT1A ou un antagoniste 5-HT2A. Par la suite, nous avons évalué dans divers paradigmes expérimentaux l’effet de l’éticlopride, un antagoniste spécifique D2, afin d’explorer davantage le mécanisme de l’effet transcriptionnel des antagonistes D2. Étonnamment, la suppression de l’isoforme D2L chez la souris D2L KO ne réduit pas la réponse de l’éticlopride dans le striatum. Par contre, une lésion corticale avec l’acide iboténique bloque l’effet de l’éticlopride sur la transcription de Nur77, suggérant un rôle du glutamate. La combinaison d’un antagoniste des récepteurs métabotropes du glutamate de types 5 (mGluR5) et d’un antagoniste des récepteurs de l’adénosine A2A abolit complètement l’augmentation de la transcription de Nur77 induit par l’éticlopride dans le striatum. La modulation directe de l’expression striatale de Nur77 par les récepteurs mGluR5 et A2A a été confirmée dans un modèle de cultures organotypiques de tranches cérébrales. Ces résultats démontrent clairement que la modulation de l’expression génique dans le striatum, à la suite d’un traitement avec un antagoniste D2 pourrait être indépendante d’une interaction directe avec les récepteurs D2 post-synaptiques, et reposerait plutôt sur son interaction avec les récepteurs D2 hétérosynaptiques des afférences corticostriées et l’activation subséquente des récepteurs post-synaptiques du glutamate et de l’adénosine. En résumé, nos résultats suggèrent que l’interaction des antipsychotiques atypiques avec les récepteurs 5-HT2A et 5-HT1A pourrait expliquer la différence dans le patron d’expression génique induit par ces drogues en comparaison avec les antipsychotiques typiques. De plus, nos résultats révèlent un nouveau mécanisme d’action des antagonistes D2 et supportent un rôle primordial du glutamate et de l’adénosine dans les effets des antipsychotiques de première génération.

Role of receptor and non-receptor protein tyrosine kinases in vasoactive peptide-induced signaling

L'endothéline-1 (ET-1) et l'angiotensine II (Ang II) jouent un rôle important dans le maintien de la pression artérielle et l'homéostasie vasculaire. Une activité accrue de ces peptides vasoactifs est présumée contribuer au développement de pathologies vasculaires, telles que l'hypertension, l'athérosclérose, l'hypertrophie et la resténose. Ceci est causé par une activation excessive de plusieurs voies de signalisation hypertrophiques et prolifératives, qui incluent des membres de la famille des Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK), ainsi que la famille phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) / protéine kinase B (PKB). Bien que l'activation de ces voies de signalisation soit bien élucidée, les éléments en amont responsables de l'activation des MAPK et de la PKB, induite par l'ET-1 et Ang II, demeurent mal compris. Durant les dernières années, le concept de la transactivation de récepteurs et/ou non-récepteurs protéines tyrosine kinases (PTK) dans le déclenchement des événements de signalisation induits par les peptides vasoactifs a gagné beaucoup de reconnaissance. Nous avons récemment démontré que la PTK Insulin-like Growth Factor type-1 Receptor (IGF-1R) joue un rôle dans la transduction des signaux induits par l‟H2O2, menant à la phosphorylation de la PKB. Étant donné que les peptides vasoactifs génèrent des espèces réactives d'oxygène, telles que l‟H2O2 lors de leur signalisation, nous avons examiné le rôle de d‟IGF-1R dans la phosphorylation de la PKB et les réponses hypertrophiques dans les cellules muscle lisse vasculaires (CMLV) induites par l'ET-1 et Ang II. AG-1024, un inhibiteur spécifique de l'IGF-1R, a atténué la phosphorylation de la PKB induite à la fois par l'ET-1 et Ang II. Le traitement des CMLVs avec l‟ET-1 et Ang II a également induit une phosphorylation des résidus tyrosine dans les sites d'autophosphorylation d'IGF-1R, celle-ci a été bloquée par l‟AG-1024. En outre, l‟ET-1 et l‟Ang II on tous les deux provoqué la phosphorylation de c-Src, une PTK non-récepteur, bloqué par PP-2, inhibiteur spécifique de la famille Src. La PP-2 a également inhibé la phosphorylation de PKB et d‟IGF-1R induite par l‟ET-1 et l‟Ang II. De plus, la synthèse de protéines ainsi que d‟ADN, marqueurs de la prolifération cellulaire et de l'hypertrophie, ont également été atténuée par l‟AG-1024 et le PP-2. Bien que ce travail démontre le rôle de c-Src dans la phosphorylation PKB induite par l'ET-1 et Ang II, son rôle dans l'activation des MAPK induit par l'ET-1 dans les CMLVs reste controversé. Par conséquent, nous avons examiné l'implication de c-Src dans l'activation de ERK 1/2, JNK et p38MAPK, par l'ET-1 et Ang II, ainsi que leur capacité à régulariser l'expression du facteur de transcription Early growth transcription factor-1 « Egr-1 ». ET-1 et Ang II ont induit la phosphorylation de ERK 1/2, JNK et p38 MAPK, et ont amplifié l'expression d'Egr-1 dans les CMLVs. Cette augmentation de la phosphorylation des MAPK a été diminuée par la PP-2, qui a aussi atténué l'expression d'Egr-1 induite par l'ET-1 et l'Ang II. Une preuve supplémentaire du rôle de c-Src dans ce processus a été obtenue en utilisant des fibroblastes embryonnaires de souris déficientes en c-Src (Src -/- MEF). L'expression d'Egr-1, ainsi que l'activation des trois MAPKs par l'ET-1 ont été atténuées dans les cellules Src -/- par rapport au MEF exprimant des taux normaux Src. En résumé, ces données suggèrent que l'IGF-1R et c-Src PTK jouent un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation de PKB et des MAPK dans l‟expression d'Egr-1, ainsi que dans les réponses hypertrophiques et prolifératives induites par l'ET-1 et Ang II dans les CMLVs.

Nouvelle approche pour modifier le tropisme des vecteurs adénoviraux à l’aide de ligands bispécifiques

L’adénovirus a été étudié dans l’optique de développer de nouveaux traitements pour différentes maladies. Les vecteurs adénoviraux (AdV) sont des outils intéressants du fait qu’ils peuvent être produits en grandes quantités (1X1012 particules par millilitre) et de par leur capacité à infecter des cellules quiescentes ou en division rapide. Les AdVs ont subi bon nombre de modifications pour leur permettre de traiter des cellules tumorales ou pour transporter des séquences génétiques exogènes essentielles pour le traitement de maladies monogéniques. Toutefois, les faibles niveaux d’expression du récepteur primaire de l’adénovirus, le CAR (récepteur à l’adénovirus et au virus coxsackie), réduit grandement l’efficacité de transduction dans plusieurs tumeurs. De plus, certains tissus normaux comme les muscles n’expriment que très peu de CAR, rendant l’utilisation des AdVs moins significative. Pour pallier à cette limitation, plusieurs modifications ont été générées sur les capsides virales. L’objectif de ces modifications était d’augmenter l’affinité des AdVs pour des récepteurs cellulaires spécifiques surexprimés dans les tumeurs et qui seraient exempts dans les tissus sains avoisinant. On peut mentionner dans les approches étudiées: l’utilisation de ligands bispécifiques, l’incorporation de peptides dans différentes régions de la fibre ou la substitution par une fibre de sérotypes différents. Notre hypothèse était que les domaines d’interaction complémentaire (K-Coil et ECoil) permettraient aux ligands de s’associer aux particules virales et d’altérer le tropisme de l’AdV. Pour ce faire, nous avons inclus un domaine d’interaction synthétique, le K-Coil,dans différentes régions de la fibre virale en plus de générer des mutations spécifiques pour abolir le tropisme naturel. Pour permettre la liaison avec les récepteurs d’intérêt dont l’EGF-R, l’IGF-IR et le CEA6, nous avons fusionné le domaine d’interaction complémentaire, le E-Coil, soit dans les ligands des récepteurs ciblés dont l’EGF et l’IGF-I, soit sur un anticorps à un seul domaine reconnaissant la protéine membranaire CEA6, l’AFAI. Suite à la construction des différents ligands de même que des différentes fibres virales modifiées, nous avons determiné tout d’abord que les différents ligands de même que les virus modifiés pouvaient être produits et que les différentes composantes pouvaient interagir ensemble. Les productions virales ont été optimisées par l’utilisation d’un nouveau protocole utilisant l’iodixanol. Ensuite, nous avons démontré que l’association des ligands avec le virus arborant une fibre modifiée pouvait entraîner une augmentation de transduction de 2 à 21 fois dans différentes lignées cellulaires. À cause de la difficulté des adénovirus à infecter les fibres musculaires occasionnée par l’absence du CAR, nous avons cherché à savoir si le changement de tropisme pourrait accroître l’infectivité des AdVs. Nous avons démontré que l’association avec le ligand bispécifique IGF-E5 permettait d’accroître la transduction autant dans les myoblastes que dans les myotubes de souris. Nous avons finalement réussi à démontrer que notre système pouvait induire une augmentation de 1,6 fois de la transduction suite à l’infection des muscles de souriceaux MDX. Ces résultats nous amènent à la conclusion que le système est fonctionnel et qu’il pourrait être évalué dans des AdVs encodant pour différents gènes thérapeutiques.

Antidiabetic activity of Vaccinium vitis-idaea, a medicinal plant from the traditional pharmacopeia of the James Bay Cree

L’incidence du diabète chez les premières nations du Canada est plus de trois fois celle du reste du pays, dû, en partie, aux traitements culturellement inappropriés. Notre projet vise à traiter le diabète chez ces populations à partir de leur pharmacopée de médicine traditionnelle afin d’améliorer l’acceptation des traitements. En utilisant une approche ethnobotanique, notre équipe a identifié 17 plantes médicinales utilisées pour traiter des symptômes du diabète par les Cris d'Eeyou Istchee (Baie James, Québec). Parmi eux, l'extrait éthanolique de baies de Vaccinium vitis-idaea a montré un effet stimulateur sur le transport du glucose dans les cellules musculaires squelettiques et les adipocytes en culture. Le but de cette thèse était d’élucider les mécanismes par lesquels cet extrait exerce ses effets anti-hyperglycémiants, d’identifier ses principes actifs et de confirmer in vivo, son efficacité. Les résultats démontrent que V.vitis a augmenté le transport du glucose dans les cellules musculaires en cultures, C2C12 et L6 et a stimulé la translocation des transporteurs GLUT4 dans les cellules L6. L'extrait a également inhibé la respiration dans les mitochondries isolées du foie du rat. Cet effet est semblable à celui de la metformine et en lien avec la production du stress métabolique et l'activation de l'AMPK. De plus, la voie de signalisation de l’insuline ne semble pas être impliquée dans le mécanisme d’action de V. vitis. Le fractionnement guidé par la stimulation du transport du glucose a mené à l'isolation des principes actifs; la quercétine, la quercétine-3-O-galactoside, et la quercétine-3-O-glucoside. Comparable à l'extrait brut, ses composés ont stimulé la voie AMPK. Cependant, la quércetine était la seule à inhiber la respiration mitochondriale. Pour valider l'effet de V.vitis in vivo, l'extrait (1% dans l'eau de boisson) a été administré aux souris KKAy pendant 10 jours. La glycémie et le poids corporel ont été significativement réduits par V.vitis. Ces effets ont été associés à une diminution de la prise alimentaire, ce qui suggère que V.vitis diminue l'appétit. L'étude pair-fed a confirmé que les effets de V.vitis sont, majoritairement, dû à la réduction de l’appétit. De plus, V.vitis a augmenté la teneur en GLUT4 dans le muscle squelettique, a stimulé la iv phosphorylation de l'ACC et a augmenté les niveaux de PPAR-α dans le foie des souris KKAy. Ces effets se voient être additifs à l’effet anorexigène de V. vitis. Au cours du fractionnement bioguidé de l’extrait, l’ester méthylique de l'acide caféique (CAME), un produit formé lors de la procédure du fractionnement, a démontré un effet stimulateur puissant sur le transport du glucose dans les celules C2C12 et donc un potentiel anti-diabétique. Pour identifier d'autres acides caféique active (AC) et pour élucider leurs relations structure-activité et structure-toxicité, vingt dérivés AC ont été testés. Outre CAME, quatre composés ont stimulé le transport du glucose et ont activé l'AMPK suite au stress métabolique résultant d'un découplage de la phosphorylation oxydative mitochondriale. L’activité nécessite une fonction d’AC intacte dépourvu de groupements fortement ionisés et ceci était bien corrélée avec la lipophilicite et la toxicité. Les résultats de cette thèse soutiennent le potentiel thérapeutique de V. vitis, ses composés actifs ainsi que de la famille de l’AC et pour la prévention et le traitement du diabète.

Heteroplasmy in mammal mitochondrial deoxyribonucleic acid

La nature a développé diverses stratégies afin d’assurer le commencement de la vie dans des conditions d’homoplasmie, c’est-à-dire des conditions telles que les cellules sont dotées du même ADN mitochondrial. Toutefois, des nouveaux haplotypes de l’acide désoxyribonucléique mitochondrial (ADNmt) peuvent apparaitre et croître de plusieurs façons tout au long de la durée d’une vie menant à l’hétéroplasmie. Par exemple, l’hétéroplasmie de l’ADNmt peut être créée artificiellement par des technologies reproductives assistées, ainsi que naturellement par le processus de vieillissement. De ce fait, la thèse de ce doctorat fut divisée en deux principaux objectifs. Le premier étant celui d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt produit par le transfert nucléaire des cellules somatiques (SCNT) lors du développement de l’embryon jusqu’au fœtus et aux tissus adultes de bovins clonés. En ce qui concerne le second objectif, il s’agit d’analyser les changements survenus dans l’hétéroplasmie de l’ADNmt causés par le vieillissement dans une cellule somatique adulte et dans des tissus germinaux durant l’ovogénèse, ainsi qu’au début de l’embryogenèse et dans la procédure de culture in vitro sur des souris. Dans la première série d’expériences sur des bovins, des fibroblastes fœtaux transportant une mutation d’ADNmt (insertion de 66 pb) furent fusionnés avec des ovocytes receveurs transportant l’ADNmt du type sauvage. La présence d’ADNmt venant de la cellule donneuse a été analysée à différents stades de développement, soit sur des embryons âgés de 17 jours (n=17), des fœtus âgés de 40 jours (n=3), des fœtus âgés de 60 jours (n=3), un fœtus âgé de 240 jours et 3 clones post-nataux âgés de 18 à 24 mois. Chaque individu s’est avéré être hétéroplasmique et 99 % (103/104) des échantillons de tissus analysés étaient également hétéroplasmiques. Cependant, l’ovaire venant du fœtus de 240 jours fut le seul à être homoplasmique pour l’ADNmt de l’ovocyte receveur. Dans la plupart des échantillons analysés (95,2 %, soit 99/104) la moyenne d’hétéroplasmie était de 1,46 %. Par contre, un fœtus âgé de 40 jours a présenté un niveau élevé d’hétéroplasmie (20,9 %), indiquant ainsi que des évènements rares d’augmentation de l’ADNmt des cellules donneuses peuvent survenir. Étant donné que la majorité des clones SCNT montrait de l’hétéroplasmie de l’ADNmt à des proportions comparables à celles des cellules donneuses au moment de la reconstruction de l’embryon, on a pu conclure que l’hétéroplasmie produite par des techniques de transfert nucléaire utilisant des cellules somatiques est due à une ségrégation neutre de l’ADNmt. Dans la seconde série d’expériences sur des souris, des femelles de différents âges, c.à.d. jeunes (0 – 8 mois), moyennes (8 – 16 mois) et vieilles (16 – 24 mois), ont été synchronisées (gonadotrophines) et sacrifiées dans le but d’obtenir des ovocytes au stade de vésicule germinal, et des ovocytes au stade métaphase-II produits in vivo et in vitro. De plus, des embryons in vivo et in vitro au stade de deux-cellules et des embryons au stade de blastocystes ont été obtenus de femelles jeunes. Différents tissus somatiques, venant de femelles des trois stades d’âge ont été obtenus : cerveau, foie, muscle et du cumulus ovocytaire. De plus, l’effet du vieillissement a été mesuré selon la fertilité de la femelle. En effet, les effets sur l’hétéroplasmie du vieillissement, du stade de développement et de la culture in vitro ont été mesurés dans des ovocytes et dans des embryons. Les effets du vieillissement sur les mitochondries ont été mesurés par rapport au nombre total de copies de l’ADNmt, au pourcentage des délétions communes et sur l’expression de trois gènes : Ndufs4, Mt-nd2 and Mt-nd4. Il a été possible d’observer que la fertilité des femelles dans la colonie de souris diminuait avec l’âge. En fait, le vieillissement affectait l’ADNmt dans les tissus somatiques, cependant il n’avait pas d’effet sur le cumulus, les ovocytes et les embryons. Le nombre de délétions de l’ADNmt augmentait pendant la reprise de la méiose et celui-ci diminuait au début du développement embryonnaire. La culture in vitro n’affectait pas la quantité d’ADNmt dans la plupart des tissus germinaux. Puisque nous n’avons pas trouvé d’effet de l’âge dans la majorité des paramètres mitochondriaux analysés dans les ovocytes et les embryons, il est suggéré que la délétion commune de l’ADNmt dans les tissus germinaux est davantage reliée au statut cellulaire de la production d’énergie qu’au processus de vieillissement. Deux sources différentes de mutations de l’ADNmt produites dans les ovocytes normaux ou reconstitués ont produit différents résultats d’hétéroplasmie au début de l’embryogénèse. Chez les bovins, l’hétéroplasmie artificielle impliquant une petite insertion (66 pb) dans la région non codante (D-loop) de l’ADNmt a été vraisemblablement non nocive pour l’embryon, tolérant la persistance de l’ADNmt étranger pendant les différents stades du développement des clones. Chez les souris, l’hétéroplasmie naturelle produite par une grande délétion (4974 pb délétion commune) dans la région codante de l’ADNmt a été vraisemblablement nocive pour l’embryon et par conséquent éliminée pour assurer l’homoplasmie au début du développement embryonnaire.

Rôle du tissu adipeux dans l’effet cardioprotecteur du EP 80317, un ligand sélectif du récepteur CD36

Le récepteur CD36 est impliqué dans le transport des acides gras libres non estérifiés (AGNE) au niveau des tissus cardiaque et périphériques. Les dommages tissulaires et la dysfonction cardiaque observés après une ischémie-reperfusion (I/R) du myocarde sont en partie liés à l’internalisation et au métabolisme oxydatif accrus des AGNE dont la concentration sanguine augmente transitoirement après un infarctus du myocarde, contrairement à ce qui est observé chez des souris déficientes en CD36. Nous avons émis l’hypothèse selon laquelle le EP 80317, un ligand synthétique du récepteur CD36, exercerait un effet cardioprotecteur contre les dommages induits par une ischémie transitoire du myocarde. Nos objectifs étaient 1) de vérifier l’effet cardioprotecteur du EP 80317 et 2) de définir son mécanisme, plus précisément de documenter l’effet du traitement sur le métabolisme lipidique. À cette fin, des souris de type sauvage ont été traitées par le EP 80317 (289 nmol/kg) par voie sous-cutanée pendant 14 jours avant d’être soumises à 30 minutes d’ischémie suivant la ligature de l’artère coronaire gauche descendante et de sa reperfusion pendant une période de 6 ou 48 heures. Le cœur et les tissus périphériques (foie, muscle squelettique et dépôts adipeux) ont été prélevés pour déterminer le profil de certains gènes impliqués dans la régulation du métabolisme lipidique. Nos travaux ont montré que l’effet cardioprotecteur d’un traitement préventif par le EP 80317 est associé à une augmentation transitoire du stockage des triglycérides et d’une réduction des AGNE circulants.

Étude de la voie de signalisation de l’insuline chez la drosophile par une approche phosphoprotéomique

La phosphorylation est une modification post-traductionnelle modulant l’activité, la conformation ou la localisation d’une protéine et régulant divers processus. Les kinases et phosphatases sont responsables de la dynamique de phosphorylation et agissent de manière coordonnée. L’activation anormale ou la dérégulation de kinases peuvent conduire au développement de cancers ou de désordres métaboliques. Les récepteurs tyrosine kinase (RTKs) sont souvent impliqués dans des maladies et la compréhension des mécanismes régissant leur régulation permet de déterminer les effets anticipés sur leurs substrats. Dans ce contexte, le but de cette thèse est d’identifier les évènements de phosphorylation intervenant dans la voie de l’insuline chez la drosophile impliquant un RTK : le récepteur de l’insuline (InR). La cascade de phosphorylation déclenchée suite à l’activation du récepteur est conservée chez le mammifère. Afin d’étudier le phosphoprotéome de cellules S2 de drosophile, nous avons utilisé une étape d’enrichissement de phosphopeptides sur dioxyde de titane suivie de leur séparation par chromatographie liquide (LC) et mobilité ionique (FAIMS). Les phosphopeptides sont analysés par spectrométrie de masse en tandem à haute résolution. Nous avons d’abord démontré les bénéfices de l’utilisation du FAIMS comparativement à une étude conventionnelle en rapportant une augmentation de 50 % dans le nombre de phosphopeptides identifiés avec FAIMS. Cette technique permet de séparer des phosphoisomères difficilement distinguables par LC et l’acquisition de spectres MS/MS distincts où la localisation précise du phosphate est déterminée. Nous avons appliqué cette approche pour l’étude des phosphoprotéomes de cellules S2 contrôles ou traitées à l’insuline et avons identifié 32 phosphopeptides (sur 2 660 quantifiés) pour lesquels la phosphorylation est modulée. Étonnamment, 50 % des cibles régulées possèdent un site consensus pour la kinase CK2. Une stratégie d’inhibition par RNAi a été implémentée afin d’investiguer le rôle de CK2 dans la voie de l’insuline. Nous avons identifié 6 phosphoprotéines (CG30085, su(var)205, scny, protein CDV3 homolog, D1 et mu2) positivement régulées suite à l’insuline et négativement modulées après le traitement par RNAi CK2. Par essai kinase in vitro, nous avons identifié 29 cibles directes de CK2 dont 15 corrélaient avec les résultats obtenus par RNAi. Nous avons démontré que la phosphorylation de su(var)205 (S15) était modulée par l’insuline en plus d’être une cible directe de CK2 suite à l’expérience RNAi et à l’essai kinase. L’analyse des données phosphoprotéomiques a mis en évidence des phosphopeptides isomériques dont certains étaient séparables par FAIMS. Nous avons déterminé leur fréquence lors d’études à grande échelle grâce à deux algorithmes. Le script basé sur les différences de temps de rétention entre isomères a identifié 64 phosphoisomères séparés par LC chez la souris et le rat (moins de 1 % des peptides identifiés). Chez la drosophile, 117 ont été répertoriés en combinaison avec une approche ciblée impliquant des listes d’inclusion. Le second algorithme basé sur la présence d’ions caractéristiques suite à la fragmentation de formes qui co-éluent a rapporté 23 paires isomériques. L’importance de pouvoir distinguer des phosphoisomères est capitale dans le but d’associer une fonction biologique à un site de phosphorylation précis qui doit être identifié avec confiance.

Études génétiques moléculaires du gène de la polarité planaire SCRIBBLE1 chez les anomalies du tube neural

Les anomalies du tube neural (ATN), incluant l'anencéphalie et le spina-bifida, représentent un groupe de malformations congénitales très fréquentes chez l'homme. Ces anomalies sont causées par un défaut partiel ou complet de la fermeture du tube neurale au cours de l'embryogenèse. Les ATN ont une étiologie complexe et multifactorielle impliquant des facteurs environnementaux et génétiques. La voie de signalisation non-canonique du Frizzled (Fz)/Dishevelled (Dvl) contrôle la polarité cellulaire planaire (PCP) et le processus morphogénétique appelé l’extension convergente qui est essentiel pour la gastrulation et la fermeture du tube neural. Très important, des mutations des gènes de cette voie étaient fortement associées aux ATN chez la souris et l’humain. Scribble est un gène de la voie PCP qui cause une sévère ATN chez la souris Circletail. Notre étude vise à analyser le rôle de SCRIBBLE1 dans les ATN humains par des analyses de séquence de son cadre de lecture et ses jonctions exon-introns. Notre étude comporte 396 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Gaslini en Gènes, Italie et 83 patients recrutés au Centre Spina Bifida de l’hôpital Sainte Justine. Les patients sont affectés par plusieurs formes d’ATN. Nous avons identifié neuf mutations rares et non synonymes chez 10 patients, p.Asp93Ala (c. 435G>A), p.Gly145Arg (c. 278A>C), p.Gly263Ser (c. 786C>A), p.Gly469Ser (c. 1405G>A), p.Pro649His (c. 1946C>A), p.Gln808His (c. 2424G>T), p.Val1066Met (c. 3196G>A), p.Arg1150Gln (c. 3480G>A) et p.Thr1422Met (c. 4266C>T). Cinque mutations, p.Gly263Ser, p.Pro649His, p.Gln808His, p.Arg1150Gln, p.Thr1422Met, étaient absentes dans les contrôles analysés et prédites d’être pathogéniques in silico. Cette étude montre que des mutations rares dans SCRIB1 pourraient augmenter le risque des ATN dans une fraction des patients. L’identification des gènes prédisposant aux ATN nous aidera à mieux comprendre les mécanismes pathogéniques impliqués dans ces maladies.