The anti-inflammatory properties of intravenous immunoglobulin in a murine model of allergic airway disease ; effects on the development of regulatory T-cells

Les immunoglobulines intraveineuses (IVIg) constituent une préparation polyclonale d’IgG isolée et regroupée à partir du plasma sanguin de multiples donneurs. Initialement utilisé comme traitement de remplacement chez les patients souffrant d’immunodéficience primaire ou secondaire, les IVIg sont maintenant largement utilisées dans le traitement de plusieurs conditions auto-immunes, allergiques ou inflammatoires à une dose élevée, dite immunomodulatrice. Différents mécanismes d’action ont été postulés au fil des années pour expliquer l’effet thérapeutique des IVIg dans les maladies auto-immunes et inflammatoires. Entre autre, un nombre grandissant de données issues de modèles expérimentaux chez l’animal et l’humain suggère que les IVIg induisent l’expansion et augmentent l’action suppressive des cellules T régulatrices (Tregs), par un mécanisme qui demeure encore inconnu. Également, les patients atteints de maladies auto-immunes ou inflammatoires présentent souvent un nombre abaissé de Tregs par rapport aux individus sains. Ainsi, une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les IVIg modulent les cellules T régulatrices est requise afin de permettre un usage plus rationnel de ce produit sanguin en tant qu’alternative thérapeutique dans le traitement des maladies auto-immunes et inflammatoires. Par le biais d’un modèle expérimental d’allergie respiratoire induite par un allergène, nous avons démontré que les IVIg diminuaient significativement l’inflammation au niveau des voies aériennes ce, en association avec une différenciation des Tregs à partir des cellules T non régulatrices du tissu pulmonaire. Nous avons également démontré qu’au sein de notre modèle expérimental, l’effet anti-inflammatoire des IVIg était dépendant des cellules dendritiques CD11c+ (CDs) pulmonaires, puisque cet effet pouvait être complètement reproduit par le transfert adoptif de CDs provenant de souris préalablement traitées par les IVIg. À cet effet, il est déjà établi que les IVIg peuvent moduler l’activation et les propriétés des CDs pour favoriser la tolérance immunitaire et que ces cellules seraient cruciales pour l’induction périphérique des Tregs. C’est pourquoi, nous avons cherché à mieux comprendre comment les IVIg exercent leur effet sur ces cellules. Pour la première fois, nous avons démontré que la fraction d’IgG riche en acide sialique (SA-IVIg) (constituant 2-5% de l’ensemble des IgG des donneurs) interagit avec un récepteur dendritique inhibiteur de type lectine C (DCIR) et active une cascade de signalement intracellulaire initiée par la phosphorylation du motif ITIM qui est responsable des changements observés en faveur de la tolérance immunitaire auprès des cellules dendritiques et des Tregs. L’activité anti-inflammatoire de la composante SA-IVIg a déjà été décrite dans des études antérieures, mais encore une fois le mécanisme par lequel ce traitement modifie la fonction des CDs n’a pas été établi. Nous avons finalement démontré que le récepteur DCIR facilite l’internalisation des molécules d’IgG liées au récepteur et que cette étape est cruciale pour permettre l’induction périphérique des Tregs. En tant que produit sanguin, les IVIg constitue un traitement précieux qui existe en quantité limitée. La caractérisation des mécanismes d’action des IVIg permettra une meilleure utilisation de ce traitement dans un vaste éventail de pathologies auto-immunes et inflammatoires.

Étude génétique et fonctionnelle des Interferon-producing Killer Dendritic Cells

L’idée qu’une cellule puisse effectuer la cytolyse de cellules transformées, comme une cellule Natural Killer (NK), tout en ayant la capacité de présenter des antigènes, comme une cellule dendritique (DC), peut sembler fantaisiste. Cependant, de telles cellules furent bel et bien identifiées chez la souris en 2006. Ces cellules, nommées Interferon-producing Killer Dendritic Cells (IKDC), furent l’objet d’une caractérisation extensive qui révéla leur énorme potentiel immunologique. La combinaison de fonctions associées à des cellules NK et à des DC a doté les IKDC d’un pouvoir antitumoral remarquable. D’ailleurs, il a été démontré que les IKDC sont plus efficaces que les cellules NK pour limiter la croissance tumorale. Ainsi, suite à leur découverte, les IKDC ont suscité beaucoup d’intérêt. Cependant, une controverse émergea sur la nature des IKDC. Plusieurs groupes indépendants tentèrent de reproduire les expériences attestant les fonctions de DC des IKDC, sans y parvenir. De plus, des études additionnelles révélèrent que les IKDC possèdent des similitudes très importantes avec les cellules NK. Ces observations ont mené la communauté scientifique à suggérer que les IKDC sont des cellules NK en état d’activation (aNK). Malgré cette controverse, les caractéristiques antitumorales des IKDC sont si uniques et considérables qu’il est primordial de poursuivre l’étude de ces cellules. Pour y arriver, il est essentiel de déterminer la nature des IKDC et de mettre fin à ce débat. Par la suite, il sera important d’identifier des façons de cibler spécifiquement les IKDC pour permettre leur usage dans le cadre de thérapies antitumorales. Ainsi, l’objectif de cette thèse est de définir l’identité des IKDC, puis de déterminer les facteurs génétiques responsables de la régulation de ces cellules. Nous avons démontré que les IKDC ne sont pas des cellules aNK, contrairement à ce qui avait été suggéré. Nous avons constaté que les IKDC prolifèrent activement et possèdent un phénotype unique, des caractéristiques associées à des cellules NK très immatures. Afin de déterminer si les IKDC peuvent acquérir un phénotype mature, nous avons effectué des expériences de transfert adoptif. Suite à leur injection in vivo, les IKDC acquièrent un phénotype de cellules matures, mais étonnamment, elles se différencient aussi en cellules NK. Ainsi, nous avons révélé que les IKDC sont un intermédiaire dans la différenciation des cellules NK. En parallèle, nous avons démontré que la proportion d’IKDC varie grandement entre des souris de fond génétique différent, indiquant que des facteurs génétiques sont impliqués dans la régulation de ces cellules. Nous avons alors effectué une analyse génétique qui a révélé que les IKDC sont régulées par des facteurs génétiques compris dans une région distale du chromosome 7. Les résultats présentés dans cette thèse constituent une avancée importante pour la recherche sur les IKDC. Ils ont permis de définir la nature des IKDC et d’identifier un intervalle génétique impliqué dans la régulation de ces cellules. Ces découvertes sont des connaissances précieuses pour l’identification des IKDC chez l’Homme et la création de nouvelles thérapies dans la lutte contre le cancer.

Antigen and superantigen presentation as defined by the MHCII-accessory proteins and associated-peptides

MHCII molecules expose a weave of antigens, which send survival or activation signals to T lymphocytes. The ongoing process of peptide binding to the MHC class II groove implicates three accessory molecules: the invariant chain, DM and DO. The invariant chain folds and directs the MHCII molecules to the endosomal pathway. Then, DM exchanges the CLIP peptide, which is a remnant of the degraded invariant chain, for peptides of better affinity. Expressed in highly specialized antigen presenting cells, DO competes with MHCII molecules for DM binding and favors the presentation of receptor-internalized antigens. Altogether, these molecules exhibit potential immunomodulatory properties that can be exploited to increase the potency of peptide vaccines. DO requires DM for maturation and to exit the ER. Interestingly, it is possible to monitor this interaction through a conformation change on DOβ that is recognized by the Mags.DO5 monoclonal antibody. Using Mags.DO5, we showed that DM stabilizes the interactions between the DO α1 and β1 chains and that DM influences DO folding in the ER. Thus, the Mags.DO5+ conformation correlates with DO egress from the ER. To further evaluate this conformation change, directed evolution was applied to DO. Of the 41 unique mutants obtained, 25% were localized at the DM-DO binding interface and 12% are at the solvent-exposed β1 domain, which is thought to be the Mags.DO5 epitope. In addition, I used the library to test the ability of HLA-DO to inhibit HLA-DM and sorted for the amount of CLIP. Interestingly, most of the mutants showed a decrease inhibitory effect, supporting the notion that the intrinsic instability of DO is a required for its function. Finally, these results support the model in which DO competes against classical MHCII molecules by sequestering DM chaperone’s function. MHCII molecules are also characterized by their ability to present superantigens, a group of bacterial or viral toxins that coerces MHCII-TCR binding in a less promiscuous fashion than what is observed in a canonical setting. While the mechanism of how bacterial superantigens form trimeric complexes with TCR and MHCII is well understood, the mouse mammary tumor virus superantigens (vSAG) are poorly defined. In the absence of a crystal structure, I chose a functional approach to examine the relation between vSAG, MHCII and TCR with the goal of uncovering the overall trimolecular architecture. I showed that TCR concomitantly binds both the MHCII α chain and the vSAG and that TCR-MHCII docking is almost canonical when coerced by vSAGs. Because many peptides may be tolerated in the MHCII groove, the pressure exerted by vSAG seems to tweak conventional TCR-MHCII interactions. Furthermore, my results demonstrate that vSAG binding to MHCII molecules is conformation-dependent and abrogated by the CLIP amino-terminal residues extending outside the peptide-binding groove. In addition, they also suggest that vSAGs cross-link adjacent MHCIIs and activate T cells via a TGXY motif.

The role of EphB6 and ephrinbs in blood pressure regulation

L’hypertension artérielle est le facteur de risque le plus important dans les maladies cardiovasculaires (MCV) et les accidents vasculaires cérébraux (AVC). L’hypertension artérielle essentielle est une maladie complexe, multifactorielle et polygénique. Même si on a identifié de nombreux facteurs de risque de l’hypertension artérielle, on ne comprend pas encore clairement les mécanismes qui la régissent. Les kinases hépatocytes produisant l’érythropoïétine (Eph) constituent la plus grande famille des récepteurs tyrosine kinase qui se lient à des ligands de surface cellulaire appelés éphrines sur les cellules avoisinantes. On sait que les interactions de Eph et des éphrines sont essentielles aussi bien dans les processus de développement que dans le fonctionnement des organes et des tissus adultes. Cependant on n’a pas encore étudié la relation entre Eph/éphrines et l’hypertension artérielle. Nous avons créé des modèles de souris knockout (K.O.) Ephb6-/-, Efnb1-/- et Efnb3-/- pour cette étude. Dans le modèle EphB6-/-, nous avons observé que les souris K.O. Ephb6 castrées, mais pas les femelles, ainsi que les souris mâles non castrées présentaient une tension artérielle élevée (TA) par rapport à leurs homologues de type sauvage (TS). Ceci suggère que Ephb6 doit agir de concert avec l’hormone sexuelle mâle pour réguler la TA. Les petites artères des mâles castrés Ephb6-/- présentaient une augmentation de la contractilité, une activation de RhoA et une phosphorylation constitutive de la chaîne légère de la myosine (CLM) lorsque comparées à celles de leurs homologues TS. Ces deux derniers résultats indiquent que la phosphorylation de CLM et de RhoA passe par la voie de signalisation de Ephb6 dans les cellules du muscle lisse de la paroi vasculaire (CMLV). Nous avons démontré que la réticulation de Efnbs mais non celle de Ephb6 aboutit à une réduction de la contractilité des CMLV. Ceci montre que l’effet de Ephb6 passe par la signalisation inversée à travers Efnb. Dans le modèle Efnb1-/- conditionnel spécifique au muscle lisse, nous n’avons observé aucune différence entre Efnb1-/- et les souris de TS concernant la mesure de la TA dans des conditions normales. Cependant, la TA des souris K.O. Efnb1 lors d’un stress d’immobilisation est supérieure à celle des souris de TS. Dans les petites artères des souris K.O. Efnb1, le rétrécissement et la phosphorylation de CLM étaient élevés. In vitro, la contractilité et l’activation RhoA de la CMLV des souris TS étaient augmentées quand leur Efnb1 était réticulé. Ces résultats corroborent ceux des souris KO Ephb6 et prouvent que l’effet de Ephb6 dans le contrôle de la TA se produit au moins par l’intermédiaire d’un de ses ligands Efnb1 dans les CMLV. Dans le modèle Efnb3-/-, on a observé une augmentation de la TA et du rétrécissement des vaisseaux chez les femelles Efnb3-/-, mais non chez les mâles; l’échographie a aussi révélé une résistance accrue au débit sanguin des souris K.O. femelles. Cependant la mutation de Efnb3 ne modifie pas la phosphorylation de la CLM ou l’activation de RhoA in vivo. Dans l’expérience in vitro, les CMLV des souris femelles Efnb3-/- ont présenté une augmentation de la contractilité mais pas celle des souris mâles Efnb3-/-. La réticulation des CMLV chez les mâles ou les femelles de TS avec solide anti-Efnb3 Ab peut réduire leur contractilité. Notre étude est la première à évaluer le rôle de Eph/éphrines dans la régulation de la TA. Elle montre que les signalisations Eph/éphrines sont impliquées dans le contrôle de la TA. La signalisation inverse est principalement responsable du phénotype élevé de la TA. Bien que les Efnb1, Efnb3 appartiennent à la même famille, leur fonction et leur efficacité dans la régulation de la TA pourraient être différentes. La découverte de Eph/Efnb nous permet d’explorer plus avant les mécanismes qui gouvernent la TA.

Induction d’anticorps anti-idiotypiques contre les protéoglycanes de la matrice extracellulaire dans la réduction des lésions athérosclérotiques

L’athérosclérose est caractérisée par l’accumulation de lipoprotéines de basse densité (LDL) liées aux protéoglycanes de la paroi artérielle. Des anticorps chimériques (ch) qui se lient aux glycosaminoglycanes (GAG) ont été générés. L'hypothèse est que la vaccination avec le chP3R99, un anticorps chimérique mutant de l'hybridome P3, pouvait interférer avec la rétention des LDL par l’induction d’une cascade d’anticorps anti-idiotypiques dirigés contre les GAG. Des souris mâles déficientes en apolipoprotéine E ont été soumises à une diète hypercholestérolémique et ont reçu 5 injections sous-cutanées de 50 μg de vaccin chP3R99 ou de vaccin chP3S98 (un mutant de faible réactivité). Les injections ont été effectuées à chaque semaine ou aux 2 semaines. Au moment du sacrifice, l'aorte perfusée avec du PBS a été excisée et analysée après coloration au Oil Red-O. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de lésions sur la superficie totale de l'aorte. La réactivité contre le chP3R99, chP3S98, l’héparine, le sulfate de dermatane et de chondroïtine des sérums de souris immunisées a été mesurée par ELISA. De plus, la liaison de l'anticorps chP3R99 aux GAG dans la lésion d'athérosclérose a été observée par un appareil de visualisation in vivo.Nos résultats montrent que l’immunogénicité des anticorps chP3R99 est supérieure à celle des anticorps chP3S98 et que le sérum des souris immunisées avec le chP3R99 présente des anticorps anti-idiotypiques dirigés contre les GAG. Cet effet est associé à une réduction de 42 % (p < 0.01) du pourcentage de lésions athérosclérotiques chez les souris vaccinées. L'utilisation d’une immunisation active avec l’anticorps chP3R99 pourrait constituer une approche thérapeutique pour le traitement de l'athérosclérose.

Function of the immunoregulatory CD4-CD8- T cells in the context of autoimmune diabetes

La tolérance immunitaire dépend de la distinction entre le soi et le non soi par le système immunitaire. Un bris dans la tolérance immunitaire mène à l'auto-immunité, qui peut provoquer la destruction des organes, des glandes, des articulations ou du système nerveux central. Le diabète auto-immun, également connu sous le nom diabète juvénile et diabète de type 1, résulte d'une attaque auto-immune sur les cellules β pancréatiques sécrétrices d’insuline, localisées au niveau des îlots de Langerhans du pancréas. Bien que le diabète auto-immun soit traitable par une combinaison d’injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, de régime et d'exercices, beaucoup de complications chroniques peuvent se manifester chez les patients, y compris, mais non limitées à, la cécité, les maladies cardiovasculaires, l’insuffisance rénale et l'amputation. En raison des nombreuses complications liées au diabète auto-immun à long terme, la recherche continue afin de mieux comprendre tous les facteurs impliqués dans la progression de la maladie dans le but de développer de nouvelles thérapies qui empêcheront, renverseront et/ou traiteront cette maladie. Un rôle primordial dans la génération et l'entretien de la tolérance immunitaire a été attribué au nombre et à la fonction des sous-populations de cellules régulatrices. Une de ces populations est constituée de cellules T CD4-CD8- (double négatives, DN), qui ont été étudiées chez la souris et l'humain pour leur contribution à la tolérance périphérique, à la prévention des maladies et pour leur potentiel associé à la thérapie cellulaire. En effet, les cellules de T DN sont d'intérêt thérapeutique parce qu'elles montrent un potentiel immunorégulateur antigène-spécifique dans divers cadres expérimentaux, y compris la prévention du diabète auto-immun. D’ailleurs, en utilisant un système transgénique, nous avons démontré que les souris prédisposées au diabète auto-immun présentent peu de cellules T DN, et que ce phénotype contribue à la susceptibilité au diabète auto-immun. En outre, un transfert des cellules T DN est suffisant pour empêcher la progression vers le diabète chez les souris prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats suggèrent que les cellules T DN puissent présenter un intérêt thérapeutique pour les patients diabétiques. Cependant, nous devons d'abord valider ces résultats en utilisant un modèle non-transgénique, qui est plus physiologiquement comparable à l'humain. L'objectif principal de cette thèse est de définir la fonction immunorégulatrice des cellules T DN, ainsi que le potentiel thérapeutique de celles-ci dans la prévention du diabète auto-immun chez un modèle non-transgénique. Dans cette thèse, on démontre que les souris résistantes au diabète auto-immun présentent une proportion et nombre absolu plus élevés de cellules T DN non-transgéniques, lorsque comparées aux souris susceptibles. Cela confirme une association entre le faible nombre de cellules T DN et la susceptibilité à la maladie. On observe que les cellules T DN éliminent les cellules B activées in vitro par une voie dépendante de la voie perforine et granzyme, où la fonction des cellules T DN est équivalente entre les souris résistantes et prédisposées au diabète auto-immun. Ces résultats confirment que l'association au diabète auto-immun est due à une insuffisance en terme du nombre de cellules T DN, plutôt qu’à une déficience fonctionnelle. On démontre que les cellules T DN non-transgéniques éliminent des cellules B chargées avec des antigènes d'îlots, mais pas des cellules B chargées avec un antigène non reconnu, in vitro. Par ailleurs, on établit que le transfert des cellules T DN activées peut empêcher le développement du diabète auto-immun dans un modèle de souris non-transgénique. De plus, nous observons que les cellules T DN migrent aux îlots pancréatiques, et subissent une activation et une prolifération préférentielles au niveau des ganglions pancréatiques. D'ailleurs, le transfert des cellules T DN entraîne une diminution d'auto-anticorps spécifiques de l'insuline et de cellules B de centres germinatifs directement dans les îlots, ce qui corrèle avec les résultats décrits ci-dessus. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de démontrer la fonction des cellules T DN in vitro et in vivo, ainsi que leur potentiel lié à la thérapie cellulaire pour le diabète auto-immun.

Optimisation du vecteur adénoviral pour la thérapie génique de la dystrophie musculaire de Duchenne

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie très sévère, progressive et sans traitement vraiment efficace. Elle est caractérisée par l’absence fonctionnelle de la dystrophine, une protéine essentielle au maintien des muscles squelettiques. La thérapie génique est actuellement envisagée comme approche thérapeutique pour livrer la dystrophine dans les muscles. Les vecteurs adénoviraux de troisième génération (Helper-dependent adenoviral vector, HD) sont des véhicules de transfert génique très prometteurs pour traiter la DMD. Puisque les gènes adénoviraux ont été enlevés complètement du HD, ils sont peu toxiques, faiblement immunogéniques et ils possèdent un espace cargo suffisant pour transporter l’ADN codant complet de la dystrophine. Bien que le HD puisse fournir la dystrophine de façon thérapeutique chez des souris dystrophiques (mdx), l’expression du gène thérapeutique est progressivement perdue plusieurs mois suivant l’injection intramusculaire. Deux stratégies innovantes furent explorées dans cette thèse dans le but de stabiliser l’expression de la dystrophine. La première stratégie vise à l’intégration de l’ADN du HD dans les chromosomes cellulaires, ce qui pourrait le protéger contre son élimination progressive des muscles. Une intégrase site-spécifique issue du phage ΦC31 a été utilisée pour catalyser l’intégration d’un HD transportant un marqueur de sélection. Dans les cellules humaines et les myoblastes murins, l’activité de l’intégrase a été évaluée d’après son efficacité d’intégration (après sélection) et sa spécificité (dans les clones résistants). L’efficacité atteint jusqu’à 0,5 % par cellule et jusqu’à 76 % des événements d’intégration ont été réalisés de façon site-spécifique. Bien que des délétions aient été trouvées aux extrémités du vecteur, 70 % des clones analysés montraient une seule copie du vecteur intégré (le nombre attendu). Seulement une petite augmentation du nombre de brisures double-brin a été mesurée dans les myoblastes exprimant l’intégrase. En conclusion, l’intégration du HD est relativement efficace, spécifique et sécuritaire. Cette méthode est très prometteuse, car la dystrophine peut être livrée dans le muscle avec l’aide du HD et l’intégration de l’ADN du HD pourrait stabiliser son expression in vivo. La deuxième stratégie implique l’utilisation d’un nouveau promoteur musculospécifique (ΔUSEx3) pour réduire la toxicité induite liée à une expression trop étendue de la dystrophine. Dans cette étude, nous avons investigué l’effet du contexte viral sur l’activité du promoteur. Un HD et un vecteur lentiviral (LV) ont été construits avec le promoteur ΔUSEx3 pour contrôler l’expression d’un gène rapporteur. Les résultats démontrent que ΔUSEx3 confère une expression puissante, musculospécifique et stable (via le LV) in vitro. L’injection intramusculaire du HD a conduit à une expression puissante du transgène. Ces résultats contrastent avec ceux du LV, car après l’injection de ce dernier, l’expression était faible. La livraison du HD dans le muscle, mais aussi dans plusieurs organes démontre la musculospécificité de ΔUSEx3. Par conséquent, le contexte du vecteur et l’environnement musculaire modulent tous les deux l’activité de ΔUSEx3. Bien que ΔUSEx3 soit musculospécifique, d’autres études sont requises pour déterminer si le promoteur peut stabiliser l’expression de la dystrophine in vivo.

Effect of exercise training on preeclampsia superimposed on chronic hypertension in a mouse model

Preeclampsia is among the leading causes of perinatal mortality and morbidity, affecting 2-7% of pregnancies. Its incidence increases to 10-25% in already hypertensive women. To date, no treatment, aside from delivery, is known. Interestingly, several studies have reported that exercise training (ExT) can reduce preeclampsia prevalence although the available studies are considered insufficient. Therefore, the aim of this study is to determine the impact of ExT when practiced before and during gestation on pregnancy outcome in a mouse model of preeclampsia superimposed on chronic hypertension (SPE). To do so, mice overexpressing both human angiotensinogen and renin (R+A+) were used because they are hypertensive at baseline and they develop many hallmark features of SPE. Mice were trained by placing them in a cage with access to a running wheel 4 weeks before and during gestation. ExT in this study prevented the rise in blood pressure at term observed in the sedentary transgenic mothers. This may be realized through an increased activity of the angiotensin-(1-7) axis in the aorta. In addition, ExT prevented the increase in albumin/creatinine ratio. Moreover, placental alterations were prevented with training in transgenic mice, leading to improvements in placental and fetal development. Placental mRNA and circulating levels of sFlt-1 were normalized with training. Additionally, the increase in angiotensin II type I receptor and the decrease in Mas receptor protein were reversed with training. ExT appears to prevent many SPE-like features that develop in this animal model and may be of use in the prevention of preeclampsia in women.

Les cytokines inflammatoires modulent la prolifération et la différenciation in vitro des cellules souches/progénitrices de la moelle épinière.

La moelle épinière (MÉ) est essentielle pour relier les informations motrices et sensorielles entre le cerveau et la périphérie. Malheureusement, elle peut facilement être endommagée suite à un traumatisme médullaire (TM) ou des pathologies comme la sclérose en plaques. Chez les vertébrés inférieurs, tels les amphibiens, la MÉ lésée se régénère via ses cellules souches endogènes, alors que celle des mammifères démontre une très faible habileté régénératrice post-traumatique. Des travaux récents ont démontré que la MÉ des mammifères contient des cellules souches neurales latentes correspondant aux cellules épendymaires du canal central. D’autres études ont prouvé qu’à la suite d’un TM, les cellules souches épendymaires (cSÉ) prolifèrent, migrent vers le site de la lésion et se différencient principalement en cellules gliales. Promouvoir la régénération de la MÉ endommagée via la modulation des cellules souches endogènes devient donc une voie thérapeutique intéressante. Isolant des cellules souches/progénitrices de la MÉ via la culture de neurosphères (NS), nos études in vitro, en présence de cytokines inflammatoires ou de milieu conditionné auxmacrophages, suggèrent que la réponse inflammatoire influence fortement la prolifération et la différentiation des cSÉ. Dans l’objectif de définir le programme génétique relié à l’activation des cSÉ de la MÉ, nous avons débuté l’élaboration d’un protocole d’isolement des cSÉ à l’aide d’un modèle de souris transgénique.

Études de réseaux d’expression génique : utilité pour l’élucidation des déterminants génétiques des traits complexes

Les traits quantitatifs complexes sont des caractéristiques mesurables d’organismes vivants qui résultent de l’interaction entre plusieurs gènes et facteurs environnementaux. Les locus génétiques liés à un caractère complexe sont appelés «locus de traits quantitatifs » (QTL). Récemment, en considérant les niveaux d’expression tissulaire de milliers de gènes comme des traits quantitatifs, il est devenu possible de détecter des «QTLs d’expression» (eQTL). Alors que ces derniers ont été considérés comme des phénotypes intermédiaires permettant de mieux comprendre l’architecture biologique des traits complexes, la majorité des études visent encore à identifier une mutation causale dans un seul gène. Cette approche ne peut remporter du succès que dans les situations où le gène incriminé a un effet majeur sur le trait complexe, et ne permet donc pas d’élucider les situations où les traits complexes résultent d’interactions entre divers gènes. Cette thèse propose une approche plus globale pour : 1) tenir compte des multiples interactions possibles entre gènes pour la détection de eQTLs et 2) considérer comment des polymorphismes affectant l’expression de plusieurs gènes au sein de groupes de co-expression pourraient contribuer à des caractères quantitatifs complexes. Nos contributions sont les suivantes : Nous avons développé un outil informatique utilisant des méthodes d’analyse multivariées pour détecter des eQTLs et avons montré que cet outil augmente la sensibilité de détection d’une classe particulière de eQTLs. Sur la base d’analyses de données d’expression de gènes dans des tissus de souris recombinantes consanguines, nous avons montré que certains polymorphismes peuvent affecter l’expression de plusieurs gènes au sein de domaines géniques de co-expression. En combinant des études de détection de eQTLs avec des techniques d’analyse de réseaux de co-expression de gènes dans des souches de souris recombinantes consanguines, nous avons montré qu’un locus génétique pouvait être lié à la fois à l’expression de plusieurs gènes au niveau d’un domaine génique de co-expression et à un trait complexe particulier (c.-à-d. la masse du ventricule cardiaque gauche). Au total, nos études nous ont permis de détecter plusieurs mécanismes par lesquels des polymorphismes génétiques peuvent être liés à l’expression de plusieurs gènes, ces derniers pouvant eux-mêmes être liés à des traits quantitatifs complexes.

Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy

La détérioration de la barrière hémato rétinienne et l'oedème maculaire consécutif est une manifestation cardinale de la rétinopathie diabétique (RD) et la caractéristique clinique la plus étroitement associée à la perte de la vue. Alors que l'oedème maculaire affecte plus de 25% des patients souffrant de diabète, les modalités de traitement actuellement disponibles tels que les corticostéroïdes administrés localement et les thérapies anti-VEGF récemment approuvés présentent plusieurs inconvénients. Bien que le lien entre une rupture de l’unité neuro-vasculaire et la pathogénèse de la RD ait récemment été établi, l’influence de la signalisation neuro-vasculaire sur la vasculopathie oculaire diabetique a jusqu’à présent reçu peu d’attention. Ici, à l’aide d’ètudes humaines et animales, nous fournissons la première preuve du rôle essentiel de la molécule de guidage neuronale classique Sémaphorine 3A dans l’instigation de la perméabilité vasculaire maculaire pathologique dans le diabète de type 1. L’étude de la dynamique d’expression de Sémaphorine 3A révèle que cette dernière est induite dans les phases précoces hyperglycèmiques du diabète dans la rétine neuronale et participe à la rupture initiale de la fonction de barrière endothéliale. En utilisant le modèle de souris streptozotocine pour simuler la rétinopathie diabétique humaine, nous avons démontré par une série d’approches analogue que la neutralisation de Sémaphorine 3A empêche de façon efficace une fuite vasculaire rétinienne. Nos résultats identifient une nouvelle cible thérapeutique pour l’oedème maculaire diabétique en plus de fournir d’autres preuves de communication neuro-vasculaire dans la pathogènese de la RD.

Caractérisation neuro-immunitaire d'un modèle d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale spontanée

La sclérose en plaques est une maladie neuroinflammatoire idiopathique caractérisée par la formation de lésions focales de démyélinisation, qui apparaissent suite à l’infiltration périvasculaire de cellules immunitaires et à l’augmentation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est le modèle animal de cette maladie. Cependant, ce modèle présente des différences importantes avec la sclérose en plaques. L’objectif de ce projet de maîtrise était d’approfondir la caractérisation d’un nouveau modèle transgénique d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale spontanée, le modèle TCR1640, afin de valider celui-ci pour l’étude des phénomènes physiopathologiques qui surviennent à différents stades de la sclérose en plaques, ainsi que pour le développement de nouveaux traitements de la maladie. La souris TCR1640 porte un récepteur des cellules T (TCR) transgénique autoréactif, qui reconnaît un peptide de la myéline et déclenche une réaction auto-immune contre la myéline endogène au sein du système nerveux central (SNC). Des observations faites in situ et in vitro ont permis d’identifier des changements qui surviennent de façon très précoce dans l’unité neurovasculaire chez les animaux TCR1640 présymptomatiques, et qui sont liés à la présence d’un profil immunitaire périphérique proinflammatoire. Lors des phases actives de l’EAE spontanée, les animaux TCR1640 au stade chronique présentent une inflammation accrue du système nerveux central associée à une infiltration leucocytaire massive, par rapport aux animaux au stade aigu de la maladie. Une étude in vivo a également permis de moduler la maladie développée par des animaux ayant subi une immunisation passive avec des cellules T auxiliaires en provenance de souris TCR1640. Enfin, l’implication de nouvelles molécules d’adhésion cellulaire dans le développement et le maintien de l’EAE spontanée a été suggérée par des observations in vitro. L’ensemble de ces résultats suggère que le modèle TCR1640 présente plusieurs avantages pour l’étude de la physiopathologie de maladies neuroinflammatoires telles que la sclérose en plaques, et servira d’outil afin de valider de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Rôle du facteur de transcription PITX1 dans la pathogenèse de l'arthrose.

L'arthrose ou ostéoarthrite (OA) est la plus commune des maladies chroniques associées au vieillissement. La multiplicité des loci et des polymorphismes associés à l'OA suggère l'implication de nombreuses voies de signalisation. La plupart des voies empruntées partagent des points en commun avec le processus d'ossification endochondrale. Dans l'arthrose, la réinitiation de ce processus pourrait être responsable de la dégradation du cartilage et de la présence d'ostéophytes. Un des gènes ayant fait surface autant dans l'OA que dans le développement musculosquelettique est PITX1. Contrairement à ce que son nom l'indique, PITX1 n'est pas seulement exprimé dans la glande pituitaire mais également dans l'os, le cartilage, les muscles et les fibroblastes. Pitx1 joue un rôle clé dans l'identité des membres inférieurs et son inactivation complète chez la souris mène à un phénotype ressemblant aux membres supérieurs. Moins sévère, son inactivation partielle provoque des symptômes apparentés à l'arthrose précoce chez la souris vieillissante. Chez l'humain, une perte d'expression de PITX1 est observée dans le cartilage OA de concert avec une augmentation des protéines EXTL3, REG1 et PARP1. Ces dernières pourraient favoriser la phase initiale de régénération associée à l'arthrose. Pour induire la prolifération des chondrocytes, de bas niveaux de PITX1 sont nécessaires. À l'inverse, de hauts niveaux de PITX1 pourraient prévenir la prolifération et être responsables du statut différencié des chondrocytes articulaires normaux. L'étude des mécanismes de régulation du gène PITX1 a mené à l'identification d'un co-répresseur, nommé prohibitine (PHB1), lié sur une région promotrice distale. PHB1 est normalement retrouvé au niveau des mitochondries mais son accumulation nucléaire semble corréler avec la perte de PITX1 et l'initiation de l'OA. Cette découverte pourrait avoir un impact sur le diagnostic et d'éventuels traitements visant à prévenir l'apparition de l'arthrose.

Impact d’un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions sur le développement des interneurones corticaux : rôle de l’adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK)

L’encéphalopathie hypoxique-­‐ischémique cause des milliers de victimes à travers le monde chaque année. Les enfants survivants à un épisode hypoxique-­‐ischémique sont à risque de développer des problèmes neurologiques incapacitants comme une paralysie cérébrale, un retard mental, une épilepsie ou des troubles d’ordre comportemental. Les modèles animaux ont amélioré nos connaissances sur les mécanismes sous-­‐jacents aux dommages cérébraux, mais elles sont encore trop incomplètes pour être capables de prévenir les problèmes neurologiques. Ce projet vise à comprendre l’impact d’un épisode asphyxique périnatale associé à des convulsions ainsi que l’activation de l’adenosine monophosphate-­‐activated protein kinase (AMPK) sur les circuits GABAergiques inhibiteurs en développement chez la souris. Dans le but d’investiguer le sort des neurones inhibiteurs, appelés interneurones, suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions avec des animaux transgéniques, nous avons pris avantage d’un nouveau modèle d’hypoxie permettant d’induire des convulsions chez la souris. Deux populations d’interneurones représentant ensemble environ 60% de tous les interneurones corticaux ont été étudiées, soit les cellules exprimant la parvalbumine (PV) et les cellules exprimant la somatostatine (SOM). L’étude stéréologique n’a montré aucune mort neuronale de ces deux populations d’interneurones dans l’hippocampe chez les souris hypoxique d’âge adulte. Par contre, le cortex des souris hypoxiques présentait des zones complètement ou fortement dépourvues de cellules PV alors que les cellules SOM n’étaient pas affectées. L’utilisation d’une lignée de souris transgénique exprimant une protéine verte fluorescente (GFP) dans les cellules PV nous a permis de comprendre que les trous PV sont le reflet de deux choses : 1) une diminution des cellules PV et 2) une immaturité des cellules PV restantes. Puisque les cellules PV sont spécifiquement affectées dans la première partie de notre étude, nous avons voulu étudier les mécanismes moléculaires sous-­‐jacents à cette vulnérabilité. L’AMPK est un senseur d’énergie qui orchestre le rétablissement des i niveaux d’énergie cellulaire dans le cas d’une déplétion énergétique en modulant des voies de signalisation impliquant la synthèse de protéines et l’excitabilité membranaire. Il est possible que l’activation d’AMPK suite à un épisode asphyxique périnatal associé à des convulsions soit néfaste à long-­‐terme pour le circuit GABAergique en développement et modifie l’établissement de l’innervation périsomatique d’une cellule PV sur les cellules pyramidales. Nous avons étudié cette hypothèse dans un modèle de culture organotypique en surexprimant la forme wild-­‐type (WT) de la sous-­‐unité α2 d’AMPK, ainsi qu’une forme mutée dominante négative (DN), dans des cellules PV individuelles. Nous avons montré que pendant la phase de formation synaptique (jours post-­‐natals équivalents EP 10-­‐18), la surexpression de la forme WT désorganise la stabilisation des synapses. De plus, l’abolition de l’activité d’AMPK semble augmenter le nombre de synapses périsomatiques faits par la cellule PV sur les cellules pyramidales pendant la phase de formation et semble avoir l’effet inverse pendant la phase de maturation (EP 16-­‐24). La neurotransmission GABAergique joue plusieurs rôles dans le cerveau, depuis la naissance jusqu’à l’âge adulte des interneurones, et une dysfonction des interneurones a été associée à plusieurs troubles neurologiques, comme la schizophrénie, l’autisme et l’épilepsie. La maturation des circuits GABAergiques se fait majoritairement pendant la période post-­‐natale et est hautement dépendante de l’activité neuronale et de l’expérience sensorielle. Nos résultats révèlent que le lourd fardeau en demande énergétique d’un épisode asphyxique périnatal peut causer une mort neuronale sélective des cellules PV et compromettre l’intégrité de leur maturation. Un des mécanismes sous-­‐ jacents possible à cette immaturité des cellules PV suite à l’épisode hypoxique est l’activation d’AMPK, en désorganisant leur profil d’innervation sur les cellules pyramidales. Nous pensons que ces changements dans le réseau GABAergique pourrait contribuer aux problèmes neurologiques associés à une insulte hypoxique.

La collaboration entre l'oncogène E2A-PBX1 et Hoxa9 lors de l'induction de B-ALL implique l'activation de Flt3

La protéine de fusion E2A-PBX1 induit une leucémie lymphoblastique aigüe des cellules B pédiatrique chez l’humain. E2A-PBX1 possède de puissantes propriétés de trans-activation et peut se lier à l’ADN ainsi qu’aux protéines homéotiques (HOX) via des domaines conservés dans sa portion PBX1, ce qui suggère qu’une dérégulation des gènes cibles de HOX/PBX1 contribue à la leucémogénèse. Précédemment, Bijl et al. (2008) ont démontré que certains gènes Hox collaborent de manière oncogénique avec E2A-PBX1, et que ces interactions sont cellules-spécifiques et varient en fonction du gène Hox impliqué. Une mutagénèse d’insertion provirale suggère et supporte la collaboration des gènes Hoxa et E2A-PBX1 lors de la leucémogénèse des cellules B. La présence de ces interactions dans les cellules B et leur implication dans l’induction des B-ALL est pertinente pour la compréhension de la maladie humaine, et reste encore mal comprise. Notre étude démontre qu’Hoxa9 confère un avantage prolifératif aux cellules B E2A-PBX1. Des expériences de transplantation à l’aide de cellules B E2A-PBX1/Hoxa9 positives isolées de chimères de moelle osseuse démontrent qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 en contribuant à la transformation oncogénique des cellules, et qu’Hoxa9 seul n’induit aucune transformation. Une analyse par Q-RT-PCR nous a permis de démontrer une forte inhibition de gènes spécifiques aux cellules B dans les leucémies co-exprimant Hoxa9 et E2A-PBX1, en plus d’une activation de Flt3, suggérant une inhibition de la différenciation des cellules B accompagnée d’une augmentation de la prolifération. De plus, la surexpression de Hoxa9 dans des cellules leucémiques de souris transgéniques E2A-PBX1, confère aussi un avantage prolifératif aux cellules in vitro, qui semblent être influencé par une augmentation de l’expression de Flt3 et Pdgfδ. En conclusion, nous démontrons pour la première fois à l’aide d’un modèle murin qu’Hoxa9 collabore avec E2A-PBX1 lors de la transformation oncogénique des cellules B et que la signalisation via Flt3 est impliquée, ce qui est potentiellement pertinent pour la maladie humaine.