栉孔扇贝(Chlamys farreri)Toll样受体及其信号传递相关基因的克隆与表达

扇贝是我国海水养殖的重要品种，但自1994年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且直接威胁到现有产业的生存和发展。引起扇贝大规模死亡原因是多方面的，其主要原因是养殖环境恶化、扇贝种质衰退和抗病力下降。因此，深入研究扇贝免疫防御机制，探讨提高机体抗病力的有效途径和方法，改良种质和培育抗病品系，无疑是解决目前困扰扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。 Toll样受体（TLRs）家族是新近发现的模式识别受体（PRRs），参与识别病原体相关的分子模式（PAMPs），在天然免疫系统中起着非常重要的作用。哺乳动物中Toll样受体信号通路还参与诱导树枝状细胞成熟、参与免疫耐受、参与凋亡发生发展、介导非感染性因素的识别等，被视为联系天然免疫和获得性免疫的桥梁。同时果蝇的Toll信号通路也是不具备获得性免疫的果蝇赖以抵御病毒、细菌和真菌感染，介导天然免疫反应的重要信号通路。 本研究采用大规模EST测序方法，结合Genome Walker库的构建和cDNA末端快速扩增技术，从栉孔扇贝克隆得到CfToll-1、CfMyd88、CfTRAF6和CfCactus这四个Toll样受体信号通路基因的全长cDNA，同时用荧光实时定量PCR技术检测了这些基因的组织分布及在脂多糖（LPS）和肽聚糖（PGN）刺激下的表达规律。 栉孔扇贝Toll样受体（CfToll-1）的cDNA序列全长4308 bp，包含5’非翻译区（UTR）211 bp，3597 bp的开放阅读框，500 bp的3’UTR，最后为18个腺嘌呤的ploy A 尾巴。开放阅读框编码1198个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为137.41kd，估计的等电点为5.62，该多肽有信号肽，具有一个预测的跨膜区，因此是一种跨膜蛋白。经BLAST比对，CfToll-1基因与节肢动物多种Toll蛋白高度的相似性。SMART（Simple Modular Architecture Research Tool）软件分析，CfToll-1包含典型的Toll样受体的结构：富含亮氨酸的重复序列的胞外区（leucine-rich repeats, LRR），一段跨膜结构域，以及胞内区的TIR结构域（Toll/IL-1 receptor homologous region）。利用Real-time RT-PCR发现CfToll-1mRNA在扇贝体内普遍存在于血细胞、肌肉、外套膜、心、性腺和鳃组织中。利用体外培养的原代血细胞系研究不同浓度LPS刺激后CfToll-1的表达变化，结果显示低剂量（100ng.mL-1 ）LPS 使CfToll-1 mRNA表达量减小，该变化在1.5h、3h 和9h组差异显著，虽然在6h组表达量稍有恢复，但尚未达到对照水平；用1μg.mL-1LPS处理细胞时， 6h组CfToll-1表达量明显上调，约为对照水平的2倍。证实细菌结构脂多糖对CfToll-1基因的表达有影响，且这种影响有剂量依赖效应。 栉孔扇贝Myd88同源基因（CfMyd88）的cDNA序列全长1554bp，包含5’UTR 427 bp，1101bp的开放阅读框，最后为18个腺嘌呤的ploy A 尾。CfMyd88的开放阅读框可编码367个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为42.37kD，估计的等电点为5.71。利用SMART程序分析发现CfMyd88编码了Death和TIR结构域, 这两个结构域是Myd88特征结构。BLAST程序发现扇贝的序列与数据库哺乳动物的Myd88基因高度同源。原代培养的扇贝血细胞在受到PGN刺激后，CfMyd88 mRNA表达在1.5小时开始下调，直到9小时下调至对照表达量的1/10，证实肽聚糖结构对CfMyd88基因的表达有影响。 栉孔扇贝TRAF6同源基因（CfTRAF6）的cDNA序列全长2510bp，包含5’UTR 337 bp，1965bp的开放阅读框，3’UTR 208bp，最后为21 个腺嘌呤的ploy A 尾巴。CfTRAF6开放阅读框编码655个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为74.09kD，估计的等电点为6.01。InterPro Scan在线分析发现CfTRAF6有典型的TRAF蛋白家族的特征结构，包括的一个指环结构，两个锌指结构，一个MATH （the meprin and TRAF homology）结构域以及Coiled-coil区域。CfTRAF6的序列与数据库多物种的TRAF6高度同源，同源性最高的是乌贼序列（Identity＝68）和鼠类（Identity＝45%）。利用Real-time RT-PCR，发现CfTRAF6在各组织普遍存在，在性腺中的表达最高。原代培养的扇贝血细胞在受到不同浓度PGN刺激后，与CfMyd88的情况一样，CfTRAF6的表达量变化减少，且这种变化随剂量的增加更加明显。 栉孔扇贝Cactus同源基因（CfCactus）的cDNA序列全长2488bp，包含5’UTR 181 bp，840bp的开放阅读框， 3’UTR 1467bp，最后为19个腺嘌呤的ploy A 尾巴。CfCactus的开放阅读框编码279个氨基酸的多肽，该多肽的估计分子量为31.37 kD；估计的等电点为4.74，与果蝇的Cactus基因的等电点相近（4.5）。利用SMART程序分析发现CfCactus主要编码了ANK结构域（ankyrin repeats）。Cactus基因为哺乳动物NF-κB抑制蛋白IκB的同源分子，BLAST 程序发现扇贝的序列与数据库多物种的Cactus或IκB基因高度同源。同源性最高的是太平洋牡蛎（Identity=35%）和圆尾鲎（Identities = 44%）。对CfTCactus mRNA在扇贝的血细胞、性腺、 肠的组织表达进行分析，并同时与CfTRAF6和CfMyd88的表达量进行了对比，发现CfCactus的表达水平明显高于这两个基因，而且CfTRAF6的基因表达量也高于CfMyd88，表现出级联放大效应。正常情况下，三个基因在性腺的表达量最高，推测这条通路可能和发育等功能密切相关。 通过本研究我们首次在双壳类软体动物找得到与果蝇Toll蛋白家族高度同源的CfToll-1基因，同时发现其他三个在Toll样受体信号传递过程中起重要作用的基因，其中包括在软体动物中获得的第一个Toll样受体的接头分子－CfMyd88基因，该结果直接证明软体动物具有与哺乳动物和节肢动物高度类似Myd88依赖的Toll样受体信号通路。同时通过这些基因组织分布的研究以及细菌结构LPS和PGN对这条通路上基因表达的影响，证明扇贝Toll信号通路可能与在果蝇中一样，参与扇贝的发育和免疫防御等多种功能。

中国明对虾病原检测新方法及酚氧化酶通路相关基因的研究

对虾病害在世界范围内肆虐，给水产养殖和沿海农村经济造成了重大损失。在水产养殖的实践中快速检测水产动物的病害并及时采取隔离等措施对于控制病害尤为重要，其中关键的环节就是快速检测出病害，并在对虾免疫机制上寻找对虾疾病防治的有效方法。研究表明当对虾等甲壳动物受到外界病原刺激时，极微量的微生物多糖就可以激活proPO系统。激活过程中涉及和产生一系列活性物质，如黑色素、酚氧化酶原激活因子（PPA）、模式识别蛋白（BGBP、PGBP、LGBP、LBP）及其膜上受体和A2巨球蛋白等，它们可通过多种方式参与防御反应，包括提供调理素，促进血细胞吞噬作用，形成结节或包囊以及介导凝集和凝固，产生杀菌物质并且黑色素化。黑色素常常在节肢动物的体表形成黑色斑点，形成的色素沉着对机体起到保护作用。所以，酚氧化酶原激活的级联反应是节肢动物免疫的关键因素。本论文研究开发了以环等温介导技术（LAMP）为基础的检测对虾白斑病毒（WSSV）和鳗弧菌（V. anguillarum）的快速检测方法。并从对虾对病害的免疫机制为切入点，从中国明对虾体内克隆了酚氧化酶原（PrpPO）和丝氨酸蛋白酶FcSP3这两个免疫系统中重要的基因，分析了它们的分子结构特征，组织分布及应答鳗弧菌病原刺激的表达变化模式。 建立的对虾常见病害对虾白班病毒（WSSV）和鳗弧菌（V. anguillarum）的LAMP检测方法，经过实验比对和Blast检索，发现本研究中使用的引物，比已经报导的LAMP方法或者PCR方法具有更宽的检测范围（更低的假阴性）。检测WSSV的LAMP方法使用病毒的VP28基因设计引物，而鳗弧菌的检测方法使用empA基因设计引物。在方法中，首次提出加入UNG酶和dUTP的措施来预防污染，在实际检测中非常有效。LAMP方法与PCR检测方法的灵敏性比较也进行了研究，二者灵敏性相当。 依据中国明对虾血液cDNA文库提供的部分片段信息，结合SMART-RACE技术，克隆了酚氧化酶原（PrpPO）基因，通过序列比对分析发现，PrpPO基因cDNA全长为3040 bp，其中开放阅读框2061 bp，编码686个氨基酸，其中推测的信号肽为12个氨基酸。推测的序列与斑节对虾（P. monodon）同源性为93%,与短钩对虾（P. semisulcatus.）同源性为92%。real time RT-PCR实验结果表明， ProPO在血细胞中的相对表达量最高，肝胰脏中表达量最低。弧菌刺激实验中注射弧菌，刺激了血细胞和淋巴器官中的ProPO mRNA显著增加，说明在血细胞和淋巴器官中存在快速反应的ProPO通路。而ProPO mRNA量在淋巴器官中在时间上早于血液中升至最高，说明该动物在在病原刚开始入侵的时候先有淋巴器官发挥主要的免疫作用，随着时间推移血细胞便变成主要的免疫器官。 根据中国明对虾肝胰脏cDNA文库提供EST信息，经过SMART-RACE克隆了一个丝氨酸蛋白酶FcSP3基因，通过序列比对分析发现，该丝氨酸蛋白酶基因cDNA全长为1622 bp，其中开放阅读框1431 bp，编码477个氨基酸，其中推测的信号肽为22个氨基酸。推测的序列与疟蚊的丝氨酸蛋白酶（A. gambiae）同源性为33%,与丽蝇蛹集金小蜂的酚氧化酶原激活因子（N. vitripennis）同源性为32%，与东北大黑鳃金龟的酚氧化酶原激活因子（H. diomphalia）同源性为34%。淋巴器官中PPAⅡ表达量约为血液中表达量的47560倍，肝胰脏中的FCSP3表达量为血细胞表达量的6226倍。鳗弧菌注射对虾后，淋巴器官中刺激组和对照组FcSP3的mRNA量在刺激后6小时显著降低，但是刺激组的表达量明显高于对照组。刺激组的血细胞与肝胰脏中FcSP3 mRNA的相对表达量增高。而病原刺激后的血液与肝胰脏中的FcSP3 mRNA的增长趋势也在时间上先与ProPO mRNA。这说明FcSP3对ProPO有正调控的作用，但这个调控有一个时间差，并且在不同组织中有不同的调控效率。

栉孔扇贝CfLITAF基因的克隆与表达分析

关于无脊椎动物中是否存在细胞因子一直都存在着异议。从细胞因子本身入手，运用细胞生物学和免疫学手段，已经在软体动物、节肢动物和棘皮动物等无脊椎动物中证实了高等动物细胞因子样活性物质的存在，然而利用分子生物学手段至今没有得到任何核苷酸或蛋白序列信息，而从与细胞因子相关的分子如调控其表达的转录因子入手来研究无脊椎动物中的细胞因子样物质的存在，或许会得到意想不到的惊喜。 最近从人的单核细胞系THP-1中分离纯化出一种新型的转录因子，它可以被LPS诱导表达，产生的蛋白在TNF-α的表达过程中起着非常重要的作用，因而命名为LPS-induced TNF-α factor（LITAF）。随后该基因在小鼠和鸡中也被克隆分离出来，其编码的蛋白已经证实在TNF-α的表达过程中起着不可或缺的作用。迄今为止，在无脊椎动物中还没有相关同源基因的报道。 本研究采用大规模EST测序方法，结合锚定PCR技术从栉孔扇贝体内克隆到了高等动物LITAF基因的同源基因CfLITAF的全长cDNA序列。该cDNA全长为1240bp，其中5' 非编码区（UTR）为112 bp；开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）包括450 bp，编码149个氨基酸残基，该多肽的理论分子量为16.08 kDa，等电点为6.77；3' UTR为678bp，包含一个poly A尾巴。SMART结构域预测发现CfLITAF蛋白含有一个保守的LITAF结构域。实时定量PCR检测CfLITAF基因在栉孔扇贝主要免疫器官中的表达分布情况，发现在所检测的六种组织血细胞、外套膜、肌肉、心、腮、性腺中均能检测到CfLITAF基因转录本的不同丰度的表达。血淋巴和肌肉中的表达量相差不大，而在心、外套膜、腮和性腺中的表达量要高于血淋巴和肌肉中的表达量，分别是血中表达量的2.45、2.82、9.23和24.93倍。 为了验证其表达量是否会受到LPS的诱导，利用QRT-PCR（quantitative real time PCR）检测了CfLITAF基因在受到LPS和PGN刺激后在血细胞中的表达规律。结果如下：在LPS刺激后3h，CfLITAF的表达量显著上调，达到了原初水平的1.5倍，随着时间的延长，其表达量逐渐恢复到刺激前水平；在用PGN刺激血细胞后的9个小时内均没有检测到CfLITAF基因mRNA表达量的显著变化。实验中所用血细胞为同一批原代培养的栉孔扇贝血淋巴细胞，细胞活力通过台盼蓝拒染实验测定。 CfLITAF基因的克隆与表达分析，不仅为进一步认识栉孔扇贝的免疫防御机制提供了实验参考，更重要的是为无脊椎动物中细胞因子样物质的研究提供了一个分子水平上的线索，为无脊椎动物中细胞因子样物质的研究奠定了理论基础。

中国明对虾体内凝结作用相关免疫基因的克隆与表达研究

对虾疾病在世界范围内的频频爆发，给地区经济造成了重大损失。然而到目前为止，我们对于对虾免疫系统的分子机制还知之甚少，深入了解其免疫应答过程，包括异物识别，信息传递以及作用方式等是从根本上解决疾病问题的关键之一。本论文从中国明对虾血细胞中分别克隆了一种C型凝集素基因（Fclectin）、参与凝结过程的谷氨酰胺转移酶基因（FcTG）以及参与凝结级联反应和酚氧化酶原激活系统的两种丝氨酸蛋白酶基因（SP-1和SP-2）和两种丝氨酸蛋白酶抑制剂基因（SPI-1和SPI-2），分析了它们的分子结构特征，预测了其可能的作用，并对它们的组织分布及应答不同病原感染的表达变化模式进行了研究。 首次从对虾中克隆了Fclectin基因，比对结果发现该基因属于C型凝集素超家族的成员之一；Northern blot和原位杂交结果显示，Fclectin基因在部分血细胞中呈组成型表达；利用毛细管电泳半定量RT-PCR方法分别研究了细菌和病毒感染后该基因的表达特征，并初步尝试了利用体外培养的原代血细胞系统研究LPS刺激后Fclectin的表达变化。该基因在感染或刺激后表达水平有明显的改变。 利用RACE技术从中国明对虾血细胞中克隆了一个FcTG基因，它与斑节对虾的谷氨酰胺转移酶基因有93%的相似性，可能编码一种具有活性的TG；原位杂交结果FcTG主要在血细胞中表达，在淋巴器官管腔的血细胞中表达尤为丰富，推断该基因可能主要在吞噬细胞中表达；病原的刺激未能使该基因的表达明显改变，但损伤（注射）的刺激会对其表达产生一定影响。 利用本组构建的对虾血液cDNA文库，克隆到了两个不同的丝氨酸蛋白酶基因，命名为SP-1和SP-2。前者为具有假clip结构域的胰蛋白酶样SP类似物（SPH），后者是一个具有完整的clip结构域的SPH，这在对虾中是首次发现。SP-1和SP-2都主要在血细胞中表达，此外SP-1在淋巴器官中的表达水平也很高；细菌的刺激对SP-1的影响不大，但会诱导SP-2表达量的增加，这两个基因的表达模式在病毒刺激后很相似，都出现先上调后下降的过程，可见病毒的感染会导致这两个基因转录的增强。 利用SMART-RACE技术结合对虾血液cDNA文库的利用，从中国明对虾血细胞中克隆到了两种SPI基因，它们分别为kazal-SPI和serpin-SPI，属于两个不同的家族。SPI-1与斑节对虾的SPI有76%的相似性，推断SPI-1可能主要对弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等有抑制作用；SPI-2为对虾中首次报道的serpin型抑制剂，它与淡水螯虾的serpin有42%的相似性，SPI-2可能主要对胰蛋白酶、酚氧化酶原激活酶、凝血酶和凝结酶有抑制活性。组织分别特征显示这两个抑制剂基因都在鳃、血细胞和淋巴器官中有高水平的表达。细菌的刺激都会导致这两个基因的表达在感染后出现下调，随后又上升至原有水平；病毒感染后，SPI-1和SPI-2的表达变化情况相似，感染后前12h基本没有明显的改变，到了感染的晚期（感染后24h和48h），随着病毒在体内大量复制，这两个基因的表达都急剧下降至接近基因关闭的状态，这可能暗示着与SPI相对应的蛋白酶的活力将很大程度的异常的增加，机体内稳定的免疫系统平衡状态可能已被破坏。

栉孔扇贝凝集素家族基因研究

栉孔扇贝是我国北方重要的贝类养殖品种。自1997年以来爆发的栉孔扇贝大规模死亡，给地区经济造成了重大损失并且已经严重威胁扇贝养殖业的健康发展。然而，到目前为止，对扇贝免疫防御的分子机理了解还很少，深入研究扇贝免疫应答的分子机制是认识和了解病害发生和实现病害控制的关键问题之一。本研究采用了EST大规模测序结合cDNA锚定扩增的方法，从栉孔扇贝cDNA文库中克隆到五个C－型凝集素基因，并对其中部分基因进行了深入研究。 C－型凝集素CFLec－1的基因全长1785bp，其中含有5’非翻译区66bp，随后是666bp的开放阅读框；最后一条非常长的3’非翻译区1040bp，其中包含多个多聚腺甘酸加尾信号和polyA尾巴。栉孔扇贝CFLec－1编码221个氨基酸的蛋白，其N末端为15个氨基酸的信号肽。CFLec－1的成熟肽为206个氨基酸，其等电点为5.12，计算分子量为23.49kDa。SMART程序分析显示，C末端130氨基酸是一个标准的长型C－型凝集素结构域，其中四个半光胺酸（Cys104，Cys177，Cys193，Cys202）形成的两对二硫键维持了C－型凝集素的空间结构，而位于N末端的两个二硫键（Cys74，Cys85）构成了长型C－型凝集素结构域特有的一对额外二硫键。同源性分析表明，CFLec－1的C－型凝集素结构域与红原鸡的甘露糖受体中的C－型凝集素结构域有47％的相似度，与大西洋鲑的C－型凝集素受体C有31％的相似度。通过与其他同源的C－型凝集素结构域序列比对，发现了可能的糖结合位点EPD基域（Glu169-Pro170-Asp171）。通过RT－PCR研究CFLec－1在扇贝不同组织中的分布后发现，在健康扇贝中，CFLec－1在性腺中有中等程度的表达，在腮中有少量表达，在血淋巴和外套膜中有微量表达。经热处死的鳗弧菌刺激后，CFLec－1在几乎所有检测组织中的表达量都有明显的提高，其中，血淋巴中的表达量变化最为显著。这些结果说明CFLec－1是组成/诱导型基因，并且可能参与了黏膜防御。通过RT－PCR分析了CFLec－1在血淋巴中的表达特征后发现，在革兰氏阳性菌溶壁微球菌和革兰氏阴性菌鳗弧菌刺激后，CFLec－1的表达均显著高于对照组，并且成明显的随时间变化趋势。在大肠杆菌中表达的重组CFLec－1可以凝集革兰氏阴性菌大肠杆菌JM109，且凝集过程需要钙离子的参与。重组CFLec－1对大肠杆菌JM109有较弱的抑菌活性，对溶壁微球菌有明显的抑菌活性，对鳗弧菌没有抑菌活性。这一结果说明，CFLec－1可能不仅参与对入侵微生物的识别过程，而且可能作为效应分子起到了直接杀灭入侵微生物的作用。 CFLec-2的cDNA全长为708bp，其5’UTR为59bp。3’UTR为217bp。 CFLec-2的开放阅读框为432bp，编码160个氨基酸残基,其中包含5’信号肽17个残基。CFLec-2的编码区中含有一个C-型凝集素结构域。利用本研究中构建的原核表达载体，CFLec-2的成熟肽在大肠杆菌中被成功表达。 mCFLec-1的cDNA全长为2257bp，5’UTR17bp，3’UTR为713bp。mCFLec-1的开放阅读框为1527bp，编码508个氨基酸残基，其中包含17个氨基酸残基的信号肽序列。mCFLec-1的编码区含有三个串联的C-型凝集素结构域。利用本研究中构建的原核表达载体，mCFLec-2的成熟肽在大肠杆菌中被成功表达。 mCFLec-2的cDNA全长2086bp。其5’UTR长为18bp，3’UTR长为238bp。开放阅读框均为1776bp，编码609个氨基酸残基，其中包含N末端由18个氨基酸构成的信号肽。mCFLec-2的编码区包含四个C-型凝集素结构域。mCFlec-3的cDNA全长1897bp，其5’UTR和编码区与mCFLec-2几乎完全相同，只有个别碱基的差异。mCFlec-3的3’UTR为49bp。 本研究从扇贝机体本身的免疫机制入手，深入探讨其免疫机理，为进一步研究信号传导，了解扇贝先天性免疫的机制，为制定合理的研制策略提供坚实的理论基础；丰富和发展海水无脊椎动物免疫学的内容，为控制养殖生物疾病提供了新的思路；进一步通过高低等生物之间功能类似分子的同源性比对，为解释和阐明先天免疫这种已经存在数十亿年，从低等生物开始到人类仍旧保留且更加完善的免疫系统的奥秘和本质提供证据。

大熊猫RPS15 cDNA的克隆及序列分析

本研究运用RT—PCR技术，首次从大熊描Ailuropoda melanoleucu的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S15（RPS15）基因的表达序列．并对其进行了初步分析。结果表明：大熊猫RPS15基因的表达序列全长为442bp，开放阅读框（ORF）为438bp，编码145个氨基酸，该蛋白的分子量为17．0401KDa，等电点为10．3，含有2个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点，5个蛋白激酶C磷酸化位点，4个N-酰基化位点及1个RPS19蛋白signature位点。进一步分析发现，大熊猫RPS15基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性。

相异物种同源基因cDNA的快速克隆

介绍了一种经合生物信息学数据库的比较分析，在系统发生相近物种的核酸保守区设计PCR引物，通过RT-PCR和RACE方法，在相异物种中快速克隆同源基因cDNA的一种简捷方法。

cDNA cloning and overexpression of acidic ribosomal phosphoprotein P1 gene (RPLP1) from the Giant Panda

RPLP1 is one of acidic ribosomal phosphoproteins encoded by RPLP1 gene, which plays an important role in the elongation step of protein synthesis. The cDNA of RPLP1 was cloned successfully for the first time from the Giant Panda (Ailuropoda melanoleuca) using RT-PCR technology, which was also sequenced, analyzed preliminarily and expressed in E. coli. The cDNA fragment cloned is 449bp in size, containing an open reading frame of 344bp encoding 114 amino acids. Alignment analysis indicated that the nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence are highly conserved to other five species studied, including Homo sapiens, Mus musculus, Rattus norvegicus, Bos Taurus and Sus scrofa. The homologies for nucleotide sequences of Giant Panda PPLP1 to that of these species are 92.4%, 89.8%, 89.0%, 91.3% and 87.5%, while the homologies for amino acid sequences are 96.5%, 94.7%, 95.6%, 96.5% and 88.6%. Topology prediction showed there are three Casein kinase II phosphorylation sites and two N-myristoylation sites in the RPLP1 protein of the Giant Panda (Ailuropoda melanoleuca). The RPLP1 gene was overexpressed in E. coli and the result indicated that RPLP1 fusion with the N-terminally His-tagged form gave rise to the accumulation of an expected 18kDa polypeptide, which was in accordance with the predicted protein and could also be used to purify the protein and study its function.

Hypoxia-inducible factor 1 alpha cDNA cloning and its mRNA and protein tissue specific expression in domestic yak (Bos grunniens) from Qinghai-Tibetan plateau

Adaptation to hypoxia is regulated by hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1), a heterodimeric transcription factor consisting of an oxygen-regulated a-subunit and a constitutively expressed beta-subunit. How animals living on Qinghai-Tibetan plateau adapt to the extreme hypoxia environment is known indistinctly. In this study, the Qinghai yak which has been living at 3000-5000 m attitude for at least two millions of years was selected as the model of high hypoxia-tolerant adaptation species. The HIF-1 alpha ORFs (open reading frames) encoding for two isoforms of HIF-1 alpha have been cloned from the brain of the domestic yak. Its expression of HIF-1 alpha was analyzed at both mRNA and protein levels in various tissues. Both its HIF-1 alpha mRNA and protein are tissue specific expression. Its HIF-1 alpha protein's high expression in the brain, lung, and kidney showed us that HIF-1 alpha protein may play an important role in the adaptation to hypoxia environment. (c) 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.

Leptin cDNA cloning and its mRNA expression in plateau pikas (Ochotona curzoniae) from different altitudes on Qinghai-Tibet Plateau

Leptin, an adipocyte-derived hormone, plays all important role in body energy homeostasis. Plateau pika (Ochotona curzoniae), an endemic and keystone species living only at 3000-5000 in above sea level oil Qinghai-Tibet Plateau, is a typically high hypoxia and low temperature tolerant mammal with high resting metabolic rate (RMR), non-shivering thermogenesis (NST), and high ratio of oxygen utilization to cope with harsh plateau environment. To explore the molecular mechanism of ecological acclimation in plateau pika, we first cloned pika leptin cDNA and compared its mRNA expression in different altitudes (3200 and 3900 in) using real-time RTPCR (Taqman probe) technology. The full-length pika leptin cDNA was 3015 with 504 bp open-reading frame encoding the precursor peptide of 167 amino acids including 21 residues of signal peptide. Pika leptin was 70-72% homologous to that of other species and was of similarly structural characteristics with other species. The pika-specific genetic diversity in leptin sequence occurred at twenty sites. With the increase in attitude, there were larger fat store and high level of ob gene expression in plateau pika. Our results indicated that leptin is sensitive to cold and hypoxia plateau environment and may play one of important roles in pika's ecological adaptation to harsh plateau environment. (c) 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.

Cloning of hypoxia-inducible factor 1 alpha cDNA from a high hypoxia tolerant mammal - plateau pika (Ochotona curzoniae)

Hypoxia-inducible factor I is a transcription factor composed of HIF-1alpha and HIF-1beta. It plays an important role in the signal transduction of cell response to hypoxia. Plateau pika (Ochotona curzoniae) is a high hypoxia-tolerant and cold adaptation species livin only at 3000-5000m above sea level on the Qinghai-Tibet Plateau. In this study, HIF-1alpha cDNA of plateau pika was cloned and its expression in various tissues was studied. The results indicated that plateau pika HIF-1alpha cDNA was highly identical to those of the human (82%), bovine (89%), mouse (82%), and Norway rat (77%). The deduced amino acid sequence (822 bp) showed 90%, 92%, 86%, and 86% identities with those of the human, bovine, house mouse, and Norway rat, respectively. Northern blot analyses detected two isoforms named pLHIF-1alpha and pSHIF-1alpha. The HIF-1alpha mRNA was highly expressed in the brain and kidney, and much less in the heart, lung, liver, muscle, and spleen, which was quite different from the expression pattern of mouse mRNA. Meanwhile, a new variant of plateau pika HIF-1alpha mRNA was identified by RT-PCR and characterized. The deduced protein, composed of 536 amino acids, lacks a part of the oxygen-dependent degradation domain (ODD), both transactivation domains (TADs), and the nuclear localization signal motif (NLS). Our results suggest that HIF-1alpha may play an important role in the pika's adaptation to hypoxia, especially in brain and kidney, and pika HIF-1alpha function pattern may be different from that of mouse HIF-1alpha. Further-more, for the high ratio of HIF-1alpha homology among the animals, the HIF-1alpha gene may be a good phylogenetic performer in recovering the true phylogenetic relationships among taxa. (C) 2004 Elsevier Inc. All rights reserved.

The D-CIXS X-ray mapping spectrometer on SMART-1

Grande, Manuel; Browning, R.; Waltham, N.; Parker, D., 'The D-CIXS X-ray mapping spectrometer on SMART-1', Planetary and Space Science (2003) 51(6) pp.427-433 RAE2008

The D-CIXS X-ray spectrometer on the SMART-1 mission to the Moon - First Results

Grande, Manuel; Kellett, B.; Howe, C.; Perry, C.H., 'The D-CIXS X-ray spectrometer on the SMART-1 mission to the Moon - First Results', Planetary And Space Science (2007) 55(4) pp.494-502 RAE2008

A smart wireless inertial measurement unit system: simplifying & encouraging usage of WIMU technology

Wireless Inertial Measurement Units (WIMUs) combine motion sensing, processing & communications functionsin a single device. Data gathered using these sensors has the potential to be converted into high quality motion data. By outfitting a subject with multiple WIMUs full motion data can begathered. With a potential cost of ownership several orders of magnitude less than traditional camera based motion capture, WIMU systems have potential to be crucially important in supplementing or replacing traditional motion capture and opening up entirely new application areas and potential markets particularly in the rehabilitative, sports & at-home healthcarespaces. Currently WIMUs are underutilized in these areas. A major barrier to adoption is perceived complexity. Sample rates, sensor types & dynamic sensor ranges may need to be adjusted on multiple axes for each device depending on the scenario. As such we present an advanced WIMU in conjunction with a Smart WIMU system to simplify this aspect with 3 usage modes: Manual, Intelligent and Autonomous. Attendees will be able to compare the 3 different modes and see the effects of good andbad set-ups on the quality of data gathered in real time.

Optimisation of Smart Grid performance using centralised and distributed control techniques

A massive change is currently taking place in the manner in which power networks are operated. Traditionally, power networks consisted of large power stations which were controlled from centralised locations. The trend in modern power networks is for generated power to be produced by a diverse array of energy sources which are spread over a large geographical area. As a result, controlling these systems from a centralised controller is impractical. Thus, future power networks will be controlled by a large number of intelligent distributed controllers which must work together to coordinate their actions. The term Smart Grid is the umbrella term used to denote this combination of power systems, artificial intelligence, and communications engineering. This thesis focuses on the application of optimal control techniques to Smart Grids with a focus in particular on iterative distributed MPC. A novel convergence and stability proof for iterative distributed MPC based on the Alternating Direction Method of Multipliers is derived. Distributed and centralised MPC, and an optimised PID controllers' performance are then compared when applied to a highly interconnected, nonlinear, MIMO testbed based on a part of the Nordic power grid. Finally, a novel tuning algorithm is proposed for iterative distributed MPC which simultaneously optimises both the closed loop performance and the communication overhead associated with the desired control.