Mechanisms of Chloroperoxidase-catalyzed Enantioselective Reactions as Probed by Site-directed Mutagenesis and Isotopic Labeling

Chloroperoxidase (CPO) is a heme-containing glycoprotein secreted by the marine fungus Caldariomyces fumago. Chloroperoxidase contains one ferriprotoporphyrin IX prosthetic group per molecule and catalyzes a variety of reactions, such as halogenation, peroxidation and epoxidation. The versatile catalytic activities of CPO coupled with the increasing demands for chiral synthesis have attracted an escalating interest in understanding the mechanistic and structural properties of this enzyme. In order to better understand the mechanisms of CPO-catalyzed enantioselective reactions and to fine-tune the catalytic properties of chloroperoxidase, asparagine 74 (N74) located in the narrow substrate access channel of CPO was replaced by a bulky, nonpolar valine and a polar glutamine using site-directed mutagenesis. The CPO N74 mutants displayed significantly enhanced activity toward nonpolar substrates compared to wild-type CPO as a result of changes in space and polarity of the heme distal environment. More interestingly, N74 mutants showed dramatically decreased chlorination and catalase activity but significantly enhanced epoxidation activity as a consequence of improved kinetic perfection introduced by the mutation as reflected by the favorable changes in kcat and kcat/KM of these reactions. It is also noted that the N74V mutant is capable of decomposing cyanide, the most notorious poison for many hemoproteins, as judged by the unique binding behavior of N74V with potassium cyanide. Histidine 105 (H105) was replaced by a nonpolar amino acid alanine using site-directed mutagenesis. The CPO H105 mutant (H105A) displayed dramatically decreased chlorination and catalase activity possibly because of the decreased polarity in the heme distal environment and loss of the hydrogen bonds between histidine 105 and glutamic acid 183. However, significantly increased enantioselectivity was observed for the epoxidation of bulky styrene derivatives. Furthermore, my study provides strong evidence for the proposed histidine/cysteine ligand switch in chloroperoxidase, providing experimental support for the structure of the 420-nm absorption maximum for a number of carbon monoxide complexes of heme-thiolate proteins. For the NMR study, [dCPO(heme)] was produced using 90% deuterated growth medium with excess heme precursors and [dCPO(Phe)] was grown in the same highly deuterated medium that had been supplemented with excess natural phenylalanine. To make complete heme proton assignments, NMR spectroscopy has been performed for high-resolution structural characterization of [dCPO(heme)] and [dCPO(Phe)] to achieve unambiguous and complete heme proton assignments, which also allows important amino acids close to the heme active center to be determined.

Steroid induced neuroprotection of damaged photoreceptor cells

Retinitis Pigmentosa (RP) is the name given to a group of hereditary diseases causing progressive and degenerative blindness. RP affects over 1 in 4000 individuals, making it the most prevalent inherited retinal disease worldwide, yet currently there is no cure. In 2011, our group released a paper detailing the protective effects of the synthetic progestin ‘Norgestrel’. A common component of the female oral contraceptive pill, Norgestrel was shown to protect against retinal cell death in two distinct mouse models of retinal degeneration: in the Balb/c light damage model and the Pde6brd10 (rd10) model. Little was known of the molecular workings of this compound however and thus this study aimed to elucidate the protective manner in which Norgestrel worked. To this aim, the 661W cone photoreceptor-like cell line and ex vivo retinal explanting was utilised. We found that Norgestrel induces a increase in neuroprotective basic fibroblast growth factor (bFGF) with subsequent downstream actions on the inhibition of glycogen synthase kinase 3β. Progesterone receptor expression was subsequently characterised in the C57 and rd10 retinas and in the 661W cell line. Norgestrel caused nuclear trafficking of progesterone receptor membrane complex one (PGRMC1) in 661W cells and thus Norgestrel was hypothesised to work primarily through the actions of PGRMC1. This trafficking was shown to be responsible for the critical upregulation of bFGF and PGRMC1- Norgestrel binding was proven to cause a neuroprotective bFGF-mediated increase in intracellular calcium. The protective properties of Norgestrel were further studied in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Using non-invasive diet supplementation (80mg/kg), we showed that Norgestrel gave significant retinal protection out to postnatal day 40 (P40). Overactive microglia have previously been shown to potentiate photoreceptor cell loss in the degenerating rd10 retina and thus we focussed on Norgestrel-mediated changes in photoreceptor-microglial crosstalk. Norgestrel acted to dampen pro-inflammatory microglial cell reactivity, decreasing chemokine (MCP1, MCP3, MIP-1α, MIP-1β) and subsequent damaging cytokine (TNFα, Il-1β) production. Critically, Norgestrel up-regulated photoreceptor-microglial, fractalkine-CX3CR1 signalling 1000-fold in the P20 rd10 mouse. Known to prevent microglial activation, we hypothesise that Norgestrel acts as a vital anti-inflammatory in the diseased retina, driving fractalkine-CX3CR1 signalling to delay retinal degeneration. This study stands to highlight some of the neuroprotective mechanisms utilised by Norgestrel in the prevention of photoreceptor cell death. We identify for the first time, not only a pro-survival pathway activated directly in photoreceptor cells, but also a Norgestreldriven mediation of an otherwise damaging microglial cell response. All taken, these results form the beginning of a case to bring Norgestrel to clinical trials, as a potential therapeutic for the treatment of RP.

Adicción al trabajo en el contexto Colombiano

Este estudio aborda el fenómeno de la Adicción al trabajo (AT) en el contexto de los sistemas de producción y de los escenarios del trabajo en Colombia como un país de economía emergente, donde el trabajo hace parte esencial de la cultura, es considerado un valor central de la sociedad y un medio para alcanzar la movilidad social y reducir las desventajas sociales propias de este tipo de economías. De modo que, el trabajo es esencial y determinante en la calidad de vida de las personas por su implicación física, psicológica, emocional y social (Polo, Briñez, Navarro, & Alí, 2016). De esta manera la AT extiende su impacto a la vida privada y familiar, por ello se profundiza en la comprensión de este fenómeno en el marco especifico de economías en donde la intensificación de tareas es un recurso clave para garantizar la eficiencia competitiva de las empresas y en el marco legal Colombiano.

Niveles de actividad física, contenidos-contextos de la clase e intervención docente durante la clase de educación física y su asociación con el tipo de profesor

Resumen: Objetivo: determinar la asociación entre el tipo de profesor (especialista y no especialista en educación física), con el nivel de actividad física, el contenido-contexto de la clase y el comportamiento del profesor. Método: Estudio descriptivo de corte transversal en un colegio distrital de Bogotá. Fueron evaluadas 57 clases de educación física, y dos docentes (uno con formación académica en Educación física), por medio del Sistema para la observación del tiempo de instrucción de la condición física (SOFIT). Las variables observadas fueron analizadas con estadística descriptiva en cantidades relativas a los minutos y proporción de la clase. Para establecer la asociación entre el género de los estudiantes y el tipo de profesor se usaron test t para muestras independientes y U de Mann-Witney. Resultados: La duración promedio de la clase fue 82,7 minutos, 69% del tiempo programado; los estudiantes pasaron la mayor parte del tiempo de pie 29% (25 minutos), el contenido predominante de la clase fue el de tipo general 21% (25 minutos) y los maestros ocuparon en promedio el 36% (29 minutos) de la clase observando. Los estudiantes pasaron 53% (44 minutos) en actividades físicas moderadas a vigorosas (AFMV). Los niños fueron más activos que las niñas (53.94% vs 50,83%). Se observó una asociación positiva entre el género y casi todos los niveles de actividad física de los estudiantes (p<0,05). Se identificó que existe una diferencia estadísticamente significativa (p<0,05), para las categorías sentado y estar de pie de la variable Niveles de Actividad física tanto en los resultados expresados en minutos, como en la proporción del tiempo de la clase y para la categoría caminando expresada en tiempo de la clase. Para la variable contenido-contexto se determinó una asociación para la categoría conocimiento, tanto en la proporción como en el número de minutos, y para la categoría contenido general en los resultados expresados en proporción de la clase. Finalmente, para la variable comportamiento del profesor expresada tanto en minutos como en proporción de la clase tuvo significancia estadística en todas sus categorías a excepción de la categoría promover Conclusiones: hay una diferencia importante en la forma como los dos tipos de maestros desarrollan la clase y los niveles de actividad física en que involucran a los estudiantes. La educación física en la escuela debe ser impartida por profesionales formados en el área, que tengan las destrezas y habilidades necesarias para desarrollar una educación física de calidad.