Regulation of Nav1.7 and Nav1.8 voltage-gated sodium channels by Nedd4-2 and β-subunits and its implication in neuropathic pain

In mammals, the presence of excitable cells in muscles, heart and nervous system is crucial and allows fast conduction of numerous biological information over long distances through the generation of action potentials (AP). Voltage-gated sodium channels (Navs) are key players in the generation and propagation of AP as they are responsible for the rising phase of the AP. Navs are heteromeric proteins composed of a large pore-forming a-subunit (Nav) and smaller ß-auxiliary subunits. There are ten genes encoding for Navl.l to Nav1.9 and NaX channels, each possessing its own specific biophysical properties. The excitable cells express differential combinations of Navs isoforms, generating a distinct electrophysiological signature. Noteworthy, only when anchored at the membrane are Navs functional and are participating in sodium conductance. In addition to the intrinsic properties of Navs, numerous regulatory proteins influence the sodium current. Some proteins will enhance stabilization of membrane Navs while others will favour internalization. Maintaining equilibrium between the two is of crucial importance for controlling cellular excitability. The E3 ubiquitin ligase Nedd4-2 is a well-characterized enzyme that negatively regulates the turnover of many membrane proteins including Navs. On the other hand, ß-subunits are known since long to stabilize Navs membrane anchoring. Peripheral neuropathic pain is a disabling condition resulting from nerve injury. It is characterized by the dysregulation of Navs expressed in dorsal root ganglion (DRG) sensory neurons as highlighted in different animal models of neuropathic pain. Among Navs, Nav1.7 and Nav1.8 are abundantly and specifically expressed in DRG sensory neurons and have been recurrently incriminated in nociception and neuropathic pain development. Using the spared nerve injury (SNI) experimental model of neuropathic pain in mice, I observed a specific reduction of Nedd4-2 in DRG sensory neurons. This decrease subsequently led to an upregulation of Nav1.7 and Nav1.8 protein and current, in the axon and the DRG neurons, respectively, and was sufficient to generate neuropathic pain-associated hyperexcitability. Knocking out Nedd4-2 specifically in nociceptive neurons led to the same increase of Nav1.7 and Nav1.8 concomitantly with an increased thermal sensitivity in mice. Conversely, rescuing Nedd4-2 downregulation using viral vector transfer attenuated neuropathic pain mechanical hypersensitivity. This study demonstrates the significant role of Nedd4-2 in regulating cellular excitability in vivo and its involvement in neuropathic pain development. The role of ß-subunits in neuropathic pain was already demonstrated in our research group. Because of their stabilization role, the increase of ßl, ß2 and ß3 subunits in DRGs after SNI led to increased Navs anchored at the membrane. Here, I report a novel mechanism of regulation of a-subunits by ß- subunits in vitro; ßl and ß3-subunits modulate the glycosylation pattern of Nav1.7, which might account for stabilization of its membrane expression. This opens new perspectives for investigation Navs state of glycosylation in ß-subunits dependent diseases, such as in neuropathic pain. - Chez les mammifères, la présence de cellules excitables dans les muscles, le coeur et le système nerveux est cruciale; elle permet la conduction rapide de nombreuses informations sur de longues distances grâce à la génération de potentiels d'action (PA). Les canaux sodiques voltage-dépendants (Navs) sont des participants importants dans la génération et la propagation des PA car ils sont responsables de la phase initiale de dépolarisation du PA. Les Navs sont des protéines hétéromériques composées d'une grande sous-unité a (formant le pore du canal) et de petites sous-unités ß accompagnatrices. Il existe dix gènes qui codent pour les canaux sodiques, du Nav 1.1 au Nav 1.9 ainsi que NaX, chacun possédant des propriétés biophysiques spécifiques. Les cellules excitables expriment différentes combinaisons des différents isoformes de Navs, qui engendrent une signature électrophysiologique distincte. Les Navs ne sont fonctionnels et ne participent à la conductibilité du Na+, que s'ils sont ancrés à la membrane plasmique. En plus des propriétés intrinsèques des Navs, de nombreuses protéines régulatrices influencent également le courant sodique. Certaines protéines vont favoriser l'ancrage et la stabilisation des Navs exprimés à la membrane, alors que d'autres vont plutôt favoriser leur internalisation. Maintenir l'équilibre des deux processus est crucial pour contrôler l'excitabilité cellulaire. Dans ce contexte, Nedd4-2, de la famille des E3 ubiquitin ligase, est une enzyme bien caractérisée qui régule l'internalisation de nombreuses protéines, notamment celle des Navs. Inversement, les sous-unités ß sont connues depuis longtemps pour stabiliser l'ancrage des Navs à la membrane. La douleur neuropathique périphérique est une condition débilitante résultant d'une atteinte à un nerf. Elle est caractérisée par la dérégulation des Navs exprimés dans les neurones sensoriels du ganglion spinal (DRG). Ceci a été démontré à de multiples occasions dans divers modèles animaux de douleur neuropathique. Parmi les Navs, Nav1.7 et Nav1.8 sont abondamment et spécifiquement exprimés dans les neurones sensoriels des DRG et ont été impliqués de façon récurrente dans le développement de la douleur neuropathique. En utilisant le modèle animal de douleur neuropathique d'épargne du nerf sural (spared nerve injury, SNI) chez la souris, j'ai observé une réduction spécifique des Nedd4-2 dans les neurones sensoriels du DRG. Cette diminution avait pour conséquence l'augmentation de l'expression des protéines et des courants de Nav 1.7 et Nav 1.8, respectivement dans l'axone et les neurones du DRG, et était donc suffisante pour créer l'hyperexcitabilité associée à la douleur neuropathique. L'invalidation pour le gène codant pour Nedd4-2 dans une lignée de souris génétiquement modifiées a conduit à de similaires augmentations de Nav1.7 et Nav1.8, parallèlement à une augmentation à la sensibilité thermique. A l'opposé, rétablir une expression normale de Nedd4-2 en utilisant un vecteur viral a eu pour effet de contrecarrer le développement de l'hypersensibilité mécanique lié à ce modèle de douleur neuropathique. Cette étude démontre le rôle important de Nedd4-2 dans la régulation de l'excitabilité cellulaire in vivo et son implication dans le développement des douleurs neuropathiques. Le rôle des sous-unités ß dans les douleurs neuropathiques a déjà été démontré dans notre groupe de recherche. A cause de leur rôle stabilisateur, l'augmentation des sous-unités ßl, ß2 et ß3 dans les DRG après SNI, conduit à une augmentation des Navs ancrés à la membrane. Dans mon travail de thèse, j'ai observé un nouveau mécanisme de régulation des sous-unités a par les sous-unités ß in vitro. Les sous-unités ßl et ß3 régulent l'état de glycosylation du canal Nav1.7, et stabilisent son expression membranaire. Ceci ouvre de nouvelles perspectives dans l'investigation de l'état de glycosylation des Navs dans des maladies impliquant les sous-unités ß, notamment les douleurs neuropathiques.

Role of notch signalling in mammary gland

ÁBSTRACT : Mammary gland is composed of two main epithelial cell types, myoepithelial and luminal. The mechanisms involved in determination and maintenance of them remain poorly understood. Notch signaling is known to regulate cell fate determination in other tissues like skin and nervous system. It was also shown that it can act as tumor suppressor or oncogene depending on the tissue type. The mouse models overexpressing active Notch receptors indicated that Notch signaling is oncogenic in the mammary gland. This observation was followed by some descriptive and functional studies in human breast cancer and it was reported that Notch signaling activity or expression of its components are increased in some of the breast tumor samples compared to normal tissue. However, the physiological role of the Notch signaling and its downstream mechanisms in mammary gland is poorly defined. p63, a member of p53 family, has been implicated in the cell fate determination of keratinocytes. Knockout mouse models revealed that p63 is required for the formation of the mammary anlagen in embryo and its ΔN isoform is expressed exclusively in the myoepithelial layer of the adult breast. In order to understand its function in normal breast epithelial cells, I activated Notch signaling by expression of Notch1 intracellular domain (NICD) in normal primary human breast epithelial cells (HBECs). In this context, NICD reduced growth of HBECs and led to downmodulation of extracellular matrix-receptor interaction network (ECM) components as well as ΔNp63. Expression of ΔNp63 together with NICD partially rescued Notch induced growth reduction, which was correlated with an increase in ECM components. Moreover, silencing ΔNp63 in myoepithelial HBECs reduced growth similar to Notch activation and it led to downregulation of myoepithelial and upregulation of luminal markers. Complementing this observation, forced expression of ONp63 in luminal HBECs induced myoepithelial phenotype and decreased luminal markers. In vivo, by the analysis of a Notch reporter mouse strain, I showed that Notch is activated during puberty specifically at the sites of ductal morphogenesis, terminal end buds. FAGS analysis revealed that it can be detected in two different populations based on CD24 expression (low (lo) or high (high)): at lower levels in CD24lo, which includes stem/progenitor and myoepithelial cells and higher levels in CD24hi, which contains luminal cells. In parallel with in vitro results, the CD24lo mouse mammary epithelial cells displaying Notch activity have lower levels of p63 expression. Furthermore, deletion of RBPjk, the main mediator of Notch signaling, or the overexpression of ΔNp63 inhibited luminal cell lineage in vivo. Another important point revealed by Notch reporter mouse strain is the simultaneous activation of Notch with estrogen signaling during pubertal development. The expression of FOXA1, the mediator of estrogen receptor (ER) transcriptional activity, is correlated with Notch activation in vivo that it is lower in CD24lo than in CD24hi cells. Moreover, FOXA1 is regulated by NICD in vitro supporting the presence of a link between Notch and ER signaling. Taken together, I report that Notch signaling is involved in luminal cell fate determination and its effects are partially mediated through inhibition of ONp63. Besides, ΔNp63 is required for the maintenance and sufficient for the induction of myoepithelial phenotype in HBECs in vitro and is not compatible with luminal lineage in vivo. Based on these results, I propose a model for epithelial cell hierarchy in mammary gland, whereby there are two different types of luminal progenitors, early and late, displaying different levels of Notch activity. Notch signaling contributes to the determination of luminal cell lineage in these two progenitor steps: In "Early Luminal Progenitor" stage, it inhibits myoepithelial fate by decreasing p63 expression, and in "Late Luminal Progenitor" stage, Notch signaling is involved in induction of luminal lineage by acting on ER-FOXA1 axis. It has to be investigated further whether Notch signaling might behave as an oncogene or tumor suppressor depending on which cell type in the epithelial hierarchy it is modulated and which one is more likely to occur in different human breast cancer types. RÉSUMÉ : La glande mammaire est composée de deux types principaux de cellules: les cellules luminales, qui bordent le lumen et les cellules myoépithéliales, qui se trouvent entre la lame basale et les cellules luminales. Les mécanismes intervenant dans leur différenciation et leur maintenance demeurent encore mal compris. La protéine transmembranaire Notch est connue pour déterminer le destin des cellules dans plusieurs types de tissus comme la peau ou le système nerveux. Selon le type de tissu dans lequel se trouve Notch, il agira soit comme un suppresseur de tumeur soit comme un oncogène. A l'aide de modèles de souris surexprimant les récepteurs actifs de Notch, il a été démontré que la voie de signalisation de Notch est oncogénique au niveau de la glande mammaire. Des études descriptives et fonctionnelles dans le cadre du cancer du sein ont permis de mettre en évidence une augmentation de l'activité de Notch ou de l'expression de ces composants dans certains tissus cancéreux. Toutefois, le rôle physiologique de Notch et des mécanismes qu'il active restent méconnus. P63, une protéine membre de la famille p53, est impliquée dans la différenciation des kératinocytes. Le modèle issu de l'étude des souris p63 knockout a révélé que cette protéine est requise pour la formation des primordia mammaires chez l'embryon et que son isoforme ΔNp63 est exclusivement exprimée dans la couche myoépithéliale de la glande mammaire adulte. Dans le but de comprendre les fonctions physiologiques de Notch, je l'ai activé en exprimant le domaine intracellulaire de Notch 1 (NICD) dans des cellules épithéliales primaires de glande mammaire humaine (HBECs). Le NICD a alors réduit la croissance des HBECs et conduit à la régulation négative non seulement de p63 mais également des composants du réseau d'interaction des récepteurs de la matrice extracellulaire (ECM). En exprimant conjointement ΔNp63 et NICD, il est apparu que la réduction de croissance induite par Notch était partiellement compensée, et qu'il y avait également une augmentation des composants ECM. De plus, lorsque ΔNp63 a été inactivé dans les cellules HBECs myoépithéliales, une réduction de croissance cellulaire identique à celle provoquée par l'activation de Notch a pu être mise en évidence, de même qu'une régulation négative des marqueurs myoépithéliaux ainsi qu'une augmentation des marqueurs luminaux. Afin de compléter ces informations, l'expression de ΔNp63 a été forcée dans les HBECs luminales, ce qui a induit un phénotype myoépithélial et une diminution des marqueurs lumineux. In vivo, par l'analyse de souris ayant un gène rapporteur de l'activité de Notch, j'ai démontré que Notch est activé pendant la puberté au niveau des sites de la morphogenèse canalaire, à savoir les bourgeons terminaux. Les analyses par FACS (Fluorescence-activated cell sorting) basées sur l'expression de l'antigène CD24 ont révélé qu'il peut tre détecté dans deux populations différentes : une population qui l'exprime faiblement, qui regroupe les cellules souches/progéniteurs et les cellules myoépithéliales, et une population qui l'exprime fortement qui est composé des cellules luminales. Parallèlement aux résultats in vitro, j'ai mis en évidence un faible niveau d'expression de p63 dans les cellules épithéliales de la glande mammaire de souris, exprimant faiblement l'antigène CD24 et présentant une activité de Notch. De plus, la délétion de RBPjr~, médiateur principal de la signalisation de Notch, ainsi que la surexpression de ΔNp63 in vivo ont inhibé la lignée des cellules luminales. Un autre point important révélé par les souris rapporteur de l'activité de Notch a été l'activation simultanée de Notch et de la signalisation de l'oestrogène pendant le développement pubertaire. L'expression de FOXA1, médiateur de l'activité transcriptionnelle des récepteurs aux oestrogènes (ER), est en corrélation avec l'activation de Notch in vivo, plus basse dans les cellules avec une faible expression de l'antigène CD24 que dans celles avec une forte expression. De plus, FOXA1 est régulé par NICD in vitro confirmant la présence d'un lien entre Notch et la signalisation des ER. En résumé, la signalisation de Notch est impliquée dans la détermination du destin cellulaire des cellules luminales et ses effets sont partiellement modifiés par l'inhibition de ΔNp63. ΔNp63 est requis pour la maintenance et est suffisant pour l'induction du phénotype myoépithéliale dans les HBECs in vitro et ne peut donc pas se trouver dans les cellules luminales in vivo. Basé sur ces résultats, je propose un modèle de hiérarchisation des cellules épithéliales de la glande mammaire, dans lequel sont présents deux types de progéniteurs des cellules luminales exprimant des niveaux différents d'activité de Notch, les progéniteurs lumineux précoces et tardifs. La signalisation de Notch contribue à la différenciation de la lignée cellulaire luminale au niveau de ces deux progéniteurs : dans la forme précoce, il inhibe la différenciation des cellules myoépithéliales en réduisant l'expression de p63 et dans la forme tardive, Notch est impliqué dans l'induction de la lignée luminale en agissant sur l'axe ER-FOXA1. Il serait nécessaire d'investiguer plus loin si le fait que Notch agisse comme oncogène ou suppresseur de tumeur dépend du stade de différenciation de la cellule dans laquelle il est modulé et laquelle de ces deux fonctions il est le plus probable de rencontrer dans les différents types de cancer du sein.

Bioinformatic study of selection in animal genomes

Les gènes orthologues divergent sur plusieurs aspects durant l'évolution. Après une revue de la littérature cherchant à montrer de la divergence entre les orthologues de l'humain et de la souris, j'ai souligné les différentes causes de cette divergence. En comparant les gènes qui divergent en fonction, je n'ai pas trouvé de lien avec la divergence des séquences, pour cette raison je me suis penché sur l'étude de l'expression. Notamment, j'ai étudié le niveau, la spécificité ainsi que la présence/absence d'expression des orthologues humain-souris liés aux maladies Mendéliennes. Malgré les similarités trouvées entre l'humain et la souris, j'ai détecté une différence d'expression spécifique à une des deux espèces liée a un phénotype précis (gène essentiel/non-essentiel). Cela m'a permis de conclure que la différence sur le plan phénotypique entre l'humain et la souris est mieux expliquée par les patrons d'expression plutôt que le niveau d'expression ou la sélection. J'ai été également intéressé par l'évolution des séquences d'ADN codantes pour des protéines, en particulier sur le rôle de la sélection. J'ai commencé par une étude sur la fiabilité de détection de la sélection positive en comparant des séquences divergentes. J'ai trouvé, en utilisant le model de branche-site que la sélection peut être détectée sur des séquences qui ont divergé il y a plus de 500 millions d'années. J'ai analysé le biais de GC entres les séquences sans trouver une influence sur l'estimation de la sélection positive. Finalement, Je crois que ce travail est une première étape dans l'établissement d'un lien entre la sélection et les patrons d'expression des gènes chez les vertébrés.

Pulse wave analysis aortic pressure . distole should also be considered

La rigidité anormalement haute des artères à grande conductance est un marqueur de l'augmentation du risque cardiovasculaire et est typiquement retrouvée chez les patients diabétiques ou hypertendus. Ces vaisseaux deviennent plus rigides avec l'âge, expliquant la haute prévalence d'hypertension systolique chez les personnes âgées. Cette rigidification agit sur la pression sanguine de plusieurs façons. Notamment la fonction windkessel est gênée, menant à l'augmentation de la pression systolique et de la pression puisée, la diminution de la pression diastolique, et ainsi à l'augmentation de la postcharge ventriculaire gauche associée à une probable diminution de la perfusion coronarienne. De plus, la propagation des ondes de pression le long de l'arbre vasculaire est accélérée, de sorte que les ondes réfléchies générées au site de décalage d'impédance atteignent l'aorte ascendante plus tôt par rapport au début de l'éjection ventriculaire, aboutissant à une augmentation de la pression systolique centrale, ce qui n'arriverait pas en présence de vaisseaux moins rigides. Dans ce cas, au contraire, les ondes de pression antérogrades et réfléchies voyages plus lentement, de sorte que les ondes de réflexion tendent à atteindre l'aorte centrale une fois l'éjection terminée, augmentant la pression diastolique et contribuant à la perfusion coronarienne. La tonométrie d'applanation est une méthode non invasive permettant l'évaluation de la forme de l'onde de pression au niveau l'aorte ascendante, basée sur l'enregistrement du pouls périphérique, au niveau radial dans notre étude. Nous pouvons dériver à partir de cette méthode un index d'augmentation systolique (sAIX) qui révèle quel pourcentage de la pression centrale est du aux ondes réfléchies. Plusieurs études ont montré que cet index est corrélé à d'autres mesures de la rigidité artérielle comme la vitesse de l'onde de pouls, qu'il augmente avec l'âge et avec les facteurs de risques cardiovasculaires, et qu'il est capable de préciser le pronostic cardiovasculaire. En revanche, peu d'attention a été portée à l'augmentation de la pression centrale diastolique due aux ondes réfléchies (dAIX). Nous proposons donc de mesurer cet index par un procédé d'analyse développé dans notre laboratoire, et ce dans la même unité que l'index systolique. Etant donné que les modifications de la paroi artérielle modulent d'une part la vitesse de l'onde de pouls (PWV) et d'autre part le temps de voyage aller-retour des ondes de pression réfléchies aux sites de réflexion, toute augmentation de la quantité d'énergie réfléchie atteignant l'aorte pendant la systole devrait être associée à une diminution de l'énergie arrivant au même point pendant la diastole. Notre étude propose de mesurer ces deux index, ainsi que d'étudier la relation de l'index d'augmentation diastolique (dAIX) avec la vitesse de propagation de l'onde de pouls (PWV) et avec le rythme cardiaque (HR), ce dernier étant connu pour influencer l'index d'augmentation systolique (sAIX) . L'influence de la position couchée et assise est aussi étudiée. Les mesures de la PWV et des sAIX et dAIX est réalisée chez 48 hommes et 45 femmes âgées de 18 à 70 ans, classés en 3 groupes d'âges. Les résultats montrent qu'en fonction de l'âge, le genre et la position du corps, il y a une relation inverse entre sAIX et dAIX. Lorsque PWV et HR sont ajoutés comme covariables à un modèle de prédiction comprenant l'âge, le genre et la position du corps comme facteurs principaux, sAIX est directement lié à PWV (p<0.0001) et inversement lié à HR (p<0.0001). Avec la même analyse, dAIX est inversement lié à PWV (p<0.0001) et indépendant du rythme cardiaque (p=0.52). En conclusion, l'index d'augmentation diastolique est lié à la rigidité vasculaire au même degré que l'index d'augmentation systolique, alors qu'il est affranchi de l'effet confondant du rythme cardiaque. La quantification de l'augmentation de la pression aortique diastolique due aux ondes réfléchies pourrait être une partie utile de l'analyse de l'onde de pouls.

Étude du mécanisme de transport des cations par la Na, K-ATPase et de son implication dans la migraine familiale hémiplégique de type 2

Résumé La Na,K-ATPase est une protéine transmembranaire, présente dans toutes les cellules de mammifères et indispensable à la viabilité cellulaire. Elle permet le maintien des gradients sodiques et potassiques à l'origine du potentiel membranaire en transportant 3 Na+ en dehors de la cellule contre 2 K+, grâce à l'énergie fournie par l'hydrolyse d'une molécule d'ATP. Le potentiel membranaire est indispensable au maintien de l'excitabilité cellulaire et à la transmission de l'influx nerveux. Il semblerait que la Na,K-ATPase soit liée à l'hypertension et à certains troubles neurologiques comme la Migraine Familiale Hémiplégique (1VIFH). La MFH est une forme de migraine avec aura, qui se caractérise par une hémiparésie. Cette forme de migraine est très rare. Elle se transmet génétiquement sur un mode autosomique dominant. Plusieurs mutations localisées dans le gène de la Na,K-ATPase ont été identifiées durant ces 3 dernières années. C'est la première fois qu'une maladie génétique est associée au gène de la Na,K-ATPase. La compréhension du fonctionnement de cette protéine peut donner des informations sur les mécanismes conduisant à ces pathologies. On sait que la fonction d'une protéine est liée à sa structure. L'étude de sa fonction nécessite donc l'étude de sa structure. Alors que la structure de la SERCA a été déterminée à haute résolution, par cristallographie, celle de la Na,K-ATPase ne l'est toujours pas. Mais ces 2 ATPases présentent une telle homologie qu'un modèle de la Na,K-ATPase a pu être élaboré à partir de la structure de la SERCA. Les objectifs de cette étude sont d'une part, de comprendre le contrôle de l'accessibilité du K+ extracellulaire àses sites de liaison. Pour cela, nous avons ciblé cette étude sur la 2ìème et la 31eme boucle extracellulaire, qui relient respectivement les segments transmembranaires (STM) 3-4 et 5-6. Le choix s'est porté sur ces 2 boucles car elles bordent le canal des cations formés des 4ième' Sième et 6'ème hélices. D'autre part, nous avons également essayer de comprendre les effets des mutations, liées à la Migraine Familiale Hémiplégique de type 2 (MFH2), sur la fonctionnalité de la Na,K-ATPase. Alors que les STM et les domaines cytoplasmiques sont relativement proches entre la Na,KATPase et la SERCA, les boucles extracellulaires présentent des différences. Le modèle n'est donc pas une approche fiable pour déterminer la structure et la fonction des régions extracellulaires. Nous avons alors utilisé une approche fonctionnelle faisant appel à la mutation dirigée puis à l'étude de l'activité fonctionnelle de la Na,K ATPase par électrophysiologie sur des ovocytes de Xenopus. En conclusion, nous pouvons dire que la troisième boucle extracellulaire participerait à la structure de la voie d'entrée des cations et que la deuxième boucle extracellulaire semble impliquée dans le contrôle de l'accessibilité des ions K+àses sites de liaison. Concernant les mutations associées à la MFH2, nos résultats ont montré une forte diminution de l'activité fonctionnelle de la pompe Na,K, inférieure aux conditions physiologiques de fonctionnement, et pour une des mutations nous avons observés une diminution de l'affmité apparente au K+ externe. Nous poumons faire l'hypothèse que l'origine pathologique de la migraine est liée à une diminution de l'activité de la pompe à Na+. Summary The Na,K-ATPase is a transmembrane protein, present in all mammalian cells and is necessary for the viability of the cells. It maintains the gradients of Na+ and K+ involved in the membrane potential, by transporting 3Na+ out the cell, and 2K+ into the cell, using the energy providing from one ATP molecule hydrolysis. The membrane potential is necessary for the cell excitability and for the transmission of the nervous signal. Some evidence show that Na,K-ATPase is involved in hypertension and neurological disorders like the Familial Hemiplegic Migraine (FHM). La FHM is a rare form of migraine characterised by aura and hemiparesis and an autosomal dominant transmission. Several mutations linked to the Na,KATPase gene have been identified during these 3 last years. It's the first genetic disorder associated with the Na,K-ATPase gene. Understand the function of this protein is important to elucidate the mechanisms implicated in these pathologies. The function of a protein is linked with its structure. Thus, to know the function of a protein, we need to know its structure. While the Ca-ATPase (SERCA) has been crystallised with a high resolution, the structure of the Na,K-ATPase is not known. Because of the great homology between these 2 ATPases, a model of the Na,K-ATPase was realised by comparing with the structure of the SERCA. The aim of this study is on one side, understand the control of the extracellular K+ accessibility to their binding sites. Because of theirs closed proximity with the cation pathway, located between the 4th, 5th and 6th helices, we have targeted this study on the 2nd and the 3rd extracellular loops linking respectively the transmembrane segment (TMS) 3 and 4, and the TMS 5 and 6. And on the other side, we have tried to understand the functional effects of mutations linked with the Familial Hemiplegic Migraine Type 2 (FHM2). In contrast with the transmembrane segments and the cytoplasmic domains, the extracellular loops show lots of difference between Na,K-ATPase and SERCA, the model is not a good approach to know the structure and the function of the extracellular loops. Thus, we have used a functional approach consisting in directed mutagenesis and the study of the functional activity of the Na,K-ATPase by electrophysiological techniques with Xenopus oocytes. In conclusion, we have demonstrated that the third extracellular loop could participate in the structure of the entry of the cations pathway and that the second extracellular loop could control the K+ accessibility to their binding sites. Concerning the mutations associated with the FHM2, our results showed a strong decrease in the functional activity of the Na,K-pump under physiological conditions and for one of mutations, induce a decrease in the apparent external K+ affinity. We could make the hypothesis that the pathogenesis of migraine is related to the decrease in Na,K-pump activity. Résumé au large publique De la même manière que l'assemblage des mots forme des phrases et que l'assemblage des phrases forme des histoires, l'assemblage des cellules forme des organes et l'ensemble des organes constitue les êtres vivants. La fonction d'une cellule dans le corps humain peut se rapprocher de celle d'une usine hydroélectrique. La matière première apportée est l'eau, l'usine électrique va ensuite convertir l'eau en énergie hydraulique pour fournir de l'électricité. Le fonctionnement de base d'une cellule suit le même processus. La cellule a besoin de matières premières (oxygène, nutriments, eau...) pour produire une énergie sous forme chimique, l'ATP. Cette énergie est utilisée par exemple pour contracter les muscles et permet donc à l'individu de se déplacer. Morphologiquement la cellule est une sorte de petit sac rempli de liquide (milieu intracellulaire) baignant elle-même dans le liquide (milieu extracellulaire) composant le corps humain (un adulte est constitué environ de 65 % d'eau). La composition du milieu intracellulaire est différente de celle du milieu extracellulaire. Cette différence doit être maintenue pour que l'organisme fonctionne correctement. Une des différences majeures est la quantité de sodium. En effet il y a beaucoup plus de sodium à l'extérieur qu'à l'intérieur de la cellule. Bien que l'intérieur de la cellule soit isolé de l'extérieur par une membrane, le sodium arrive à passer à travers cette membrane, ce qui a tendance à augmenter la quantité de sodium dans la cellule et donc à diminuer sa différence de concentration entre le milieu extracellulaire et le milieu intracellulaire. Mais dans les membranes, il existe des pompes qui tournent et dont le rôle est de rejeter le sodium de la cellule. Ces pompes sont des protéines connues sous le nom de pompe à sodium ou Na,K-ATPase. On lui attribue le nom de Na,K-ATPase car en réalité elle rejette du sodium (Na) et en échange elle fait entrer dans la cellule du potassium (K), et pour fonctionner elle a besoin d'énergie (ATP). Lorsque les pompes à sodium ne fonctionnent pas bien, cela peut conduire à des maladies. En effet la Migraine Familiale Hémiplégique de type 2, est une migraine très rare qui se caractérise par l'apparition de la paralysie de la moitié d'un corps avant l'apparition du mal de tête. C'est une maladie génétique (altération qui modifie la fonction d'une protéine) qui touche la pompe à sodium située dans le cerveau. On a découvert que certaines altérations (mutations) empêchent les pompes à sodium de fonctionner correctement. On pense alors que le développement des migraines est en partie dû au fait que ces pompes fonctionnent moins bien. Il est important de bien connaître la fonction de ces pompes car cela permet de comprendre des mécanismes pouvant conduire à certaines maladies, comme les migraines. En biologie, la fonction d'une protéine est étudiée à travers sa structure. C'est pourquoi l'objectif de cette thèse a été d'étudier la structure de la Na,K-ATPase afin de mieux comprendre son mécanisme d'action.

The congenital soidum diarrhea and Spint2: from the molecules to the disease

La diarrhée congénitale de sodium est une maladie génétique très rare. Les enfants touchés par cette maladie présentent une diarrhée aqueuse sévère accompagnée d'une perte fécale de sodium et bicarbonates causant une déshydratation hyponatrémique et une acidose métabolique. Des analyses génétiques ont identifié des mutations du gène Spint2 comme cause de cette maladie. Le gène Spint2 code pour un inhibiteur de sérine protéase transmembranaire exprimé dans divers épithéliums tels que ceux du tube digestif ou des tubules rénaux. Le rôle physiologique de Spint2 n'est pas connu. De plus, aucun partenaire physiologique de Spint2 n'a été identifié et le mécanisme d'inhibition par Spint2 nous est peu connu. Le but de ce projet est donc d'obtenir de plus amples informations concernant la fonction et le rôle de Spint2 dans le contexte de la diarrhée congénitale de sodium, cela afin de mieux comprendre la physiopathologie des diarrhées et peut-être d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Un test fonctionnel dans les ovocytes de Xenopus a identifié les sérine protéases transmembranaires CAPI et Tmprssl3 comme potentielles cibles de Spint2 dans la mesure où ces deux protéases n'étaient plus bloquées par le mutant de Spint2 Y163C qui est associé avec la diarrhée congénitale de sodium. Des expériences fonctionnelles et biochimiques plus poussées suggèrent que l'inhibition de Tmprssl3 par Spint2 est le résultat d'une interaction complexe entre ces deux protéines. Les effets des sérine protéases transmembranaires sur l'échangeur Na+-H+ NHE3, qui pourrait être impliqué dans la pathogenèse de la diarrhée congénitale de sodium ont aussi été testés. Un clivage spécifique de NHE3 par la sérine protéase transmembranaire Tmprss3 a été observé lors d'expériences biochimiques. Malheureusement, la pertinence physiologique de ces résultats n'a pas pu être évaluée in vivo, étant donné que le modèle de souris knockout conditionnel de Spint2 que nous avons créé ne montrait une réduction de l'expression de Spint2 que de 50% et aucun phénotype. En résumé, ce travail met en évidence deux nouveaux partenaires possibles de Spint2, ainsi qu'une potentielle régulation de NHE3 par des sérine protéases transmembranaires. Des expériences supplémentaires faites dans des modèles animaux et lignées cellulaires sont requises pour évaluer la pertinence physiologique de ces données et pour obtenir de plus amples informations au sujet de Spint2 et de la diarrhée congénitale de sodium. - The congenital sodium diarrhea is a very rare genetic disease. Children affected by this condition suffer from a severe diarrhea characterized by watery stools with a high fecal loss of sodium and bicarbonates, resulting in hyponatremic dehydration and metabolic acidosis. Genetic analyses have identified mutations in the Spint2 gene as a cause of this disease. The spint2 gene encodes a transmembrane serine protease inhibitor expressed in various epithelial tissues including the gastro-intestinal tract and renal tubules. The physiological role of Spint2 is completely unknown. In addition, physiological partners of Spint2 are still to be identified and the mechanism of inhibition by Spint2 remains elusive. Therefore, the aim of this project was to get insights about the function and the role of Spint2 in the context of the congenital sodium diarrhea in order to better understand the pathophysiology of diarrheas and maybe identify new therapeutic targets. A functional assay in Xenopus oocytes identified the membrane-bound serine proteases CAPI and Tmprssl3 as potential targets of Spint2 because both proteases were no longer inhibited by the mutant Spint2 Y163C that has been associated with the congenital diarrhea. Further functional and biochemical experiments suggested that the inhibition of Tmprssl3 by Spint2 occurs though a complex interaction between both proteins. The effects of membrane-bound serine proteases on the Na+-H+ exchanger NHE3, which has been proposed to be involved in the pathogenesis of the congenital sodium diarrhea, were also tested. A specific cleavage of NHE3 by the membrane-bound serine protease Tmprss3 was observed in biochemical experiments. Unfortunately, the physiological relevance of these results could not be assessed in vivo since the conditional Spint2 knockout mouse model that we generated showed a reduction in Spint2 expression of only 50% and displayed no phenotype. Briefly, this work provides two new potential partners of Spint2 and emphasizes a putative regulation of NHE3 by membrane-bound serine proteases. Further work done in animal models and cell lines is required to assess the physiological relevance of these results and to obtain additional data about Spint2 and the congenital diarrhea.

Etude de Nkx5-3, un facteur de transcription impliqué dans le développement de l'oeil

Résumé :Une famille souffrant d'un nouveau syndrome oculo-auriculaire, appelé syndrome de Schorderet-Munier, a été identifiée. Ce syndrome est caractérisé par une déformation du lobe de l'oreille et des anomalies ophtalmiques, notamment une microphtalmie, une cataracte, un colobome et une dégénérescence rétinienne. Le gène impliqué dans ce syndrome est NKX5-3 codant un facteur de transcription contenant un homéodomaine. Chez les patient atteints, le gène comporte une délétion de 26 nucléotides provoquant probablement l'apparition d'un codon stop précoce. Ce gène n'est exprimé que dans certains organes dont les testicules et les ganglions cervicaux supérieurs, ainsi que dans les organes touchés par ce syndrome, à savoir le pavillon de l'oreille et l'oeil, surtout lors du développement embryonnaire. Au niveau de la rétine, NKX5-3 est présent dans la couche nucléaire interne et dans la couche dè cellules ganglionnaires et est exprimé de manière polarisée selon un axe temporal > nasal et ventral > dorsal. Son expression in vitro est régulée par Spl, un facteur de transcription exprimé durant le développement de l'oeil chez la souris. NKX5-3 semble lui-même provoquer une inhibition de l'expression de SHH et de EPHA6. Ces gènes sont tous les deux impliqués à leur manière dans le guidage des axones des cellules ganglionnaires de la rétine. Pris ensemble, ces résultats nous permettent donc d'émettre une hypothèse quant à un rôle potentiel de NKX5-3 dans ce processus.Abstract :A family with a new oculo-auricular syndrome, called syndrome of Schorderet-Munier, was identified. This disease is characterised by a deformation of the ear lobule and by several ophthalmic abnormalities, like microphthalmia, cataract, coloboma and a retinal degeneration. The gene, which causes this syndrome, is NKX5-3 coding for a transcription factor contaning a homeodomain. In the affectd patients, the defect consists of a deletion of 26 nucleotides probably producing a premature stop codon. This gene is only expressed in a few organs like testis and superior cervical ganglions, as well as in organs affected by this syndrome, namely the ear pinna and the eye, mainly during embryonic development. In the retina, NKX5-3 is present in the inner nuclear layer and in the ganglion cells layer. It is expressed along a gradient ranging from the temporal retina to nasal retina and from the ventral to the dorsal part. Its in vitro expression is regulated by Spl, a transcription factor expressed during the murine eye development. NKX5-3 seems to inhibit the expression of SHH and EPHA6. These genes are both implicated, in their own way, in the axon guidance of the retinal ganglion cells. Taken together, these results allow us to make an assumption about a potential role of NKX5-3 in this process.

Mechanisms involved in the maintenance of inbreeding depression in gynodioecious "Silene vulgaris" (Caryophyllaceae): an experimental investigation

Summary Gynodioecy, the joint occurrence of females and hermaphrodites within natural populations, is a widely studied mating system ever since Darwin (1877). It is an exceptional mating system because continuous selection is necessary to maintain it. Since females only reproduce through ovules whereas hermaphrodites transmit genes through ovules and pollen, larger female fitness, in terms of seed output, is required to allow their maintenance. Two non-exclusive mechanisms can account for the maintenance of females. First, as females do not produce pollen they can reallocate their resources towards a higher ovule production. Second, hermaphrodites can self- and cross-fertilize whereas females are obligate outcrossers. Thus hermaphrodites should partly suffer from inbreeding depression (i.e.: the fitness decline of inbred relative to outbred individuals) and thereby produce less fit progeny than females. This thesis investigated the effects of self- and cross-fertilization of heimaphrodites over two consecutive generations. Inbreeding depression increased across the successive stages of the life- cycle (i.e.: from "seed traits" to "reproductive traits") displaying large inbreeding depression estimates (up to 0.76). This investigation not only detected large inbreeding depression estimates but also detected mechanisms involved in the maintenance of inbreeding depression. For instance cryptic self-incompatibility which is here a larger in vivo pollen performance of distant pollen compared to self-pollen; the expression of inbreeding depression especially in late life-cycle stages, and the appearance of females in the progeny of selfed hermaphrodites. The female biased sex ratio in the progeny of selfed hermaphrodites was a surprising result and could either come from the sex determining mechanisms (complex nucleo-cytoplasmic interaction(s)) and/or from inbreeding depression. Indeed, we not only got females and hermaphrodites but also partial male-sterile (PMS) individuals (i.e.: individuals with differing number of viable stamens). We detected that inbred pollen bearing plants (excluding females) have less viable stamens per flower than outbred plants. A positive correlation was detected between inbreeding depression for the number of viable stamens per flower and the difference in sex ratio between inbred and outbred individuals. A positive relationship was also detected between inbreeding depression for pollen viability and inbreeding depression for number of viable stamens per flower. Each correlation can either account for pleiotropic effects (a major gene acting on the two considered traits) or linkage disequilibrium between genes controlling each of the two related traits. If we hypothesize that these correlations are due to a major gene with pleiotropic effects, the positive relationship between inbreeding depression for number of viable stamens per flower and inbreeding depression for pollen viability showed that deleterious alleles present on a major gene coding for pollen production and viability depressed male fitness within inbred plants. The positive relationship between sex ratio difference between inbred and outbred individuals and inbreeding depression for number of viable stamens per flower indicates that (1) either number of viable stamens per flower is, in addition to inbreeding, also affected by the loci coding for sex determinism or, (2) the presence of females within the progeny of selfed hermaphrodites is a consequence of large inbreeding depression inhibiting pollen production, or (3) sex is here determined by a combination of loci coding for sex expression and inbreeding depression for male reproductive traits. In conclusion, Silene vulgaris has been shown to be a good model for understanding the evolution of mating systems that promote outbreeding. Résumé La gynodïoécie est définie comme étant la présence simultanée d'hermaphrodites et de femelles au sein de populations naturelles d'une même espèce. Ce système de reproduction a toujours fasciné le monde scientifique depuis Darwin, comme en témoigne ses écrits (1876, 1877) sur les systèmes de reproduction chez les plantes. Les femelles ne transmettent leurs gènes qu'à travers leurs ovules alors que les hermaphrodites transmettent leurs gènes à la fois par la voie mâle (le pollen) et la voie femelle (les ovules). La condition pour que la gynodïoécie se maintienne nécessite donc une fitness de la fonction femelle plus élevée chez les femelles que chez les hermaphrodites. Deux mécanismes mutuellement non exclusifs peuvent expliquer le maintien des femelles au sein de ces populations gynodioïques. D'une part, les femelles peuvent réallouer les ressources non utilisées pour la production de pollen et peuvent par conséquent produire plus d'ovules. D'autre part, la reproduction des femelles ne peut se faire que par allo-fécondation alors que les hermaphrodites, peuvent se reproduire à la fois par auto- et allo-fécondation. L'autofécondation s'accompagne en général d'une diminution de fitness de la descendance relativement à la progéniture issue d'allo-fécondation ; ce phénomène est connu sous le nom de dépression de consanguinité. Cette thèse avait pour but de mettre en évidence une éventuelle dépression de consanguinité chez Silene vulgaris, une espèce gynodioïque. Des hermaphrodites, issus de trois vallées alpines, ont été auto- et allo¬fécondés sur deux générations successives. La dépression de consanguinité pouvant s'exprimer à tous les stades de vie d'un individu, plusieurs traits de fitness, allant du nombre de graines par fruit à la production de gamètes ont été mesurés sur différents stades de vie successifs. L'estimation de la dépression de consanguinité totale atteignait des valeurs allant de 0.52 à 0.76 selon la vallée considérée, ce qui indiquerait que les hermaphrodites ont tout intérêt à limiter l'autofécondation et que les femelles ne devraient pas avoir de peine à subsister dans les vallées étudiées. Par la même occasion des mécanismes diminuant la purge potentielle du fardeau génétique, et permettant ainsi le maintien du « niveau » de dépression de consanguinité et par conséquence le maintien de la gynodïoécie ont été mis en évidence. En effet, nos résultats montrent que la dépression de consanguinité s'exprimait tard dans le cycle de vie permettant ainsi à un certain nombre individus consanguins de transmettre leurs allèles délétères à la génération suivante. D'autre part, la croissance in vivo des tubes polliniques d'auto-pollen était plus lente que celle de l'allo-pollen et donc en situation de compétition directe, les ovules devraient plutôt être issus d'allo-fécondation, diminuant ainsi les chances de purges d'allèles délétères. Enfin, l'apparition de femelles dans la progéniture d'hermaphrodites autofécondés diminue aussi les chances de purge d'allèles délétères. Il nous a été impossible de déterminer si l'apparition de femelles dans la descendance d'hermaphrodites autofécondés était due au déterminisme génétique du sexe ou si la différence de sexe ratio entre la descendance auto- et allo-fécondée était due à une éventuelle dépression de consanguinité inhibant la production de pollen. Nous avons observé que S. vulgaris ne présentaient pas uniquement des hermaphrodites et des femelles mais aussi toute sorte d'individus intermédiaires avec un nombre variable d'étamines viables. Nous avons pu mettre' en évidence des corrélations positives entre (1) la différence de sexe ratio (la proportion d'individus produisant du pollen) entre individus consanguins et non consanguins et une estimation de la dépression de consanguinité pour le nombre d'étamines viables d'individus produisant du pollen, ainsi qu'entre (2) la dépression de consanguinité pour le nombre d'étamines viables et celle estimée pour la viabilité du pollen. Chaque corrélation indique soit l'effet d'un (ou plusieurs) gène(s) pléiotropique(s), soit un déséquilibre de liaison entre les gènes. En considérant que ces corrélations sont le résultat d'effet pléiotropiques, la relation entre le nombre d'étamines viables par fleur et la viabilité du pollen, indiquerait un effet négatif de la consanguinité sur la production et la viabilité du pollen due partiellement à un gène majeur. La seconde corrélation indiquerait soit que les gènes responsables de la détermination du sexe agissent aussi sur l'expression de la fonction mâle soit que l'expression du sexe est sujette à la dépression de consanguinité, ou encore un mélange des deux. Aux regards de ces résultats, Silene vulgaris s'est avéré être un bon modèle de compréhension de l'évolution des systèmes de reproduction vers la séparation des sexes.

Genomic copy number aberrations in glioblastoma, response to therapy and molecular machanisms

Résumé : Le glioblastome (GBM, WHO grade IV) est la tumeur cérébrale primaire la plus fréquente et la plus maligne, son pronostic reste très réservé et sa réponse aux différents traitements limitée. Récemment, une étude clinique randomisée (EORTC 26981/NCIC CE.3) a démontré que le traitement combiné de temozolomide et radiothérapie (RT/TMZ) est le meilleur dans les cas de GBM nouvellement diagnostiqués [1]. Cependant, seul un sous-groupe de patients bénéficie du traitement RT/TMZ et même parmi eux, leur survie reste très limitée. Pour tenter de mieux comprendre les réponses au traitement RT/TMZ, la biologie du GBM, identifier d'autres facteurs de résistance et découvrir de nouvelles cibles aux traitements, nous avons conduit une analyse moléculaire étendue à 73 patients inclus dans cette étude clinique. Nous avons complété les résultats moléculaires déjà obtenus par un profil génomique du nombre de copies par Array Comparative Genomic Hybridization. Afin d'atteindre nos objectifs, nous avons analysé en parallèle les données cliniques des patients et leurs profils moléculaires. Nos résultats confirment des analyses connues dans le domaine des aberrations du nombre de copies (CNA) et de profils du glioblastome. Nous avons observé une bonne corrélation entre le CNA génomique et l'expression de l'ARN messager dans le glioblastome et identifié un nouveau modèle de CNA du chromosome 7 pouvant présenter un intérêt clinique. Nous avons aussi observé par l'analyse du CNA que moins de 10% des glioblastomes conservent leurs mécanismes de suppression de tumeurs p53 et Rb1. Nous avons aussi observé que l'amplification du CDK4 peut constituer un facteur supplémentaire de résistance au traitement RT/TMZ, cette observation nécessite confirmation sur un plus grand nombre d'analyses. Nous avons montré que dans notre analyse des profils moléculaires et cliniques, il n'est pas possible de différencier le GBM à composante oligodendrogliale (GBM-O) du glioblastome. En superposant les profils moléculaires et les modèles expérimentaux in vitro, nous avons identifié WIF-1 comme un gène suppresseur de tumeur probable et une activation du signal WNT dans la pathologie du glioblastome. Ces observations pourraient servir à une meilleure compréhension de cette maladie dans le futur. Abstract : Glioblastoma, (GBM, WHO grade IV) is the most malignant and most frequent primary brain tumor with a very poor prognosis and response to therapy. A recent randomized clinical trial (EORTC26981/NCIC CE.3) established RT/TMZ as the 1St effective chemo-radiation therapy in newly diagnosed GBM [1]. However only a genetic subgroup of patients benefit from RT/TMZ and even in this subgroup overall survival remains very dismal. To explain the observed response to RT/TMZ, have a better understanding of GBM biology, identify other resistance factors and discover new drugable targets a comprehensive molecular analysis was performed in 73 of these GBM trial cohort. We complemented the available molecular data with a genomic copy number profiling by Array Comparative Genomic Hybridization. We proceeded to align the molecular profiles and the Clinical data, to meet our project objectives. Our data confirm known GBM Copy Number Aberrations and profiles. We observed a good correlation of genomic CN and mRNA expression in GBM, and identified new interesting CNA pattern for chromosome 7 with a potential clinical value. We also observed that by copy number aberration data alone, less than 10% of GBM have an intact p53 and Rb1 tumor .suppressor pathways. We equally observed that CDK4 amplification might constitute an additional RT/TMZ resistant factor, an observation that will need confirmation in a larger data set. We show that the molecular and clinical profiles in our data set, does not support the identification of GBM-O as a new entity in GBM. By combining the molecular profiles and in vitro model experiments we identify WIF1 as a potential GBM TSG and an activated WNT signaling as a pathologic event in GBM worth incorporation in attempts to better understand and impact outcome in this disease.

Molecular mechanisms of penicillin-induced killing and penicillin tolerance in Streptococcus gordonii

Abstract The main thesis topic relates to the 'molecular mechanisms of penicillin-induced bacterial death. Indeed, bacteria have developed two principal mechanisms to escape the killing effect of ß-lactam antibiotics: resistance and tolerance. Resistant bacteria are characterized by their ability to grow in the presence of drug concentrations higher than the one inhibiting the growth of susceptible members of the same species. Hence, resistant bacteria have an increased minimal inhibitory concentration (MIC) of the drug. Nevertheless, when exposed to antibiotic concentrations exceeding their new MIC, resistant bacteria remain sensitive to the antibiotic killing effect. In contrast, tolerant bacteria have an unchanged MIC. However, they have a considerably increased ability to survive drug-induced killing, even at concentrations exceeding their MIC by several orders of magnitude. In other words, in the presence of the antibiotic, tolerant bacteria become persister cells which stop growing but are not killed. In the present thesis, it is shown that the survival phenotype of a tolerant Streptococcus gordonii strain depends on two components belonging to sugar metabolism pathways. First, the transcription factor CcpA which mediates a global regulatory mechanism allowing bacteria to utilize the most efficient sugar source for their growth. We show that the inactivation of the ccpA gene leads to a partial loss of penicillin tolerance both in vitro and in a rat model of experimental endocarditis. Second, the Enzyme I of the phosphotransferase system which is involved in the uptake and phosphorylation of sugars. Here, we -show that a single nucleotide mutation in ptsI, the gene encoding the Enzyme I, is sufficient to confer a fully tolerant phenotype in S. gordonii both in vivo and in vivo. The mutation results in a radical proline to arginine substitution in the C-terminal domain of the protein, probably leading to a decrease in its homodimerization and subsequent activity. Taken together our results prove that tolerance is a global survival mechanism linked to sugar metabolism. We hypothesize that, in the presence of the antibiotic, the already altered metabolic processes of the tolerant strain are completely inactivated. Hence, bacteria may enter in a dormant state and become insensitive to the bactericidal effect of ß-lactams, which depends on actively dividing cells. This thesis manuscript also contains two other side-projects. The first one establishes that the ability to form a biofilm is not a requisite for the successful establishment of endocarditis due to S. gordonii. The second one characterizes the S. gordonii a-phosphoglucomutase gene, and shows that its inactivation results in a loss of in vitro fitness and in vivo virulence. Résumé Le sujet principal de cette thèse concerne les mécanismes moléculaires de la mort bactérienne induite par la pénicilline. En effet, les bactéries ont développé deux mécanismes principaux pour échapper à l'effet bactéricide des ß-lactamines : la résistance et la tolérance. Les bactéries résistantes sont caractérisées par leur capacité de croître en présence de concentration d'antibiotiques plus élevées que celles inhibant la croissance des organismes sensibles de la même espèce. Les bactéries résistantes ont donc une augmentation de leur concentration minimale inhibitrice (CMI) à l'antibiotique. Néanmoins, quand elles sont exposées à des concentrations dépassant leur nouvelle CMI, elles restent sensibles à l'effet bactéricide. Au contraire, les bactéries tolérantes ont une CMI inchangée. Toutefois, elles ont une très importante capacité à survivre à l'effet bactéricide des ß-lactamines, ceci même à des concentrations excédant leur CMI de plusieurs ordres de grandeur. En d'autres termes, en présence de l'antibiotique, les bactéries tolérantes deviennent des cellules persistantes qui arrêtent leur croissance mais ne sont pas tuées. Dans la présente thèse, il est montré que le phénotype de survie d'un Streptococcus gordonii tolérant dépend de deux composants appartenant aux voies du métabolisme des sucres. Premièrement, le facteur de transcription CcpA qui contrôle un système global de régulation permettant à la bactérie d'utiliser les sources de sucre les plus efficaces pour sa croissance. Il est montré que l'inactivation du gène ccpA résulte en la perte partielle de la tolérance à la pénicilline aussi bien in vitro que dans un modèle d'endocardite expérimentale chez le rat. Deuxièmement, l'Enzyme I du système de phosphotransfert impliqué dans l'import et la phosphorylation des sucres. Nous montrons qu'une mutation ponctuelle d'un nucléotide dans ptsl, le gène codant pour l'Enzyme I, suffit à complètement conférer un phénotype tolérant chez S. gordonii aussi bien in vitro qu'in vivo. La mutation induit la substitution radicale d'une proline en une arginine dans le domaine C-terminal de la protéine, résultant probablement en une diminution de sa capacité d'homodimérisation et donc d'activité. Dans leur ensemble, nos résultats prouvent que la tolérance est un mécanisme global de survie lié au métabolisme des sucres. Nous présentons l'hypothèse que, en présence de l'antibiotique, les processus métaboliques déjà altérés de la souche tolérante deviennent complètement inactifs. En conséquence, les bactéries entreraient dans un état dormant nonréplicatif, devenant ainsi insensibles à l'effet bactéricide des ß-lactamines qui nécessite des cellules en cours de division active. Le manuscrit de cette thèse contient également deux projets secondaires. Le premier montre que la capacité de former un biofilm n'est pas un prérequis pour le succès de l'initiation de l'endocardite à S. gordonii. Le second caractérise le gène de l'a-phosphoglucomutase de S. gordonii et montre que son inactivation résulte en une perte de fitness in vitro et de virulence in vivo.

Analysis of the mechanisms controlling the activity of flp1, a chromosomal passenger protein in the fission Schizosaccharomyces pombe

ABSTRACT In S. cerevisiae, the protein phosphatase Cdc14pwt is essential far mitotic exit through its contribution to reducing mitotic CDK activity. But Cdc14pwt also acts as a mare general temporal coordinator of mid and late mitotic events by controlling the partitioning of DNA, microtubule stability and cytokinesis. Cdc14pwt orthologs are well conserved from yeasts to humans, and sequence comparison revealed the presence of three domains, A, B and C, of which A and B form the catalytic domain. Cdc14pwt orthologs are regulated (in part) through cell cycle dependent changes in their localization. Some of them are thought to be kept inactive by sequestration in the nucleolus during interphase. This is the case for flp1pwt, the single identified Cdc14pwt ortholog in the fission yeast S. pombe. In early mitosis, flp1pwt leaves the nucleolus and localizes to the kinetochores, the contractile ring and the mitotic spindle, suggesting that it has multiple substrates and regulates many mitotic processes. flp1D cells show a high chromosome loss rate and septation defects, suggesting a role for flp1wt in the fidelity of chromosome transmission and cytokinesis. The aim of this study is to characterize the mechanisms underlying flp1pwt functions and the control of its activity. A structure-function analysis has revealed that the presence of both A and B domains is required for biological function and for proper flp1pwt mitotic localization. In contrast, the C domain of flp1pwt is responsible for its proper nucleolar localization in G2/interphase. My data suggest that dephosphorylation of substrates by flp1pwt is not necessary for any changes in localization of flp1pwt except that at the medial ring. In that particular case, the catalytic activity of flp1pwt is required for efficient localization, therefore revealing an additional level of regulation. All the functions of flp1pwt assayed to date require its catalytic activity, emphasizing the importance of further identification of its substrates. As described for other orthologs, the capability of selfinteraction and phosphorylation status might help to control flp1pwt activity. My data suggest that flp1pwt forms oligomers in vivo and that phosphorylation is not essential far localization changes of the protein. In addition, the hypophosphorylated form of flp1pwt might be specifically involved in the promotion of cytokinesis. The results of this study suggest that multiple modes of regulation including localization, selfassociation and phosphorylation allow a fine-tuning regulation of flp1pwt phosphatase activity, and more generally that of Cdc14pwt family of phosphatases. RESUME Chez la levure S. cerevisiae, la protéine phosphatase Cdc14pwt est essentielle pour la sortie de mitose du fait de sa contribution dans la réduction d'activité des CDK mitotiques. Comme elle contrôle également le partage de l'ADN, la stabilité des microtubules et la cytokinèse, Cdc14pwt est en fait considérée comme un coordinateur temporel général des évènements de milieu et de fin de mitose. Les orthologues de Cdc14pwt sont bien conservés, des levures jusqu'à l'espèce humaine. Des comparaisons de séquence ont révélé la présence de trois domaines A, B et C, les deux premiers constituant le domaine catalytique. Ils sont régulés (en partie) via des changements dans leur localisation, eux-mêmes dépendants du cycle cellulaire. Plusieurs de ces orthologues sont supposés inactivés par séquestration dans le nucléole en interphase, ce qui est le cas de flp1pwt le seul orthologue de Cdc14pwt identifié chez la levure fissipare S, pombe. En début de mitose, flp1pwt quitte le nucléole et localise au niveau des kinetochores, de l'anneau contractile d'actine et du fuseau mitotique, ce qui laisse supposer de multiples substrats et fonctions. Comme les cellules délétées pour le gène flp1wt présentent un taux élevé de perte de chromosome et des défauts de septation, flp1pwt semble jouer un rôle dans la fidélité de la transmission du matériel génétique et la cytokinèse. Le but de cette étude est de caractériser les mécanismes impliqués dans les fonctions assurées par flp1pwt d'une part, et dans le contrôle de son activité d'autre part. Une analyse structure-fonction a révélé que la présence simultanée des deux domaines A et B est requise pour la fonction biologique de flp1pwt et sa localisation correcte pendant la mitose. Par contre, le domaine C de flp1pwt confère une localisation nucléolaire adéquate en G2/interphase. Mes données suggèrent que la déphosphorylation de substrats par flp1pwt est dispensable pour sa localisation correcte excepté celle à l'anneau médian, qui requiert dans ce cas, l'activité catalytique de flp1pwt, révélant ainsi un niveau de régulation supplémentaire. Toutes les fonctions de flp1 pwt testées jusqu'à présent nécessitent également son activité catalytique, ce qui accentue l'importance de l'identification future de ses substrats. Comme cela a déjà été décrit pour d'autres orthologues, la capacité d'auto-intéraction et le niveau de phosphorylation pourraient contrôler l'activité de flp1pwt. En effet, mes données suggèrent que flp1pwt forme des oligomères in vivo et que la phosphorylation n'est pas essentielle pour les changements de localisation observés pour la protéine. De plus, la forme hypophosphorylée de flp1pwt pourrait être spécifiquement impliquée dans la promotion de la cytokinèse. De multiples modes de régulation incluant la localisation, l'auto-association et la phosphorylation semblent permettre un contrôle fin et subtil de l'activité de la phosphatase flp1pwt, et plus généralement celle des protéines de la famille de Cdc14pwt.

Strategies of "Pseudomonas aeruginosa" to overcome copper limitation

Summary Copper is an important trace element and micronutrient for living organisms as it is the cofactor of several enzymes involved in diverse biological redox processes such as aerobic respiration, denitrification and photosynthesis. Despite its importance, copper may be poorly bioavailable in soils and aquatic environments, as well as in the human body, especially at physiological or alkaline pH. In this work, we have investigated the strategies that the versatile bacterium and opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa has evolved to face and overcome copper limitation. The global response of the P. aeruginosa to copper limitation was assessed under aerobic conditions. Numerous iron uptake functions (including the siderophores pyoverdine and pyochelin) were down-regulated whereas expression of cioAB (encoding an alternative, copper-independent, cyanide-resistant ubiquinol oxidase) was up-regulated. Wild type P. aeruginosa was able to grow aerobically in a defined glucose medium depleted of copper by a copper chelator, whereas a cioAB mutant did not grow. Thus, P. aeruginosa relies on the CioAB enzyme to cope with severe copper deprivation. A quadruple cyo cco1 cco2 cox mutant, which was deleted for all known heme-copper terminal oxidases of P. aeruginosa, grew aerobically, albeit more slowly than did the wild type, indicating that the CioAB enzyme is capable of energy conservation. However, the expression of a cioA'-'lacZ fusion was less dependent on the copper status in the quadruple mutant than in the wild type, suggesting that copper availability might affect cioAB expression indirectly, via the function of the heme-copper oxidases. These results suggest that the CioAB enzyme can be used as a by-pass strategy to overcome severe copper limitation and perform aerobic respiration even if virtually no copper is available. The PA0114 gene, which encodes a protein of the SCOT/SenC family, was found to be important for copper acquisition and aerobic respiration in low copper conditions. A PA0114 (sent) mutant grew poorly in low copper media and had low terminal oxidase activity with TMPD (N,N,N',N'-tetramethyl-p-phenylenediamine), but expressed the CioAB enzyme at elevated levels. Addition of copper reversed these phenotypes, suggesting that periplasmic copper capture by the SenC protein is another strategy that helps P. aeruginosa to adapt to copper deprivation. RESUME Le cuivre est un micronutriment important pour les organismes vivants. Il représente le cofacteur de plusieurs enzymes impliquées dans une multitude de processus biologiques tels que la respiration aérobie, la dénitrification et la photosynthèse. Malgré son importance, le cuivre peut être peu disponible dans les sols, les environnements aquatiques et le corps humain, spécialement à pH physiologique ou alcalin. Dans ce travail nous avons étudié les stratégies développées par la bactérie pathogène opportuniste Pseudomonas aeruginosa PAO1 afm de faire face et de surmonter le manque de cuivre. La réponse globale de P. aeruginosa à la carence de cuivre a été analysée dans des conditions aérobie. Les résultats obtenus ont montré que plusieurs gènes impliqués dans l'acquisition du fer, tels que les gènes codant pour les sidérophores (pyoverdine et pyochéline), étaient réprimés, tandis que l'expression de l'opéron cioAB, codant pour l'oxydase terminale insensible au cyanure (CIO), était augmentée. La souche sauvage P. aeruginosa est capable de croître dans un milieu où la concentration en cuivre est limitée, due à la présence d'un chélateur spéciftque de cuivre, tandis que le mutant cioAB ne croît pas dans ces conditions. Nous avons conclu que P. aeruginosa nécessite l'oxydase terminale CIO pour faire face à la carence en cuivre. Un quadruple mutant affecté dans toutes les oxydases dépendantes du cuivre (cyo ccol cco2 cox) et appartenant aux oxydases de type hème-cuivre, peut croître en aérobie, néanmoins plus lentement que la souche sauvage, ce qui montre que l'enzyme CIO est capable de conserver l'énergie. L'expression de la fusion rapportrice cioA'-'IacZ chez le quadruple mutant est moins dépendante de la disponibilité de cuivre que chez la souche sauvage. Ces résultats suggèrent que la disponibilité de cuivre influence l'expression de cioAB d'une façon indirecte, par le biais des oxydases terminales de type héme-cuivre. Il est donc possible qu'en cas de carence de cuivre, P. aeruginosa utilise l'enzyme CIO comme stratégie afin de surmonter ce manque et de réaliser la respiration aérobie. Nous avons démontré que le gène PA0114, codant pour une protéine appartenant à la famille SCO1/SenC, est important dans l'acquisition et dans la respiration aérobie dans des environnements où le cuivre est présent en faible concentration. En ces conditions, la croissance du mutant senC est faible; de plus, l'activité des oxydases terminales en présence du donneur d'électrons TMPD (N,N,N,N'-tetraméthyl-p-phénylenediamine) est basse. Toutefois, l'addition de cuivre au milieu de culture permet de restaurer le phénotype du type sauvage. Ces résultats montrent que la protéine SenC est capable d'acquérir le cuivre et représente donc une autre stratégie chez P. aeruginosa pour s'adapter à un manque de cuivre.

Qualitative and quantitative analysis of thalamo-cortical axons in the somatosensory cortex of normal and barrelless mice

Résumé Les rongeurs utilisent leurs moustaches (vibrisses) pour explorer le milieu environnant. Chaque moustache est mue par un système des muscles. Les récepteurs situés à sa base transmettent les informations au système nerveux central. La transmission vers l'écorce se fait via trois neurones de relais qui se trouvent au niveau du ganglion trigéminé, du tronc cérébral et du thalamus. La représentation corticale d'une vibrisse est une concentration des axones thalamo-corticaux (ATC) autour desquelles s'organisent leurs cibles, les cellules de la couche IV. La structure peut être identifiée histologiquement en coupes tangentielles et porte le nom de « barrel » (« tonneau »). Cette correspondance vibrisse - barrel fait de ce système un model idéal pour étudier l'influence de l'activité périphérique sur l'établissement et le maintien des cartes somatotopiques. Notre laboratoire dispose d'une souche de souris qui a subi une mutation spontanée pour le gène codant l'adenylyl cyclase I (ACI). Cette enzyme membranaire catalyse la formation de l'AMPc et joue un rôle important dans le guidage axonal, la libération des neurotransmetteurs et l'intégration des signaux postsynaptiques. Nous avons démontré dans un premier temps que cette souris adulte ne développe pas de barrels. Cela est dû à un manque d'organisation des ATC et aussi des cellules de la couche IV. De plus, les résultats électrophysiologiques montrent que les informations venant des vibrisses adjacentes ne sont pas intégrées d'une manière normale. Dans ce travail de thèse, j'ai analysé la morphologie des ATC révélés individuellement avec de la biocytine. L'analyse quantitative des ATC a mis en évidence les points suivants: 1. Les axones de la souris normale (NOR) quittent le thalamus, traversent la capsule interne et la substance blanche sous-corticale et pénètrent dans le cortex somato-sensoriel primaire. A l'intérieur de l'écorce ils traversent au maximum 3 colonnes corticales adjacentes dont une contient le barrel cible. En passant à travers les couches VI et V, ces axones arborisent et convergent progressivement vers le barrel dans lequel ils forment une riche arborisation. Un petit nombre des branches « errantes », pleines de boutons synaptiques, pénètrent dans les barrels voisins. Deux axones NOR provenant de corps cellulaires très proches dans le thalamus peuvent avoir un cheminement très divergent lors de la traversée de la capsule interne et de la substance blanche sous-corticale mais, à leur entrée dans le cortex, ils sont distants d'au maximum 2 colonnes corticales de la colonne qui contient le barrel cible et ils convergent progressivement vers ce barrel. 2. Les axones de la souris mutante (BRL) ont le même trajet sous-cortical que les axones NOR, mais leur entrée dans le cortex somato-sensoriel primaire est aléatoire. A l'interface entre la substance blanche sous-corticale et le cortex, l'axone principal se divise rapidement en troncs axonaux qui traversent les couches VI et V d'une manière divergente pour arriver dans la couche IV. Cela contraste beaucoup avec la trajectoire des NOR qui convergent graduellement vers leur barrel cible. Le nombre de branches radiales que les axones BRL utilisent pour entrer dans le cortex et dans la couche IV est double par rapport aux axones NOR. Parmi ces branches, seules quelques-unes donnent des arborisations, les autres ne sont pas développées et leur morphologie est semblable à celle des branches formées par les axones de la souris normale lors du développement. Deux axones BRL issus de corps cellulaires proches dans le thalamus peuvent avoir une trajectoire très divergente jusqu'à leur entrée dans la couche IV, mais à ce niveau ils sont réorientés pour se retrouver et faire un nombre maximal de branches et boutons synaptiques dans la même région corticale. Dans un cas extrême, un des axones observés est entré dans le cortex à la limite entre l'aire somatosensorielle primaire et secondaire et a parcouru une distance de 2 mm pour retrouver son partenaire thalamique et donner avec celui-ci un nombre maximal de branches dans la même région de la couche IV. 3. Les mesures quantitatives ont montré que les arborisations corticales des axones NOR ont une longueur moyenne de 18mm et sont formées par 200 segments qui portent 1200 boutons synaptiques. Par rapport à la souris NOR, les axones BRL ont en moyenne la même longueur, le même nombre de segments et boutons synaptiques, mais donnent deux fois plus de branches radiales. La surface tangentielle occupée par les arborisations BRL dans la couche IV est 2 fois plus grande que celle des NOR. Cela signifie que les 1000 boutons synaptiques qui caractérisent les arborisations NOR et BRL dans la couche IV sont disséminés sur une surface tangentielle double chez les derniers, et donc que la densité des boutons par unité de surface corticale est en moyenne plus faible. En effet, l'augmentation de la surface corticale tangentielle des BRL est due aux surfaces de faible et moyenne densité synaptique (0 - 8 boutons / 400pn2) qui augmentent 2 fois tandis que les surfaces de haute densité synaptiques (8 - 64 boutons / 4001.tm2) sont les mêmes. Nous émettons l'hypothèse selon laquelle, durant le développement, les ATC de la souris BRL divergent et forment un nombre exubérant de branches. Grâce à cette divergence et aux branches supranuméraires, ils trouvent l'endroit de l'écorce où se trouvent leurs voisins thalamiques et arborisent abondamment dans cette région. Cependant, le déficit en AGI ne leurs permet pas par la suite, sous influence de l'activité périphérique, de retirer les branches qui se trouvent dans les endroits inappropriés de l'écorce, avec de possibles conséquences sur la discrimination tactile.

Organisation and role of actin microfilaments during cellular growth and morphogenesis in the moss Physcomitrella patens

ABSTRACT The network of actin cytoskeleton is composed of actin filaments (F-actin) that are made by polymerisation of actin monomers and actin binding proteins. It is required for growth and morphogenesis of eukaryotic cells. The labelling of F-actin with constitutively expressed GFP-Talin (Kost et al., 1998) reveals the organisation of cellular actin networks in plants. Due to the lack of information on actin cytoskeleton through gametophytic development of the model moss plant Physcornitrella patens, stable transgenic lines overexpressing GFP-Talin were generated to detect F-actin structures. It is shown that the 35S promoter driven expression is not suitable for F-actin labelling in all cells. When it is replaced by the inducible heat-shock promoter Gmhsp17.3 from soybean, one hour mild heat stress at 37°C followed by recovery at 25°C is enough to induce efficient and transient labelling in all tissues without altering cellular morphology. The optimal observations of F-actin structures at different stages of moss development can be done between 12-18 hours after the induction. By using confocal microscopy, we demonstrate that stellated actin arrays were densely accumulated at the growing tip in regenerating protoplasts, apical protonemal cells and rhizoids and connected with a fine dispersed F-actin mesh. Following three-dimensional growth, the cortical star-like structures are widespread in the meristematic cells of developing bud and young gametophores. On the contrary, undulating networks of actin cables are found at the final stage of cell differentiation. During redifferentiation of mature leaf cells into protonemal filaments the rather stagnant web of actin cables is replaced by diffuse actin meshwork. In eukaryotes, nucleation of the actin monomers prior to their polymerization is driven by the seven-subunit ARP2/3 complex and formins. We cloned the gene encoding the ARP3 subunit of P. patens and generated arp3 mutants of the moss through gene disruption. The knockout of ARP3 affects the elongation of chloronemal cells and blocks further differentiation of caulonemal cells and rhizoids, and the gametophores are slightly stunted compared to wild-type. The arp mutants were created in the heat-shock inducible GFP-Talin strains allowing us to visualise a disorganised actin network and a lack of star-like actin cytoskeleton arrays. We conclude that ARP2/3 dependent nucleation of actin filaments is critical for the growth of filamentous cells, which in turn influences moss colonization. In complementation assays, the overexpression of Physcomitrella and Arab idopsis ARP3 genes in the moss arp3 mutant results in full recovery of wild type phenotype. In contrast the ARP3 subunit of fission yeast is not able to complement the moss arp3 mutant of moss indicating that regulation of the ARP2/3 dependent actin nucleation diverged in different kingdoms. RESUME Le réseau d'actine est composé de filaments de F-actine et d'un ensemble de protéines s'y attachant (Actin binding proteins). Le réseau d'actine est nécessaire à la croissance et à la morphogenèse de toutes les cellules eucaryotes. Chez les plantes, le marquage ainsi que l'étude de l'organisation du réseau d'actine ont été réalisés en utilisant une fusion GFP-Talin (Kost et al., 1998) exprimée sous le control d'un promoteur constitutif. Afin d'étudier les structures F-actine dans les cellules de Physcomitrella Patens et pour combler le manque d'information sur le développement des gamétophores, des lignées transgéniques stables surexprimant GFP-Talin ont été crées. Nous avons démontré que l'utilisation du promoteur 35S est inadéquate pour le marquage complet et homogène des filaments d'actine dans toutes les cellules de P. patens. Par contre, l'utilisation du promoteur inductible Gmhsp17.3 nous a permis de réaliser un marquage transitoire et général dans tous les tissus de la mousse. Une heure de choc thermique à 37°C suivis d'un temps de récupération de 12-18h à 25°C sont les conditions optimales (sans dommages cellulaires) pour l'observation des structures F-actine à différentes étapes de développement de la mousse. En utilisant la microscopie confocale, nous avons observé l'existence de structures F-actine accumulées en forme d'étoiles. Ces structures, qui sont liées au réseau de microfilaments d'actine, ont été observées dans les protoplastes en régénération, les cellules des protonema apicales ainsi que dans les rhizoïdes. En suivant la croissance tridimensionnelle, ces structures en étoiles ont été observées dans les cellules meristématiques des bourgeons et des jeunes gamétophores. Par contre, dans les cellules différentiées ces structures laissent place à des réseaux de câbles épais. Nous avons également remarqué que durant la redifferentiation des cellules foliaires le réseau de câbles de F-actine est remplacé par un réseau de F-actine diffus. Dans les cellules eucaryotes, la nucléation des filaments d'actirie précédant leur polymérisation est contrôlé par sept sous unités du complexe ARP2/3 et par des formines. Nous avons isolé le gène codant pour la sous unité ARP3 de P. patens et nous avons crée des mutants arp3 par intégration ciblée (Knockout). L'élongation des cellules chloronema est clairement affectée dans les mutants arp3. La différentiation des caulonemata et des rhizoïdes est bloquée et les gametophores sont légèrement plus courts comparé au type sauvage. A fin d'étudier l'organisation des filaments d'actines dans les mutants arp3, nous avons aussi réalisé un arp3-knockout dans la lignée Hsp-GFP-Talin. La nouvelle lignée générée nous a permis de visualiser une désorganisation du réseau d'actine et une absence complète de structures de F-actine accumulée en forme d'étoiles. Les résultats obtenus nous amènent à conclure que la nucléation (ARP2/3 dépendante) des filaments d'actine est indispensable à la croissance des cellules filamenteuses. Par conséquent, les filaments d'actine semblent avoir un rôle dans la colonisation des milieux par les mousses. Nous avons également procédé à des essais de complémentation du mutant arp3. La surexpression des gènes ARP3 de Physcomitrella et d'Arabidopsis dans les cellules du mutant arp3 rétabli complètement le phénotype WT. Par contre, le gène ARP3 des levures n'est pas suffisant pour complémenter la même mutation dans les cellules de mousses. Ce résultat démontre que les mécanismes de régulation de la nucléation des filaments d'actine (ARP2/3 dépendante) sont différents entre les différents groupes d'eucaryotes.

Looking for factors involved in the light-dependent degradation of phytochrome A

SUMMARY : Phytochromes constitute a family of red/far-red photoreceptors regulating all the major transitions during the life cycle of plants. In Arabidopsis, five members: phyA,_ B, C, D and E, were identified. Phytochromes are synthesized in their inactive red-light absorbing form called Pr. Upon light absorbance they convert to the far-red light absorbing Pfr form. The Pfr form is the active conformer which converts back to the Pr form either rapidly upon far-red perception or in a slower process called dark reversion. ph~A represents an exception, in that it does not significantly dark-revert and two specific processes have been developed by the plants to decrease the amount of biologically active phyA. The first one is alight-dependent repression of the PHYA gene expression and the second one is alight-dependent degradation of the phyA protein. The latter is the most efficient process to rapidly decrease the level of active phyA. The ability of plants to regulate the amount of active phyA is critical in a far-red rich environment, a situation observed under a canopy. In these conditions, phyA is essential to induce the germination and the deetiolation of the young seedling. Later in the development the ability of phyA to repress growth counteracts the shade avoidance response. Therefore decreasing the amount of phyA allows stem growth and to compete with neighbours for the light. In this thesis, I investigate the light-dependent degradation of phyA. I developed a reverse genetic approach based on the systematic analysis of the light-dependent accumulation of phyA in the different cullin mutant cull, cul3a; cul3b and cul4. This analysis allowed me to show that CUL1 and CUL3A-based E3 ligase complexes are involved in the regulation of phyA degradation. Surprisingly, our results also demonstrate that cu14 is not affected in the degradation of phyA whereas constitutive Photomorphogenic 1 (COP1) a subunit of one CUL4based E3 complex was reported to be involved. Further investigations showed that the phenotype of cop1 is conditional, the mutant being defective in phyA degradation only in the presence of metabolisable sugars. I also showed that phyA is degraded by a proteasome-dependent mechanism both in the cytoplasm and in the nucleus using mutants and transgenic lines affected in the localization of phyA. Interestingly, I observed that phyA degradation was faster in the nucleus than in the cytosol and that rapid degradation of Pr also occurred in the nucleus suggesting that cytosolic accumulation of phyA in the dark is a way to regulate its proteolysis. Finally, we identify a short region similar to a PEST sequence required for phyA stability and we developed a unbiased genetic screen to identify new components involved in the regulation of the light-dependent degradation of phyA. The significance of these results are discussed. RESUME : Les phytochromes (phy) constituent une famille de photorécepteurs absorbant la lumière rouge et rouge lointaine et régulant toutes les étapes de transitions majeures dans la vie des plantes. Chez Arabidopsis, cinq membres : phyA, B, C, D et E ont été identifiés. Les phytochromes sont synthétisés sous une forme inactive appelée Pr absorbant la lumière rouge. Après perception de lumière ils passent sous une forme active Pfr absorbant dans le rouge lointain. La forme Pfr peut retourner sous la forme Pr après absorption de lumiëre rouge lointaine ou dans un processus lent appelé «réversion à l'obscurité ». phyA représente une exception à cette règle car il ne retoune pas significativement sous sa forme inactive dans le noir. Deux processus spécifiques ont donc été développés pour diminuer le taux de phyA actif. Le premier consiste en la répression du gène PHYA en condition de lumière et le second en une dégradation induite par la lumière de la protéine phyA. Ce dernier processus est le plus efficace pour diminuer rapidement le niveau de phyA. La capacité des plantes à réguler le taux de phyA actifs est critique dans un environnement riche en lumière rouge lointaine, une situation observée sous une canopée. Sous une canopée, phyA est essentiel pour induire la germination et la dé-étiolation de la jeune pousse. Plus tard dans le développement la capacité de phyA de réprimer la croissance freine la «réponse à l'évitement de l'ombre ». Par conséquent diminuer le taux de phyA permet la croissance de la tige et donc de rentrer en compétition pour la lumière avec les plantes avoisinantes. Dans cette thèse, j'ai étudié la dégradation de phyA. J'ai développé une approche génétique inverse basée sur l'analyse systématique de l'accumulation de phyA en condition de lumière dans les différents mutants cullin, cul1, cul3a, cul3b et cul4. Ces analyses nous ont permis d'identifier qu'un complexe E3 ligase CUL1 et un complexe E3 ligase CUL3A sont impliqués dans la régulation de la dégradation de phyA. Mes résultats démontrent aussi que le mutant cul4 n'est pas affecté dans la dégradation de phyA alors que Çonstitutive Photomorphogenic 1 (COPI) une sous unité d'un complexe CUL4 à été identifier dans la régulation de cette dégradation. Des analyses supplémentaires suggèrent que l'effet de la mutation cop1 est dépendante dë la présence de sucres métabolisables. J'ai aussi montré que phyA est dégradé dans le noyau et dans le cytoplasme par un mécanisme dépendant du protéasome et que la dégradation dans le.noyau est non seulement aspécifique de la forme Pr ou Pfr mais aussi est plus rapide que dans le cytoplasme. Ceci suggère que l'accumulation de phyA dans le cytoplasme permet son accumulation à des niveaux élevés à l'obscurité. Enfin j'ai identifié une région similaire à un motif PEST requise pour la stabilité de phyA et j'ai aussi développé un criblage génétique non biaisé pour identifier de nouveaux composants impliqués dans la régulation de la dégradation de phyA. L'importance de ces résultats est discutée dans le dernier chapitre de cette thèse.