Les sHsps en surera: capacitat protectora enfront l'estrés i variabilitat genètica

Els organismes responen a la temperatura i a molts altres estressos sintetitzant un grup de proteïnes anomenat proteïnes de xoc de calor (HSPs). En plantes les sHsps, d'entre 15 i 30 kDa formen el grup més abundant i divers, classificat en funció de la seva localització subcel.lular i homologia en: mitocondrials, cloroplàstiques, de reticle endoplasmàtic i citoplàsmiques de classe I i II. Les sHsps-CI s'ha descrit que s'indueixen per estrès tèrmic, hídric i oxidatiu (peròxid d'hidrògen, llum UV, ozó) i en resposta a algunes hormones. També s'expressen durant el desenvolupament, per exemple durant l'embriogènesi, on es creu que podrien tenir un paper protector de l'embrió enfront la dessecació. Tot i que hi ha abundants treballs que correlacionen la resistència a l'estrès i l'acumulació de sHsps-CI, els mecanismes moleculars d'aquesta activitat són poc conguts. Tot i això, per diverses sHsps-CI ha estat descrita una activitat xaperona in vitro i, més recentment, que la seva sobreexpressió augmenta la viabilitat de cèl.lules d'E.coli en condicions d'estrès tèrmic. L'estudi de l'acumulació de sHsps-CI en surera (Quercus suber) mitjançant immunodetecció en electroforesi bidimensional mostra uns patrons d'acumulació complexos i formats per dos grups d'espècies proteiques principals, a l'entorn dels 10 i 17 kDa respectivament, que mostren una inducció diferencial en funció del teixit i l'estrès. Mentre que les espècies proteiques de 17 kDa s'indueixen per temperatura però no per estrès oxidatiu, les de ca. 10 kDa ho fan per estrès oxidatiu i no per temperatura. Ambdós grups d'espècies proteiques s'acumulen conjuntament en fel.lema. Assajos de PCR i RT-PCR han permès clonar parcialment tres noves sHsps-CI en surera: Qshsp10-CI, QshspC-CI i QshspD-CI. Aquest fet confirma la multigeneïcitat de les sHsps-CI en surera que apuntava el patró bidimensional. Dels nous clons obtinguts destaca especialment Qshsp10-CI, un gen que presenta un codó stop enmig del domini -cristal.lí que fa que a la proteïna que se'n dedueix li manqui un 55% del domini -cristal.lí i tota l'extensió C-terminal. Es tractaria de la sHsp més petita i més truncada descrita fins al moment. L'anàlisi de l'expressió de Qshsp10-CI mitjançant RT-PCR mostra expressió en plantes tractades amb H2O2 però no en les que han estat sotmeses a un xoc de calor. Aprofitant l'oportunitat que oferia aquesta sHsp-CI de ser utilitzada com a model per l'estudi de la importància del domini -cristal.lí i l'extensió C-terminal en l'activitat protectora enfront l'estrès, es va voler determinar la capacitat que tenia d'augmentar la viabilitat de cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i oxidatiu. Els resultats mostren que la proteïna recombinant QsHsp10-CI, tot i la important truncació que té, és capaç de protegir cèl.lules d'E. coli en condicions d'estrès tèrmic i, remarcablement, en condicions d'estrès oxidatiu. Tots aquests resultats indiquen que les espècies proteiques de ca. 10 kDa podrien correspondre a Qshsp10-CI i tenir un paper en les cèl.lules del fel.lema en la protecció enfront l'estrès oxidatiu. L'estrès oxidatiu provoca lesions al DNA que poden produir errors en la replicació, transcripció o traducció i generar proteïnes aberrants. Donades les condicions d'estrès oxidatiu a les quals es troben sotmeses les cèl.lules del fel.lema, s'ha volgut estudiar la variabilitat dels seus àcids nucleics. La determinació de la taxa de mutació de la regió codificant del gen Qshsp17.4-CI en mRNA i DNA de fel.lema i àpex radicular, un teixit jove i en creixement actiu va mostrar unes taxes sorprenentment elevades en l'mRNA (1/1784 pb) i el DNA genòmic (1/1520 pb) del fel.lema. Aquestes taxes són les més altes descrites en un genoma nuclear eucariota i són similars a les dels virus d'RNA d'evolució ràpida com el virus de l'Hepatitis C. Amb aquestes taxes de mutació, un terç dels mRNAs del fel.lema de la surera contindrien missatges aberrants i la supervivència de les cel.lules es veuria compromesa. Això implica que el fel.lema hauria de ser considerat com un mosaic de cèl.lules genèticament heterogènies i, per tant, una sola seqüència no defineix en tota la seva amplitud un gen en aquest teixit. No es va detectar cap mutació en àpex de rel. Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les mutacions que es donen en aquests dos teixits i per tal de poder fer una anàlisi qualitativa més completa que permetés especular sobre el seu origen, es va aplicar un mètode de selecció de seqüències mutants en base a la utilització d'enzims de restricció. Les mutacions detectades en fel.lema es corresponen amb les relacionades, en altres sistemes no nuclears (plasmidis, fags i DNA bacterià), amb l'estrès oxidatiu. En conseqüència, l'estrès oxidatiu al qual estan sotmeses les cèl.lules del fel.lema podria ser el causant de l'elevada taxa de mutació detectada. D'acord amb això, el tipus majoritari de productes d'oxidació de les bases del DNA que s'acumulen en brots de plàntules de surera en resposta al peròxid d'hidrògen produeixen el mateix tipus de mutacions detectades en l'mRNA del fel.lema de la surera. La major sensibilitat d'aquest nou mètode ha permès, a més, detectar mutacions en molècules d'mRNA de rel, un teixit en el qual no s'havia trobat cap mutació utilitzant el mètode de clonatge i seqüenciació directa. Tot i això, el tipus de mutacions predominants no estan relacionades amb l'estrès oxidatiu sinó amb erros en la reparació dels àcids nucleics.

Chromosomal mapping of ANTP class homeobox genes in amphioxus: piecing together ancestral genomes

Homeobox genes encode DNA-binding proteins, many of which are implicated in the control of embryonic development. Evolutionarily, most homeobox genes fall into two related clades: the ANTP and the PRD classes. Some genes in ANTP class, notably Hox, ParaHox, and NK genes, have an intriguing arrangement into physical clusters. To investigate the evolutionary history of these gene clusters, we examined homeobox gene chromosomal locations in the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma floridae. We deduce that 22 amphioxus ANTP class homeobox genes localize in just three chromosomes. One contains the Hox cluster plus AmphiEn, AmphiMnx, and AmphiDll. The ParaHox cluster resides in another chromosome, whereas a third chromosome contains the NK type homeobox genes, including AmphiMsx and ArnphiTlx. By comparative analysis we infer that clustering of ANTP class homeobox genes evolved just once, during a series of extensive cis-duplication events of genes early in animal evolution. A trans-duplication event occurred later to yield the Hox and ParaHox gene clusters on different chromosomes. The results obtained have implications for understanding the origin of homeobox gene clustering, the diversification of the ANTP class of homeobox genes, and the evolution of animal genomes.

Conditional transgenic expression of fibroblast growth factor 9 in the adult mouse heart reduces heart failure mortality after myocardial infarction

BACKGROUND: Fibroblast growth factor 9 (FGF9) is secreted from bone marrow cells, which have been shown to improve systolic function after myocardial infarction (MI) in a clinical trial. FGF9 promotes cardiac vascularization during embryonic development but is only weakly expressed in the adult heart. METHODS AND RESULTS: We used a tetracycline-responsive binary transgene system based on the α-myosin heavy chain promoter to test whether conditional expression of FGF9 in the adult myocardium supports adaptation after MI. In sham-operated mice, transgenic FGF9 stimulated left ventricular hypertrophy with microvessel expansion and preserved systolic and diastolic function. After coronary artery ligation, transgenic FGF9 enhanced hypertrophy of the noninfarcted left ventricular myocardium with increased microvessel density, reduced interstitial fibrosis, attenuated fetal gene expression, and improved systolic function. Heart failure mortality after MI was markedly reduced by transgenic FGF9, whereas rupture rates were not affected. Adenoviral FGF9 gene transfer after MI similarly promoted left ventricular hypertrophy with improved systolic function and reduced heart failure mortality. Mechanistically, FGF9 stimulated proliferation and network formation of endothelial cells but induced no direct hypertrophic effects in neonatal or adult rat cardiomyocytes in vitro. FGF9-stimulated endothelial cell supernatants, however, induced cardiomyocyte hypertrophy via paracrine release of bone morphogenetic protein 6. In accord with this observation, expression of bone morphogenetic protein 6 and phosphorylation of its downstream targets SMAD1/5 were increased in the myocardium of FGF9 transgenic mice. CONCLUSIONS: Conditional expression of FGF9 promotes myocardial vascularization and hypertrophy with enhanced systolic function and reduced heart failure mortality after MI. These observations suggest a previously unrecognized therapeutic potential for FGF9 after MI.

REST: transcriptional and epigenetic regulator

Acquisition and maintenance of cell fate and potential are dependent on the complex interplay of extracellular signaling, gene regulatory networks and epigenetic states. During embryonic development, embryonic stem cells become progressively more restricted along specific lineages, ultimately giving rise to the diversity of cell types in the adult mammalian organism. Recent years have seen major advances in our understanding of the mechanisms that regulate the underlying transcriptional programmes during development. In particular, there has been a significant increase in our knowledge of how epigenetic marks on chromatin can regulate transcription by generating more or less permissive chromatin conformations. This article focuses on how a single transcription factor, repressor element-1 silencing transcription factor, can function as both a transcriptional and epigenetic regulator, controlling diverse aspects of development. We will discuss how the elucidation of repressor element-1 silencing transcription factor function in both normal and disease conditions has provided valuable insights into how the epigenome and transcriptional regulators might cooperatively orchestrate correct development.

The integration of lipid-sensing and anti-inflammatory effects: how the PPARs play a role in metabolic balance

The peroxisomal proliferating-activated receptors (PPARs) are lipid-sensing transcription factors that have a role in embryonic development, but are primarily known for modulating energy metabolism, lipid storage, and transport, as well as inflammation and wound healing. Currently, there is no consensus as to the overall combined function of PPARs and why they evolved. We hypothesize that the PPARs had to evolve to integrate lipid storage and burning with the ability to reduce oxidative stress, as energy storage is essential for survival and resistance to injury/infection, but the latter increases oxidative stress and may reduce median survival (functional longevity). In a sense, PPARs may be an evolutionary solution to something we call the 'hypoxia-lipid' conundrum, where the ability to store and burn fat is essential for survival, but is a 'double-edged sword', as fats are potentially highly toxic. Ways in which PPARs may reduce oxidative stress involve modulation of mitochondrial uncoupling protein (UCP) expression (thus reducing reactive oxygen species, ROS), optimising forkhead box class O factor (FOXO) activity (by improving whole body insulin sensitivity) and suppressing NFkB (at the transcriptional level). In light of this, we therefore postulate that inflammation-induced PPAR downregulation engenders many of the signs and symptoms of the metabolic syndrome, which shares many features with the acute phase response (APR) and is the opposite of the phenotype associated with calorie restriction and high FOXO activity. In genetically susceptible individuals (displaying the naturally mildly insulin resistant 'thrifty genotype'), suboptimal PPAR activity may follow an exaggerated but natural adipose tissue-related inflammatory signal induced by excessive calories and reduced physical activity, which normally couples energy storage with the ability to mount an immune response. This is further worsened when pancreatic decompensation occurs, resulting in gluco-oxidative stress and lipotoxicity, increased inflammatory insulin resistance and oxidative stress. Reactivating PPARs may restore a metabolic balance and help to adapt the phenotype to a modern lifestyle.

Differential expression of connexins during histogenesis of the chick retina

Gap junction (GJ) channels couple adjacent cells, allowing transfer of second messengers, ions, and molecules up to 1 kDa. These channels are composed by a multigene family of integral membrane proteins called connexins (Cx). In the retina, besides being essential circuit element in the visual processing, GJ channels also play important roles during its development. Herein, we analyzed Cx43, Cx45, Cx50, and Cx56 expression during chick retinal histogenesis. Cx exhibited distinct expression profiles during retinal development, except for Cx56, whose expression was not detected. Cx43 immunolabeling was observed at early development, in the transition of ventricular zone and pigmented epithelium. Later, Cx43 was seen in the outer plexiform and ganglion cell layers, and afterwards also in the inner plexiform layer. We observed remarkable changes in the phosphorylation status of this protein, which indicated modifications in functional properties of this Cx during retinal histogenesis. By contrast, Cx45 showed stable gene expression levels throughout development and ubiquitous immunoreactivity in progenitor cells. From later embryonic development, Cx45 was mainly observed in the inner retina, and it was expressed by glial cells and neurons. In turn, Cx50 was virtually absent in the chick retina at initial embryonic phases. Combination of PCR, immunohistochemistry and Western blot indicated that this Cx was present in differentiated cells, arising in parallel with the formation of the visual circuitry. Characterization of Cx expression in the developing chick retina indicated particular roles for these proteins and revealed similarities and differences when compared to other species. (C) 2008 Wiley Periodicals, Inc.

Samba, a Xenopus hnRNP Expressed in Neural and Neural Crest Tissues

RNA binding proteins regulate gene expression at the posttranscriptional level and play important roles in embryonic development. Here, we report the cloning and expression of Samba, a Xenopus hnRNP that is maternally expressed and persists at least until tail bud stages. During gastrula stages, Samba is enriched in the dorsal regions. Subsequently, its expression is elevated only in neural and neural crest tissues. In the latter, Samba expression overlaps with that of Slug in migratory neural crest cells. Thereafter, Samba is maintained in the neural crest derivatives, as well as other neural tissues, including the anterior and posterior neural tube and the eyes. Overexpression of Samba in the animal pole leads to defects in neural crest migration and cranial cartilage development. Thus, Samba encodes a Xenopus hnRNP that is expressed early in neural and neural crest derivatives and may regulate crest cells migratory behavior. Developmental Dynamics 238:204-209, 2009. (C) 2008 Wiley-Liss, Inc.

Efeitos biológicos dos campos eletromagnéticos de ultra alta freqüência

Vários estudos têm sugerido que seres vivos podem ser suscetíveis aos campos eletromagnéticos (CEMs). Os supostos efeitos dos Campos Eletromagnéticos de Ultra Alta Freqüência (CEMUAFs) em sistemas biológicos são pouco conhecidos. Os relatos de um possível efeito biológico dependente da alteração de estados de oxidação entre pares de radicais sugerem um mecanismo de transdução orgânica para os campos. Outros trabalhos obtiveram alterações na sinalização celular e defesas antioxidantes após a exposição CEMUAFs e, tais alterações, poderiam ser um agente causador de doenças como, por exemplo, a leucemia infantil, esta já correlacionada com a exposição aos CEMs. Desta forma o objetivo deste estudo foi investigar se o CEMUAF (834 MHz) poderia interferir com o balanço oxidativo de planárias e ratos, assim como, estudar a participação de enzimas responsáveis pela hidrólise de nucleotídeos, enzimas estas reconhecidas por serem influenciadas pela ação de radicais livres. As planárias foram expostas por 1, 3 e 6 dias (8 h/dia). Após a exposição foi feito um homogenato de todo o corpo de cada animal. Foi encontrado um aumento na atividade da superóxido desmutase (SOD) e um decréscimo na atividade da catalase (CAT) e na defesa antioxidante não-enzimática (TRAP) após 6 dias de exposição. Adicionalmente, houve um aumento na freqüência de micronúcleos (MN) após 3 e 6 dias de exposição. Não houve alteração nos parâmetros de dano oxidativo a lipídios (TBARS) e proteínas (Carbonil) em nenhum dos tempos de exposição. Estes resultados sugerem um aumento nos níveis de radicais livres e de danos aos ácidos nucléicos. Estudos posteriores deverão determinar se estes efeitos apresentam ou não associações do tipo causa e efeito. Foram utilizados três modelos com ratos. No primeiro modelo, animais com idades de 30, 80 e 210 dias foram expostos por 6 dias (7:30 h/dia). Não foram encontradas mudanças nos parâmetros de TRAP, TBARS e Carbonil em nenhuma das idades expostas ao CEMUAF. Estes resultados sugerem que os tempos de exposição utilizados não foram suficientes para causar alguma mudança perceptível nos parâmetros de estresse oxidativo. No segundo modelo, utilizou-se o sangue e fígado dos neonatos expostos ao CEMUAF ainda no útero de suas mães durante todo o seu desenvolvimento embrionário (8:30 h/dia). Não foram encontradas mudanças em nenhum parâmetro oxidativo. Foi encontrado um aumento na freqüência de MN nas hemácias, sugerindo um efeito genotóxico da irradiação do celular afetando o tecido hematopoiético dos fetos. No terceiro modelo, utilizou-se o sangue de ratos adultos (180 dias) expostos por 12 dias (8:30 h/dia). Os níveis da hidrólise de ATP e ADP estavam aumentados no grupo irradiado. Nenhum efeito foi observado nas atividades da SOD e da CAT, sugerindo nenhuma participação de radicais livres nestes resultados. Ainda são necessários muitíssimos estudos para determinar quais os mecanismos transdutores dos CEMUAFs em sistemas biológicos e de que forma esta interação ocorre, porém estes resultados sugerem: (a) um papel para os radicais livres sobre, pelo menos, alguns dos efeitos atribuídos aos CEMUAFs e (b) que os organismos em fase de formação podem ser mais sensíveis aos campos. Por fim, sugerimos que sistemas biológicos podem sofrer a ação da irradiação com uma quantidade de energia muito menor do que a esperada para promover algum efeito no metabolismo.

Biologia de Leptopharsa heveae Drake & Poor (Heteroptera: Tingidae) e a relação de suas exigências térmicas com a flutuação populacional em seringueira

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Efeito de diferentes dietas sobre o desenvolvimento pós-embrionário de Chrysoperla defreitasi Brooks (Neuroptera: Chrysopidae)

Avaliou-se o período pós-embrionário do predador Chrysoperla defreitasi Brooks alimentada com ovos de Sitotroga cerealella (Olivier) e Diatraea saccharalis (Fabricius) em condições de laboratório à temperatura de 25±2ºC, UR de 70±10% e fotofase de 14h. Os ovos do crisopídeo foram individualizados em tubos de vidro e, após a eclosão, as larvas foram alimentadas com as respectivas presas e mantidas em sala climatizada, sob condições controladas. O delineamento estatístico utilizado foi inteiramente casualizado com 150 repetições para cada dieta. As durações do 1º, 2º e 3º ínstar e da fase pupal foram, respectivamente, 3,4, 2,7, 3,5 e 11,9 dias para larvas alimentadas com D. saccharalis e 3,6, 2,8, 2,7 e 9,3 dias, quando a dieta oferecida foi ovos de S. cerealella. Larvas de crisopídeos alimentados com ovos de D. saccharalis levaram em média 21,5 dias para completar o desenvolvimento pós-embrionário, com 34,0% de adultos emergidos, enquanto que os alimentados com ovos de S. cerealella levaram 18,4 dias com 55,3% de adultos. Pode-se, pois, constatar que a melhor dieta para o desenvolvimento pós-embrionário de C. defreitasi foram os ovos de S. cerealella, sendo que insetos alimentados com esta dieta apresentaram período mais curto de desenvolvimento, maior viabilidade nos três ínstares larvais e no período pupal, produzindo maior número de adultos.

Efeito da escassez de alimento no desenvolvimento pós-embrionário e no potencial reprodutivo de Chrysoperla externa (Hagen) (Neuroptera: Chrysopidae) em laboratório

As conseqüências da escassez alimentar no período pós-embrionário e potencial reprodutivo de Chrysoperla externa (Hagen) em laboratório foram avaliadas. Larvas de 1.°, 2.º e 3.° ínstares receberam alimento apenas no 1.°, 2.º ou 3.° dia após a ecdise. Nos períodos em que antecederam ou sucederam os testes com os respectivos ínstares, as larvas receberam uma, duas e três unidades de alimentação (UA) a cada dois dias para o 1.°, 2.º e 3.° ínstares, respectivamente. Cada UA constou de um disco de cartolina contendo ovos de Sitotroga cerealella (Olivier) (Lepidoptera: Gelechiidae). Diariamente, avaliou-se a viabilidade nos diferentes ínstares, da fase larval e pupal, assim como os períodos de pré-oviposição e oviposição, o número e a viabilidade de ovos. A escassez de alimento durante o 1.° ínstar pode ser suprida no decorrer do desenvolvimento larval. Entretanto, as larvas precisam encontrar alimento nas primeiras 48 horas de vida, pois a viabilidade nesse ínstar foi decrescendo com a ausência de alimento, podendo ocorrer 100% de mortalidade quando as larvas não se alimentam em até 48 horas após a eclosão. Os períodos de pré-oviposição e oviposição, assim como a fecundidade, não foram influenciados pela escassez de alimento durante o 1.° ínstar larval. Durante os 2.° e 3.° ínstares larvais, C. externa necessita de alimentação rica em proteína, pois a ingestão de apenas água e açúcares nesses estádios ocasionou alta mortalidade. Entretanto, a fecundidade e viabilidade dos ovos não foram afetadas pela escassez de alimento nesses ínstares.

Interspecific interaction between Telenomus remus (Hymenoptera: Platygastridae) and Trichogramma pretiosum (Hymenoptera: Trichogrammatidae) on Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) eggs

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Aspectos biológicos de Chrysoperla raimundoi Freitas & Penny (Neuroptera, Chrysopidae)

Os crisopídeos são importantes predadores e são encontrados em diversos agroecossistemas. A temperatura é um dos fatores determinantes para o desenvolvimento dos insetos, sendo que existe um gradiente de variação aceitável para cada espécie. Portanto, objetivou-se com este estudo verificar a influência de diferentes temperaturas sobre o desenvolvimento embrionário e pós-embrionário de C. raimundoi assim como verificar as conseqüências nas diferentes gerações. As fases jovens foram criadas em três ambientes com temperaturas constantes de 19,0, 25,0 e 31,0ºC e em um ambiente externo sem controle dos fatores abióticos. Foram observados a duração do período embrionário, do primeiro, segundo e terceiro ínstares, a duração do período larval, pupal e ovo-adulto, assim como, a sobrevivência em cada estágio, estádio e a porcentagem de emergência. O desenvolvimento embrionário e pós-embrionário diferiu entre as gerações F2 e F4. Quanto à influência de diferentes temperaturas para a geração F2, os indivíduos criados a 31,0ºC demonstraram redução na taxa de desenvolvimento com relação aos outros dois ambientes. Para a geração F4, observou-se que as diferentes temperaturas influenciaram no desenvolvimento, sendo que a 19,0ºC houve prolongamento do mesmo.

Parthenogenetic activation of bovine oocytes using single and combined strontium, ionomycin and 6-dimethylaminopurine treatments

In vitro-matured (IVM) bovine oocytes were activated with single and combined treatments of strontium (S), ionomycin (1) and 6-DMAP (D). Using oocytes IVM for 26 h, we observed that activation altered cell cycle kinetics (faster progression, MIII arrest, or direct transition from MII to pronuclear stage) when compared to in vitro fertilization. The effect of oocyte age on early parthenogenesis was assessed in oocytes IVM for 22, 26 and 30 h. Better results in pronuclear development were obtained in treatments ISD (81.7%) at 22 h; D (66.7%), IS (63.3%), ID (73.3%) and ISD (76.7%) at 26 h; and D (86.7%), IS (85.0%) and ID (78.3%) at 30 h. Higher cleavage occurred on ISD (80.0%) at 22 h; ID (83.3%) and ISD (91.7%) at 26 h; and 1 (86.7%), IS (90.0%), ID (85.0%) and ISD (95.0%) at 30 h. More blastocysts were achieved in ID (25.0%) and ISD (18.3%) at 22h; and in ID at 26h (45.0%) and 30h (50.0%). We also observed that IS allowed higher haploid (77.4%) embryonic development, whilst ID was better for diploid (89.1%) development. It was concluded that association of S and D without I was not effective for blastocyst development; treatments using S were less influenced by oocyte age, but when S was associated with D there was a detrimental effect on aged oocytes; treatment ISD promoted higher activation and cleavage rates in young oocytes and ID protocol was the best for producing blastocysts.

Relationship between follicle size and ultrasound-guided transvaginal oocyte recovery

We evaluated the relationship between follicle size and oocyte recovery (OR) using ultrasound-guided follicle aspiration. Thirty Holstein cows were subjected to OR without gonadotrophic therapy. Oocytes were recovered two to four times from each cow in a total of 67 aspiration sessions, Ovarian follicles with diameters less than or equal to4 mm and >4 mm were aspirated in separated groups. Recovered oocytes from each group were kept separate and submitted to in vitro maturation, fertilization, and culture to the blastocyst stage. A total of 430 follicles were aspirated, of which 154 (35.8%) were from follicles >4 mm and 276 (64.2%) were from follicles less than or equal to4 mm. Seventy-seven oocytes (50%) were recovered from follicles >4 mm and 200 (72.2%) were from follicles less than or equal to4 mm. Nineteen blastocysts were obtained from follicles >4 mm, whereas 45 blastocysts were obtained from follicles less than or equal to4 mm. Recovery rate was greater (P < 0.01) in follicles less than or equal to4 mm, Oocyte quality, cleavage rate and blastocyst development did not differ between different follicle sizes. Routine aspiration of small follicles (less than or equal to4 mm) could increase the number of oocytes available for in vitro development. (C) 2001 Elsevier B.V. B.V. All rights reserved.