Proteínas imunorreativas de Conidiobolus lamprauges isoladas de ovinos infectados naturalmente

O estudo de conidiobolomicose ovina tem sido realizado nos seus aspectos clínicos, epidemiológicos, patológicos e moleculares. Informações, entretanto, sobre a resposta imune do hospedeiro na infecção por Conidiobolus lampraugessão inexistentes. Este estudo teve por objetivo a identificação de proteínas imunorreativas que possam desempenhar papel importante na resposta imune de ovinos naturalmente infectados por C. lamprauges. Para a caracterização protéica e imunológica foi utilizada a cepa de C. lamprauges(FIOCRUZ-INCQS 40316) isolada de ovino com sinais clínicos de conidiobolomicose no Estado do MT e cinco amostras de soro de ovinos infectados naturalmente pelo fungo. A presença de anticorpos IgG foi observada em todos os animais doentes com títulos reagentes em diluições de até 1:1.600. Na técnica do immunoblot, o perfil antigênico frente aos soros ovinos com a doença apresentou doze bandas reativas, com massas moleculares variando de 35 a 198 kDa. Dentre estas, a proteína de 198 kDa foi reativa em 3 soros de ovinos e a de 53 kDa apresentou a maior intensidade comparativamente com outras bandas, sendo provavelmente imunodominante. Amostras de soro de animais sadios não apresentaram reatividade demostrando a especificidade da técnica. A presença de proteínas antigênicas de C. lamprauges e IgG específicos em soros de ovinos observados no presente trabalho poderá auxiliar no desenvolvimento de métodos de diagnóstico precoces e na utilização de proteínas candidatas a vacinas para o controle e prevenção da infecção em animais e humanos.

Variabilidade genética em biotipos de leiteiro de Londrina/PR

Euphorbia heterophylla, também conhecida como amendoim-bravo ou leiteira, é considerada planta invasora importante em mais de 56 países, inclusive no Brasil, tendo acarretado perdas de até 33 % na cultura da soja. Fenotipicamente, é uma espécie de características variáveis, especialmente em relação ao formato do limbo foliar. Esta variabilidade fenotípica tem sido utilizada para diferenciar e classificar as plantas, sugerindo a vários autores que a leiteira seria, de fato, constituída por diferentes espécies. Para estudar a variabilidade genética a nível de DNA entre plantas de Euphorbia heterophylla, que apresentam folhas morfologicamente diferentes, foram analisadas dez plantas diferentes coletadas em campos de soja, em Londrina/PR. As plantas foram transplantadas para casa-devegetação e o DNA das folhas foi extraído para análise pela técnica de RAPD. Vinte seis diferentes "primers", de dez nucleotídeos de sequência aleatória, geraram total de 102 bandas de DNA, sendo 38 delas polimórficas. A distância genética entre os indivíduos foi calculada em função da presença e da ausência das bandas, variando de 1 a 39% entre plantas. A análise de agrupamento dividiu as plantas em dois grupos, considerando limite de distância relativa de 22%. Os grupos gerados separaram nitidamente as plantas quanto ao formato do limbo foliar (estreito ou arredondado) e quanto á ramificação (densa ou normal).

Similaridade genética entre acessos de Bidens pilosa resistentes aos herbicidas inibidores da ALS

Herbicidas inibidores da enzima acetolactato sintase (ALS) têm sido amplamente utilizados no controle da planta daninha picão-preto (Bidens pilosa). A pressão de seleção causada pelo uso intensivo desses herbicidas tem selecionado biótipos de picão-preto resistentes. O objetivo deste trabalho foi avaliar o grau de similaridade genética entre acessos de picão-preto resistentes aos herbicidas inibidores da ALS, bem como a relação entre coeficiente de similaridade genética e distância geográfica desses acessos. Para isso, sementes de dois grupos de acessos de picão-preto, originárias de uma propriedade em Pato Branco, Paraná, resistentes aos herbicidas inibidores da ALS foram colhidas, e plântulas foram cultivadas em casa de vegetação na Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre-RS, em outubro de 2004. Por meio do marcador molecular RAPD (polimorfismo de DNA amplificado ao acaso) foi possível avaliar a similaridade genética entre os acessos de picão-preto. Na análise conjunta dos acessos, dos 20 primers utilizados, 17 apresentaram-se polimórficos, amplificando um total de 94 bandas. Houve baixa similaridade genética (38%) entre acessos de picão-preto resistentes aos herbicidas inibidores da ALS originários de uma mesma propriedade. Não foi observada relação entre distância genética e distância geográfica entre os acessos avaliados.

Variabilidade genética e sensibilidade de acessos de Pistia stratiotes ao herbicida glyphosate

A alface-d'água (Pistia stratiotes) é uma das principais entre as macrófitas aquáticas que causam problemas em corpos hídricos no Brasil e são consideradas como plantas daninhas. O presente trabalho foi realizado com os objetivos de conhecer melhor a variabilidade genética dessa macrófita e relacionar essa variabilidade com a resposta à aplicação do herbicida glyphosate. Para isso, foram coletados indivíduos em 12 corpos hídricos em diferentes cidades do território nacional (Americana, Cambaratiba, Curitiba, Itapura, Jaboticabal, Lagoa Santa, Piraí, Rio Grande, Rubinéia, Salto Grande, Santa Gertrudes e Três Lagoas). Os acessos foram caracterizados pelo uso de marcadores RAPD (DNA Polimórfico Amplificado ao Acaso), que permitiram, com o auxílio de iniciadores aleatórios, a caracterização dos locos polimórficos identificados por uma matriz de ausência e presença de bandas. Utilizando essa matriz, a análise de agrupamento permitiu nítida classificação dos acessos em três grupos com diferenças genéticas entre eles. Um ensaio de controle químico, com plantas mantidas em vasos plásticos (5 L) e pulverizadas com o herbicida glyphosate nas concentrações de 0,0, 0,6, 1,2, 1,8 e 2,4 kg ha-1, identificou, utilizando avaliações aos 7, 14 e 21 dias após aplicação, que as duas maiores doses promoveram melhor efeito herbicida. Foi verificado também que os acessos de Curitiba e Cambaratiba apresentaram menor suscetibilidade ao herbicida glyphosate. Não houve correspondência entre a estrutura de grupos dos acessos pela análise multivariada de agrupamento com a técnica RAPD e a suscetibilidade da alface-d'água ao glyphosate.

Enzimas amilolíticas de mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft.)

O objetivo do presente trabalho foi de caracterizar as enzimas amilolíticas de mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza Bancroft.). Foram realizados ensaios mediante a determinação da atividade enzimática, variando-se as condições do meio, tais como temperatura, pH e concentração de cátions. Em gel de eletroforese foram detectadas três bandas protéicas com intensa atividade hidrolítica. As enzimas apresentaram pH ótimo de atividade em torno de 6,0 e mostraram-se mais sensíveis a valores de pH alcalino quando pré-incubadas a 50oC. A temperatura ótima de ativação enzimática foi de 50oC, enquanto aos 70oC, a atividade amilásica foi reduzida em 80%. Em temperaturas altas temperaturas (60 e 70oC), a inativação enzimática ocorreu após 60 e 25min de incubação, respectivamente. Ensaios de estabilidade térmica mostraram que as amilases mantiveram alta atividade após 25h mediante a incubação a 20 e 30oC. Os valores de Km, Vmax e energia de ativação foram de 0,41mg/mL, 1,11mg/mL/min e 7,53kcal/mol, respectivamente. Constatou-se que a presença de Ca+2 ou Mg+2 provoca aumento na atividade amilásica, enquanto íons de Cu+2 causam uma diminuição. Apesar da discreta atividade amilásica apresentada, as enzimas demonstraram ter alta resistência e estabilidade térmicas.

Caracterização e hidrólise in vitro da globulina principal de grão-de-bico (Cicer arietinum L.), var. IAC-Marrocos

No presente estudo procedeu-se ao isolamento e caracterização da fração globulina majoritária (11 S) de grão-de-bico, var. IAC-Marrocos. A globulina majoritária extraída foi isolada por cromatografia de filtração em gel e de troca-iônica mostrando apenas uma banda de proteína na eletroforese em gel de poliacrilamida. A globulina majoritária, após passagem em coluna de Sephadex, revelou duas bandas protéicas de 55 e 52,5kDa e três bandas menores em gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio. Na presença de 2-mercaptoetanol 6 polipeptídios na faixa de 18 a 42kDa foram revelados na eletroforese. A globulina isolada foi submetida à ação da tripsina e quimotripsina onde a forma nativa mostrou-se resistente à ação enzimática enquanto o aquecimento (96 e 121°C/15min) não foi suficiente para aumentar a susceptibilidade à hidrólise, significativamente. Adição de NaCl 0,3M levou a um aumento da estabilidade estrutural com menor susceptibilidade à digestão proteolítica, fato em parte perdido com o aquecimento. As hidrólises foram acompanhadas por eletroforese em gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sódio.

Obtenção e caracterização química e nutricional in vitro das proteínas do soro de sangue bovino

O objetivo principal deste trabalho foi o isolamento e a caracterização química e nutricional (in vitro) das duas principais frações protéicas do soro de sangue bovino. Imediatamente, após coleta higiênica do sangue em matadouro, promoveu-se a coagulação e a remoção da fração celular por centrifugação, em condições apropriadas. A fração globulina (GB) foi precipitada do soro pela saturação a 50% com (NH4)2 SO4 . Após separação da GB por centrifugação a saturação do sobrenadante foi elevada a 80%, para a precipitação da albumina (BSA). A precipitação de proteínas séricas das duas frações somou 98% das proteínas totais do soro. As duas frações protéicas foram caracterizadas quanto à composição centesimal, perfil de aminoácidos, composição mineral, escore de aminoácidos essenciais (EAE), digestibilidade da proteína e PDCAAS ("Protein digestibility corrected amino acid scoring"). O teor de proteína nas duas frações foi de aproximadamente 85% e a BSA se caracterizou pelo elevado teor de lisina, histidina e aminoácidos sulfurados. O EAE para BSA foi 70% sendo triptofano o aminoácido mais limitante e 87,8% para a GB, sendo a isoleucina o aminoácido mais limitante. O uso das técnicas de eletroforese e densitometria permitiu a caracterização das frações quanto ao número de bandas pesos moleculares e proporção relativa entre as várias proteínas.

Caracterização química e nutricional de plasteína produzida a partir de hidrolisado pancreático de isolado protéico de soja

O presente trabalho teve como objetivo realizar a caracterização química e nutricional da plasteína produzida a partir de isolado protéico de soja (IPS). O hidrolisado de IPS foi produzido em sistema descontínuo, 5% de substrato, relação enzima/substrato 1/20, 6 h, 37°C, sob agitação. A plasteína foi produzida com 40% de substrato em solução aquosa, pH 7, 24 h a 37°C, sob repouso. Na caracterização química, foi verificada a distribuição dos pesos moleculares por meio de eletroforese (SDS-PAGE) e cromatografia de exclusão molecular (CEM). A SDS-PAGE não permitiu a visualização das bandas tanto no hidrolisado quanto na plasteína. Na CEM o hidrolisado apresentou 5 frações de PM na faixa de 5,4 a 66,2 kDa e a plasteína com 2 frações de PM na faixa de 9,6 e 58,7 kDa. O escore químico de aminoácidos essenciais confirmou a presença dos aminoácidos sulfurados como limitantes, sendo obtidos os valores de 93,2 e 96,4% para o hidrolisado e plasteína, respectivamente. A modificação enzimática através da reação de síntese de plasteína mostrou ser um processo viável na produção de matéria-prima para formulações alimentares de uso em nutrição clínica e em outros sistemas, sendo necessária a suplementação de metionina quando utilizada como fonte exclusiva de proteína.

Discriminação de sorovares de Salmonella spp. isolados de carcaças de frango por REP e ERIC-PCR e fagotipagem do sorovar Enteriditis

Salmonelose é a infecção bacteriana de origem alimentar mais freqüente no Paraná, Brasil, e os surtos estão associados, principalmente, ao consumo de ovos, carne de aves e derivados. Os objetivos deste trabalho foram identificar os sorovares de Salmonella isolados de carcaças de frango e caracterizá-los molecularmente por REP e ERIC-PCR, assim como identificar os fagotipos de Salmonella Enteriditis. Dos 25 isolados de Salmonella spp. analisados, 18 foram identificados como Enteriditis, 4 como Braenderup, 2 como Worthington e 1 como infantis. Dos 18 isolados de Enteriditis, 14 foram PT4, 2 PT4a, 1 PT7 e 1 RDNC, por se tratar de colônia rugosa. REP-PCR forneceu padrão eletroforético distinto de 10 a 13 bandas distribuídas entre 120 e 2072 pb para cada sorovar diferente testado. A ERIC-PCR mostrou um padrão de 4 a 5 bandas entre 180 e 1000 pb e foi menos discriminativa quando comparada à REP-PCR. Os resultados encontrados confirmaram que a fagotipagem é uma ferramenta útil e discriminativa para o sorovar Enteriditis. Apesar do pequeno número de sorovares testados, os resultados sugerem que a REP-PCR parece ser um método atrativo a ser utilizado no futuro para a discriminação preliminar de sorovares de Salmonella.

Caracterização da fração protéica da cianobactéria Aphanothece Microscopica Nägeli cultivada no efluente da parboilização do arroz

O objetivo do presente trabalho foi avaliar a fração protéica da cianobactéria Aphanothece microscopica Nägeli cultivada no efluente da parboilização do arroz quando submetida a diferentes condições de secagem. A produção da biomassa foi realizada a partir da água residuária do processo de parboilização do arroz em bioreatores de coluna de bolhas. A biomassa foi separada do efluente por centrifugação e desidratada em secador descontínuo de bandejas nas condições de 40, 50 e 60ºC e espessuras de bandejas de 5 e 7 mm. O comportamento eletroforético das proteínas da biomassa foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamamida na presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e apresentou bandas com peso molecular de 15 kDa a 62,5 kDa. O perfil aminoacídico mostrou teores superiores aos recomendados pelo padrão FAO, com exceção dos aminoácidos lisina e dos sulfurados (MET+CYS). A caracterização funcional, expressa em termos de solubilidade e capacidade emulsificante, demonstrou a influência da condição de secagem na funcionalidade protéica da biomassa.

Carboidratos das fibras de cotilédones e proteínas de produtos derivados de soja (Glycine max (L.) Merril)

Fibras alimentares obtidas de cotilédones de soja original (FAO) e micronizada (FAM) foram fracionadas e avaliadas quanto a polissacarídeos e monossacarídeos constituintes. O componente majoritário foi a hemicelulose, totalizando 59% em FAO e 51% na FAM, a pectina representou em média 14% e a celulose 8,5%. As duas amostras de fibras apresentaram 17 mg.g-1 de ácidos urônicos e a mesma composição de monossacarídeos, sendo galactose, glicose e arabinose/ramnose os principais componentes. As proteínas de concentrado protéico, farinha desengordurada e fibras alimentares (FAO e FAM) foram avaliadas quanto à solubilidade em diferentes solventes (NaCl, água, etanol e NaOH) e quanto ao peso molecular. A farinha desengordurada de soja teve a maior parte das proteínas passível de extração com solução salina, e o concentrado protéico e as fibras de cotilédones com solução alcalina. A fração protéica que não foi extraída com nenhum dos quatro solventes utilizados permaneceu no resíduo, o maior percentual estava no concentrado, seguido pela fibra alimentar micronizada e a farinha, já a menor quantidade estava na fibra alimentar original. A eletroforese das proteínas dos quatro ingredientes alimentares mostrou as subunidades que constituem as frações β-conglicinina e glicinina. Bandas com peso molecular próximo aos 30 kDa foram reveladas nas proteínas extraídas das fibras de cotilédones de soja, sendo provavelmente glicoproteínas de parede celular, ricas em hidroxiprolina.

Proteínas da semente de cupuaçu e alterações devidas à fermentação e à torração

O cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum) é um fruto típico da região Norte do Brasil, com grande potencial econômico. Atualmente, é a polpa que mobiliza e sustenta a produção, a industrialização e a comercialização deste fruto. A semente, um subproduto da industrialização da polpa, apresenta teor considerável de proteínas. Entretanto, muito pouco ou nada se conhece acerca de seu perfil eletroforético, de aminoácidos e de principais frações, uma vez que ocorrem alterações protéicas devidas aos processos de fermentação e torração. O objetivo deste estudo consiste em caracterizar as alterações da proteína da semente, da amêndoa fermentada e da amêndoa torrada de cupuaçu, mediante a análise dos perfis eletroforéticos, dos aminogramas característicos e do fracionamento da proteína em diferentes solubilidades. A fermentação e a torração provocaram uma ligeira redução nos teores de proteína total e aminoácidos totais, quando comparados aos teores das sementes não submetidas a essas etapas do processamento. Observou-se, para a semente e a amêndoa fermentada, a presença de quatro bandas protéicas principais de 20,4, 33,6 e 38,7 kDa. Para as amêndoas que foram submetidas ao processo de fermentação e, em seguida, à torração, observou-se a presença de uma única banda protéica forte, com peso molecular aparente de 21,0 kDa. As extrações para fracionamento das proteínas em diferentes solubilidades não resultaram em frações protéicas puras. Observou-se a presença de quatro bandas principais em todas as frações protéicas isoladas, sendo a banda de peso molecular próximo a 21,1 kDa a mais abundante em todos os casos. Esta banda é aparentemente muito semelhante à fração albumina do cacau, que apresenta peso molecular aparente de 21,3 kDa.

Extração e caracterização de carboidratos presentes no alho (Allium sativum L.): proposta de metodologia alternativa

O alho é um alimento funcional que contém inulina, um polissacarídeo de reserva, que auxilia no controle das bactérias patogênicas e putrefativas existentes no intestino. O presente trabalho teve por objetivo avaliar uma metodologia simples de extração de carboidratos do alho, qualificar e quantificar a composição desse extrato empregando a cromatografia líquida de alta eficiência e a espectroscopia na região do infravermelho utilizando para isso um padrão de inulina. Os bulbos de alho foram submetidos à extração aquosa a quente por 4 horas; posteriormente o líquido resultante foi separado e a ele foram adicionados 300 mL de acetona. O extrato isolado foi avaliado quanto aos seus produtos de hidrólise alcalina e os resultados indicaram a presença de um oligossacarídeo como o observado para a inulina padrão. As principais bandas características dos carboidratos foram visualizadas entre 3600 a 3000 e 1200 a 900 cm-1. A técnica utilizada neste trabalho pode ser utilizada para extração da inulina, pois agrega valor a produtos naturais, gerando alternativas do ponto de vista econômico.

Utilização do Intron Splice Site primer EI-1 na discriminação de leveduras contaminantes do processo de fermentação alcoólica

Neste trabalho, utilizamos o Intron Splice Site primer EI-1 para a análise do perfil de amplificação de diferentes espécies de leveduras consideradas contaminantes no processo de fermentação alcoólica, originadas de uma destilaria no Estado da Paraíba na safra 2004/2005. Foram realizadas as etapas analíticas para discriminação molecular das leveduras a partir da extração do DNA total, amplificação por PCR e análise do perfil genético. Os resultados obtidos indicam que o Intron Splice Site primer EI-1é muito eficaz na discriminação das diferentes espécies de Saccharomyces e não Saccharomyces, evidenciando padrões de bandas específicos para as leveduras analisadas. Este primer, por ser complementar a uma região muito conservada do genoma das leveduras, mostrou-se incapaz de uma discriminação intraespecífica. Isto demonstra a utilidade deste marcador no auxílio à taxonomia de leveduras.

Análise da pureza genética e discriminação de cultivares de vinca (Catharanthus roseus (L.) G.Don) usando "random amplified polymorphic DNA" em DNA extraído de sementes e folhas

A técnica "Random Amplified Polymorphic DNA" (RAPD) surgiu como uma ferramenta útil para testar a pureza genética e a discriminação de cultivares em muitas espécies. É uma técnica simples, rápida, relativamente de baixo custo e permite o uso de DNA extraído de sementes secas, o que é muito importante em um programa de análise de sementes. O uso desta tecnologia no teste da pureza genética pode ser muito interessante para algumas espécies, como a vinca (Catharanthus roseus (L.) G.Don), pois pouco se conhece a respeito da seqüência de seu DNA. É interessante, também, pelo fato de existir grande número de "primers" comercialmente disponíveis, que podem ser prontamente utilizados para gerar dados. Essa técnica pode ser mais facilmente utilizada para gerar padrões de bandas polimórficas suficientes para discriminar genótipos diferentes. Todavia, no presente estudo, os padrões RAPD de bandas obtidas de amostras de DNA extraído de sementes de vinca em "bulk" foram não-consistentes, o mesmo ocorrendo com o uso de DNA extraído de sementes individuais de um mesmo cultivar, o que evidencia que a técnica não é aplicável para testar a pureza genética e a discriminação de cultivares de vinca. Entretanto, os padrões de bandas RAPD gerados a partir de DNA extraído de tecido foliar de plântulas foram mais reproduzíveis e poderiam ser considerados na caracterização de cultivares.