Wide Field-of-view Microscopes and Endoscopes for Time-lapse Imaging and High-throughput Screening

Wide field-of-view (FOV) microscopy is of high importance to biological research and clinical diagnosis where a high-throughput screening of samples is needed. This thesis presents the development of several novel wide FOV imaging technologies and demonstrates their capabilities in longitudinal imaging of living organisms, on the scale of viral plaques to live cells and tissues.

The ePetri Dish is a wide FOV on-chip bright-field microscope. Here we applied an ePetri platform for plaque analysis of murine norovirus 1 (MNV-1). The ePetri offers the ability to dynamically track plaques at the individual cell death event level over a wide FOV of 6 mm × 4 mm at 30 min intervals. A density-based clustering algorithm is used to analyze the spatial-temporal distribution of cell death events to identify plaques at their earliest stages. We also demonstrate the capabilities of the ePetri in viral titer count and dynamically monitoring plaque formation, growth, and the influence of antiviral drugs.

We developed another wide FOV imaging technique, the Talbot microscope, for the fluorescence imaging of live cells. The Talbot microscope takes advantage of the Talbot effect and can generate a focal spot array to scan the fluorescence samples directly on-chip. It has a resolution of 1.2 μm and a FOV of ~13 mm². We further upgraded the Talbot microscope for the long-term time-lapse fluorescence imaging of live cell cultures, and analyzed the cells’ dynamic response to an anticancer drug.

We present two wide FOV endoscopes for tissue imaging, named the AnCam and the PanCam. The AnCam is based on the contact image sensor (CIS) technology, and can scan the whole anal canal within 10 seconds with a resolution of 89 μm, a maximum FOV of 100 mm × 120 mm, and a depth-of-field (DOF) of 0.65 mm. We also demonstrate the performance of the AnCam in whole anal canal imaging in both animal models and real patients. In addition to this, the PanCam is based on a smartphone platform integrated with a panoramic annular lens (PAL), and can capture a FOV of 18 mm × 120 mm in a single shot with a resolution of 100─140 μm. In this work we demonstrate the PanCam’s performance in imaging a stained tissue sample.

Perfis de resistência de cepas de Escherichia coli isoladas em urocultura e a correlação com os fatores de risco diversos para infecção do trato urinário

As infecções do trato urinário (ITUs) são uma das causas mais comuns de consultas médicas. No ambiente hospitalar estão entre as mais frequentes infecções relacionadas à assistência à saúde (35 a 45%). Nos Estados Unidos da América, resultam em 3.600.000 consultas médicas anuais e mais de 100.000 hospitalizações. No Reino Unido, representam 23% das infecções relacionadas à assistência à saúde. Estudos mostram que a E. coli é a bactéria mais isolada em uroculturas (75% a 80%), tanto em pacientes hospitalizados quanto não hospitalizados. A antibioticoterapia para ITU é comumente iniciada empiricamente, antes da urocultura e do antibiograma, por isso, faz-se necessário conhecer a sensibilidade e resistência dos prováveis agentes etiológicos, deve-se considerar o histórico clínico epidemiológico do paciente. No presente estudo foi realizada a análise da resistência das cepas de E. coli isoladas em 261 uroculturas de pacientes assistidos no serviço ambulatorial e hospitalar do Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) e, também, de 81 cepas isoladas em uroculturas de pacientes assistidos no serviço ambulatorial de um Hospital Maternidade do Município do Rio de Janeiro (HMMRJ), no período de maio de 2010 a dezembro de 2010. A susceptibilidade aos antimicrobianos foi determinada pela metodologia de disco difusão por Kirby e Bauer. Foram realizadas triagens fenotípicas para cepas produtoras de ESBL e para cepas produtoras de carbapenemases. Através dos dados contidos nos prontuários dos pacientes com uroculturas positivas para E. coli (≥ 105 ufc/mL), foi realizada a pesquisa clínica epidemiológica para se verificar a ocorrência de fatores de risco diversos, para ITU por E. coli. Observou-se que pacientes do sexo feminino são mais susceptíveis a ITU e o uso de antibiótico até 03 meses antes do episódio infeccioso (p= 0,04746), diabetes (p= 0,01683), trauma recente (p= 0,000238), cirurgia abdominal ou pélvica prévia (p= 0,00221), patologia crônica de bexiga (p= 0,002150), uso de cateter urinário (p=0,0002), insuficiência renal crônica (p= 0,02178), e hospitalização por até 06meses prévios (p= 0,01802) podem ser considerados fatores de risco para ITU por E. coli. Verificou-se que o uso de cateter urinário (p=0,000399), cirurgia abdominal ou pélvica prévia (p=0,004458) e o uso de antimicrobianos prévios ao processo infeccioso (p=0,002625), podem ser considerados fatores de risco importantes, para ITU por E. coli multirresistentes. Os pacientes do sexo masculino, apesar de minoria no estudo, representam a maioria dos pacientes com ITU por E. coli multirresistente. Verificou-se que a classe de antimicrobiano utilizado previamente ao episódio infeccioso, aumenta a chance de ocorrer ITU por E. coli multirresistente, principalmente quando associadas ao uso de cateter urinário e cirurgia abdominal ou pélvica prévia. Os perfis de resistência da cepas isoladas dos pacientes assistidos no serviço ambulatorial e hospitalar do HUPE apresentam semelhanças. Apesar do baixo número de cepas multirresistentes entre as isoladas dos pacientes assistidos no serviço ambulatorial do HMMRJ, essas apresentam perfil de resistência semelhante aos perfis das cepas isoladas dos pacientes assistidos no serviço ambulatorial e hospitalar do HUPE. A partir das evidências, percebe-se que o uso racional de antimicrobianos é muito importante para diminuir a problemática da resistência bacteriana

Caracterização fenotípica e molecular de amostras de Enterococcus isoladas em hospitais da cidade do Natal/ RN

O gênero Enterococcus tem emergindo como um dos mais importantes patógenos em infecções relacionadas à assistência à saúde no mundo. Estes microrganismos apresentam habilidade de adquirir genes de resistência a vários antimicrobianos, incluíndo à vancomicina, além de possuir diversos fatores associados à virulência, que contribuem sobremaneira para a sua permanência no hospedeiro, facilitando sua disseminação, particularmente, no ambiente hospitalar. Os objetivos deste estudo foram caracterizar, por testes fenotípicos e genotípicos, amostras de Enterococcus isoladas de quadros infecciosos em pacientes atendidos em quatro instituições de saúde localizadas na cidade do Natal, RN, no período de setembro de 2010 a junho de 2011. As espécies de Enterococcus foram caracterizadas por testes fisiológicos convencionais e por reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex, utilizando oligonucleotídeos específicos para caracterização do gênero e espécies. O perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos foi avaliado por testes de difusão em ágar. Os valores de concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina, teicoplanina e linezolida foram determinados pelo emprego do teste E; e o genótipo de resistência à vancomicina foi analisado por PCR. Genes associados à virulência (asa1, cylA, esp, gelE e hyl) foram detectados por ensaios de PCR multiplex. O polimorfismo genético das amostras bacterianas foi avaliado por metodologia de eletroforese em campo pulsado (PFGE), com a utilização da enzima SmaI. Foram obtidas 117 amostras, a partir de quadros infecciosos em 116 pacientes. Os resultados revelaram que a espécie E. faecalis foi a prevalente (91,4%). Os testes de susceptibilidade revelaram que as taxas de resistência mais elevadas estiveram associadas à tetraciclina (58,2%) e a níveis elevados de estreptomicina (36,7%). A resistência à vancomicina foi detectada em uma amostra de E. faecium, portadora do genótipo vanA, correspondendo ao primeiro isolamento de amostra com essa característica de resistência no RN. Esta amostra foi isolada em um caso de co-infecção com E. faecalis sensível à vancomicina. Adicionalmente, susceptibilidade intermediária a linezolida foi identificada em três amostras de E. faecalis. Dentre os determinantes de virulência identificados, gelE foi o prevalente (83,8%). De acordo com as espécies E. faecalis o perfil mais detectado foi gelE + esp (31,6%), na espécie E. faecium foi o perfil esp (28,6%) e a única amostra de E. gallinarum apresentou dois determinantes de virulência (asa1 + cylA). O gene hyl não foi identificado em nenhuma das amostras. A análise do polimorfismo genético das amostras por PFGE evidenciou uma elevada policlonalidade. Diante das características de resistência e de virulência observadas e da sinalização da emergência de mecanismos de resistência importantes no Estado do RN, este estudo chama atenção para a necessidade de rastreamento, particularmente entre portadores sadios, e estabelecimento de políticas de controle da disseminação dessas amostras nas instituições de saúde, mesmo em regiões onde tais características ainda sejam pouco frequentes.

Caracterização e diversidade molecular do transposon Tn1546, carreador do gene vanA, responsável pela expressão de resistência à vancomicina, em amostras clínicas de diferentes espécies de Enterococcus

Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) são reconhecidos como importantes patógenos causadores de infecções nosocomiais, configurando um grave problema de saúde pública, principalmente pela escassez de opção terapêutica eficaz. O fenótipo de resistência VanA é o mais frequente, sendo definido pela resistência a altos níveis de vancomicina e teicoplanina. VanA é caracterizado por um conjunto gênico (vanRSHAXYZ) localizado no elemento genético móvel denominado transposon Tn1546. A diversidade de Tn1546 resulta de alterações estruturais promovidas por deleções ou integração de sequências de inserção (IS) que, exercem papel chave na evolução do elemento VanA, modificando os aspectos relacionados à sua transferência e expressão do fenótipo. O objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar o polimorfismo de elementos Tn1546 presentes em amostras de diferentes espécies de Enterococcus isoladas em instituições hospitalares do Estado do Rio de Janeiro no período de 2000 a 2012. Foram incluídas neste estudo 70 amostras VRE que foram caracterizadas quanto ao gênero, espécies e genótipo de resistência aos glicopeptídeos por métodos convencionais e PCR multiplex. A susceptibilidade a 17 antimicrobianos foi avaliada pelo método de difusão em ágar, e concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina e teicoplanina foi determinada por microdiluição em caldo. O tranposon foi obtido após lise das células bacterianas e amplificação por PCR longo, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para a região repetida e invertida que flanqueia este elemento genético. A diversidade dos elementos Tn1546 foi avaliada por um conjunto de métodos moleculares que incluiu a análise do polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição (restriction fragment lenght polymorphism, RFLP), utilizando-se a endonuclease ClaI, amplificação de segmentos internos por PCR de sobreposição de oligonucleotídeos (overlapping PCR) e detecção de sequências de inserção (ISs). A caracterização em espécies considerada para as demais análises foi obtida pela metodologia de PCR de acordo com a seguinte distribuição: E. avium (N=6), E. faecalis (N=12), E. faecium (N=46), E. gallinarum (N=4) e E. raffinosus (N=2). Todas as amostras apresentaram o genótipo vanA. Nos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foi observado que todas as amostras foram multirresistentes, sendo resistente de 6 a 13 dentre os 17 antimicrobianos testados. A presença de elementos semelhantes ao arquétipo de Tn1546 foi observada em 61,5% das amostras; entretanto, 27 amostras apresentaram perfis variantes de Tn1546. Foram identificados nove perfis de RFLP, dentre 66 avaliadas, sendo o perfil I, prevalente e semelhante ao arquétipo de Tn1546. Não foi possível analisar quatro amostras por RFLP. Os produtos de amplificação de Tn1546 alterados, obtidos pela overlapping PCR e pelo rastreamento de IS, levaram à classificação de 15 tipos polimórficos, nomeados de A a O. A maioria dos Tn1546 polimórficos teve suas regiões de ORF1 e/ou ORF2 deletadas; e IS1542 juntamente com IS1216V foram as inserções mais frequentes, que em muitas situações compartilhavam a mesma região de inserção. IS19 foi detectada apenas na região vanS-vanH. Os dados apresentados neste estudo indicam que o polimorfismo de Tn1546 pode ser explorado no rastreamento de rotas de transmissão, acompanhamento da dispersão de elementos VanA e investigação da evolução de amostras VRE.

PCR-SSCP and Isoelectric Focusing as Screening Methods for Identification of (Sub-) Tropical Fish Species

To ensure the authentication of fishery products lacking biological characters, rapid species identification methods are required. Two DNA- and protein-based methods, PCR-SSCP (polymerase chain reaction - single strand conformation polymorphism) of a 464 bp segment of the cytochrome b – gene and isoelectric focusing (IEF) of water-soluble proteins from fish fillets, were applied to identify fillets of (sub-) tropical fish species available on the European market. Among the samples analysed were two taxonomically identified species from the family Sciaenidae and one from Sphyraenidae. By comparison of DNA- and protein patterns of different samples, information about intra-species variability of patterns, and homogeneity of batches (e.g. fillet blocks or bags) can be obtained. PCR-SSCP and IEF may be useful for pre-checking of a large number of samples by food control laboratories. Zusammenfassung Zur Sicherstellung der Authentizität von Fischerei-Erzeugnissen ohne biologische Merkmale sind schnelle Verfahren zur Speziesidentifizierung hilfreich. Zwei Methoden der DNA- bzw. Protein-Analyse wurden eingesetzt, um Filets (sub-) tropischer Fischarten, die auf dem europäischen Markt angeboten werden, zu identifizieren. Bei diesen Methoden handelt es sich um die PCR-SSCP (Polymerase-Kettenreaktion – Einzelstrang-Konformationspolymorphismus) – Analyse der PCR-Produkte und die IEF (isoelektrische Fokussierung) der wasserlöslichen Fischmuskelproteine. Unter den untersuchten Proben waren zwei taxonomisch bestimmte Arten aus der Familie Sciaenidae und eine Spezies aus der Familie Sphyraenidae. Durch Vergleich der DNA- bzw. Proteinmuster lassen sich Informationen über die intra-spezifische Variabilität solcher Muster und die Einheitlichkeit von Partien (beispielsweise Filetblöcke oder Filetbeutel) gewinnen. PCR-SSCP und IEF können in Laboratorien der Lebensmittelüberwachung als Vortest gerade bei hohen Probenzahlen sinnvoll eingesetzt werden.

Phosphate treatment of frozen prawns. Pt. 1. Screening of various phosphates for prevention of drip loss

Various phosphates and their mixtures were screened for their efficiency of preventing drip loss in frozen prawns. The effectiveness of the phosphates decreased in the following order: Sodium tripolyphosphate — Sodium pyrophosphate — Sodium hexametaphosphate Sodium metaphosphate — Sodium dihydrogen phosphate; the last two being ineffective. Even though thaw drip loss was reduced by the above treatments the organoleptic quality of the thawed as well as cooked products was unsatisfactory, discoloration being the major defect. A solution of a mixture of 12% sodium tripolyphosphate and 8.6% sodium dihydrogen phosphate or 2% citric acid in water when used as dip prevented thaw drip loss, improved cooked yield and organoleptic quality without adversely affecting the biochemical characteristics. Commercial scale trials showed that the results are highly reproducible.

Radical Scavenging and Antimicrobial Activities of Methanol Extracts of Two Kinds of Formicary

对两种不同的蚂蚁窝进行甲醇提取,并对提取物进行了急性毒性、抗自由基,酚含量、还原能力和抗菌活性的检测。二苯基三硝基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基的清除能力的检测表明:两种蚂蚁窝甲醇提取物都具有显著的自由基清除能力,并呈现出剂量依赖性,而且,在高浓度时(5~10mg·mL-1),它们的自由基清除能力甚至显著地高于二丁基羟基甲苯(butylated hydroxyl toluene,BHT)。酚的含量和还原能力分别用福林酚试剂和铁氰化钾还原反应来测定,统计分析显示两种蚂蚁窝的抗氧化能力和其酚含量、还原能力都存在着正相关。两种蚂蚁窝甲醇提取物都具有抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的活性,但它们却对真菌没有作用。

An anionic antimicrobial peptide from toad Bombina maxima

Amphibian skin is a rich resource of antimicrobial peptides like maximins and maximins H from toad Bombina maxima. A novel cDNA clone encoding a precursor protein that comprises maximin 3 and a novel peptide. named maximin H5. was isolated from a skin cDNA library of B. maxima. The predicted primary structure of maximin H5 is ILGPVLGLVSDTLDDVLGIL-NH2,. Containing three aspartate residues and no basic amino acid residues. maximin H5 is characterized by an anionic property. Different from cationic maximin H peptides. only Gram-positive strain Staphylococcus aureus was sensitive to maximin H5. while the other bacteria] and fungal strains tested ere resistant to it. The presence of metal ions. like Zn2+ and Mg2+, did not increase its antimicrobial potency. Maximin H5 represents the first example of potential anionic antimicrobial peptides from amphibians, The results provide the first evidence that. together kith cationic antimicrobial peptides. anionic antimicrobial peptides may also exist naturally as part of the innate defense system. (C), 2002 Elsevier Science (USA). All rights reserved.

Antimicrobial peptides from skin secretions of Chinese red belly toad Bombina maxima

Two groups of antimicrobial peptides have been isolated from skin secretions of Bombina maxima. Peptides in the first group, named maximins 1, 2, 3, 4 and 5, are structurally related to bombinin-like peptides (BLPs). Unlike BLPs, sequence variations in maximins occurred all through the molecules. In addition to the potent antimicrobial activity, cytotoxicity against tumor cells and spermicidal action of maximins, maximin 3 possessed a significant anti-HIV activity. Maximins 1 and 3 were toxic to mice with LD50 values of 8.2 and 4.3 mg/kg, respectively. Peptides in the second group, termed maximins H1, H2, H3 and H4, are homologous with bombinin H peptides. cDNA sequences revealed that one maximin peptide plus one maximin H peptide derived from a common larger protein. (C) 2002 Elsevier Science Inc. All rights reserved.

Two families of antimicrobial peptides with multiple functions from skin of rufous-spotted torrent frog, Amolops loloensis

There are around 27 species of Amolops amphibian distributed in South-east of Asia. Seven antimicrobial peptides (AMPs) belonging to two different families were purified from skin of rufous-spotted torrent frog, Amolops loloensis, and designated brevinins